Ji chu fen zi sheng wu xue

11 纪 写 军工 校 玫 村 COPD

基 侧 分 于 生物 学

叶 林 柏 分 金 荣 编著

7

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21 世纪 高 等 院 校 教材 一 生物 科学 类

基础 分 子 生 物 字

内 容 简介

本 书 以 “内 容 新 \ 重 基础 ”为 指导 思想 , 从 分 子 生 物 学 的 概念 ,术语 、 理 论
及 新 发 现 出 发 ,系统 介绍 了 分 子 生 物 学 的 理论 。 书 中 强调 生物 大 分 子 的 结
构 、 构 象 与 功能 关系 及 DNA、RNA、 有 蛋白 质 之 间 的 相互 作用 ,对 DNA 复制 、
基因 表达 调控 、 转 录 、 翻 译 等 内 容 给 予 详细 介绍 。

本 书 可 作为 生物 学 、 医 学 农学 药学 等 学 科 领 域 的 本 科 生 、 研 究 生 的 教
材 , 也 可 作为 以 上 各 领域 的 教师 和 研究 工作 者 的 参考 书 。

图 书 在 版 编目 (CIP) 数 据

基础 分 子 生 物 学 / 叶 林 柏 ， 部 金 荣 编 著 . 一 北京 : 科学 出 版 社 ，2004.8
(21 世纪 高 等 院 校 教材 .生物 科学 类 )
ISBN 7-03-012830-3

T . 基 … 工 .@ 叶 …@ 部 … ” 亚 . 分 子 生 物 学 -高 等 院 校 -教材 区.Q7
中 国 版 本 图 书馆 CIP 数据 核 字 (2004) 第 005877 号

责任 编辑 : 周 远 彭 克 里 和 孙 晓 洁
责任 校对 :， 柏 连 海 /责任 印 制 : 安 春 生 / 封 面 设 计 : 陈 茹

人 鲁 学 入 上 且 社 出 版
北京 东 黄 城 根 北 街 16 号
邮政 编码 :100717
http: 人 Www.sciencep.com
源 海 印 别 有 限 责 他 公司 印 刷
科学 出 版 社 发 行 ”各 地 新 华 书店 经 销
2004 年 8 月 第 一 版 开本 : B5 (720x1000)
2004 年 8 月 第 一 次 印刷 1 外 张 : 31
印 数 : 1 一 3 000 字数 : 592 000
定价 : 38.00 元
(如 有 印 装 质量 问题 ， 我 社 负 责 调换 《路 通 ) )

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编写 人 员 (以 姓氏 笔画 为 序 )

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插图 制作 人 员 (以 姓氏 笔画 为 序 )

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论 全 有 个 PR 下 和 二 旺旺 人 下 下 〔( 工

、 分 子 生 物 学 发 展 简 述 pp CT

、 分 子 生 物 学 的 主要 内 容 pp 人

、 如 何 学 好 分 子 生物 学 pp 6
生物 大 分 子 的 基本 结构 和 性 质 pp (7 人
生物 大 分 子 概述 pp (了

、 生 物 大 分 子 的 化 学 结构 ppp 7)
二 、 决 定 蛋白 质 和 核酸 三 维 结构 的 非 共 价 相互 作用 (9 )
三 、 研 究 生 物 大 分 子 的 基本 方法 ppp 他 卓 本
四 、 生 物 大 分 子 的 分 子 质量 测定 pp (2
后 DNA 的 结构 和 性 质 的 相生 和 下 -古人 玫 2 人 全 人 -4 太 - (CT2)
一 、DNA 的 基本 结构 pp (12)
二 、DNA 的 基本 性 质 (23)
节 RNA .pp (26)
节 条 白质 pp (35)
一 、 蛋 白质 的 结合 位 点 和 多 亚 基 蛋 白质 pp (35)
二 、 和 蛋白 质 活 性 的 调节 pp (38)
三 、 蛋 白质 重要 的 结构 域 pppp ( 才 7 人
四 、 生物 大 分 子 相 互 作 用 和 复杂 聚集 物 的 结构 ie (60 )
遗传 物质 二 (2
苦 遗传 物质 的 证 明 汪汪 汪汪 科 罗 浊 村 村 人 人 半 站 仆人 天 生生 (72
一 、 转 化 实验 pe 729
三 、 化 学 实验 pp (74)
三 、Blendor 实验 “osesopmeeeooooeooeeosoesoeeeases 人 证 So (74 )
生意 遗传 物质 的 性 质 5 (76)
一 、 遗 传 信 息 由 DNA 储存 和 传递 ppp (76)
二 、 遗 传 信息 从 亲 代 传递 到 子 代 pp (77 7)
三 站 携带 遗传 信息 的 DNA 的 化 学 稳定 性 877)
四 、 遗 传 物质 的 变异 性 〈 突 恋 ) pp (79)
节 遗传 物质 一 一 RNA oo (80)
区 可 转移 的 遗传 因子 5 (80 )

一 、 质 粒 … 和 pp (81)

二 :， 转 座 因 子 pp (91)

三 、 病 毒 及 其 与 质粒 、 转 座 因 子 之 间 的 关系 pp (101)

第 五 节 ”基因 和 基因 组 .PP (103)
第 四 章 DNA 复制 人 (105)
第 一 节 _DNA 的 复制 起 始 区 PP (105)
第 二 节 _DNA 复制 的 相关 和 蛋白质 pp (107)
一 、DNA 聚 合 酶 (107)

二 、DNA 连 接 酶 (114)

三 、 与 解 链 有 关 的 酶 和 和 蛋白质。 pp 《TS)
三 节 DNA 复制 的 起 始 、 延 伸 和 终止 pp (119)
一 、 复 制 子 (119)

二 、 半 保留 复制 和 半 不 连续 复制 pp 〔 玲 轴

三 、 不 同 的 复制 引发 机 制 pp (126)

四 、 复 制 的 延伸 和 终止 pp (35)

第 四 节 DNA 复制 的 调控 pp (136)
第 五 章 DNA 损伤 修复 和 基因 突变 wa 天 人 二 二 0 和 (139)
第 一 节 “避免 差错 的 DNA 损 伤 修复 ppp (140)
一 、 光 复活 作用 和 切除 修复 pp (140)

二 、 重 组 修复 pp (143)

三 、N- 糖 苷 酶 和 DNA 损伤 修复 ppp (144)

四 、 校 读 作 用 pp (144)

五 、 交 联 的 修复 pp (146)
第 二 节 ”避免 差错 的 DNA 损 作 修 复 和 基因 突变 PP (147)
三 节 应急 修复 反应 (148)
一 、7e&A 和 1exzrA 基因 (149)

二 、SOS 反应 过 程 (149)

三 、SOS 反应 和 细胞 分 裂 pp 和 区 且

四 、SOS 反应 和 DNA 复制 pp (5T)

五 、SOS 网 络 中 的 基因 和 诱发 突变 pp (151 )

六 、 二 聚 体 和 诱发 突 恋 pe ( 租 轴

七 、 无 嘎 叭 位 点 和 基因 突变 pp (152)

八 、DNA 聚 合 酶 和 基因 突变 ppp (152)

第 四 节 诱 变 剂 、 诱 变 、 基因 突变 和 突变 体 2 (153)
一 、 突 恋 的 类 型 和 它们 的 标志 pp (15S3)

二 、 罕 恋 株 的 筛选 和 ppp (154)

三 、 诱 变 ooeeessoaeeoeooeoeeeoeoooooiisoosseoooevosooieioousososooeesoei oo。oooo。 (15S5 )

四 、Oligo 诱 导 的 定点 突变 站 pp (161)

第 五 节 基因 突变 的 校正 :pp (163)
一 、 无 义 突变 的 校正 pp (163)

二 、 错 义 突变 的 校正 pp (164)

三 、 移 码 突变 的 校正 pp (164)

第 六 章 DNA 重组 pp (165 )
第 一 节 同 源 重 组 的 机 制 怕 pp (165 )
一 、 断 裂 重 接 和 异 源 双 链 pp (165)

二 、 支 链 迁 移 (166)

三 、 碱 基 对 的 错 配 及 消除 pp (167)

四 、 DNA 分 子 的 配对 : nespeeeeaeeeeaeseece5azzeeeeeasoe2seaoeooeseeaooseasts so。。。 (168)
二 节 细菌 转化 中 的 重组 pp (170)
一 、 细 菌 中 的 转化 站 pp (170)

二 、 酵 母 中 的 转化 pp GL71T)

第 过 节 同 源 双 链 DNA 分 子 之 间 的 交换 pp (173)
一 、 噬 菌 体 的 整合 pp CT73)

二 、 细 菌 接合 转移 中 的 重组 ppp (174)

三 、 转 导 中 的 重组 pp (174)

四 、 减 数 分 裂 重组 pp (176)
第 四 节 ， 同 源 重 组 模型 ppp (178)
一 、Helliday 模型 (179)

二 、 不 对 称 链 转移 模 型 pp (180)

三 、8 字形 分 子 的 解 离 pp (182)
第 五 节 ”RecA 和 RecBCD 蛋白 在 重组 中 的 作用 ppp (183)
一 、RecA 蛋 自 (183)

二 .RecBCD 酶 pe (185)

三 、 参 与 同 源 重组 的 其 他 蛋白 质 pp (186)

第 七 章 转录 ye (192)
第 一 节 RNA 的 酶 促 合 成 和 (192)
一 、RNA 酶 促 合 成 的 基本 特征 pp (192)

二 、 大 肠 杆菌 RNA 聚合 酶 pp (193)

三 、RNA 事 合 酶 在 DNA 上 的 识别 结合 位 题 (194)

四 、 转 录 的 起 始 pp (198)

五 、RNA 链 的 延伸 pp (199)

六 、RNA 链 合成 的 终止 和 新 合成 RNA 链 的 释放 (201)

第 二 节 RNA 分 子 的 种 类 及 转录 后 加 工 pp (204 )
一 、mRNA 的 结构 全 (204)
二 、mRNA 的 寿命 :pp (204)
三 、 稳 定 的 RNA- -一 核糖 体 RNA 和 转运 RNA pp (205 )
四 、tRNA 分 子 的 加 工 pp (205 )
五 、 大 肠 杆菌 中 rRNA 的 加 工 ppp (209 )
第 三 节 真 核 生 物 中 RNA 的 转录 和 加 工 waneaeeeeesee 证 生 天生 (210)
一 、 真 核 生 物 中 RNA 的 转录 pp (210)

二 、 真 核 mRNA 分 子 5 端 和 3 端的 结构 (219)
三 、 真 核 生 物 mRNA 的 加 工 RN (22 芭

四 、 核 酶 (234)

第 八 章 翻译 ww 人 全 吉 后 是 有 二 二 二 而 二 而 癌 生 后 局 咸 后 二 全 辣 瑟 局 语 后 而 而 六 后 汪 后 二 而 忆 乒乓 有 二 让 和 和 守 汪 汪汪 丰 寺 本 坝 生生 和 (236)
第 一 节 遗传 密码 的 破译 三 古 且 二 证 砚 呈 而 友 二 全 局 二 用 有 和 后 二 证 各 乓 于 和 守候 全 全 和 相生 (236 )
一 、GCrick 的 探索 (237)

二 、Nirenberg 的 实验 和 pp (237)

三 、Khorana 的 实验 (238)

入 二 :和 摇摆 假设 站 et (243)

第 三 节 ， 和 蛋白 质 生物 合成 的 机 制 怕 Nt (243)

一 、 与 蛋白 质 生物 合成 有 关 的 生物 大 分 子 pp (243)

0

蛋白 质 生 物 合 成 的 机 制 二 辣 训 二 高 届 而 本 遇 让 古训 全 训 局 让 让 在 二 在 二 二 和 在 证 (2

第 九 章 原核 基因 表达 调控 (257)
第 一 节 乳糖 代谢 系统 和 操纵 子 模型 .pp (257)
一 、 酶 的 诱导 (258)

二 、 结 构 基 因 和 调节 基因 的 突变 pp (260 )

三 、 调 节 基 因 (260)

四 、Jacob-Monod 的 负 控制 模型 及 实验 依据 pp (262 )

五 、 了 基因 产物 及 功能 pp (263)

六 、 操 纵 区 和 启动 区 ppp (264 )

七 、 正 控制 系统 pe (265)

八 . 一 瑟 回 区 的 结构 和 (266 )
第 二 节 ” 半 乳糖 操纵 子 站 RN (267)
一 、cAMP_CAP 对 两 个 gal 启动 子 的 不 同 作用 pp (268)

二 、 双 启动 子 的 生理 功能 pp (269)

三 、 双 操纵 区 pe (270)

第 三 节 色 氮 酸 操纵 子 站 pt (271)
一 、 色 氨 酸 操纵 子 的 阻 遇 - 操 纵 系 统 pp (271)

二 、 弱 化 子 和 前 导 区 pp (27 荔

三 、mRNA 的 前 导 区 全 序列 分 析 ppp K2799

四 、 弱 化 的 机 制 pp (274)

五 、 色 氨 酸 操纵 子 弱化 机 制 的 实验 依据 pp (275)

第 四 节 入 噬菌体 基因 表达 的 调节 PP (2789
一 、 入 了 办 菌 体 简介 2089

二 、 入 噬菌体 基因 组 pp (279)

三 、 入 叭 菌 体感 染 宿主 后 的 转录 次 序 pp (280)

四 、 入 叭 菌 体 的 调控 区 pp (281)

五 、 溶 源 化 的 遗传 控制 及 入 阻 遏 物 的 发 现 BR (282)

六 、 入 叭 菌 体 的 操纵 区 和 启动 子 结构 ppp (283)

七 、CI 和 蛋白 和 Cro 蛋 自 (284)

第 五 节 DNA 重 排 对 基因 表达 的 调节 aaa or (288)
第 六 节 西 格 马 因 子 对 基因 表达 的 调控 pp (289)
第 七 节 转录 后 的 调控 .pp (293)
一 、 翻 译 水 平 上 的 调控 pp (293)

二 、 翻 译 后 调控 (298)

第 十 章 真 核 生 物 基 因 组 及 其 基因 表达 调控 站 县 人 和 全 和、 (300)
第 一 节 真 核 生物 基因 组 和 (300)
一 、 重 复 序列 pp (300)

二 、 基 因 家 族 pp (302)

三 、 反 转 病 毒 和 癌 基 因 pp (304)

四 、 真 核 细胞 中 的 转 座 因 子 pp (307)

五 、 真 核 细胞 中 的 线粒体 基因 组 和 叶绿体 基因 组 (308)
第 三 靖 真 核 基因 的 结构 wwauanumassawwsauosaoeeEos Rd SS (308)
一 、rTRNA 基因 pe (309)

二 _、tRNA 基 因 六 pp (313)

三 、 为 蛋 和 白质 编 码 的 基因 pp (313)

四 、 内 部 间隔 区 和 隔 裂 基因 (314)

第 三 节 真 核 基因 表达 的 调控 ay9ese9g (319)
一 、 真 核 基因 表达 控制 的 特点 和 复杂 性 (319)

二 、 真 核 基因 转录 起 始 的 控制 机 制 pp (320)

三 、 几 种 真 核 基 因 转 录 调 控 模 型 pp (329)

四 、DNA 修饰 和 染色 质 结 构 控制 基因 转录 pp (332)

五 、 转 录 后 的 控制 pe (341 1)

六 、 真 核 蛋 白质 合成 的 控制 pp (343)

第 一 节

第 十 一 章 细胞 信号 调控 和 站 本 本 证 而 相交 而 生 6 和 85 (350)
= 细胞 信号 的 一 般 概念 50 (350)
、 信 和 号 分 子 和 信和 号 受 体 (350)

、 细 胞 对 信和 号 的 反应 (351)

三 、 三 类 已 知 的 细胞 表面 受 体 pp (352 )
第 二 节 “ 通 过 'G- 蛋 上 关 联 受 体 进行 的 信号 调控 “0 (353)
一 、G- 和 蛋白 关联 受 体 结构 七 次 跨 膜 (353 )
二 、 三 聚 体 G 蛋 自 (354)
三 、G- 蛋 白 关 联 受 体 作 用 的 两 条 主要 途径 (354)
三 节 ， 通 过 酶 关联 细胞 表面 受 体 进 行 的 信号 调控 (356)
一 、 受 体 栈 氨 酸 激酶 是 大 多 数 生 长 因子 的 受 体 pp (35S7)
二 、 形 成 二 聚 体 是 酶 关联 受 体 被 信号 激活 的 普遍 机 制 他 和 (357)

三 、 受 体 酷 氨 酸 激酶 上 的 棍 酸化 的 栈 氨 酸 被 具有 SH2 结构 的 蛋白 质 识别 和
结合 (357)
第 四 节 小 分 子 信 号 调控 证 证 全 届 汪 六 六 证 辣 全 届 个 色 六 证 闪 生 计 丰 向 全 二 汪 付 机 和 (358 )
一 、NO 和 CO 能 直接 与 细胞 内 的 酶 结合 ppN (358)
二 、 维 生 素 D 和 佣 类 激素 等 直接 和 基因 转录 的 调控 蛋白 结合 (359)
第 五 节 细胞 对 信和 号 的 反应 (360)
一 、 细 了 胞 信号 逻辑 : 信和 号 网 络 (360 )
二 、 细 胞 对 信和 号 的 适应 性 pp (360)
第 十 二 章 癌 分 子 生物 学 5 (362 )
第 一 节 癌 发 生 的 分 子 基础 一 -DNA 序列 改变 pp (362)
第 二 节 ， 瘤 的 发 生 和 发 展 包括 多 种 因素 的 协同 作用 -ss (363)
第 三 节 原 癌 基因 和 癌 基 因 这 汪汪 (364 )
第 四 节 原 癌 基因 的 激活 和 (365 )
一 、rus 原 癌 基 因 可 被 基因 变异 所 激活 pp (365 )
二 、 揪 入 、 转 位 和 基因 放大 可 激活 原 瘤 基因 (366 )
第 五 节 ， 肿 瘤 抑制 蛋 自 Pt (369)
第 十 三 章 ”发 育 与 分 化 调控 .pe 食 列 )
第 一 节 “ 果 晶 胚 轴 的 形成 (371 )
一 、 果 蝇 胚 胎 前 后 轴 决 定 的 基因 调控 :和 (371 )
二 、 果 蝇 胚 胎 背 腹 轴 建立 的 基因 调控 pp (373)
三 、 参 与 果 蝇 胚胎 体 节 形成 控制 的 基因 pp (373 )
第 二 节 ，” 果 晶体 细胞 的 性 别 分 化 :ppp (377)
一 、szl 基因 一 一 果 蝇 性 别 决 定 的 枢纽 pp (378)
二 、s 民 功能 的 维持 (379)

三 、 性 别 分 化 调控 途径 中 的 靶 基 因 pp (380)

第 三 节 “光滑 爪 蟾 且 中 组 织 和 轴 的 发 育 和 pt (380)
第 四 节 ”哺乳 类 体 轴 建 立 的 基因 调 探 (383)
一 、 参 与 背 腹 轴 和 前 后 轴 形 成 的 基因 (384)

二 、 左 右 轴 形成 的 基因 调控 pp (385)
第 五 节 ， 拟 南 芥 花 的 发 育 调控 (386)
第 六 节 ”造血 系统 发 育 的 分 子 机 制 怕 PN (388)
一 、 细 胞 谱系 选择 的 分 子 基础 pp (388)

二 、B 淋 巴 细胞 发 育 的 分 子 机制 怕 RN (391)

第 十 四 章 细胞 凋 亡 Reoweeeooeweseea 和 ev (397)
第 一 节 ”细胞 凋 记 的 概念 及 意义 (397)
一 、 油 亡 的 概念 (397)

二 、 细 胞 油 亡 的 意义 (399)
第 二 节 ， 细 胞 凋 亡 的 诱导 因素 、 受 体 、 相 关 基 因 (402)
一 、 细 胞 凋 亡 的 诱导 因素 (402)

二 、 与 细胞 凋 亡 相关 的 受 体 pp (403 )

三 、 细 胞 凋 亡 相关 基因 pp (405)
三 节 “病毒 感染 与 细胞 凋 产 和 (407)
一 、 病 毒 基 因 与 细胞 凋 让 pp (407)

二 、 病 毒 对 细胞 凋 亡 的 抑制 机 制 及 生物 学 意义 pp (407)
第 四 节 ”细胞 油 亡 信号 传导 途径 及 调 探 :4 (408)
一 、 线 粒 体 介 导 的 细胞 凋 亡 信 号 传导 途径 (408)

二 、 死 亡 受 体 介 导 的 细胞 凋 亡 信和 号 传导 途径 (410)

三 、 内 质 网 介 导 的 细胞 凋 亡 信和 号 传导 途径 (412)

四 、 细 胞 凋 亡 信号 传导 途径 的 相互 交叉 (412)

五 、CTL 诱导 丢 细 胞 的 凋 它 (413)

第 十 五 章 重组 DNA 技术 及 其 应 用 vi CS)
第 一 节 载体 和 工具 酶 5 (416)
一 、 载体 ee (4106)

二 、 工 具 酶 (424)
第 二 节目 的 基因 制备 pp (428)
一 、 直 接 分 离 法 pe (428)

二 、 构 建 基因 组 文库 或 xDNA 基因 文库 分 离 法 pp (429)

三 、PCR 法 分 离 目 的 基因 pp (430)

四 、 目 的 基因 的 化 学 合成 法 ppp (430)
第 三 节目 的 基因 与 载体 的 体外 重组 .PP (430)

一 、 目的 基因 与 载体 的 剪 切 oooeeoeoseeiosaoiaiiesso5assasaaosoe5sobaaassaaas5sa (430 )

二 、 目 的 基因 和 载体 的 体外 连接 pp (433 )

第 四 节 重组 子 导 入 细胞 技术 :pp (435)
一 、 重 组 DNA 分 子 转化 原核 生物 细胞 大肠 杆菌 ) (435)

二 、 重 组 DNA 分 子 导入 哺乳 动物 细胞 pp (436 )

三 、 重 组 入 噬菌体 DNA 分 子 转 导 大 肠 杆 菌 入 pp (437 )

四 、 重 组 DNA 分 子 导 入 植物 细胞 ppp (437)
23 重组 子 的 筛选 与 鉴定 pa (438)
一 、 根 据 重组 载体 的 选择 性 标记 进行 算 选 ppp (438)
2 法 和 (440 )

三 、 限 制 性 内 切 核酸 酶 酶 切 分 析 法 和 pp (440)

四 、 核 酸 杂 交 法 pp (440)

五 、 免 疫 学 方法 (441 )

六 、 核 苷 酸 序列 测定 (441 )

七 、 植 物 转化 细胞 和 哺乳 动物 转化 细胞 的 筛选 鉴定 (441)

第 六 节 克隆 基因 的 表达 本 (441 )
一 、 目 的 基因 在 原核 生物 表达 系统 中 的 表达 (大肠 杆 菌 表达 系统 ) 。 ……， (442)

二 、 目 的 基因 在 真 核 生 物 表 达 系 统 中 的 表达 pp (444 )

第 七 节 重组 DNA 技术 应 用 人 (445)
一 、 重 组 DNA 技术 在 医学 上 的 应 用 pp (446 )

二 、 重 组 DNA 技术 在 农业 上 的 应 用 pp (449 )

三 、 基 因 工 程 在 环境 保护 中 的 应 用 :Ne (452)
第 十 六 章 ， 现 代 分 子 生物 学 的 重要 研究 方法 和 技术 :PP (454)
2 定量 PCR RN (454)
一 、 常 用 的 实时 定量 PCR 方法 (454)
ET 核酸 分 子 的 杂交 机 (460)
一 、 核 酸 分 子 杂 交 的 原理 PN (461 )

二 、 国 相 支持 物 的 选择 (461)

三 、 印 迹 技术 (462 )
三 节 ”基因 沉 默 与 基因 剔除 Ne (463 )
一 、 基 因 沉 默 (463 )

二 、 基 因 剔 除 pp (466)

第 四 节 基因 表达 差异 分 析 (467)
一 、 传 统 研究 基因 表达 差异 的 方法 Ne (468)

二 、 差 异 展示 (468)

三 、 代 表 差 异 分 析 (469)

“2

小
蒜

四 、 基因 表达 系列 分 析 oooooesesesooooeeoooooooooooeooooososoeessoooeoaseossoseooosoeo。 (469 )

五 、 生 物 芯片 技术 (470)
节 DNA 启 动 子 的 活性 研究 pp (471)
一 、CAT 实验 原理 症 RN 全 729》
二 、CAT 实验 方 潜 怕 pe (57 区
节 DNA 与 蛋白 质 相互 作用 研究 方法 PP (474 )
二 、 凝 胶 阻 滞 分 析 二 “GelLshift 试验 pp (474)
写 ，DNase 了 是 迹 潜 人 ee (475)
三 、 甲 基 化 干扰 足迹 潜 pp (476)
节 和 蛋白质 与 蛋白 质 的 相互 作用 .PP (476)
要 双 杂 交 了 系统 .2 (477)
三 、 隐 菌 体 展示 技术 pp [77
三 、 免 疫 共 沉 淀 技术 (479)

第 -- 章 绪论

虽然 William Astbury 在 1945 年 最 先 提 出 了 “分 子 生 物 学 ”一 词 ， 但 “分 子
生物 学 ”这 门 学 科 的 诞生 时 间 是 不 能 用 具体 年 月 来 限定 的 。 分 子 生物 学 本 身 就 是
一 门 技术 和 应 用 性 较 强 的 交叉 学 科 。 它 有 一 个 逐步 积累 的 形成 和 发 展 的 连续 过
程 ， 它 的 逐步 形成 和 发 展 ， 与 生物 学 的 其 他 学 科 以 及 化 学 和 物理 学 的 发 展 有 着 密
切 的 关系 。 尤 其 是 与 生物 化 学 、 细 胞 学 、 遗 传 学 和 微生物 学 (包括 病毒 学 ) 的 发
展 关系 更 为 密切 。 而 分 子 生 物 学 的 发 展 又 对 其 他 学 科 的 发 展 产生 了 重大 影响 ， 事
实 上 ， 今 天 生物 学 的 其 他 学 科 也 发 展 到 了 分 子 水 平 ， 学 科 之 间 的 互相 交叉 和 渗透
越 来 越 广泛 。 分 子 生 物 学 从 人 们 决定 打破 细胞 、 研 究 组 成 细胞 的 大 分 子 〈 如 核
酸 、 蛋 和 白质、 多糖 ) 的 结构 与 生物 学 功能 开始 ， 逐 步 在 分 子 水 平 上 认识 了 生物 的
和 遗传、 变异 、 进 化 、 遗 传 信息 的 传递 、 基 因 的 表达 与 调控 、 细 胞 内 和 细胞 间 的 信
号 调节 、 细 胞 分 化 和 细胞 癌变 (增生 ) 及 凋 亡 、 个 体 发 育 过程 调 控 、 感 染 、 病 理
及 机 体 防 预 ; 直到 认识 高 等 动 植物 乃至 大 类 基因 组 学 、 蛋 白质 组 学 。 这 样 ， 分 子
生物 学 的 发 展 又 回 到 了 整体 生物 学 ， 而 生物 学 的 各 学 科 则 可 能 在 分 子 生 物 学 的 基
础 上 统一 为 整体 生物 学 或 总 体 生物 学 。

一 、 分 子 生物 学 发 展 简 述

旱 在 20 世纪 40 年 代 之 前 ， 人 们 就 已 经 知道 蛋白 质 和 核酸 是 细胞 内 的 重要 成
分 ， 蛋 白质 参与 或 催化 细胞 内 的 化 学 反应 ， 而 且 细 胞 组 分 可 以 在 不 依赖 完整 细胞
的 情况 下 进行 反应 从 而 实现 物质 转换 ， 并 且 那 时 已 经 发 现 了 病毒 这 种 比 细胞 结构
简单 得 多 、 微 小 得 多 的 原始 的 生命 形式 ，Stainly 可 以 把 这 种 生命 在 试管 中 像 化
学 物质 一 样 “ 结 唱 ” 沉 演出 来 ， 这 种 生命 只 含 蛋 白质 和 核酸 。 但 当时 人 们 并 不 知
道 核 酸 是 遗传 物质 ， 尽 管 摩尔 根 的 “基因 ”概念 这 时 已 从 “一 个 基因 一 种 性 状 ”
向 “一 个 基因 一 个 酶 ”过 渡 ， 并 且 Avery 的 肺炎 双 球 菌 的 转化 结果 已 为 人 所 知 ，
但 人 们 仍 相 信 蛋 白质 是 遗传 物质 ， 因 为 人 们 认为 蛋 白 质 是 由 20 种 不 同 的 氨基 栈
通过 肽 键 连 接 而 成 ， 比 核酸 只 含 4 种 碱 基 的 结构 要 复杂 得 多 。 后 来 用 从 热 灭 活 杀
死 的 光滑 型 (野生 型 致 病 ) 肺炎 球菌 中 提取 的 DNA 转化 活 的 粗糙 型 (不致 病 )
肺炎 球菌 ， 证 实 可 使 部 分 后 代 恢 复 成 野生 型 ， 仍 有 人 怀疑 这 是 由 于 提取 的 核酸 中
带 有 蛋白 质 所 致 。 直 至 1952 年 Hershey 在 著名 的 搅拌 试验 中 分 别 用 ?2P 和 35S 标
记 T2 鸣 菌 体 的 核酸 和 蛋白， 证 明 在 感染 细菌 时 T2 鸣 菌 体 只 要 把 核酸 注入 细菌
内 ， 就 能 完成 感染 和 复制 的 过 程 ， 从 而 产生 子 代 鸣 菌 体 ， 这 才 最 后 确定 了 核酸 是

呈

遗传 物质 。 现 在 我 们 都 知道 ，DNA 和 RNA (RNA 病毒 的 基因 组 ) 都 是 遗传 物
质 ， 是 遗传 信息 的 携带 者 。
确定 DNA 是 遗传 物质 是 分 子 生物 学 发 展 的 重大 里 程 碑 ， 但 是 DNA 只 有 14
种 不 同 的 碱 基 ， 它 如 何 能 编码 由 20 种 不 同 氨基 酸 组 成 的 蛋白 质 ? 它 如何 能 准确
复制 从 而 把 性 状 准确 遗传 给 后 代 ? 它 在 核 中 携带 的 信息 如 何 传递 、 如 何 准确 控制
细胞 的 各 种 生化 反应 ? 这 些 困 惑 科 学 家 们 的 问题 立即 就 被 提出 来 了 ， 要 回答 这 些
问题 ， 必 须 首先 了 解 DNA 的 结构 。1953 年 ，Watson 和 Crick 借助 于 其 他 研究 组
提供 的 DNA 晶体 X 射线 衍射 照片 来 研究 DNA 结构 ， 提 出 了 DNA 双 螺 旋 结 构 模
型 ， 这 一 模型 令 人 相信 DNA 可 以 通过 碱 基 配对 的 原则 准确 复制 而 把 信息 遗传 给
后 代 ， 也 可 以 转录 成 副本 从 核 中 转运 到 细胞 质 。Crick 接着 又 提出 “中 心 法 则 ”
即 遗传 信息 从 DNA->RNA-> 蛋 白质 。DNA 双 螺 旋 结 构 模 型 的 建立 是 分 子 生 物 学
发 展 史 上 又 一 块 丰碑 ， 而 有 些 学 者 认为 这 是 分 子 生 物 学 诞生 的 标志 。 此 后 ， 分 子
生物 学 发 展 越 来 越 快 ， 取 得 了 不 少 重大 突破 性 成 果 ， 取 得 的 这 些 成 果 将 永远 载 入
学 科 发 展 史册 ， 而 这 些 成 果 同时 也 反映 了 分 子 生物 学 发 展 的 历程 。 为 使 读者 对 分
子 生物 学 发 展 过 程 加 深 理 解 ， 现 把 这 些 重大 发 展 略 述 如 下 ;
1956 年 “ A，Kornberg 发 现下. co DNA 聚 合 酶 工 ，1958 年 分 离 该 酶 并
在 体外 环境 下 酶 促 合 成 有 活性 的 DNA， 因 而 于 1959 年 获 诺 贝
1958 年 Meselson 用 著名 的 “密度 转移 ”实验 证 实 DNA 的 “ 半 保 留 复
制 "; 建立 密度 梯度 离心 技术 。1968 年 冈 崎 片段 发 现 后 提出
DNA 复制 是 半 保 留 不 连续 复制 。
1959 年” S，Weiss 发 现 转录 酶 。
1960 年 Jacob 和 Monod 经 10 余年 研究 后 提出 乳糖 操纵 子 模型 ， 这 是 第
一 个 原核 基因 表达 控制 的 模型 ， 同 时 还 预言 mRNA 的 存在 。
1961 年 ” SSpiegelman 在 T2 感染 的 正 . coli 中 发 现 mRNA， 建 立 分 子 杂
1965 年 ” R. 双 .， Holley 测定 酵母 两 氨 酸 tRNA 的 一 级 结构 ， 提 出 芒 NA
的 “三 叶 草 ”结构 模型 。
1966 年 M，W. Nirenberg 和 HG.，Khorana 完成 全 部 遗传 密码 的 破
译 。
1967 年 Kates 和 McAuslan 发 现 真 核 转录 酶 ，1970 年 发 现 真 核 mRNA 含
有 polyA 尾巴 (在 天 花 病 毒 感染 细胞 中 发 现 )， 于 是 用 oligo
(dT) 柱 分 离 纯化 真 核 mRNA 从 而 促进 研究 进展 。
1968 年 ” MGellert 等 五 个 实验 室 发 现 DNA 连接 酶 ， 为 发 展 体 外 DNA
重组 技术 黄 定 了 基础 。
1970 年 ” H.， M.， Temin 和 D，Baltimore 同时 发 现 不 同 反 转 录 病 毒 的 逆向
。 党

转录 酶 ， 补 充 了 “中 心 法 则 ”。
1970 年 H. O. Smith 发 现 了 第 一 个 工 型 DNA 限制 性 内 切 核酸 酶
” ， 亚 md II， 导 致 之 后 一 系列 DNA 限制 性 内 切 核酸 酶 的 发 现 及 应
用 ， 和 DNA 连接 酶 一 起 促进 了 DNA 体外 重组 的 发 展 。
1972 年 ” PRBerg 等 三 人 建立 DNA 重组 技术 ， 建 立 了 第 一 个 体外 DNA
重组 分 子 (和 dvgal DNRA 片段 克隆 到 SV40)。 并 建立 了 含有 哺乳
动物 激素 基因 的 工程 菌株 ， 促 进 了 DNA 克隆 技术 的 发 展 和 应

用 。

1975 年 ”Furuichit 和 Miura 研究 质 型 多 角 体 病毒 ， 发 现 真 核 mRNA 中 的
m'Gppp 帽子 结构 。

1977 年 ” _P. Sharp 和 了 P. Leder 分 别 从 腺 病毒 II 型 和 鸡 卵 日 蛋 日 基因 中
发 现 真 核 基因 内 部 含有 内 含 子 。

1977 年 Gilbert 和 下 .， Sanger 分 别 发 明了 不 同 的 DNA 测序 技术 ， 前 者 发
明了 化 学 断裂 法 ; 后 者 发 明了 加 减法 和 聚合 酶 链 式 反 应 终止 技
术 “〈 即 双 脱 氧 终止 技术 )， 帮 助人 们 研究 基因 的 精细 结构 和 排列
乃至 对 人 类 基因 组 的 研究 。Sanger 因此 第 二 次 获 诺 贝 尔 奖 〈 第
一 次 因 首 次 测定 蛋白 质 一 一 牛 胰岛 素 的 氨基 酸 顺 序 )。
1979 年 本 A.， Shapiro 提出 了 描述 转 座 子 转 座 过 程 的 DNA 转 座 重 组 模
型 ， 即 Shapiro 模型 。

到 了 20 世纪 80 年 代 后 ， 基 因 工 程 产业 诞生 ， 分 子 生 物 学 发 展 到 实用 阶段 ，
特别 是 20 世纪 90 年 代 后 ， 基 因 工 程 产 业 发 展 很 快 ， 已 经 可 以 用 工程 细胞 株 或 菌
株 表达 生产 多 种 产品 医药 ， 包 括 疫苗 、 抗 体 、 生 长 因子 、 细 胞 因子 、 激 素 、 治 疗
用 蛋白 质 或 有 天 、 基 因 治 疗 产品 等 。 与 此 同时 ， 转 基因 农作物 、 转 基因 动物 技术 也
被 用 于 动 植物 品种 改良 ， 使 之 具有 抗 虫 、 抗 病 、 耐 旱 、 耐 盐 、 高 产 等 更 优良 的 品
质 ， 如 抗 虫 转基因 棉花 、 番 荔 、 大 豆 等 多 种 作物 大 面积 的 推广 种 植 。 克 隆 牛 、 羊
的 成 功 已 成 为 家 喻 户 晓 的 新 闻 。 到 上 世纪 末 ， 产 业 的 年 利润 增长 速度 已 超过 电子
和 信息 产业 ， 正 在 创造 巨大 的 经 济 效益 。 生 物 技术 行业 将 成 为 本 世纪 竞争 最 激 列
的 社会 支柱 产业 。

除 产业 的 形成 和 应 用 的 发 展 外 ，20 世纪 80 年 代 后 的 基础 研究 发 展 ， 有 人 用
“知识 爆炸 ”来 形容 ， 这 段 时 间 的 发 展 太 快 ， 重 大 成 果 太 多 而 难以 一 一 举 出 ， 例
如 DNA 复制 中 的 复制 起 始 位 点 结构 及 参与 复制 的 蛋白 功能 、 互 相 作 用 ; 转录 的
起 始 及 其 调控 ;核酸 酶 发 现 及 RNA 的 加 工 ; mRNA 的 翻译 过 程 及 调控 ; 蛋白 质
的 修饰 、 折 至 和 分 子 伴 侣 的 发 现 ; 和 蛋白质 结构 与 功能 关系 、 蛋 白质 大 分 子 相 互 作
用 ; 细胞 表面 受 体 及 信号 转 导 ; 细胞 分 化 ; 癌 基 因 与 病变 ; DNA 定点 突变 技术 、
PCR 技术 、 单 抗 和 人 源 抗 体 技术 以 及 30 亿 bp 的 人 类 基因 组 全 序列 测定 的 完成
等 。 这 些 研究 成 果 ， 大 大 丰富 了 分 子 生物 学 的 内 容 、 加 速 了 分 子 生 物 学 的 发 展 ，

人

特别 是 人 类 基因 组 计划 将 会 使 人 类 更 清楚 地 了 解 自身 ， 对 今后 的 医学 及 生命 科学
的 发 展 必 将 产生 极其 深远 的 影响 。 今 后 分 子 生物 学 的 研究 方向 ， 仍 然 会 以 蛋白 质
的 功能 研究 为 中 心 。 昌 白质 通过 修饰 、 构 象 改变 以 及 通过 大 分 子 间 相 互 作 用 《和 蛋
白质 与 核酸 和 和 蛋白 与 蛋白 之 间 ) 形成 大 分 子 复合 物 而 行使 各 种 生物 学 功能 如 ， 基
因 表达 的 调控 、 发 育 和 分 化 的 控制 等 都 是 不 同 蛋白 质 的 功能 在 时 间 和 空间 上 的 具
体 表 现 ， 而 信号 也 是 通过 蛋 白 质 修 饰 (如 磷酸 化 或 去 磷酸 化 、 与 核 苷 酸 或 小 分 子
如 金属 离子 、NO 等 的 结合 )、 变 构 和 相互 作用 来 转 导 的 。 只 有 深刻 了 解 蛋 白质
的 功能 ， 才 能 读 懂 基因 组 所 包含 的 全 部 信息 。

二 、 分 子 生 物 学 的 主要 内 容

分 子 生 物 学 与 生物 学 其 他 学 科 的 交叉 和 渗透 范围 日 益 广 泛 ， 尤 其 是 与 生物 化
学 、 遗 传 学 和 细胞 学 之 间 的 关系 更 加 密切 ， 以 至 于 很 难 划分 出 明确 的 分 界线 ， 尽
管 它 包 括 的 范围 很 广 ， 但 它 绝 不 能 包括 或 代替 其 他 生物 学 学 科 ， 就 像 细 胞 学 不 能
包括 遗传 学 和 生物 化 学 一 样 。 有 人 认为 生物 化 学 已 包括 了 分 子 生物 学 ， 把 分 子 生
物 学 看 成 是 生物 化 学 的 一 部 分 ， 这 种 观点 也 不 对 。 生 物化 学 的 本 质 是 “化 学 ”，
是 生物 体内 通过 酶 催化 、 电 子 传 递 进 行 的 化 学 反应 (分解 和 合成 反应 ) 而 促使 机
体内 的 新 陈 代谢 、 能 量 产生 和 消耗 等 ， 它 的 表示 形式 常常 类 似 于 化 学 反应 式 ， 涉
及 物质 的 转变 ， 而 通常 发 生 质 的 变化 ， 如 洗 粉 被 水 解 成 葡萄 糖 ， 糖 氧化 反应 等 。
而 分 子 生 物 学 涉及 的 是 构象 改变 和 大 分 子 的 互相 作用 ， 根 本 无 法 用 化 学 反应 式 来
表示 ， 如 调控 蛋白 识别 并 结合 于 菜 一 基因 的 启动 子 序列 而 激活 该 基因 表达 ， 细 胞
表面 受 体 的 胞 外 部 分 与 配 体 结 合 后 引起 胞 内 部 分 变 构 而 进行 信号 传递 等 ， 所 以 分
子 生物 学 有 它 目 己 的 内 容 和 范围 ， 它 的 主要 内 容 如 下 :

1. 基因 的 精细 结构 及 其 表达 调控

基因 是 指 DNA (或 RNA) 上 编码 一 种 和 蛋白质 或 功能 RNA 的 一 段 序 列 ， 基
因 的 精细 结构 还 应 包括 与 基因 转录 和 翻译 调控 有 关 的 序列 、 转 录 起 始 有 关 区 域 的
核 苷 酸 序 列 。 基 因 表 达 的 调控 决定 蛋白 质 产 生 的 时 间 和 水 平 高 低 。 基 因 表 达 是 指
基因 所 含 的 信息 获得 表现 ， 因 此 一 个 基因 的 表达 过 程 应 包括 : 转录 一 RNA 加
工 一 成 熟 mRNA~> 转 运 一 翻译 一 蛋白 质 加 工 和 修饰 一 功能 蛋白 。 这 一 过 程 的 每
一 个 步骤 都 受 控 制 ， 例 如 一 种 转录 通过 RNA 加 工 可 以 产生 二 、 三 种 数量 不 相等
的 mRNA， 同 时 存在 的 数量 相近 的 两 种 不 同 的 mRNA 翻译 产生 的 蛋白 质 的 量 可
以 相差 很 大 ， 即 使 在 无 细胞 体系 中 ， 翻 译 也 是 如 此 ， 深 刻 研 究 了 解 这 些 过 程 中 调
控 的 细节 是 分 子 生 物 学 研究 的 重要 内 容 和 艰巨 任务 。

2. 信号 传导

基因 表达 调控 是 在 单个 细胞 内 进行 的 ， 然 而 细胞 如 何 与 环境 协调 、 细 胞 之 间
如 何 保持 着 一 定 的 关系 、 多 细胞 多 组 织 的 复杂 机 体 的 生命 活动 如 何 保证 高 度 协
调 、 高 度 统一 ? 这 就 涉及 信和 号 传导 问题 ， 包 括 神经 信号 和 其 他 信和 号 的 传导 。 信 和 号
传导 可 以 使 机 体 对 环境 刺激 迅速 作出 反应 ， 信 号 命令 某 一 群 细 胞 定向 分 化 并 保持
记忆 而 发 育成 某 个 组 织 或 句 官 ， 也 可 命令 细胞 “ 调 亡 ”。 如 果 信 号 传导 失灵 ， 机
体 的 生命 活动 就 会 受到 不 同 程度 的 影响 ， 如 发 病 甚至 死亡 。 分 子 生 物 学 对 信号 传
导 的 研究 、 主 要 是 研究 受 体 结构 、 信 和 号 传导 途径 、 各 级 联 式 反应 有 关 的 蛋 质 及
其 作用 以 及 信和 号 导致 的 结果 (如 离子 通道 的 开关 或 菜 一 基因 、 和 蛋白 的 激活 )。

3. 重 白质 的 结构 、 相 互 作 用 及 其 功能

基因 的 功能 归根 到 底 是 通过 蛋白 质 的 功能 而 体现 的 ， 而 蛋白 质 的 功能 又 与 它
的 构象 有 十 分 密切 的 关系 ， 体 内 蛋白 质 之 间 〈 同 种 或 不 同 种 蛋白 ) 又 常常 通过 相
互 作用 形成 大 分 子 体 系 (或 蛋白 质 复 合 物 ) 来 行使 功能 。 如 何 研究 和 确定 蛋白 质
的 结构 是 结构 生物 学 的 任务 ， 而 分 子 生 物 学 研究 则 侧重 于 研究 结构 与 功能 之 间 的
关系 。 体 外 研究 蛋白 质 的 结构 ， 无 论 是 用 晶体 的 X 射线 衍 射 或 核磁 共振 或 冷冻
电镜 结合 计算 机 分 析 的 三 维 结构 重建 ， 获 得 的 都 是 特定 条 件 下 的 三 维 结构 ， 而 利
用 计算 机 的 一 些 软件 根据 氨基 酸 序列 预示 的 三 维 结构 更 是 “ 仅 供 参 考 "。 因 为 我
们 知道 ， 蛋 白质 在 不 同 条 件 下 可 以 呈现 不 同 的 构象 。 例 如 HIV 的 两 种 糖 蛋白
GP41 和 GP120， 当 HIV 病毒 与 细胞 受 体 结合 时 这 些 蛋 白 会 发 生 结构 的 转变 ; 又
如 疯牛病 蛋白 与 正常 蛋白 比较 ， 氨 基 酸 序列 并 没有 改变 ， 但 由 于 二 级 结构 和 构象
的 改变 从 而 引起 疯牛病 。 蛋 白质 的 相互 作用 是 广 谤 存在 的 ， 而 在 相互 作用 行使 功
能 的 过 程 中 也 常 伴随 着 构象 的 改变 ， 这 一 点 我 们 在 学 习 分 子 生 物 学 时 是 值得 注意
的 。

4. 遗传 、 变 异 、 进 化 的 分 子 机 制

DNA 或 RNA 如 何 复制 、 复 制 如 何 控制 、DNA 损伤 如 何 修复 、DNA 变异 和
DNA 重组 的 不 同 机 制 、 生 命 的 原始 分 子 是 什么 及 如 何 进化 等 也 是 分 子 生物 学 的
研究 内 容 。 病 毒 的 研究 在 DNA 或 RNA 的 复制 及 其 调控 方面 做 出 了 巨大 的 贡献 ，
真 核 DNA 的 复制 是 比较 复杂 的 ， 目 前 已 知 的 参与 复制 的 蛋白 质 至 少 有 十 几 种 ，
并 且 已 经 初步 了 解 了 这 些 和 蛋白 在 复制 起 始点 形成 复制 叉 的 过 程 及 在 复制 又 移动 中
的 功能 。 但 对 于 RNA 基因 组 的 复制 认识 还 很 缺乏 。

5. 分 子 生物 学 技术 及 其 应 用

用 DNA 重组 技术 使 基因 导入 特定 宿主 中 形成 稳定 的 表达 ， 以 达到 生产 某 种
“2 分

产品 、 动 植物 品种 改良 和 建立 实验 动物 模型 或 基因 治疗 等 目的 也 是 分 子 生物 学 研
究 和 学 习 的 重要 内 容 ， 而 技术 的 发 展 往往 也 对 基础 研究 起 很 大 的 推动 作用 ， 如 前
面 提 到 DNA 测序 技术 ， 分 子 克 隆 技 术 ， 近 年 来 发 展 的 mRNA 差异 显示 技术 、 系
列 基 因 表 达 分 析 (SAGE) 及 必 片 技术 ， 如 果 读 者 对 研究 方法 的 原理 和 大 致 过 程
有 了 基本 的 了 解 ， 就 能 更 容易 理解 一 些 理论 问题 。

三 、 如 何 学 好 分 子 生 物 学

分 子 生 物 学 是 一 门 技术 性 强 、 应 用 性 强 、 发 展 迅速 的 课程 。 要 掌握 这 门 课
程 ， 需 要 有 坚实 的 细胞 学 、 生 物化 学 、 遗 传 学 和 化 学 基础 ， 同 时 还 需 结 合 一 定 的
实验 课 或 有 一 定 的 研究 经 历 。 如 果 有 了 这 些 基础 条 件 ， 本 书 还 是 可 以 自学 掌握
的 。

第 二 音 ”生物 大 分 于 的 基本 结构 和 性 质

一 个 典型 的 细胞 中 含有 10 一 10” 种 不 同 种 类 的 分 子 。 经 粗略 地 估计 发 现 其
中 有 一 半 是 分 子 质量 不 超过 几 百 道 尔 顿 的 无 机 离子 和 有 机 成 分 的 小 分 子 ， 而 另 一
些 分 子 则 非常 巨大 ， 分 子 质 量 为 104 一 102Da， 被 称 为 生物 大 分 子 。 这 些 大 分 子
主要 包括 : 蛋白 质 、 核 酸 、 多 糖 和 脂 类 ， 它 们 分 别 是 氨基 酸 、 核 苷 酸 、 单 糖 和 单
脂 的 多 聚 体 。 由 于 这 些 大 分 子 常常 能 以 多 种 方式 被 修饰 ， 因 此 ， 生 物 大 分 子 还 可
以 进一步 分 为 亚 类 ， 如 糖 蛋白 〈 和 蛋白 质 携带 有 糖 基 )、 脂 蛋白 〈 和 蛋 白 质 携 带 有 脂
类 )、 脂 多 糖 (多 糖 携带 有 脂 ) 和 糖 基 化 核酸 (核酸 的 碱 基 上 携带 有 糖 )。

生物 大 分 子 执行 各 种 功能 。 例 如 ， 核 酸 储存 和 携带 遗传 信息 ; 多 糖 提供 能 量
并 且 组 成 植物 和 许多 微生物 的 细胞 壁 ; 脂 蛋 白 是 组 成 细胞 膜 的 主要 成 分 ， 它 是 细
胞 维持 内 部 环境 的 重要 成 分 ， 并 负责 运输 物质 进出 细胞 ; 最 通用 的 生物 大 分
子 一 一 蛋白 质 ， 可 以 催化 化 学 反应 、 调 节 信 息 的 流量 、 也 是 许多 结构 亚 基 的 成
分 。

有 关 生 物 大 分 子 性 质 方面 的 知识 ， 对 了 解 生 命 活 动 的 过 程 是 必须 的 。

第 一 他。 生物 大 分 子 概述

一 、 生 物 大 分 子 的 化 学 结构
1. 蛋白 质

蛋白 质 是 由 若干 个 聚 氮 基 酸 (多 肽 ) 组 成 的 多 聚 体 ， 一 个 氨基 酸 可 以 看 做 是
与 一 个 羧基 、 一 个 氨基 和 一 个 侧 链 (R) 连 在 一 起 的 单个 碳 原 子 〈a 碳 原 子 )， 这
些 侧 链 一 般 是 碳 链 或 碳 环 。 多 种 功能 基 团 可 与 这 些 侧 链 相 接触 。 最 简单 的 侧 链 是
甘氨酸 的 羟基 和 丙 氢 酸 的 甲 基 。 组 成 蛋 白 质 的 20 种 氨基 酸 中 ， 只 有 且 氨 酸 在 基
本 化 学 结构 上 不 同 于 一 般 的 氨基 酸 。 在 且 氨 酸 中 ， 氮 原子 包括 在 环 中 ， 恰 当地
说 ， 且 氨 酸 是 一 种 亚 氨基 酸 。 由 于 且 氨 酸 的 特殊 结构 ， 使 它 可 以 引导 多 肽 链 拐
弯 ， 从 而 使 接近 且 氨 酸 的 地 方 明显 地 影响 四 白质 的 三 维 结构 。

一 个 氨基 酸 的 氨基 可 以 与 另 一 氨基 酸 的 羧基 反应 形成 二 肽 ， 两 个 氨基 酸 之 间
形成 的 这 种 键 叫 肽 键 。 多 个 氨基 酸 被 连续 地 连接 在 一 起 ， 形 成 一 条 线 状 多 肽 链 。
一 般 肽 键 数 目 超过 15 个 时 ， 此 多 肽 就 可 以 称 为 蛋白 质 。 蛋 白质 也 可 由 几 个 多 肽
链 聚 集 而 成 。 一 个 归 白 质 是 一 个 多 聚 体 ， 在 该 多 聚 体 中 ， 碳 原子 和 肽 单位 交 蔡 形
成 一 个 带 侧 链 的 有 序 排 列 的 线 状 链 ， 这 个 线 状 链 称 为 该 分 子 的 骨架 。 每 个 蛋白 质

- 汪 好 -

分 子 的 两 个 末端 的 性 质 是 截然 不 同 的 ， 一 端 有 一 自由 的 一 NEH， 称 为 N 端 ， 另
一 端 有 一 自由 的 羧基 ， 称 为 C 端 ， 这 两 个 不 同 的 末端 也 常 被 分 别称 为 N 末端 和
C 末 端 。

氨基 酸 侧 链 之 间 常 以 非 共 价 键 结 合 ， 但 半 胱 氨 酸 的 一 SH 基 是 个 例外 。 一 SH
常 与 另 一 个 相同 或 不 同 的 多 肽 链 中 半 胱 氨 酸 的 一 SH 反应 形成 二 硫 键 〈(S 一 S)，
这 对 决定 一 个 蛋白 质 的 三 维 结构 很 重要 。 许 多 蛋白 质 含 有 其 氨基 酸 侧 链 基 团 复合
物 中 整合 的 金属 离子 ， 如 : Zn 、Cuo + 和 Fe ， 这 些 金属 离子 常常 结合 在 组 氢
酸 和 谷 氢 酸 上 。

2. 核酸

核酸 是 核 苷 酸 的 多 聚 体 。 每 个 核 苷 酸 均 含 有 以 下 三 种 成 分 。

环 状 五 碳 糖 ， 有 核糖 和 脱氧 核糖 ， 核 糖 存 在 于 核糖 核酸 (RNA) 中 ， 脱 氧
核糖 存在 于 脱氧 核糖 核酸 (DNA) 中 。 这 两 种 核糖 的 区 别 在 于 脱氧 核糖 2 - 碳 原
子 上 的 一 OH 基 被 脱 了 氧 ， 只 剩 H。 这 个 区 别 使 得 DNA 比 RNA 更 具 化 学 稳定
性 。

核糖 的 二 - 碳 原 子 上 通过 N- 糖 苷 键 连接 有 了 味 叭 或 喀 喧 碱 基 。RNA 中 有 四 种
碱 基 ，A (adenine)、U (uracil) 、G (guanine) 和 C (cytosine)，DNA 中 的 四 种
碱 基 是 : A、G、C 和 T 工 (thymine)。RNA 和 DNA 都 售 有 A、G 和 C， TU 只 在
RNA 中 ， 而 工具 在 DNA 中 ， 但 此 规则 也 有 极 罕见 的 例外 ， 如 一 些 迟 NA 分 子 中
含有 T， 而 极 少数 噬菌体 ， 其 DNA 中 含 U 而 不 含 T。

核糖 的 $ - 碳 原子 上 通过 磷酸 二 酯 键 连接 有 磷酸 基 团 ， 这 些 基 团 使 核酸 和 核
苷 酸 携带 强大 的 负电 和 荷 。

核糖 连接 上 碱 基 就 叫 核 苷 (nucleoside)， 核 苷 再 磷酸 化 后 叫 核 苷 酸 (nu-
cleotide)。 核 酸 中 的 核 苷 酸 的 连接 方式 是 一 个 核 苷 酸 的 $ - 酸 和 另 一 核 苷 酸 中 的
3 -OH 形成 第 二 个 磷酸 酯 键 而 共 价 连接 ，3 和 5 - 碳 原子 上 的 磷酸 都 是 酯 化 的 ，
这 样 的 单位 帝 被 称 为 磷酸 二 酯 基 团 (phosphodiester group )。

叶 吟 和 喀 啶 碱 基 彼 此 之 间 不 形成 任何 共 价 键 ， 因 此 ， 一 个 多 核 苷 酸 含有 一 条
糖 与 磷酸 交替 出 现 的 骨架 ， 这 一 骨架 具有 一 个 3-OH 末端 和 一 个 $-P 末 端 ; 在
实验 室 里 可 制备 3-P 末 端 和 5 -OH 未 端的 多 核 苷 酸 。

3. 多 糖

多 糖 是 糖 〈 最 常见 的 是 葡萄 糖 ) 或 糖 的 衍生 物 的 多 聚 体 ， 多 糖 是 很 复杂 的 分
子 ， 因 为 有 时 在 许多 对 碳 原子 之 间 可 能 会 产生 共 价 键 ， 这 样 就 产生 了 一 个 糖 单位
与 两 个 以 上 的 其 他 糖 单位 连接 在 一 起 的 效应 ， 结 果 将 会 形成 高 度 分 支 的 大 分 子 ，
这 些 分 支 结 构 有 时 很 庞大 ， 甚 至 用 显微镜 就 可 以 观察 到 。 例 如 ， 许 多 细菌 和 植物
细胞 的 细胞 壁 就 是 由 单个 庞大 的 多 糖分 子 构成 的 。
， 8 ，

4. 脂 类

许多 脂 类 由 较 小 的 单位 组 成 ， 它 们 参与 许多 大 分 子 的 装配 。 上 自然 界 中 的 脂 类
是 难 溶 于 水 的 碳 氢 化 合 物 ， 它 们 可 以 储存 或 转移 能 量 ， 并 且 是 组 成 膜 、 保 护 性 外
鞘 及 其 他 细胞 结构 的 重要 组 分 。 甘 油 酯 是 由 一 个 到 三 个 饱和 或 不 饱和 脂肪 酸 与 1
分 子 甘油 以 酯 键 相连 而 成 。 动 物 中 的 脂肪 中 包含 的 饱和 脂肪 酸 是 固体 形式 ， 而 植
物 中 的 是 不 饱和 脂肪 酸 ， 是 液体 形式 。 膜 中 含有 脂 、 鞘 脂 及 鞘 磷脂 。

二 、 决 定 蛋白 质 和 核酸 三 维 结构 的 非 共 价 相互 作用

大 分 子 的 生物 学 性 质 主要 是 由 非 共 价 的 相互 作用 来 决定 的 。 这 些 作 用 的 结果
使 每 个 分 子 获 得 独特 的 三 维 结构 。

1. 无 规则 线 团

线 状 多 肽 链 和 核酸 链 含有 多 种 键 ， 这 些 键 中 ， 有 的 可 以 自由 旋转 ， 在 不 存在
任何 链 内 相互 作用 的 情况 下 ， 每 个 氨基 酸 或 核 苷 酸 将 是 自由 旋转 的 。 这 种 自由 旋
转 只 受到 原子 不 能 占据 同一 空间 的 限制 。 像 这 样 一 种 链 的 三 维 构 象 就 叫 无 规则 线
团 〈random coil)， 它 们 是 稍 有 点 紧密 的 球形 结构 ， 这 种 结构 由 于 受到 溶剂 分 子
的 不 停 的 碰撞 而 不 断 改变 其 形状 。

核酸 和 蛋白 质 在 天 然 状 态 下 几乎 不 存在 无 规则 线 团 ， 因 为 组 成 核酸 和 人 蛋白质
中 的 这 些 链 的 各 因素 之 间 存 在 许多 相互 作用 。 这 些 相互 作用 包括 氢 键 、 玻 水 相互
作用 、 离 子 键 以 及 范 德 华 作 用 等 ， 例 如 ， 多 肽 链 具 有 所 有 这 四 种 类 型 的 相互 作
用 ， 又 如 ， 核 酸 的 碱 基 之 间 可 通过 和 氢 键 和 下 水 作用 相互 吸引 ， 但 如 果 它 们 具有 同
一 种 电荷 ， 它 们 之 间 就 会 互相 排斥 。

2. 氢 键

生物 系统 中 常见 的 氢 键 如 下 ;

AH

加 ORDERNR HOC 一 OO 一 G 则 二 加 和 NS 而 站 N

9 请

其 中 的 氨 键 是 由 两 条 链 之 间 两 个 配对 的 核 苷 酸 碱 基 之 间 形 成 的 。 在 双 链
DNA 中 ， 氢 键 相 互 作用 是 维持 DNA 双 螺 旋 结 构 的 主要 因素 。 在 蛋白 质 中 连接 在
一 个 肽 键 上 的 一 个 亚 氨基 上 的 氧 原子 和 相 邻 的 连接 在 不 同 肽 键 上 的 氧 原子 之 间 的
氢 键 相互 作用 可 以 产生 好 几 种 特定 的 多 肽 构象 。

3. 下 水 相互 作用

下 水 相互 作用 是 指 两 个 微 溶 于 水 的 分 子 或 分 子 的 某 些 部 分 之 间 的 相互 作用 。
难 溶 于 水 的 两 个 分 子 〈 可 能 是 两 个 不 同 的 分 子 ) 趋向 于 缔 合 。 这 个 现象 可 以 简单
地 解释 为 ， 水 分 子 相互 形成 氢 键 ， 一 个 分 子 如 果 能 与 水 形成 氨 键 ， 该 分 子 就 可 溶
于 水 。 而 相互 形成 氢 键 的 水 分 子 可 以 在 不 溶 于 水 的 分 子 周 围 形成 一 层 “ 壳 ”
(shell)， 水 的 有 序 化 在 热力 学 上 降低 了 和 值 。 两 个 不 溶 于 水 的 分 子 将 分 别 形成 两
个 这 样 的 “ 壳 ”， 如 果 这 两 个 分 子 接触 ， 那 么 单个 水 “ 壳 ” 将 围 住 这 两 个 分 子 ，
由 于 严格 的 几何 学 原因 ， 这 个 围绕 一 对 分 子 的 水 “ 壳 ” 将 是 围绕 一 个 分 子 的 那 两
个 水 “ 帝 ” 所 需 有 序 水 分 子 的 数目 的 将 近 二 倍 。 一 般 来 说 ， 如 果 微 溶 于 水 的 分 子
相 接触 ， 那 么 ， 每 个 溶质 分 子 的 有 序 水 分 子 的 平均 数目 总 是 比 原来 少 的 。 因 此 ，
微 溶 于 水 的 分 子 成 复 是 符合 热力 学 原则 的 。 这 种 成 篮 的 趋势 叫做 蓝 水 相互 作用 。
在 梳 水 作用 中 是 没有 键 形成 的 ， 只 是 更 有 可 能 成 戏 ， 或 者 换 句 话说 ， 所 有 的 分 子
包括 溶剂 和 溶质 的 无 序 排列 的 箭 值 是 比 有 序 排列 的 箭 值 大 的 。

核酸 和 有 时 白质 的 许多 成 分 都 有 芯 水 性 质 ， 例 如 ， 核 酸 的 碱 基 是 局 部 携带 弱电
荷 的 平面 有 机 环 ， 这 些 局 部 的 弱电 荷 足 以 维持 溶解 性 ， 可 是 ， 那 些 大 的 难 溶 于 水
的 有 机 环 部 分 会 引起 水 分 子 有 序 化 ， 因 此 碱 基 趋 向 于 成 复 ， 最 有 效 的 成 复 类 型 是
碱 基 堆 积 。 因 碱 基 在 链 中 是 相 邻 的 ， 所 以 堆积 使 多 聚 核 苷 酸 单 链 刚性 ， 使 之 趋向
于 伸展 态 而 不 至 于 形成 无 规则 线 团 。 碱 基 堆 积 是 决定 核酸 结构 的 重要 因素 。 许 多
氨基 酸 侧 链 是 难 溶 的 ， 这 会 引起 葵 丙 氨 酸 的 葵 环 堆积 ， 丙 氨 酸 、 亮 氢 酸 、 蜡 亮 氢
酸 和 细 氢 酸 中 烃 链 将 形成 紧密 的 非 堆积 能 : 由 于 这 些 氨基 酸 不 一 定 是 相 邻 的 ， 因
此 朴 水 相互 作用 会 趋 于 把 一 个 多 肽 链 上 远离 的 下 水 部 分 聚 到 一 起 。

4. 离子 键

离子 键 是 不 相同 的 电荷 之 间 相 互 吸引 的 结果 ， 者 干 氨基 酸 侧 链 已 经 离子 化 ，
带 负 电荷 的 羧基 基 团 〈 门 冬 氨 酸 和 谷 氨 酸 ) 和 带 正 电 符 的 氨基 基 团 〈 赖 氨 酸 、 门
冬 酰 氮 和 精 氨 酸 ) 可 以 形成 离子 键 ， 也 趋向 于 将 链 中 远离 部 分 聚 到 一 起 。 离 子 相
互 作用 也 可 以 是 排斥 的 ， 如 两 种 相同 的 电荷 之 间 。 离 子 键 是 非 共 价 相 互 作用 中 最
强 的 一 种 ， 然 而 离子 键 可 被 极端 pH 所 破坏 ， 因 为 pH 可 改变 基 团 的 电荷 ， 同 时 ，
离子 键 也 可 以 被 高 浓度 盐 所 破坏 ， 这 些 盐 离子 将 带电 基 团 保护 起 来 ， 使 它们 之 间
不 能 形成 离子 键 。

5. 范 德 华 5 | 力

范 德 华 引 力 存在 于 所 有 分 子 之 间 ， 它 们 是 长 期 偶 极 子 和 电子 环流 的 结果 。 两
个 原子 之 间 的 吸引 力 相 当 于 1/“， 其 中 ，> 是 两 原子 核 之 间 的 距离 ， 所 以 这 种
吸引 是 很 弱 的 力 ， 而 且 只 有 当 两 个 原子 核 很 近 时 (1 一 2A) 才 会 明显 ， 如 果 两 个
1 0O7，

外 电子 层 重 夺 ， 那 么 将 会 有 一 个 强 有 力 的 推 斥 力 起 作用 。 范 德 华 半 径 〈Van der-
Waals radius) 是 吸引 力 和 排斥 力 精 确 地 达到 平衡 时 的 两 原子 核 之 间 的 距离 。 原
子 的 范 德 华 半径 各 不 相同 ， 如 ;

原子 半径 (A)

瑟 光
O 1 .4
N 1 本
号 :85
已 是
C 区 才

两 个 原子 之 间 的 相互 作用 常常 不 足以 抵抗 原子 的 热 运动 能 ， 但 如 果 一 个 分 子
中 两 个 分 开 的 区 域 形 状 准确 互补 ， 那 么 ， 多 个 原子 的 者 干 部 分 之 间 的 范 德 华 相互
作用 就 可 以 将 它们 保持 在 一 起 。 维 持 一 个 分 子 的 三 维 结构 稼 常 是 多 种 弱 的 相互 作
用 同时 起 作用 。

三 、 研 究 生物 大 分 子 的 基本 方法
1. 速度 沉降
沉降 系数 (sedimentation coefficient，S)， 大 多 数 大 分 子 的 S 值 为 1xX10-3 一
100Xx10- 983s 之 间 ， 因 为 Svedberg 发 明了 超 离 心 ， 所 以 将 10 93s 叫做 1 个 Sved-

berg， 即 一 个 S。 这 在 分 子 生物 学 中 被 普遍 应 用 ， 例 如 ， 一 个 分 子 的 S 值 是 30
个 Svedberg， 该 分 子 就 是 一 个 30S 的 分 子 。

2. 区 带 离心

区 带 离心 〈(zonal centrifugation) 是 用 和 蔗糖， 偶尔 也 用 甘油 或 其 他 溶液 制备 梯
度 ， 也 常 被 称 为 蔗糖 梯度 离心 (sucrose graduation centrifugation ) 。

3. 平衡 离心

在 密度 梯度 中 平衡 离心 (equilibrium centrifugation)， 用 CsCl 制 成 梯度 ， 离
心 至 平衡 时 ， 不 同 密度 的 分 子 就 停留 在 自己 的 密度 处 ， 形 成 不 同 的 带 ， 因 而 可 以
分 离 不 同 的 分 子 。

4. 电泳
分 子 生 物 学 中 用 的 最 多 的 方法 是 凝 胶 电 泳 (〈elecectrophoresis)。

S. 电镜 观察

用 电镜 (electronmicroscopy) 可 以 观察 某 些 生物 大 分 子 并 测定 这 些 生物 大 分
子 的 相对 分 子 质量 。

四 、 生 物 大 分 子 的 分 子 质量 则 定
1. DNA 的 分 子 质 量 测定

凝 胶 电泳 法 最 适合 用 于 分 子 质量 小 于 5$x105Da 的 DNA 分 子 质量 的 测定 。 该
方法 是 用 已 知 分 子 质 量 的 DNA 分 子 作为 标准 样品 ， 电 泳 后 根据 分 子 质量 和 迁移
率 的 关系 ， 做 出 标准 曲线 ， 再 根据 目的 样品 DNA 的 迁移 率 ， 算 出 其 分 子 质量 。

中 等 大 小 的 DNA 分 子 的 分 子 质量 (5x 105 一 100x 105Da) 测定 最 好 用 电镜
法 。 根 据 双 链 DNA 分 子 的 长 度 和 分 子 质量 的 关系 (lunm 相当 于 2x10%Da)， 可
在 电镜 照片 上 量 出 分 子 长 度 再 计算 其 分 子 质量 。

大 的 DNA 分 子 的 分 子 质 量 (>100x 105Da) 测定 最 好 用 速度 沉降 法 ， 即 测
ES = 耻

2. 蛋白 质 的 分 子 质量 出 定

对 和 蛋白质 的 分 子 质量 测定 最 方便 的 方法 是 SDS- 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 〈SDS-
PAGE)。

第 二 节 DNA 的 结构 和 性 质

脱氧 核糖 核酸 (DNA) 是 活 细胞 中 最 重要 的 分 子 ， 它 含有 特定 细胞 的 全 部
遗传 信息 。 而 核糖 核酸 (RNA) 除了 作为 某 些 病毒 的 遗传 物质 外 ， 主 要 是 执行
其 他 一 些 重要 的 生物 学 功能 。

一 、DNA 的 基本 结构
1. 双 螺 旋 结 构 是 DNA 的 基本 结构

早期 对 DNA 的 研究 和 各 种 实验 表明 ，DNA 分 子 是 一 个 长 的 高 度 有 序 的 结
构 。 通 过 X 射线 衍射 分 析 ， 得 知 了 关于 DNA 分 子 的 各 个 部 分 的 大 小 和 排列 ， 观
察 到 分 子 是 螺旋 形 的 ， 核 苷 酸 碱 基 是 平面 堆积 ， 两 个 碱 基 之 间 的 距离 是 3.4A。
化 学 分 析 证 明 ，DNA 分 子 含 腺 味 哈 (adenine，A)、 马 叶 吟 (guanine，C)、 胸 腺
喀 啶 (thymine，T) 和 胞 旷 啶 (cytosine，C)。 四 种 碱 基 的 比 是 A=T，G=C。
James Watson 和 Frances Crick 结合 物理 和 化 学 数据 ， 根 据 X 射线 衍射 照片 ， 设
. 训 浊 多

想 DNA 分 子 是 两 条 链 互相 缠绕 在 一 起 ， 形 成 一 个 双 螺 旋 。 在 这 个 模型 里 ， 核 糖 -
磷酸 的 骨架 在 分 子 的 外 侧 按 螺旋 方式 排列 ， 碱 基 则 伸 向 双 螺旋 的 内 部 。 一 条 链 的
碱 基 与 另 一 条 链 同一 平面 上 的 碱 基 通过 氢 键 形成 味 叭 - 喀 喧 碱 基 对 ， 即 AT 和 G-
C。 由 于 碱 基 对 中 均 含 有 双环 的 味 叭 (A 和 G) 和 单 环 的 喀 啶 (T 和 C)， 所 以 ，
每 个 碱 基 对 的 长 度 是 接近 一 致 的 。 每 个 碱 基 对 中 的 碱 基 在 同一 平面 上 ， 并 且 与 双
螺旋 的 轴 垂 直 。 相 邻 的 碱 基 对 以 36" 旋 转 ， 每 个 螺 圈 有 10 个 碱 基 对 ， 双 螺旋 两 条
链 之 间 的 距离 是 20A， 分 子 质 量 为 2x 105Da/pm。

DNA 双 螺旋 有 两 个 槽 沟 ， 一 个 大 沟 (major groove) 和 一 个 小 沟 (minor
groove)， 这 些 槽 沟 足 以 允许 蛋白 质 分 子 进 入 ， 与 碱 基 接 触 。 碱 基 配 对 是 DNA 的
一 个 重要 性 质 ， 它 意味 着 两 条 链 的 碱 基 顺序 互补 ， 这 就 暗示 了 DNA 的 复制 机
制 ， 因 为 复制 时 只 要 合成 互补 链 就 行 了 。

DNA 双 螺 旋 的 两 条 链 是 反 向 平行 的 〈 图 2-1)。 反 向 平行 有 两 重 含义 ， 其 一
是 双 螺 旋 分 子 的 每 一 端 都 有 一 3 -OH 末端 和 一 $-P 末 端 ， 其 二 是 两 条 链 的 走向
不 同 ， 双 链 的 走向 不 同 是 指 两 条 链 上 的 糖 环 的 方向 不 同 。 一 般 书写 时 ，5“-P 在 左
边 ， 如 Patcg-3 -OH， 也 常 写 为 bpApTpCpG……'。

图 2-1 DNA 的 两 条 互补 链 反 向 平行

不 同 生 物 DNA 碱 基 组 成 不 同 ， 测 定 某 种 生物 的 碱 基 组 成 通常 所 用 的 方法 是
测 G+ C/ 总 碱 基 的 碱 基 上 比率。 这样 测 定 的 G+C 含量 对 高 等 生物 来 说 一 般 变化 不
大 ， 在 50% 左 右 ， 不 同 种 之 间 变 化 在 49% 一 51% 。 而 对 低 等 生物 ，G+ C 含量 变
化 很 大 ， 如 细菌 中 ， 腾 毛 属 梭 状 芽孢 杆菌 〈genas clostridizx ) G+C 含量 极 低 ，
只 有 27%， 而 腾 毛 属 八 释 球 菌 〈genzws sarciz ) G+C 含量 达 76%。 大 肠 杆 菌 中
G+C 含 量 为 30%。 用 CsCl 平衡 梯度 离心 可 以 很 便利 地 测定 一 种 生物 DNA 的
G+C 含量 ， 因 为 在 CsCl 溶液 中 ，DNA 的 密度 与 G+C 的 含量 成 线性 关系 。

一 般 天 然 的 DNA 都 是 经 典 的 Watson-Crick 结构 ， 即 右手 螺旋 结构 ， 但 在 某

ee 13

些 条 件 下 ，DNA 分 子 具 有 左手 螺旋 形式 ， 在 天 然 条 件 下 DNA 分 子 中 也 有 某 些 区
域 明 显 是 左手 螺旋 。

湿度 不 同 对 DNA 的 结构 也 有 影响 。 在 相对 湿度 为 66% 时 ，DNA 为 A 型 。
相对 湿度 为 92% 时 ，DNA 为 B 型 。A 型 DNA 每 螺 圈 为 11 个 碱 基 对 ， 碱 基 平 面
不 是 垂直 于 双 螺 旋 的 轴 而 是 倾斜 20"。B 型 DNA 是 右手 螺旋 即 经 典 的 Watson-
Crick 结构 。 左 手 螺 旋 DNA 即 ZDNA 每 螺 圈 有 12 个 碱 基 对 ， 而 且 ZDNA 双 螺
旋 只 有 一 个 槽 沟 (图 2-2)。

图 2-2 ”核酸 可 以 形成 几 种 形式 的 螺旋

不 同 种 类 的 生物 ， 基 因 组 大 小 不 同 。 在 病毒 和 原核 生物 中 ， 某 种 病毒 或 细胞
的 整个 基因 组 是 由 一 条 DNA 分 子 缠绕 而 成 (RNA 病毒 除外 )。 在 真 核 生物 中 ，
包括 单 细 胞 生物 如 藻类 、 酵 母 和 原虫 ， 它 们 的 DNA 是 组 成 一 定数 目的 染色 体 ，
每 条 染色 体 由 一 条 巨大 的 DNA 分 子 组 成 ， 不 同 DNA 分 子 的 长 度 范 围 从 0.7pm
到 40 000pm (4cm)。

一 般 来 说 越 复 杂 的 生物 基因 组 越 大 ， 越 简单 的 生物 其 基因 组 越 小 (但 toad
蟾 肾 和 南美 洲 肺 鱼 基 因 组 比 人 的 还 大 ， 这 是 例外 )。

DNA 分 子 的 长 和 宽 的 比 是 107:1， 所 以 很 细 很 长 ， 因 此 在 分 离 提 取 DNA 时 ，
移 液 、 倾 倒 溶 液 和 混合 溶液 均 易 使 DNA 分 子 断 裂 ， 操 作 要 特别 小 心 。

从 细菌 中 提取 的 DNA 总 是 断裂 的 ， 断 裂 后 的 平均 分 子 质量 为 2.5x 10"Da，
从 高 等 动 植物 中 分 离 的 DNA 不 断裂 的 现象 很 少见 。 用 一 标准 DNA 和 提取 的
DNA 同时 电泳 ， 可 以 检查 提取 过 程 中 DNA 断裂 的 程度 。

2. 决定 DNA 结构 的 因素

在 同一 条 链 中 ，DNA 的 螺旋 结构 由 碱 基 堆积 决定 ，DNA 的 双 螺 旋 结 构 由 配
对 碱 基 间 的 氢 键 决定 。 以 下 实验 结果 可 以 证 明 这 些 结论 。
w 并 4

(1) 变性 和 熔 解 曲线

核酸 对 紫外 光 的 吸收 量 由 其 结构 决定 ， 分 子 排列 越 趋 于 有 序 ， 吸 收 紫 外 光 的
量 越 少 ， 因 此 可 以 利用 紫外 吸收 的 性 质 来 测定 DNA 的 含量 。 单 链 、 双 链 和 上 自由
碱 基 的 A6o 吸 收 值 不 同 。50wg/ml DNA 溶液 测 得 的 Azo 吸 收 值 分 别 为 : 双 链
DNA Ap0=1.00; 单 链 DNA Apo=1.37; 自由 碱 基 A;6o=1.60。

双 链 DNA 缓慢 加 热 ， 其 溶液 对 紫外 光 的 吸收 值 增加 ， 叫 增色 效应 (hyper-
chromic)， 而 单 链 DNA 缓慢 降温 ， 其 对 紫外 光 吸 收 值 减 少 ， 叫 减 色 效应
(hypochromic)。 加 温 使 DNA 变性 时 ， 其 紫外 光 吸 收 值 达 最 大 值 的 一 半 时 的 温度
叫 熔 链 温度 (melting temperature，T。)。

将 双 链 DNA 缓慢 加 热 ， 不 同时 间 取 样 测 Az6o 吸 收 值 可 制 得 该 DNA 的 熔 解
曲线 (图 2-3)。 这 种 曲线 反映 了 随 着 DNA 结构 的 变化 ， 其 对 紫外 光 的 吸收 会 不
断 增加 。 说 明 加 热 破 坏 了 原来 维持 DNA 双 螺 旋 结 构 的 因素 〈 氢 键 和 碱 基 堆积 )。

140
130

120

相对 的 4 值

110

100

30 50 70

90 _100 -10

图 2-3 DNA 分 子 的 Tu 值 和 不 同 程度 解 链 的 DNA 分 子 的 可 能 构 型

(2) DNA 中 存在 氨 键 的 证 据

从 不 同 生 物 中 分 离 的 DNA 其 G+C 含量 差异 很 大 ， 可 以 从 20% 到 80%。 用
这 些 不 同 的 DNA 做 变性 曲线 ， 发 现 G+ C 含量 高 的 ， 其 T， 值 也 高 。 已 知 DNA
双 螺 旋 的 稳定 因素 是 碱 基 对 中 的 氢 键 ， 由 于 G、C 之 间 是 三 个 氢 键 ， 而 A、T 之
间 是 两 个 氢 键 ， 所 以 打破 G、C 之 间 的 氢 键 比 打破 A、 工 之 间 的 氢 键 需要 的 能 量
要 高 ， 因 此 G、C 含量 高 的 DNA 其 T。 值 也 高 (图 2-4)。

站
尿素 〈( HN--C 一 NH ) 和 甲 酰胺 ( HN--C 一 百 ) 这 两 种 物质 加 到 DNA
四 15$ 。

0.1Smol/L NaCl

0.015 molL 柠檬 酸 钠

(G+C) 含量 /%

70 80 90,j il00e jlO
人 人 值 ACE

图 2-4 不 同 DNA 分 子 的 G+C 含 量 及 其 对 应 的 工 , 值

溶液 中 可 以 降低 DNA 的 Ta 值 。

这 两 种 物质 可 以 和 DNA 中 的 碱 基 形 成 氢 键 。 实 际 上 DNA 中 的 碱 基 对 之 间
的 氢 键 是 处 于 断 开 和 重新 形成 的 动态 平衡 状态 。 在 DNA 溶液 中 加 入 上 述 试剂 的
一 种 ， 即 可 与 处 于 氢 键 断 开 状态 的 碱 基 形 成 氢 键 ， 因 此 ， 这 个 碱 基 不 能 再 与 另 一
条 链 中 的 碱 基 配 对 ， 这 部 分 碱 基 即 处 于 熔 链 状态 ， 因 而 DNA 变性 处 理 时 所 需要
输入 的 能 量 就 少 ， 其 Tu 值 就 降低 。 事 实 上 ， 所 有 能 和 碱 基 形 成 氢 键 的 物质 均 能
降低 DNA 的 Ta 值 。

(3) DNA 中 存在 鸡 水 相互 作用

朴 水 反应 (hydrophobic reaction) 是 两 种 微 溶 于 水 的 物质 或 疏水 物质 分 子 间
的 反应 。DNA 分 子 间 的 反应 就 是 芷 水 反应 。

如 果 一 种 溶剂 能 加 强 弱 的 可 溶性 物质 与 水 的 相互 作用 ， 或 能 打破 该 物质 外 面
的 “水 壳 ”， 那 么 就 会 降低 疏水 相互 作用 ， 则 Tu 值 也 降低 。 如 甲醇 能 增加 碱 基
的 溶解 度 ， 三 氟 醋 酸 钠 盐 可 以 打破 DNA 分 子 外 的 “水 壳 "， 当 在 DNA 溶液 中 加
入 上 述 任何 一 种 物质 时 ， 都 能 使 DNA 的 Tu 值 大 大 降低 (图 2-53)。 因 此 推断 牙
水 相互 作用 也 是 关于 DNA 结构 稳定 的 一 个 重要 因素 。

(4) 碱 基 堆 积

用 旋光 色散 (opticalrotatorydispersion，ORD) 和 圆 二 色 (circulardichroism )
技术 分 析 单 链 DNA 和 RNA， 证 明 其 碱 基 排 列 在 螺旋 里 ， 即 使 在 一 个 二 核 苷 酸
里 ， 碱 基 也 是 平行 排列 的 ， 所 以 推断 即使 在 一 个 小 小 的 DNA 分 子 中 ， 也 存在 碱
基 堆 积 ， 双 链 DNA 中 的 碱 基 堆积 比 单 链 DNA 中 要 多 。 由 于 双 链 DNA 中 有 和 氧
键 ， 氢 键 和 碱 基 堆 积 是 相辅相成 的 ， 从 而 使 DNA 结构 稳定 。

碱 基 堆 积 本 身 也 是 一 种 协同 作用 。 在 碱 基 堆 积 中 ， 处 于 中 间 的 碱 基 比 处 于 两
边 的 碱 基 要 稳定 ， 两 边 的 碱 基 越 多 ， 中 间 的 碱 基 越 稳 定 。 线 状 双 链 DNA 分 子 的

“加 fa。

0.1 mol/L
三 氟 栈 酸 钠

人

7
0 南 o] 并 / 4mol 人 L
《氧化 负

0.01 moT/L

在 波长 260 nm 的 吸收 值

65 70 75a 180 8S5 90Ph950 TO 05
温度 /C

图 2-5 氧化 钠 和 三 氟 醋 酸 钠 对 DNA 深 链 温 度 的 影响 对 比
两 端 常 没有 氢 键 ， 有 7 个 没有 配对 的 碱 基 处 于 游离 状态 。 少 于 1$bp 的 双 链 DNA

片段 ， 其 T。 值 特 别 低 。 只 含 3bp 的 DNA 片段 在 室温 下 不 稳定 。 中 间 只 有 很 短
的 配对 区 而 两 侧 是 非 配对 区 的 DNA 分 子 在 生理 条 件 下 不 能 保持 其 构 型 (图 2-6)。

很 不 稳定

碱 基 顺 序 不
互补 的 区 域

图 2-6 ” 碱 基 堆 积 的 协同 作用

(5) 溶液 的 离子 强度 对 DNA 结构 的 影响

DNA 分 子 两 条 链 之 间 及 其 相 邻 的 碱 基 之 间 有 吸引 力 ， 此 外 ， 由 于 DNA 分 子
两 条 链 上 的 PO ” 带 负电 荷 ， 所 以 DNA 分 子 之 间 存 在 排斥 力 ， 这 些 负电 荷 如 不
被 中 和 ， 强 大 的 排斥 力 将 使 链 分 离 。 例 如 ，DNA 的 Tu 值 由 于 缓冲 液 的 离子 浓

sf 人

度 不 同 而 不 同 。 在 室温 下 ， 随 盐 离 子 浓度 的 下 降 DNA 的 稳定 性 会 降低 ， 其 T。
值 也 降低 。DNA 在 双 蒸 水 中 室温 下 可 以 变性 。 加 入 NaCl，Na+ 可 以 中 和 PO3-
的 负电 荷 ， 使 其 不 再 排斥 ， 因 而 一 定 的 离子 强度 使 DNA 稳定 。 在 生理 盐水 中
DNA 就 处 于 这 种 状态 。 在 高 盐 浓 度 下 ，DNA T,。 值 升 高 。 高 盐 降 低 了 碱 基 的 洲
解 度 ， 增 加 了 下 水 相互 作用 。

很 多 证 据 证 明 ，DNA 结合 阳离子 ， 如 DNA 的 钠 盐 与 DNA 的 饮 盐 分 子 质量
不 同 : NaDNAVCSDNA=0.75。

生理 条 件 下 的 DNA 双 链 常 处 于 打开 而 形成 单 链 的 breathing 状态 。 甲 醛 能 和
碱 基 上 的 一 NEH2 起 反应 ， 使 碱 基 之 间 不 再 形成 氢 键 。 在 DNA 溶液 中 加 入 甲醛 ，
可 以 引起 DNA 缓慢 的 不 可 逆 变 性 (图 2-7)。 与 甲醛 反应 的 氨基 必须 处 于 自由 状
态 ， 这 说 明了 碱 基 之 间 的 氢 键 是 处 于 断 开 和 重新 形成 的 动态 平衡 之 中 。breathing
结构 多 出 现在 A:T 富 集 区 而 不 出 现在 G'C 富 集 区 。

1.5

0 24
时 间 巾

图 2-7 在 4% 的 甲醛 溶液 中 ，DNA 的 A;6 光 吸收 增加

DNA 溶 液 的 某 些 物 理性 质 的 改变 ， 例 如 黏度 和 旋转 偏振 光 能 力 的 降低 等 ，
随 着 变性 过 程 的 发 生 ， 常 常会 发 生 DNA 的 氢 键 和 朴 水 作用 消失 、DNA 螺旋 结构
受到 破坏 且 分 子 失去 刚性 。 这 些 规 则 结构 的 瓦解 常会 伴随 着 双 链 的 完全 解 开 。 过
去 人 们 曾 认 为 DNA 分 子 太 长 ， 完 全 把 螺旋 松 开 使 两 条 链 分 离 是 不 可 能 的 ， 但 很
多 证 据 清楚 地 表明 DNA 的 两 条 链 确实 可 以 完全 分 离 。

制备 一 条 2NLTYN 杂交 双 链 DNA 分 子 ， 该 分 子 的 密度 等 于 4N YN DNA 和
5NSN DNA 分 子 密度 的 平均 值 ， 把 该 DNA 溶液 加 热 到 不 同 温度 ， 测 Azo 值 ，
得 到 熔 链 曲线 ， 将 每 个 样品 进行 CsCl 密度 梯度 离心 ， 发 现 Az6o 值 恰好 高 于 最 高
值 的 样品 在 CsCl 溶液 中 其 DNA 两 条 链 是 分 开 的 有 两 条 密度 带 (图 2-8)。 在
37 条 件 下 ， 链 分 离 的 速度 为 12 x 107 碱 基 /s。 细菌 DNA 复制 速度 是 108
碱 基 /s， 所 以 链 分 离 不 会 限制 DNA 的 复制 速度 。

在 某 些 条 件 下 ，DNA 可 以 变性 。 有 许多 蛋白 质 能 使 DNA 解 旋 ， 这 些 蛋 白质
被 称 为 松 旋 蛋 白 (relaxation protein)、 螺 旋 降 稳 蛋 白 〈helix-destabilizing protein )

四 18 四

DNA 的 浓度

也 7 下 TAN 7
CsCl 密 度 /(9/cmz )

图 2-8 “通过 CsCl 密度 梯度 离心 ， 4N SN DNA 变性 后 4N SN 链

或 熔 链 蛋白 (melting protein)。 其 中 了 解 得 最 清楚 的 是 一 种 最 简单 的 蛋白 一 一 螺
旋 降 稳 蛋 白 。 由 于 最 早 发 现 是 由 大 肠 杆 菌 T4 鸣 菌 体 32 基因 编码 的 ， 所 以 称 32
二 32 蛋白 有 两 个 重要 特点 可 以 使 DNA 变性 ， 第 一 ， 它 能 与 DNA 单 链 紧密
结合 ; 第 二 ， 蛋 白质 分 子 之 间 有 协同 效应 。 由 于 这 两 个 特点 ，32 蛋白 能 线性 地
排列 在 DNA 单 链 上 并 与 之 紧密 结合 (图 2-9)。 一 旦 有 一 个 32 蛋白 结合 到 DNA
的 breathing 处 ， 它 就 能 与 几 个 碱 基 结 合 。 这 不 仅 给 其 互补 链 提供 了 结合 32 蛋白
的 机 会 ， 而 且 使 它 自 身 结合 链 上 相 邻 的 几 个 碱 基 失 去 稳定 性 ，32 蛋白 不 断 加 入 ，
直到 DNA 分 子 全 部 变性 。 自 身 32 蛋白 对 于 DNA 复制 时 的 解 链 和 遗传 重组 中 的
单 链 入 侵 都 是 必需 的 。

上 _uazrmrm um

图 2-9 32 蛋白 与 DNA 结合 后 使 DNA 变性

DNA 在 碱 性 条 件 下 可 以 全 变性 。DNA 的 螺旋 结构 靠 碱 基 堆 积 维持 ， 氢 键 则
把 两 条 链 拉 在 一 起 。 加 热 可 破坏 上 述 结 构 ， 从 而 使 DNA 变性 。 但 高 温 可 能 也 会

ws 人

破坏 磷酸 二 酯 键 ， 故 加 热 可 能 会 产生 断裂 的 单 链 混合 物 。 在 高 bDH 时 ， 改 变 配 对
碱 基 的 某 些 基 团 的 带电 情况 ， 可 以 使 氢 键 的 形成 受到 阻碍 ， 从 而 使 DNA 全 变
DNA 在 90C 以 上 通常 全 变性 ，Azo 值 增加 37% 。 变 性 DNA 溶液 中 的 DNA
全 部 是 单 链 ， 这 些 单 链 堆积 力 降 低 。 当 变性 的 DNA 溶液 降温 到 室温 ， 在
0.05moVL 左右 的 盐 浓度 下 ， 其 Azo 值 比 变性 温度 时 达到 的 Azoo 值 明显 下 降 ，
一 般 会 降低 到 天 然 DNA A;6 值 的 1.12 倍 。 冷 却 后 大 约 有 三 分 之 二 的 碱 基 重 新 形
成 气 键 或 在 链 内 碱 基 堆 积 从 而 形成 紧密 结 直 构 。 在 低 盐 (<0.0lmolL) 浓度 下 ，
分 子 呈 展 态 ， 很 少 有 氢 键 形成 〈( 图 2-10)。 如 果 在 变性 DNA 溶液 中 加 甲醛 或 保
持 其 高 pH， DNA 的 变性 状态 ， 即 使 在 高 盐 和 室温 下 亦 无 链 内 氢 键 的
形成 和 碱 基 堆 积 。

路 玫

60 70 80
温度 /T

图 2-10“ 链 分 离 后 降温 到 25S 人 ，DNA 分 子 在 高 盐 溶 液 中
链 内 形成 氨 键 ， 在 低 盐 溶液 中 呈 展 态

3. 环 状 超 螺旋 DNA

大 多 数 原核 生物 及 病毒 的 完整 DNA 分 子 都 是 双 链 环 状 的 。 一 个 环 状 DNA
分 子 可 以 是 共 价 闭合 环 DNA (〈covalently closed circle DNA，cccDNA)， 也 可 以 是
切口 环 状 DNA (nicked circle DNA，ncDNA)， 在 DNA 分 子 中 ， 打 开 一 个 磷酸 二
酯 键 就 产生 一 个 切口 (nick)。 共 价 闭合 环 状 DNA 分 子 常 带 形成 超 螺旋 (super-
helix) 或 者 称 其 为 超级 线 团 〈super coil); 超 螺 旋 的 结构 有 两 种 ， 一 种 是 负 超 螺
旋 ， 另 一 种 是 正 超 螺旋 。

负 超 螺旋 (negative superhelix): 形成 超 螺旋 时 ， 旋 转 方 向 与 DNA 双 螺 旋 方

折 20 四

向 相反 ， 旋 转 的 结果 使 DNA 分 子 内 部 张力 减少 ， 称 其 为 松 旋 效应 〈(under-
wound)。 在 自然 条 件 下 的 共 价 闭合 环 状 DNA 呈 负 超 螺 旋 结 构 。

正 超 螺旋 DNA 与 负 超 螺旋 相反 ， 形 成 超 螺旋 时 的 旋转 方向 与 DNA 双 螺 旋
方向 相同 ， 结 果 加 大 了 DNA 分 子 内 部 张力 ， 称 其 为 紧 旋 效应 (overwound)。

超 螺旋 结构 中 存在 单 链 区 ， 这 些 单 链 区 90% 以 上 为 AT 区 ， 它 与 起 始 遗 传
重组 、 起 始 DNA 复制 和 起 始 mRNA 的 合成 有 关 。

用 在 碱 性 pH 下 沉降 的 方法 和 在 含 省 化 乙 锭 的 CsCl 中 平衡 离心 的 方法 可 以
对 共 价 闭合 环 状 DNA 进行 实验 测定 。

在 pH 大 于 11.3 时 ;所 有 和 氢 键 均 断 裂 ，DNA 分 子 松 旋 ， 如 果 是 一 个 切口 环
状 DNA， 那 么 变性 后 将 产生 一 个 线 状 分 子 和 一 个 单 链 环 分 子 ， 该 线 状 分 子 的 S
值 比 此 单 链 环 状 分 子 的 大 14% 。 而 单 链 线 状 DNA 分 子 的 S 值 比 其 天 然 状 态 的 大
30% (在 0.3molyL 或 大 于 0.3molyL 的 盐 溶液 中 )。 共 价 闭 合 环 状 DNA 分 子 由 于
其 两 条 链 不 分 开 ， 因 此 其 S 值 比 天 然 线 状 DNA 分 子 的 S 值 大 两 倍 。

省 化 乙 锭 (ethidium bromide) 能 与 DNA 紧密 结合 ， 并 使 DNA 的 密度 降低
至 接近 0.1$g/em3， 溴 化 乙 锭 插入 到 DNA 分 子 碱 基 对 之 间 ， 当 插入 较 多 时 ， 会
引起 DNA 分 子 松 旋 ; 切口 环 状 和 线 状 DNA 分 子 由 于 不 存在 松 旋 的 拓扑 学 问题 ，
就 能 够 比 共 价 闭 合 环 状 DNA 分 子 结合 更 多 的 省 化 乙 锭 分 子 。 用 足够 量 的 省 化 乙
锭 处 理 这 三 类 DNA 分 子 后 进行 密度 梯度 离心 ， 因 为 共 价 闭合 环 状 DNA 分 子 比
其 他 两 种 分 子 的 密度 都 大 ， 所 以 共 价 闭合 环 状 DNA 分 子 可 在 密度 大 的 区 域 形 成
带 而 与 另 两 类 DNA 分 子 分 开 。

用 电镜 观察 法 、 中 性 pH 沉降 法 和 凝 胶 电 泳 法 都 可 以 对 DNA 的 超 螺旋 性 进
行 实验 测定 。 在 电镜 下 观察 到 DNA 分 子 超 螺旋 的 程度 ， 如 图 2-11 所 示 。

图 2-11 叭 菌 体 PMZ-DNA 分 子 的 切口 环 状 和 超 螺旋 环 状 形式

co 2

不 同 构 型 的 DNA 的 沉降 系数 不 同 ， 环 状 DNA 分 子 比 线 状 DNA 分 子 的 S 值
大 ， 共 价 闭合 环 状 分 子 和 切口 环 状 分 子 有 同样 的 S 值 ， 而 超 螺 旋 分 子 比 其 他 任
何 形式 的 DNA S 值 都 大 。 线 状 分 子 、 非 超 螺旋 环 状 分 子 和 超 螺 旋 分 子 的 相对 S
值 分 别 为 ， 1.00:1.14:1.41。

当 省 化 乙 锭 插入 共 价 闭合 环 状 DNA 分 子 时 ， 在 特定 浓度 下 ， 溴 化 乙 锭 插入
的 DNA 分 子 呈 负 超 螺旋 ， 随 着 省 化 乙 锭 的 不 断 加 入 ， 负 超 螺旋 变 成 松弛 环 状
DNA， 进 一 步 插 入 省 化 乙 锭 ， 从 而 使 松弛 环 状 DNA 变 成 正 超 螺旋 DNA 分 子 ，
使 分 子 密度 更 加 致密 ， 沉 降 速度 再 一 次 加 快 (图 2-12)。

负 超 螺旋 正 超 螺旋

相对 的 沉降 系数

EB 的 浓度

图 2-12 闭合 环 状 DNA 分 子 中 随 着 省 化 乙 狂 的 插入 ，
由 负 超 螺旋 -松弛 环 状 一 正 超 螺旋

超 螺旋 DNA 分 子 在 凝 胶 电 泳 中 比 其 他 类 型 的 分 子 移动 速度 要 快 ， 只 需 相 差
一 个 螺旋 圈 就 可 在 凝 胶 电 泳 中 分 开 。

超 螺旋 的 生物 学 意义 主要 是 : 其 一 ， 超 螺旋 形式 在 DNA 复制 和 转录 中 是 必
须 的 〈 即 在 基因 表达 中 是 必须 的 ); 其 二 ， 它 可 以 使 巨大 的 DNA 分 子 的 体积 缩

Wi
4. 左手 虹 旋 DNA

最 早 在 合成 的 CGCGCG 核 苷 酸 序列 中 发 现 有 旋光 性 。 后 来 发 现 只 要 是 味 叭 -
喀 啶 相间 排列 的 序列 在 高 盐 溶 液 中 就 可 以 表现 出 左旋 形式 。
在 NaCl 泊 度 大 于 2moyL 或 MgCb 浓度 大 于 0.7molL 时 ， 溶 液 中 的 DNA
的 旋光 性 就 会 变 为 左旋 ，X 射线 衍射 分 析 表 明 这 是 一 种 左旋 DNA (Z-DNA)， 此
DNA 产 生 的 条 件 是 呀 吟 - 旷 啶 的 交替 出 现 。
四 2 四

在 一 条 DNA 双 螺 旋 中 ， 只 有 一 段 是 味 叭 - 啶 交替 出 现 ， 因 此 这 一 段 可 以 采
取 ZDNA 形式 ， 而 其 他 区 段 仍 为 BDNA 形式 。 形 成 ZDNA 需要 高 盐 浓 度 的 环
境 。B-DNA 变 成 ZDNA 是 自发 的 ， 故 认为 体内 应 存在 下 DNA， 而 用 免疫 学 方法
证 实 了 果 蝇 染色 体 中 确实 存在 ZDNA。

用 抗体 结合 法 提取 的 动物 病毒 SV40 基因 组 中 的 ZDNA 大 部 分 存在 于 基因
调控 区 ， 特 别 是 存在 于 增强 子 (enhancer) 处 。SV40 基因 组 中 ， 交 替 出 现 的 唆
叭 - 喀 啶 并 不 多 ， 且 均 集 中 在 调控 区 ， 所 以 认为 ZDNA 的 生物 学 意义 是 参与 基因
表达 调控 。

二 、DNA 的 基本 性 质
1. 复 性

变性 DNA 溶 液 用 某 种 方法 处 理 后 ， 使 之 重新 形成 天 然 DNA 的 过 程 叫 做 复
性 或 退火 〈reannealing)。 重 新 形成 的 天 然 DNA 叫 复 性 DNA。

(1) 复 性 的 必要 条 件 和 机 制

复 性 的 发 生 需 要 两 个 必要 条 件 : 四 盐 浓度 必须 高 ， 足 以 使 两 链 之 间 磷 酸 基 团
上 负电 荷 的 排斥 力 消 失 ， 通 常用 0.15$ 一 0.SmoyL 的 NaCl。@ 温 度 必 须 足 够 高 ，
以 防止 链 内 随机 形成 氨 键 。 复 性 的 最 适 温度 比 -Tu 值 低 20 一 2STC 。

复 性 是 一 个 比较 慢 的 过 程 。 实 际 上 重新 缠绕 成 螺旋 这 一 过 程 并 不 限制 复 性 速
度 。 变 性 DNA 的 两 条 互补 单 链 之 间 要 形成 氨 键 ， 必 须 使 配对 的 碱 基 处 于 正确 的
位 置 ， 因 为 在 变性 DNA 溶液 里 两 条 互补 链 是 否 处 于 正确 位 置 是 一 个 随机 的 过
程 ， 所 以 复 性 速度 与 DNA 的 初 浓度 有 关 ， 关 于 这 一 点 将 在 Cot 曲线 中 详细 论述 。

通过 一 个 假设 的 含 多 倍 重 复 序列 的 分 子 可 以 了 解 复 性 的 分 子 细节 。

1A 1B + 和 1D

TAG

ETNEBT GE 党 “下 ACER 钳

假设 每 条 单 链 含 有 50 000 个 碱 基 且 两 条 链 互 补 ， 在 这 样 一 个 DNA 分 子 里 ，
某 一 短 顺序 就 会 提供 许多 配对 位 点 。IA 和 1C 之 间 的 随机 碰撞 将 产生 碱 基 配对 ，
而 两 条 互补 链 之 间 的 随机 碰撞 是 无 效 的 。 但 这 种 情况 是 短暂 的 ， 因 为 周围 那些 短
的 互补 小 片段 不 能 稳定 配对 ， 从 而 不 能 形成 稳定 的 碱 基 堆 积 。 然 而 对 于 1B 和
1D， 这 样 的 顺序 一 旦 形成 配对 ， 整 个 双 链 DNA 分 子 则 可 在 几 分钟 内 形成 。

在 变性 的 DNA 溶液 中 ， 混 合 的 自由 单 链 碰 撞 是 随机 的 ， 每 一 复 性 的 DNA
分 子 并 非 都 是 由 原始 配对 的 互补 链 形成 的 。 随 机 碰撞 也 可 产生 杂交 分 子 。

(2) 复 性 对 浓度 的 依赖 关系 : Cot 曲线

复 性 的 起 始 事件 是 碰撞 ， 复 性 的 速度 依赖 于 DNA 的 浓度 ， 同 一 种 DNA， 当
其 浓度 高 时 ， 互 补 顺序 相 碰 撞 的 机 会 会 增加 ， 复 性 速度 也 会 变 快 〈 图 2-13)。 影

下

响 DNA 复 性 的 因素 很 多 ， 除 了 DNA 初始 浓度 外 ， 在 同样 条 件 下 ， 顺 序 复杂 的
DNA 比 顺序 简单 的 DNA 复 性 要 慢 ; DNA 半 懂 天 的 用 生生 捕 皇 二 温度 和
离子 强度 都 影响 复 性 速度 。

1.40

1.30

30 uejml

1p(C30hg/ml) 615(L0heg/ml)
60C 保温 时 间

图 2-13 T7DNA 的 复 性 速度 依赖 于 其 浓度

复 性 过 程 是 一 个 复杂 的 多 步骤 反应 过 程 。 复 性 的 第 一 步 是 当 两 条 链 碰撞 时 ，
假如 在 某 个 区 正确 配对 ， 就 会 形成 一 个 双 链 核心 。 核 心 形 成 后 ， 互 补 链 就 会 很 快
配对 从 而 完成 复 性 过 程 。 因 此 核心 的 形成 是 复 性 速度 的 限制 因素 。

复 性 过 程 可 用 二 级 反应 动力 学 公式 来 处 理 :

全 让 各 :一 配
S 和 SS 表示 DNA 互补 单 链 ，D 0 DNA。 按 二 级 反应 动力 学 公式 :

9 = -KC2， 积 分 后 得 ; 攻 二 TTCER

C 表示 上 时 间 的 单 链 浓度 ， 玉 和 天 ee 上 表示 时 间 ， Cuo 表示 单
链 DNA 的 初始 浓度 ，Cot 表示 DNA 单 链 浓度 Cu 和 复 性 时 间 上 的 乘积 。

在 一 个 指定 的 实验 里 ，C 是 已 知 的 ，C 可 以 测定 ， 如 以 CVCo 对 Cot 作 图 ，
可 得 图 2-13 所 示 的 曲线 。 在 曲线 的 中 点 ， 即 C/Co= LV/2 时 ，CotlHM2=1VK。

在 复 性 实验 中 ， 如 果 我 们 把 初始 浓度 、 温 度 、 离 子 强 度 、 片 段 大 小 都 进行 控
制 ， 那 么 剩 下 的 唯一 可 变 因素 就 是 顺序 的 复杂 性 。 实 验 指出 ， 速 度 常 数 开 与
DNA 的 复杂 性 N 成 反比 :

K“ =1/AN

CotL2 的 大 小 代表 了 基因 组 的 大 小 和 DNA 顺序 的 复杂 程度 。

用 这 个 方法 测定 真 核 DNA 的 Cot， 发 现 C/Co 对 Cat 所 作 的 图 并 不 是 一 条 简
单 的 S 形 曲线 。 例 如 小 鼠 DNA 中 10% 的 DNA 复 性 速度 甚至 比 已 知 的 最 小 病毒

=。 2

DNA 的 复 性 还 快 ， 说 明 这 10% 的 DNA 是 由 很 多 短 的 重复 顺序 组 成 的 。 对 真 核
生物 DNA 顺序 排列 的 知识 就 是 从 对 复 性 动力 学 的 研究 开始 获得 的 。

在 DNA 的 研究 工作 中 ， 所 采用 的 很 多 手段 都 同 DNA 的 变性 和 复 性 有 关 ，
分 子 杂 交 的 基础 就 是 DNA 的 变性 和 复 性 。

2. DNA 的 修饰

DNA 分 子 常常 被 修饰 ， 这 些 修饰 过 程 均 是 在 专 一 性 的 修饰 酶 作用 下 完成 的 。

DNA 中 最 主要 的 修饰 作用 是 DNA 的 甲 基 化 。DNA 的 甲 基 化 是 限制 -修饰 系
统 、 细 胞 中 DNA 复制 过 程 中 的 错 配 修复 和 基因 表达 调控 中 的 一 个 重要 组 成 部
2

3. 核酸 降解

DNA 和 RNA 在 化 学 方法 或 酶 学 方法 作用 下 都 可 以 水 解 成 自由 的 单 核 苷 酸 。

(1) 酸 水 解

在 pH 小 于 1 时 ，DNA 和 RNA 的 磷酸 二 酯 键 会 水 解 ， 并 且 还 伴随 着 碱 基 和
核糖 之 间 的 糖苷 键 的 断裂 从 而 产生 自由 碱 基 。 在 pH=4 时 ，DNA 中 的 嗓 叭 与 核
糖 之 间 的 糖苷 键 会 断裂 ，DNA 长 期 暴露 在 pH= 4 的 环境 中 ， 所 有 的 味 叭 都 会 脱

甲 基 化 试剂 可 使 A、G 和 C 甲 基 化 。 甲 基 化 之 后 ， 在 低 pH 或 中 性 pH 下 加
热 使 核糖 之 间 的 糖苷 键 断裂 ， 碱 基 脱 落 。 也 可 以 利用 这 种 甲 基 化 专 一 标记 某 一 碱
基 再 加 热 脱 去 此 甲 基 化 的 碱 基 从 而 进行 序列 分 析 。

(2) 破水 解

当 pH 大 于 13 时 ，RNA 水解 而 DNA 稳定 ，DNA 在 pbDH= 13 时 保持 稳定 ，
但 RNA 在 pH=11 时 全 部 水 解 。DNA 在 pH= 13 时 不 被 水 解 ， 即 其 磷酸 二 酯 键
不 会 断裂 ， 但 当 DNA 中 的 碱 基 去 掉 后 DNA 就 很 容易 被 水 解 。

(3) 酶 水 解

核酸 水 解 酶 多 种 多 样 ， 称 为 nuclease， 根 据 它 们 水 解 的 底 物 不 同 可 分 为 DNA
酶 (DNase) 和 RNA 酶 (RNase)。 许 多 DNA 酶 作用 于 单 链 DNA 或 双 链 DNA，
而 有 些 RNA 酶 只 作用 于 RNA 的 一 个 单 链 末端 ， 一 次 只 除去 一 个 核 苷 酸 ， 这 种
酶 叫 外 切 核 酸 酶 。 外 切 核 酸 酶 分 $ 专 一 性 和 3 “ 专 一 性 。 还 有 许多 核酸 酶 只 在 链
内 发 挥 作用 ， 这 种 核酸 酶 叫 内 切 核 酸 酶 。 内 切 核 酸 酶 一 般 只 识别 特定 的 几 个 碱 基
顺序 。

核酸 酶 有 多 种 生物 学 功能 ， 它 已 经 成 为 实验 室 中 人 们 切除 核 苷 酸 的 有 用 工
具 。 在 RNA 顺序 测定 中 的 第 一 步 就 是 使 用 核酸 酶 。 已 分 离 出 的 核酸 酶 的 特性 见
局 因

5

表 2-1 已 分 离 出 的 核酸 酶 的 性 质

核酸 酶 底 物 * 切割 位 点 六 汐
以 喀 啶 结尾 的 单 核 苷 酸 或
Pancreatic ribonuclease RNA 内 切 核 酸 酶 ; 相 邻 喀 喧 才 核 苷 酸 3 了 核 董 酸
0 了 内 切 核酸 酶 ;， 相 邻 的 乌 味 ”以 乌 苷 3-P 结尾 的 单 核 苷
吟 核 苷 酸 或 寡 核 苷 酸
PancreaticDNase I 1 DNA、RNA 内 切 核酸 酶 守 核 苷 酸
Venom phosphodiesterase 。” RNA 或 DNA ”3-OH 未 端 外 切 核酸 酶 5 -P 单 核 苷 酸
Spleen phosphodiesterase RNA 或 DNA 5 -OH 末端 切 核酸 酶 3 -P 单 核 苷 酸
Micrococcal nuclease ss DNA 内 切 核酸 酶 3-P 单 核 苷 酸
开 .co1i endonuclease TI1 ds DNA 多 在 3 一 5 - 磷 酯 位 点 具有 5 -P 未 端的 守 核 苷 酸
Neurospora endonuclease ssDNA 或 RNA 许多 位 点 5 -P 单 核 苷 酸
5 -P 单 核 苷 酸 加 上 一 个 未
Si nuclease ss DNA 5 -OH 末端 外 切 核酸 酶 端的 二 核 音 酸
瑟 .coli exonuclease TI DNA 单 链 区 内 切 核酸 酶 ;任何 -ss 位 点 SP 单 核 苷 酸
下 .coli exonuclease V DNA 3-OH 末端 外 切 核酸 酶 5 -P 单 核 苷 酸
巨 .coli exonuclease II ds DNA 3 -OH 末端 外 切 核酸 酶 5 -P 单 核 苷 酸
下 .co1i exonuclease VII ss DNA 32-OH 未 端 外 切 核酸 酶 5 -P 单 核 苷 酸
Phage 入 exonuclease ds DNA 5 -P 末 端 外 切 核酸 酶 5 -P 单 核 苷 酸

* ds 和 ss 分 别 代表 双 链 和 单 链 。

(4) S1 内 切 核酸 酶 和 S1 图 谱

Sl 内 切 核酸 酶 是 目前 应 用 很 广 的 一 种 酶 ，S1 酶 能 切割 单 链 DNA 或 双 链
DNA 的 单 链 区 ， 无 论 这 个 单 链 区 多 么 小 ， 即 使 只 有 一 个 核 苷 酸 也 能 被 S1 酶 切
开 。 例 如 ， 如 果 两 个 DNA 分 子 只 有 一 个 碱 基 对 不 同 ， 这 两 个 分 子 变性 后 复 性 会
形成 只 有 一 个 不 配对 碱 基 的 杂种 分 子 ，S1 酶 就 可 以 在 这 个 不 配对 的 位 点 处 切断 。
这 个 技术 可 用 于 做 突变 株 的 物理 图 谱 。 一 个 突变 株 和 野生 型 DNA 混合 后 变性 ，
复 性 ， 然 后 用 S1 酶 处 理 ，DNA 则 被 准确 地 在 突变 位 点 切断 ， 所 以 可 以 用 Sl 酶
确定 某 一 基因 突变 的 位 点 ， 因 为 S1 酶 作用 后 通过 电镜 或 凝 胶 电泳 分 析 产 生 的
DNA 片 段 的 长 度 可 以 确定 突变 的 位 置 。 这 个 技术 也 叫 S1 图 谱 (Sl mapping )。
另外 S1 酶 还 可 以 用 于 确定 转录 起 始点 。 提 取 某 一 基因 的 mRNA 与 变性 的 DNA
杂交 ， 再 用 S1 酶 处 理 ， 切 除 未 杂交 的 单 链 DNA 部 分 ， 加 入 pH 为 13 的 溶液 ，
使 RNA 水 解 ， 保 留 DNA， 分 析 DNA 序列 ， 测 知 转录 起 始点 。

核酸 是 生物 体内 重要 的 高 分 子 化合 物 ， 它 储存 着 生物 体内 全 部 遗传 信息 ， 是
基因 表达 不 可 缺少 的 基础 物质 。 除 DNA 外 ， 在 生物 体内 还 存在 着 另 一 种 核
酸 一 一 RNA。RNA 有 许多 种 类 ( 表 2-2 和 表 2-3)， 它 们 具有 不 同 的 生物 功能 。

” 256

表 2-2 大肠 杆菌 中 RNA 的 含量 和 性 质

占 细胞 总
沉降 系数 分 子 质量 (U 核 苷 酸 对 数 代谢 性 质
种 类 降 (U) 广 EN
SS 3.SX104 120 稳定
RNA 16S 5.SX105 1 542 82% 稳定
23S 1.1X106 2 904 稳定
tRNA 4S 2.5X104 一 3X104 74 一 93 16% 稳定
mRNA 4 一 2SS 2.$X104 一 105 70 一 3000 2% 稳定
部 分 其 他 RNA 4.5S 107 稳定
6S 184 稳定
10S 609 稳定
4.5S 109 不 稳定
4.5S 前 体 130 不 稳定

表 2-3 ” 真 核 生 物 中 RNA 的 存在 和 分 类

935 又 了 90?

5

稳定
6.5X105 稳定
人 7 六 10

2.5X10 320d0:

tRNA 前 体

细胞 核 IRNA 前 体 4.1X105
3.1X106
3 让 友 二

9X10

1Xx105 一 2X107

4S (3S)
类 似 原核 生物 或 更 小
类 似 原 核 生物

* 为 哺乳 动物 肝 细 胞 中 的 含量 。
1. 成 熟 RNA
细胞 内 含量 最 多 的 几 类 RNA 分 子 主要 的 生物 功能 是 参与 蛋白 质 的 生物 合

5 2 。

成 。 第 一 类 是 核糖 体 RNA (rRNA)。 原 核 生物 中 有 三 种 TRNA (SS rRNA，16S
rRNA，23S rRNA)， 真 核 生 物 中 有 四 种 (一 般 是 SS rRNA，5.8S rRNA，18S
rRNA 和 28S rRNA)。 这 些 RNA 分 子 在 代谢 上 十 分 稳定 ， 是 生物 体内 蛋白 质 合
成 的 “机 器 ” 核糖 体 的 重要 成 分 。 第 二 类 是 转移 RNA (tRNA)。 生 物体 内
存在 着 与 20 种 氨基 酸 对 应 的 RNA 分 子 ， 它 们 在 代谢 上 也 是 稳定 的 ， 在 蛋白 质
的 生物 合成 过 程 中 起 接受 、 转 运 和 挫 入 氨基 酸 的 作用 。 人 参与 蛋白 质 生 物 合成 的 第
三 类 RNA 分 子 叫 做 信使 RNA (mRNA)。 它 的 生物 功能 是 接收 DNA 上 的 遗传 密
码 即 蛋白 质 中 氨基 酸 排列 顺序 的 信息 ， 并 起 模板 作用 合成 蛋白 质 。 一 般 来 讲 ， 有
一 种 蛋 白 质 就 有 一 种 对 应 的 mRNA 分 子 ， 但 有 的 mRNA 分 子 可 以 翻译 出 几 种 时
白质 。mRNA 在 代谢 上 是 不 稳定 的 。 这 几 类 RNA 都 存在 于 细胞 质 中 ， 它 们 行使
生物 功能 的 主要 场所 在 核糖 体 上 。 在 真 核 细胞 的 线粒体 和 叶绿体 里 都 存在 着 独立
的 蛋白 质 合 成 系统 ， 因 此 也 存在 这 几 类 RNA 分 子 。 但 是 ， 其 大 小 和 结构 往往 和
细胞 质 中 的 不 完全 相同 。 此 外 ， 生 物体 内 还 存在 着 多 种 具有 特定 生物 功能 的
RNA 分 子 ， 例 如 ， 参 与 启动 DNA 复制 的 引物 RNA; 在 某 些 肿瘤 病毒 中 存在 着
一 些 类 似 tRNA 的 分 子 是 反 转 录 酶 的 引物 ， 参 与 DNA 的 合成 ; 在 某 些 细菌 中 ，
有 的 耻 NA 分 子 在 细胞 壁 合成 时 可 作为 甘氨酸 的 载体 ;还 有 一 些 RNA 分 子 是 一
些 酶 活性 不 可 缺少 的 组 成 成 分 ， 例 如 兔 肌 1，4-a 葡 聚 糖分 支 酶 含有 31 个 核 苷 酸
的 2.8SRNA 分 子 ; 特异 性 地 作用 于 tRNA 前 体 的 RNaseP 中 有 77% 的 成 分 是 核
糖 核 苷 酸 。 真 核 细胞 的 核 内 还 存在 着 许多 小 分 子 RNA (SnRNA)， 其 大 小 从 4S
到 8S 不 等 ， 大 约 由 80 到 260 个 核 苷 酸 构成 ， 其 中 有 些 SnoRNA 在 RNA 成 熟 过
程 中 起 重要 作用 ; 另外 ， 还 有 一 些 染色 质 结 合 的 RNA (chRNA)，chRNA 的 生
物 功 能 尚 不 清楚 。

2. 前 体 RNA

绝 大 多 数 RNA 分 子 都 是 在 细胞 核 内 合成 的 。 核 内 存在 着 各 种 RNA 的 前 体 ，
例如 tRNA 前 体 、rRNA 前 体 和 mRNA 前 体 。 这 些 前 体 RNA 的 分 子 质量 要 比 对
应 的 成 熟 RNA 的 大 得 多 ， 例 如 哺乳 动物 肝 细 胞 的 rRNA 的 前 体 是 4$S 细胞 核
RNA (CnRNA)， 在 成 熟 过 程 中 产生 了 41SnRNA、32SnRNA 和 20SnRNA 等 中 间
物 ， 最 后 相应 地 成 为 28S rRNA、5.8S rRNA 和 18S rRNA。 前 体 RNA 都 是 由 细
胞 核 DNA 转录 产生 的 ， 经 过 剪 切 、 装 配 和 修饰 成 为 成 熟 的 tRNA、zRNA 和
mRNA， 进 入 细胞 质 中 各 自行 使 其 生物 学 功能 。 有 人 把 在 细胞 核 内 合成 后 离开 细
胞 核 从 而 行使 生物 功能 的 RNA 分 子 称 作 迁移 性 RNA (migrating RNA)， 而 始终
存在 于 细胞 核 内 的 叫做 非 迁移 性 的 RNA (nonmigrating RNA)。

3. 病毒 RNA

病毒 中 的 遗传 物质 有 DNA、 也 有 RNA。 绝 大 多 数 植物 病毒 和 RNA 肿瘤 病
四 28 。

毒 以 RNA 作为 遗传 物质 。 一 般 讲 ， 病 毒 RNA ( 除 负 链 RNA 病毒 外 ) 包括 鸣 菌
体 RNA， 它 既是 遗传 信息 的 载体 ， 也 具有 mRNA 功能 。 类 病毒 (viroid) 没有 有 蛋
白 外 壳 ， 只 有 游离 的 RNA 分 子 。RNA 病毒 基因 组 包括 单 链 RNA 和 双 链 RNA
基因 组 。 单 链 RNA 病毒 基因 组 又 包括 “+” 链 和 “-” 链 RNA， 双 链 RNA 病
毒 基因 组 包括 单 分 子 的 和 分 段 的 RNA。RNA 病毒 基因 组 还 包括 线 状 、 环 状
RNA。

这 些 结构 不 同 的 RNA 基因 共同 的 特点 是 : 在 被 感染 的 细胞 中 ， 它 们 必须 要
有 效 地 复制 从 而 为 装配 子 代 病 毒 提 供 基 因 组 ， 又 要 为 合成 蛋白 质 提 供 mRNA，
由 RNA 病毒 执行 的 这 些 RNA 分 子 的 合成 是 个 独特 的 过 程 ， 其 细胞 中 缺少 RNA
指导 的 RNA 合成 机 器 。 除 反 转 录 病 毒 外 ， 所 有 RNA 病毒 都 编码 一 种 依赖 于
RNA 的 RNA 聚合 酶 ， 催 化 新 基因 组 和 mRNA 的 合成 。

具有 “-” 链 RNA 和 双 链 RNA 基因 组 的 病毒 粒子 必须 携带 RNA 聚合 酶 ，
因为 进入 细胞 的 这 些 病毒 基因 组 RNA 不 能 作为 mRNA 来 合成 蛋白 质 ， 也 不 能 利
用 细胞 机 器 复制 ， 去 除 蛋 白质 的 “- ” 链 和 双 链 RNA 病毒 基因 组 没有 感染 活
性 。“+” 链 RNA 病毒 粒子 不 携带 聚合 酶 ， 这 些 病毒 粒子 去 除 蛋 白质 后 有 感染
活性 ， 因 为 “+” 链 RNA 可 以 作为 mRNA 在 被 感染 的 细胞 中 通过 翻译 产生
RNA 聚合 酶 。

病毒 RNA 聚合 酶 是 数 个 病毒 基因 产物 组 成 的 常见 的 多 亚 基 装配 体 ， 其 中 一
个 亚 基 催化 RNA 的 合成 ， 其 他 亚 基 担 负 其 他 功能 。 依 赖 于 RNA 的 RNA 聚合 酶
指 的 是 该 多 亚 基 装 配 体 而 不 是 具 聚 合 活 性 的 单个 亚 基 。

依赖 于 RNA 的 RNA 聚合 酶 根据 其 在 病毒 感染 期 间 的 活性 ， 在 历史 上 曾 被
给 于 两 个 不 同 的 名 称 : 复制 酶 是 用 于 描述 该 酶 拷贝 病毒 RNA 以 产生 大 量 基因
组 ， 而 产生 mRNA 的 酶 称 为 转录 酶 。 这 个 命名 法 指出 了 执行 不 同 功能 的 RNA 合
成 的 酶 的 真正 区 别 。 然 而 这 个 术语 是 不 准确 的 。 例 如 有 些 RNA 病毒 ， 基 因 组 的
复制 和 mRNA 的 合成 是 同一 反应 。 对 于 双 链 RNA 病毒 来 说 ，mRNA 的 合成 产
物 也 可 作 基 因 组 复制 的 模板 。

转录 是 指 DNA 中 的 遗传 信息 拷贝 到 RNA 上 的 过 程 ， 这 个 术语 不 适合 RNA
病毒 基因 组 的 mRNA 合成 。

4.RNA 的 结构

除 少 数 病毒 的 RNA 是 双 链 外 ，RNA 都 是 单 链 的 。 细 胞 内 主要 有 三 种 RNA
(RNA、tRNA 和 mRNA)。 这 些 分 子 中 存在 可 配对 的 区 域 ， 因 此 链 内 可 形成 双
链 区 ， 所 以 像 zFRNA 和 tRNA 都 有 其 一 定 的 构 型 。mRNA 也 能 形成 一 定 的 高 级
结构 ， 在 蛋白 质 翻 译 中 起 调控 作用 。

。 电 昌 ”>

5. 核酸 的 结构 分 析

(1) DNA 的 物理 图 谱

DNA 的 物理 图 谱 就 是 DNA 分 子 的 限制 性 内 切 核 酸 酶 酶 解 片段 的 排列 顺序 。
物理 图 谱 可 以 用 多 种 方法 来 测定 ， 其 中 以 部 分 酶 解法 和 两 种 不 同 专 一 性 限制 酶 交
叉 酶 解法 最 为 简便 和 常用 。 部 分 酶 解法 是 其 他 各 种 测定 物理 图 谱 的 方法 的 基础 。

测定 物理 图 谱 的 第 一 步 是 测定 DNA 完全 酶 解 片段 的 数目 和 每 个 片段 的 分 子
量 。 选 择 合 适 洲 度 的 琼脂 糖 凝 胶 或 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 作 为 载体 进行 电泳 ， 通 营 能 把
绝 大 多 数 酶 解 片段 分 开 。 这 些 片段 的 分 子 质 量 能 从 泳 动 的 距离 来 判断 ， 因 为 在 合
适 条 件 下 泳 动 的 距离 同 DNA 分 子 质 量 的 对 数 成 反比 。 如 果 DNA 片段 是 放射 性
3P 全 标记 的 ， 那 么 就 可 以 从 每 个 片段 的 放射 活性 占 整个 分 子 放射 活性 量 的 百 分
比 推算 出 此 片段 分 子 质量 。

测定 了 完全 酶 解 片段 的 数目 和 分 子 质量 之 后 ， 接 着 把 DNA 用 限制 性 内 切 核
酸 酶 进行 部 分 酶 解 ， 测 定 每 个 片段 的 分 子 质量 。 从 部 分 酶 解 片段 可 以 推测 哪 几 个
酶 解 片段 是 相 邻 的 。 例 如 有 一 个 上 174 (复制 型 ) 严 zdII 片段 ， 其 分 子 大 小 是
1030bp， 这 个 片段 用 AixI 可 以 切 成 A、B、C、D 四 个 片段 ; 分 子 大 小 分 别 是
750bp，150bp，80bpb 和 50bp。 为 了 测定 这 四 个 片段 的 排列 次 序 ， 可 以 用 AzaI
部 分 酶 解 ， 在 部 分 酶 解 片段 中 可 得 到 分 子 大 小 分 别 为 810bp，230bp，130bp 等 片
段 。 从 这 个 数据 立刻 可 以 推断 AixI 酶 解 的 四 个 片段 的 排列 次 序 是 150 一 80 一
50 一 750 (图 2-14)。 当 然 也 可 以 把 每 个 部 分 酶 解 片段 从 凝 胶 上 洗 下 来 ， 用 同样
的 酶 完全 酶 解 ， 这 样 得 到 的 酶 解 片段 应 是 相 邻 的 片段 。

150bp 750bp

230 bp

130 bp>|
让
图 2-14 用 部 分 酶 解 方法 测定 物理 图 谱

用 两 种 限制 性 内 切 核酸 酶 交叉 酶 解 也 是 测定 物理 图 谱 常 用 的 方法 5 当 由 手 某
种 原因 ， 例 如 高 级 结构 导致 某 些 部 分 酶 解 片段 产 率 特别 低 时 ， 这 就 需要 第 二 种 酶
来 帮助 。 交 叉 酶 解 不 仅 可 以 得 到 两 种 以 上 限制 性 酶 切 图 谱 ， 而 且 可 以 相互 校对 ，
使 结果 更 加 可 靠 。 一 般 先 建立 产生 片段 比较 少 的 限制 性 内 切 核 酸 酶 的 物理 图 谱 ，
然后 在 此 基础 上 去 建立 产生 片段 比较 多 的 限制 性 内 切 核酸 酶 的 物理 图 谱 。

如 前 所 述 ， 部 分 酶 解 的 方法 是 建立 物理 图 谱 的 基本 手段 ， 但 是 部 分 酶 解 片段
的 数目 很 大 ， 给 分 离 带 来 困难 。 现 在 有 一 种 改进 的 部 分 酶 解 方法 ， 即 先 将 DNA

，30 ，

分 子 的 一 端 用 放射 性 同位 素 标记 ， 部 分 酶 解 后 电泳 分 离 ， 那 么 只 有 带 同位 素 的 片
段 出 现在 放射 自 显影 图 上 ， 谱 线 的 数目 相当 于 完全 酶 解 的 数目 ， 相 邻 谱 线 碱 基 对
数目 之 差 就 是 两 个 相 邻 点 之 间 的 这 段 DNA 片段 的 大 小 。 例 如 某 个 组 蛋白 基因 片
段 共 $5900bp， 末 端 标记 之 后 用 有 paII 部 分 酶 解 后 得 五 个 片段 ， 其 分 子 大 小 分 别
是 $5900bp，4210bp，3260bp，2950bp，1020bp， 显 然 最 大 的 部 分 酶 解 片段 和 其
次 的 一 个 片段 核 苷 酸 数 之 差 就 是 最 靠 右边 的 片段 分 子 大 小 。 其 余 以 此 类 推 ， 五 个
片段 的 排列 次 序 是 : 1020 一 1930 一 310 一 930 一 1690 (图 2-15 )。

5900 bp

4210bp

kB90G

图 2-15 “用 末端 标记 测定 物理 图 谱

| 1

测定 DNA 物理 图 谱 方 法 还 有 很 多 ， 在 这 不 一 一 详 述 ， 测 定 了 某 一 DNA 分
子 的 物理 图 谱 之 后 ， 就 可 以 着 手 测定 每 一 片段 的 核 苷 酸 排列 顺序 了 。

(2) 测定 DNA: 顺 序 的 方法

用 于 RNA 和 蛋白质 顺序 测定 的 基本 战略 是 小 片段 的 重 友 。 而 这 个 战略 用 于
DNA 顺序 测定 时 困难 就 很 大 ， 几 乎 是 行 不 通 的 。1975 年 Sanger 突破 了 这 个 框 ，
提出 了 一 种 新 的 战略 。 他 不 是 直接 测定 DNA 片段 中 碱 基 的 组 成 和 顺序 ， 而 是 通
过 测定 片段 的 分 子 长 度 来 推测 碱 基 的 顺序 ， 用 不 同 的 处 理 方法 来 确定 碱 基 的 性
质 。 其 后 发 展 起 来 的 各 种 DNA 顺序 测定 的 方法 都 是 以 这 个 原理 为 基础 的 。 近 来
这 个 原理 也 用 到 RNA 顺序 测定 中 ， 从 而 发 展 了 很 多 RNA 顺序 测定 的 新 方法 。
因此 这 个 原理 的 提出 在 核酸 的 顺序 测定 中 是 具有 划时代 意义 的 。

这 个 方法 的 原理 并 不 复杂 。 假 定 有 一 个 DNA 片段 ， 它 的 5 末端 用 放射 性 同
位 素 标 记 ， 这 是 片段 长 度 的 参考 位 置 。 又 假定 这 个 DNA 片段 中 有 两 个 腺 味 叭 ，
以 $ 末 端 为 起 点 ， 一 个 在 第 六 位 ， 另 一 个 在 第 十 位 。 如 果 我 们 设计 一 种 方法 ，
使 腺 味 吟 相 邻 的 磷酸 二 酯 键 断 开 ， 而 其 他 碱 基 相 邻 的 键 不 受 影 响 ， 那 么 将 可 以 得
到 两 个 片段 ， 一 个 是 六 核 苷 酸 ， 另 一 个 是 十 核 苷 酸 ， 这 两 个 片段 可 以 用 电泳 方法
分 开 并 确定 它们 的 长 度 。 反 过 来 ， 如 果 测 得 片段 的 长 度 ， 我 们 可 以 推测 ， 以 $
末端 为 参考 位 置 ， 第 六 位 和 第 十 位 由 腺 味 叭 占 据 着 ， 而 其 他 三 种 碱 基 的 位 置 可 以
用 类 似 的 方法 推测 。 显 而 易 见 ， 这 个 新 方法 能 否 成 功 取决 于 两 点 ， 首 先是 要 有 一
种 方法 能 把 仅仅 相差 一 个 核 苷 酸 的 同系 核 苷 酸 片 段 都 分 开 。 这 一 点 现 已 办 到 ， 例
如 在 40cm 的 聚 丙 烯 酰胺 凝 腕 上 电泳 就 可 以 把 100 一 200 的 核 苷 酸 全 部 分 开 ， 分
辩 率 达到 一 个 核 苷 酸 水 平 。 其 次 要 有 一 种 手段 能 制备 四 种 末端 碱 基 专 一 的 片段 。

5

1975 年 Sanger 设计 的 “加 减法 ”满足 了 这 个 要 求 ， 此 后 发 展 了 很 多 制备 片段 的
方法 。DNA 或 RNA 顺序 测定 方法 ， 原 理 都 是 如 此 。 不 同方 法 的 区 别 就 在 于 制备
片段 的 方法 不 同 ， 按 制备 片段 的 方法 的 不 同 可 以 把 这 些 方 法 分 成 两 大 类 : 一 类 是
DNA 聚合 酶 法 ， 简 称 酶 法 ; 另 一 类 是 化 学 降解 法 ， 人 简称 化 学 法 。

酶 法 。 以 单 链 DNA 为 模板 ， 加 上 一 个 合适 引物 (一般 用 限制 酶 切片 段 )，
再 加 入 四 种 脱氧 核糖 核 苷 三 磷酸 (dNTP)， 其 中 一 种 是 同位 素 标记 的 。DNA 育
合 酶 就 从 引物 开始 合成 一 条 与 模板 互补 的 DNA 链 。 对 于 DNA 顺序 分 析 最 理想
的 情况 是 ， 使 合成 产物 中 各 种 长 度 的 片段 都 存在 。 然 后 从 反应 混合 物 中 除去 四 种
dNTP， 反 应 产物 分 成 两 部 分 ， 一 部 分 用 于 加 法 系统 ， 一 部 分 用 于 减法 系统 。 用
于 加 法 系统 的 产物 再 分 成 四 小 份 ， 每 一 小 份 中 仅仅 将 四 种 dNTP 之 中 的 一 种 加 入
反应 系统 ， 比 如 仅仅 加 入 dATP， 由 于 DNA 聚合 酶 具有 3 一 和 外 切 酶 活性 ， 而
反应 系统 中 缺少 另外 三 种 dNTP， 合 成 产物 就 从 3 一 和 降解。 然而 由 于 存在
dATP， 显 然 ， 遇 到 腺 味 叭 的 位 置 时 降解 反应 就 停止 了 ， 因 此 所 有 的 片段 都 是 以
A 结 尾 。 同 理 也 可 以 分 别 制 备 以 C、G 或 工 结尾 的 另外 三 组 片段 。 四 组 片段 在 同

一 块 凝 胶 板 中 的 不 同样 品 槽 中 同时 电泳 ， 从 放射 目 显 影 图 中 就 可 以 推断 碱 基 顺

序 。 因 为 从 A 样 品 槽 中 走出 的 放射 性 区 带 代 表 A 在 片段 中 的 位 置 ， 同 理 也 可 以
定 出 C、G 和 工 的 位 置 , 因此 根据 同一 凝 胶 电 泳 上 的 四 组 区 带 就 可 以 推 怕 碱 基 顺
序 。 按 理 只 用 一 个 加 法 系统 就 足以 推断 DNA 顺序 ， 但 由 于 技术 上 的 原因 ， 只 用
一 种 方法 有 时 不 能 得 到 正确 结果 ， 因 此 又 设计 了 一 种 减法 系统 。 在 减法 系统 中 ，
也 是 将 上 述 酶 促 产 物 分 成 四 小 份 ， 每 一 小 份 中 只 加 三 种 dNTP， 比 如 缺少 dATP。
在 这 个 反应 体系 中 ，DNA 聚合 酶 能 够 把 片段 继续 合成 下 去 ， 但 是 遇 到 缺少 的
dATP 挫 入 的 位 置 时 ， 合 成 反应 就 停 下 来 。 这 就 可 以 得 到 一 组 均 以 A 前 一 个 位 置
结尾 的 片段 ， 电 泳 后 同样 可 以 测定 A 的 位 置 。 图 2-16 是 加 减法 测定 DNA 顺序 的
原理 。

加 减法 是 第 一 个 把 片段 长 度 和 碱 基 位 置 联系 起 来 的 新 的 顺序 测定 方法 ，
%X174 DNA 就 是 用 这 个 方法 测定 出 其 全 顺序 。 在 DNA 顺序 测定 方法 的 发 展 过
程 中 ， 加 减法 的 历史 性 位 置 不 可 低估 。 但 由 于 技术 上 的 问题 ， 这 个 方法 的 实际 效
果 还 不 够 理想 。 可 能 由 于 碱 基 的 特异 性 和 DNA 的 高 级 结构 的 影响 ， 聚 合 反应 并
非 完全 同步 ， 反 应 速度 有 差异 ， 有 些 片段 可 能 多 些 ， 有 的 片段 可 能 少 些 ， 有 时 可
能 导致 漏 读 和 重读 ， 有 时 图 谱 上 还 会 出 现 假 谱 线 ， 同 样 的 碱 基 连 排 时 图 谱 上 有 时
只 出 现 一 条 带 。 因 此 用 这 个 方法 测定 DNA 片段 可 能 有 五 十 分 之 一 的 误差 。

对 加 减法 一 个 最 成 功 的 改进 是 “末端 终止 法 "， 其 基本 反应 也 是 利用 DNA
聚合 酶 的 酶 促 反 应 ， 在 反应 混合 物 中 有 模板 、 引 物 、 酶 和 四 种 dNTP。 除 了 四 种
正常 的 dNTP 外 ， 另 外 再 加 入 一 定 比例 的 2，3“- 双 脱氧 核糖 核 苷 三 磷酸 ， 比 如
ddATP。 因此 在 DNA 合成 过 程 中 遇 到 dATP 挫 入 的 位 置 就 有 两 种 可 能 的 情况 发
生 。 如 果 是 dATP 挫 入 ， 合 成 继续 进行 ， 如 果 ddATP 掺 入 ， 合 成 反应 就 不 能 进

OP

DNA 模板 引物 ”3' 一 rrrrrr ATGCTG 5/
5 人 UNW 3

DNA 聚合 酶 4dNTP

〈 一 种 用 ?PP 标记 )
TEN GTO TiLO
TACGAC
TACGA
?2P 标记 的 互补 拷贝 CA

加 法 系统
减法 系统 (如 -A) NA
TOGCTG 二 TO
和 AGGAGee re 和
一 -一 TACGAC 一 入 CGA
一 一 TACG TEA
一 -一 TACG 下
一 -一 TACG 一 下 人
一 一 一 工
电泳 分 离 人 组
加 减法 混合 物

O-C-T-A-G+C+T+A+G

图 2-16 “加 减法 ”测定 DNA 顺序 的 原理

行 了 ， 因 为 ddATP 的 3“ 位 置 没 有 羟基 。 因 此 可 以 得 到 一 系列 不 同 长 度 的 以 ddA
结尾 的 片段 。 同 理 ， 也 可 以 得 到 以 G、C 或 工 结尾 的 片段 ， 电 泳 之 后 ， 就 可 以 直
接 “ 读 出 ” 碱 基 顺 序 。 这 是 一 个 十 分 方便 和 精确 的 方法 。1980 年 以 来 ， 对 此 技
术 有 进一步 发 展 : 把 DNA 重组 到 单 链 吻 菌 体 M13 中 ， 增 殖 之 后 ， 可 以 获得 大 量
的 单 链 DNA， 而 且 由 于 组 建 的 Ml3 载体 含有 通用 的 引物 结合 位 置 ， 因 此 可 以 利
用 同一 种 引物 。 这 就 简化 了 单 链 DNA 分 离 和 引物 制备 的 步骤 ， 大 大 推动 了 末端
终止 法 的 发 展 。 以 这 个 方法 为 主 ， 已 于 1982 年 完成 了 入 喉 菌 体 DNA 全 顺序
(48 502bp) 的 测定 。 后 来 又 发 展 出 现 了 直接 从 质粒 DNA 模板 出 发 的 测序 和 PCR
法 测序 ， 双 链 的 质粒 DNA 可 用 碱 变性 使 两 条 链 分 开 后 作 测 序 模 板 ， 使 DNA 测
序 更 加 灵活 、 方 便 。

1982 年 洪 国 藩 改进 了 上 述 双 脱 氧 与 M13 克隆 系统 相 结合 的 方法 。 由 于 原 有
方法 是 随机 的 ， 就 会 不 可 避免 地 出 现 测 定 的 多 次 重复 。 引 进 后 的 方法 叫做

FI

“DNA 顺序 连续 测定 法 ”。 连 续 法 的 关键 是 将 克隆 的 外 源 DNA 的 一 端 固定 起 来 ，
而 另 一 端 用 没有 专 一 性 的 DNase I 将 其 逐渐 缩短 ， 然 后 找到 长 度 约 有 200bp 差异
的 克隆 ， 实 验 设计 使 缩短 的 一 端 发 生 在 共同 引物 区 ， 这 样 对 克隆 的 顺序 进行 逐个
测定 ， 就 实现 了 对 长 链 DNA 的 连续 测定 。

化 学 法 。Gilbert 及 其 同事 Maxam 利用 某 些 化 学 试剂 专 一 地 修饰 碱 基 ， 使 相
应 的 糖苷 键 变 得 不 稳定 ， 这 样 可 以 得 到 以 特定 碱 基 结 尾 的 四 组 片段 。 他 们 所 选用
的 化 学 试剂 一 种 是 硫酸 二 甲 酯 ， 另 一 种 是 肝 。 硫 酸 二 甲 酯 可 以 使 鸟 味 叭 的 N-7
位 和 腺 味 叭 的 N-3 位 甲 基 化 ， 甲 基 化 后 的 糖苷 键 是 不 稳定 的 ， 在 中 性 pH 时 加 热
就 会 使 甲 基 化 味 叭 脱落， 脱落 了 嘲 叭 的 DNA 在 碱 性 溶液 加 热 时 ， 磷 酸 二 酯 键 就
会 断 开 ， 这 样 一 组 片段 进行 电泳 后 ， 在 放射 自 显影 图 上 有 一 深 一 浅 两 组 谱 线 ， 深
的 是 由 于 G 降解 而 产生 的 ， 浅 的 是 由 于 A 降解 产生 的 。G 之 所 以 比 A 深 是 因为
G 甲 基 化 的 速度 比 A 快 五 倍 。 如 果 将 硫酸 二 甲 酯 甲 基 化 的 DNA 片段 先 用 稀 酸 处
理 ， 则 脱 味 叭 反应 主要 是 在 A 的 位 置 上 进行 ， 因 为 在 这 种 条 件 下 甲 基 化 的 A 比
甲 基 化 的 G 更 不 稳定 。 然 后 再 断 开 磅 酸 二 酯 键 ， 电 泳 图 谱 上 深 的 谱 线 代表 A，
浅 的 谱 线 代 表 G。 对 于 喀 啶 可 以 选用 水 合 肝 部 分 简 解 ， 然 后 用 哌 啶 催化 B 消 除 反
应 ， 使 磷酸 基 团 脱 去 ， 此 条 件 对 C 和 工 没 有 选择 性 ， 当 脐 解 时 存在 2moVL NaCl
即 可 抑制 肝 同 工 的 反应 ， 这 样 产生 的 谱 线 相当 于 C 的 位 置 。

在 对 两 种 碱 基 专 一 的 化 学 反应 中 ， 酸 处 理 通过 质子 化 作用 使 味 叭 糖苷 键 不 稳
定 ， 碱 处 理 优先 打开 腺 哄 吟 和 胞 喀 啶 环 ， 最 后 均 可 被 哌 啶 所 消除 ， 使 DNA 链 在
G 和 A ( 酸 处 理 ) 或 A 和 C ( 碱 处 理 ) 处 断裂 。 此 外 ， 甲 烯 蓝 、 四 氧化 猴 也 曾 被
用 于 DNA 顺序 分 析 。

表 2-5 列 出 的 三 组 化 学 降解 反应 中 ， 以 第 I 组 效果 较 好 。 若 在 第 工 组 再 加
上 A>C 反 应 ( 见 第 II 组 的 9)， 共 五 个 反应 ， 能 得 到 更 为 满意 的 结果 。

化 学 降解 的 精细 程度 在 理论 上 应 达到 100%， 但 实际 上 测定 中 并 非 如 此 理
想 。 如 果 用 厚 的 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 板 (1.5mm)， 精 确 率 可 能 只 有 8$% ; 如 果 从 两
个 方向 测定 则 可 提高 到 99%; 如 果 用 薄 的 胶 板 (0.3mm)， 一 次 测定 精确 度 则 可
达到 99%。

DNA 顺序 测定 方法 主要 是 化 学 降解 法 和 末端 终止 法 ， 也 有 一 些 其 他 方法 。
但 基本 上 还 是 模仿 化 学 降解 法 和 末端 终止 法 。 事 实 上 除了 这 两 种 方法 ， 其 他 方法
很 少 有 人 采用 。 化 学 降解 法 和 末端 终止 法 各 有 利弊 。 对 于 单 链 DNA 而 言 ， 未 端
终止 法 特别 合适 ， 但 化 学 降解 法 由 于 条 件 简单 ， 很 多 实验 室 也 很 乐意 采用 。 近 年
来 由 于 将 末端 终止 法 与 M13 克隆 系统 相 结合 ， 已 经 把 DNA 顺序 分 析 推 向 一 个 新
阶段 。 由 于 方法 上 的 突破 ，DNA 顺序 测定 已 成 为 分 子 生物 学 中 发 展 最 快 的 分 支
之 一 ， 短 短 几 年 内 就 完成 了 不 少 DNA 的 全 序列 分 析 。 第 一 个 完成 的 全 序列 分 析
是 虹 174 DNA (5386bp，1977 年 )。 接 着 测定 了 SV40 DNA (5226bp，1977
年 )、G4 DNA (5$77bp，1978 年 ) 和 fd DNA (6408bp，1978 年 )。1981 年 报道

。 34

了 人 和 和 牛 线粒体 DNA (16 569bp 和 16 338bp) 的 结构 。1982 年 发 表 了 入 喉 菌 体
DNA (48 502bp) 的 结构 。

前 些 年 ， 人 们 还 千方百计 设法 把 DNA 转录 成 RNA， 用 测定 RNA 的 方法 来
. 反 推 DNA 的 顺序 。 现 在 ，DNA 顺序 测定 的 方法 达到 的 水 平 之 高 足以 通过 对
DNA 进行 测序 从 而 推出 RNA 的 序列 。 已 经 完成 的 一 些 大 的 RNA 的 测序 如 卯 白
蛋白 的 mRNA、16S rRNA 等 都 是 将 其 反 转 录 成 DNA 后 测定 顺序 的 。 总 的 来 说 ，
RNA 顺序 测定 进展 不 如 DNA。

如 果 对 DNA 顺序 测定 作 一 乐观 估计 ， 可 以 设想 现在 所 有 的 DNA 顺序 原则
上 都 能 测定 ， 只 是 工作 量 大 小 的 问题 。

(3) RNA 的 结构 分 析

主要 有 两 种 方法 用 于 RNA 顺序 测定 。 一 种 是 片段 重 释 法 ， 另 一 种 是 直 读
法 。 如 前 所 述 ， 由 于 DNA 顺序 测定 的 方法 简单 易 行 ， 所 以 现在 一 般 采 用 反 转 录
酶 将 待 测 的 RNA 反 转 录 成 DNA， 再 通过 对 DNA 的 顺序 测定 来 推断 RNA 的 结
构 ，RNA 的 顺序 测定 方法 不 再 详 述 。

第 四 节 Fe 生 人 5 国 栖 导

所 有 的 蛋白 质 都 是 氨基 酸 的 多 聚 体 。 从 和 蛋白质 的 氨基 酸 顺 序 测定 中 发 现 ， 每
种 蛋白 质 都 具有 特定 的 三 维 结构 ， 与 一 般 只 具有 双 螺 旋 结 构 的 DNA 相 比 ， 对 和 蛋
自 质 的 研究 更 为 复杂 。 但 从 另 一 方面 来 讲 ， 由 于 蛋白 质 的 结构 千差万别 ， 使 得 从
细胞 里 制备 某 一 种 蛋白 质 成 为 一 个 十 分 容易 研究 的 课题 。

一 、 蛋 白质 的 结合 位 点 和 多 亚 基 蛋 白质

细胞 中 的 每 一 种 蛋白 质 都 执行 一 种 特殊 的 功能 ， 主 要 是 结构 的 功能 、 酶 学 的
功能 和 调节 的 功能 。 执 行 结构 功能 的 蛋白 质 通常 是 纤维 状 的 ， 而 执行 另外 两 种 功
能 的 蛋白 质 是 球状 的 ， 执 行 酶 学 和 调节 功能 的 蛋白 质 催 化 两 种 蛋白 质 分 子 之 间或
者 细胞 内 多 种 分 子 之 间 的 高 度 专 一 反应 ， 这 些 反 应 发 生 在 蛋白 质 分 子 表面 的 氨基
酸 侧 链 之 间 。

由 于 多 肽 链 的 折 和 琶 ， 侧 链 会 产生 一 个 带 有 电荷 和 下 水 基 团 的 独特 的 表面 构
型 ， 通 常 存在 一 个 表面 构 型 大 小 为 5 一 10A 的 小 区 域 (这 个 小 区 域 叫 蛋白 质 的 结
合 位 点 )， 它 与 蛋白 质 和 其 他 分 子 之 间 的 相互 作用 有 关 。 一 个 酶 的 结合 位 点 是 它
的 催化 活性 区 ， 即 活性 位 点 ， 由 多 肽 链 上 相距 较 远 的 氨基 酸 侧 链 通过 链 内 相互 作
用 形成 一 个 结合 位 点 〈 这 是 以 使 人 们 明白 为 什么 在 突变 株 中 ， 一 个 氨基 酸 被 另 一
个 氨基 酸 的 蔡 换 如 果 发 生 在 结合 位 点 上 有 更 明显 的 效应 ， 甚 至 可 以 通过 改变 链 的
其 他 部 分 的 折 县 从 而 破坏 结合 位 点 )。

fr 9 ，

一 个 小 分 子 对 结合 位 点 的 结合 可 以 有 许多 方式 ， 图 2-17 是 其 中 的 几 种 。

. 杖 水 基

(a) (b) (c) (d)

图 2-17 小 分 子 与 蛋白 质 分 子 结合 的 四 种 类 型
(a) 电荷 ;(b) 玻 水 作用 ; (ec) 氢 键 ; (d) 范 德 华 力 。

a. 蛋白 质 上 的 两 个 带电 基 团 可 以 以 某 种 方式 形成 一 定 的 空间 结构 与 小 分 子
上 其 他 两 个 带电 基 团 准确 地 配对 结合 。

b. 蛋白 质 中 的 侧 链 臣 水 复 可 提供 一 个 具有 非 极 性 的 表面 ， 使 一 个 具有 很 大
非 极 性 基 团 的 分 子 吸附 在 上 面 。

c. 蛋白 质 中 的 氧 键 基 团 很 容易 与 小 分 子 的 互补 基 团 形成 氨 键 。

d. 蛋白 质 表 面 以 某 种 排列 形成 一 种 电子 构 型 ， 使 这 种 蛋白 质 分 子 和 将 要 结
合 的 分 子 之 间 具 有 正确 的 形状 ， 从 而 使 本 来 很 弱 的 范 德 华 力 能 以 这 种 方式 产生 很
紧密 的 结合 ， 这 就 叫做 空间 配合 〈steric fit)。

通常 这 几 种 结合 模式 是 同时 存在 的 。 例 如 ， 在 绝 大 多 数 情况 下 ， 酶 的 活性 位
点 的 形状 和 酶 作用 底 物 分 子 的 形状 接近 互补 ， 这 样 使 存在 的 范 德 华 引 力 相 当 强 ，
并 且 具 有 在 结合 位 点 排斥 那些 不 合适 的 分 子 的 效应 。 由 一 种 或 者 两 种 这 样 的 吸引
力 相 互 作用 形成 的 结合 通常 是 稳定 的 ， 这 些 吸引 力 即 离子 键 、 朴 水 相互 作用 或 氢
键 。

一 个 小 分 子 或 大 分 子 结合 到 一 个 蛋白 质 的 结合 位 点 可 能 会 引起 该 蛋 和 白质 形 状
的 微小 改变 ， 因 为 结合 常常 改变 诀 定 一 种 蛋白 质 形状 的 那些 作用 力 的 强度 。 形 状
的 改变 为 蛋白 质 提供 了 两 种 重要 功能 ， 其 一 ， 一 个 酶 的 形状 的 改变 能 够 改进 酶 的
活性 位 点 和 它 作 用 的 底 物 分 子 之 间 的 接触 ， 酶 的 这 种 性 质 叫 做 诱导 适合 〈i-
duced fit); 其 二 ， 通 过 形状 的 调整 可 调节 蛋白 质 分 子 的 生物 活性 。 如 果 一 个 酶 有
两 个 结合 位 点 ， 一 个 调节 分 子 可 以 结合 到 一 个 位 点 ， 由 此 而 影响 另外 一 个 位 点 。
影响 的 方式 可 能 是 阻止 或 促进 活性 位 点 的 结合 。

一 种 蛋白 质 分 子 的 表面 可 以 结合 另 一 种 蛋白 质 分 子 。 例 如 ， 蛋 自 水 解 酶 类
(proteinase) 和 蛋白 质 聚 集 在 一 起 形成 一 个 复杂 的 结构 。 又 如 ， 膜 和 病毒 外 壳 万
其 是 病毒 外 壳 以 相同 部 件 自我 聚集 形成 一 个 多 亚 基 的 复合 物 。

一 个 多 肽 链 通过 折 麦 后 ， 非 极 性 侧 链 往往 在 内 部 ， 即 与 水 是 分 开 的 。 因 而 对

a 36 四

于 一 条 多 肽 链 来 说 ， 以 这 种 方式 折 丢 后 ， 其 非 极 性 基 团 可 能 完全 在 内 部 ， 这 样 将
使 得 非 极 性 氨基 酸 在 此 成 复 而 力求 最 大 限度 地 减少 它 与 水 的 接触 。 一 个 蛋白 质 的
大 玻 水 区 与 另 一 蛋白 质 的 大 朴 水 区 配 位 从 而 进一步 减少 它 与 水 的 接触 。 同 样 ， 如
果 一 蛋白 质 分 子 具 有 距离 较 远 的 几 个 朴 水 区 ， 这 样 的 几 个 相同 的 分 子 相 互 作 用 形
成 的 结构 就 能 更 有 效 地 减少 其 与 水 的 接触 。 这 种 蛋白 质 是 同 亚 基 蛋 白质 。 同 亚 基
蛋白 事实 上 是 很 普遍 的 现象 ， 一 般 以 2 个 、3 个 、4 个 或 6 个 亚 基 组 成 的 同 亚 基
蛋白 最 为 常见 〈 多 亚 基 蛋 白 也 可 由 不 同 的 亚 基 组 成 ， 这 一 点 不 细 讨 论 )。

蛋白 质 为 什么 要 采取 多 亚 基 形式 呢 ? 理由 是 ， 这 种 形式 可 以 有 效 地 配置 蛋白
质 的 朴 水 基 团 。 另 一 个 可 能 会 更 正确 的 观点 是 : 许多 蛋白 质 以 逐渐 形成 朴 水 区 的
方式 折 垒 ， 同 时 亚 基 将 按 这 个 次 序 装 配 。 这 样 的 进化 是 有 价值 的 ， 因 为 多 亚 基体
系 有 以 下 优点 :

1) 亚 基 对 DNA 的 利用 来 说 是 一 种 经 济 的 方法 。 合 成 一 个 6000 氮 基 酸 的 蛋
自 质 需要 18 000 个 碱 基 对 ， 也 就 是 说 相当 于 11 个 典型 细菌 0.04% 的 编码 容量 。
如 果 这 个 蛋白 质 是 由 6 个 相同 的 亚 基 装配 而 成 的 ， 那 么 仅 3000 个 碱 基 对 就 够 了 。
一 个 多 亚 基 蛋 昌 可 以 像 一 个 单一 大 分 子 蛋白 一 样 形成 结合 位 点 。 正 像 某 一 特定 的
多 肽 链 上 相距 较 远 的 氨基 酸 在 一 起 形成 一 个 结合 位 点 一 样 ， 结 合 位 点 也 可 以 由 不
同 亚 基 上 的 氨基 酸 连 在 一 起 而 形成 。

2) 采取 多 亚 基 形 式 可 以 减少 蛋白 质 合成 过 程 中 随机 的 错误 对 蛋白 质 活性 的
影响 。 如 果 在 蛋白 质 合 成 期 间 一 个 6000 氨基 酸 的 蛋白 质 中 插入 了 一 个 错误 的 氮
基 酸 ， 那 么 这 个 6000 氨基 酸 的 蛋白 质 的 最 佳 拷贝 也 是 无 功能 的 〈 当 然 是 假设 ，
并 非 总 是 这 样 ， 只 是 举例 )。 如 果 此 和 蛋白质 由 6 个 亚 基 组 成 ， 每 个 亚 基 含 1000 个
氨基 酸 ，6 个 亚 基 中 有 1 个 有 错误 ， 那 么 以 亚 基 形式 组 成 蛋白 质 的 这 种 安排 可 以
从 两 方面 保护 蛋白 质 的 功能 。 第 一 ， 这 个 蛋白 质 可 能 在 某 种 程度 上 有 功能 ， 这 样
一 个 过 剩 体系 形成 无 功能 的 可 能 性 比 一 个 非 过 剩 体系 要 低 。 第 二 ， 一 个 缺陷 的 亚
基 就 像 一 个 具有 不 同 表面 结构 的 亚 基 一 样 ， 将 完全 挫 入 到 多 亚 基 蛋 白质 中 ， 因 而
通常 可 形成 一 个 正常 的 蛋白 质 。 所 以 ， 蛋 白质 如 以 完全 相同 的 多 肽 链 组 成 的 话 ，
将 完全 消除 错误 的 影响 。

3) 多 亚 基 外 昌 质 的 活性 开关 能 够 非常 有 效 地 和 非常 迅速 地 被 打开 和 被 关闭 。
这 种 现象 在 酶 的 活性 调节 中 有 很 多 例子 。 一 个 酶 通常 只 对 直接 的 一 步 反 应 有 活性
而 对 下 一 步 没 有 活性 。 例 如 ， 在 肌肉 的 收缩 和 松弛 循环 中 ， 在 许多 情况 下 ， 有 蛋白
质 通过 亚 基 的 解 离 抑制 活性 ， 或 通过 聚合 而 恢复 活性 。 这 个 循环 方式 的 完成 过 程
如 下 : 一 个 信和 号 分 子 或 效应 分 子 结合 到 一 个 亚 基 上 使 其 形状 发 生 很 轻微 的 改变 ，
此 亚 基 从 多 聚 体 上 掉 下 来 ， 游 离 出 来 后 其 形状 随 之 改变 ， 从 而 失去 了 与 效应 分 子
结合 的 能 力 ， 失 去 效应 分 子 后 ， 亚 基 又 恢复 其 原来 的 形状 ， 并 且 又 能 重新 聚集 形
成 一 个 有 活性 的 蛋白 质 。 这 类 开关 是 很 迅速 的 ， 使 活性 降低 到 零 的 水 平 只 需 消耗
很 少 能 量 。

下

多 亚 基 蛋白 质 除 了 目前 讨论 的 相同 亚 基 的 组 成 形式 外 ， 不 同 的 多 肽 链 也 可 以
聚集 形成 由 不 同 亚 基 组 成 的 蛋白 质 。 实 际 上 这 是 相当 普遍 的 现象 。 例 如 ， 血 红 蛋
白 一 一 血液 中 的 氧 的 携带 者 ， 由 4 个 亚 基 组 成 〈 四 种 亚 基 为 两 种 类 型 )。 类 似 的
还 有 催化 RNA 合 成 的 RNA 聚合 酶 ， 是 由 5 个 亚 基 组 成 ， 其 中 4 个 是 不 同 的 。
而 在 瓦 . co 中 合成 DNA 的 DNA 聚合 酶 III， 是 由 10 个 不 同 的 亚 基 组 成 的 。

一 个 小 蛋白 质 含 有 亚 基 是 罕见 的 ， 由 于 多 数 的 蛋白 质 都 由 亚 基 组 成 ， 而 且 多
亚 基 蛋 白质 又 有 众多 优点 ， 那 么 是 否 大 蛋白 比 小 蛋白 好 ， 当 然 这 不 能 绝对 而 论 。
亚 基 的 增多 可 能 刚好 是 一 个 进化 中 的 意外 事件 。 例 如 ， 一 个 突变 能 使 一 个 多 肽 链
发 生 自 身 聚 集 ， 这 样 反而 能 产生 一 个 活力 位 点 从 而 催化 一 个 新 的 反应 ， 如 果 这 个
酶 对 发 生 突 变 的 细胞 是 有 价值 的 话 ， 那 么 这 个 生物 宁可 选择 这 个 结构 简单 的 酶 而
不 必 采 取 多 亚 基 酶 了 。 大 和 蛋白质 有 两 方面 的 好 处 ， 第 一 ， 小 蛋白 很 难 形成 一 个 与
很 大 很 复杂 的 分 子 结合 的 结合 位 点 ， 而 大 蛋白 质 很 容易 办 到 。 第 二 种 情况 是 当 一
种 结合 反应 可 被 调节 ， 这 时 结合 蛋白 至 少 要 有 两 个 结合 位 点 ， 一 个 结合 被 结合
分 子 ， 另 一 个 用 以 结合 调控 因子 ， 小 分 子 质 量 的 蛋 白 质 几乎 不 可 能 有 两 个 或 两 个
以 上 的 结合 位 点 。

二 、 人 蛋白 质 活性 的 调

许多 蛋白 质 的 活性 随 着 细胞 内 和 细胞 外 的 条 件 而 变化 。 在 此 我 们 将 讨论 蛋 和 白
质 的 活性 被 调节 的 几 种 方式 。

1. 终 产物 的 抑制 作用

如 果 一 个 酶 催化 A->B 的 反应 ， 而 当 产 物 B 由 外 源 提 供 时 ， 这 个 酶 没有 理由
再 继续 催化 这 个 反应 。 事 实 上 ， 如 果 A 有 别 的 用 处 ， 它 将 有 效 地 关闭 这 个 酶 的
活性 ， 要 完成 这 一 步 ， 一 个 简单 的 办 法 是 使 这 个 酶 具有 两 个 结合 位 点 ， 一 个 结合
A， 另 一 个 结合 B。 如 果 结 合 了 B， 这 个 酶 就 改变 构象 而 破坏 结合 A 的 结合 位 点 。
B 以 这 种 方法 阻止 酶 执行 A->B 的 转换 ， 这 是 终 产物 抑制 作用 的 一 :个 例子 。

2. 多 亚 基 蛋白 质 的 调节 一 一 变 构

许多 酶 为 了 节约 遗传 信息 而 含有 几 个 亚 基 ， 这 些 酶 的 活性 也 是 可 以 被 调节
的 。 然 而 ， 底 物 结合 的 位 点 和 抑制 物 〈 可 能 是 反应 产物 ) 结合 的 位 点 是 在 不 同 的
亚 基 上 ， 如 果 抑 制 物 结合 ， 就 阻止 了 底 物 的 结合 。 一 个 亚 基 上 的 结合 位 点 被 占据
的 这 个 信息 必须 以 某 种 方式 转 递 到 其 他 亚 基 ， 这 可 能 是 以 下 述 方式 通过 亚 基 接触
而 介 导 的 : 抑制 物 分 子 的 结合 改变 这 个 亚 基 的 形状 ， 形 状 改变 将 影响 这 个 亚 基 与
其 他 亚 基 相互 作用 的 结合 位 点 [图 2-18 (b)]， 如 果 这 个 亚 基 仍 保持 接触 ， 那 么
所 有 毗邻 的 亚 基 首先 将 在 各 亚 基 的 相互 作用 位 点 处 改变 形状 ， 这 就 会 依次 改变 其

*，38 ，

他 亚 基 的 结合 位 点 ， 蛋 白质 经 受 这 样 的 修饰 ， 叫 做 蛋白 质 的 变 构 。

一 个 抑制 物 可 以 降低 一 个 蛋白 质 的 结合 活性 ， 相 反 地 ， 一 个 无 活性 的 蛋 日 质
也 能 被 激活 。 换 句 话 说， 一 个 亚 基 上 的 底 物 结合 位 点 对 于 底 物 的 结合 本 来 不 是 十
分 正确 的 ， 但 当 一 个 激活 物 分 子 被 结合 到 另 一 个 亚 基 的 结合 位 点 时 ， 它 就 可 能 获
得 正确 的 构象 [图 2-18 (a)]， 这 样 ， 一 些 蛋 昌 质 经 历 变 构 而 被 激活 ， 而 另 一 些
蛋白 质 经 历 变 构 而 被 抑制 。

和 底 物
站
) 抑制 物

激活 物
无 活性 形式 活性 形式 活性 形式 无 活性 形式
〈 不 能 结合 底 物 )
(a) GD)

图 2-18 变 构 的 一 个 例子
(a) 激活 ; (b) 抑制 。

正 是 这 两 种 情况 可 以 解释 开 -> 关 (抑制 ) 和 关 - 开 (激活 ) 过 程 。 而 许多 多
亚 基 归 自 质 则 根据 更 微妙 的 变化 一 一 即 它们 的 结合 活性 是 由 一 个 调节 因子 来 调
节 。

以 上 我 们 涉及 的 是 第 二 个 分 子 如 何 影响 底 物 的 结合 。 而 底 物 分 子 本 身 就 可 以
调节 一 个 蛋白 质 的 结合 活性 的 例子 更 为 普遍 。 例 如 ， 催 化 A-~B 转变 的 一 个 酶 ，
当 A 的 浓度 低 时 ， 其 活性 必定 很 弱 ， 而 当 A 的 浓度 高 时 ， 酶 活性 就 高 。 这 个 过
程 靠 一 个 单 亚 基 蛋白 质 是 很 难 完成 的 。 一 个 多 亚 基 外 和 白 的 每 一 个 亚 基 可 以 通过 较
低 的 吸引 力 结合 A， 但 是 一 旦 A 结合 到 一 个 亚 基 上 就 可 能 引起 构象 改变 而 增加
其 他 亚 基 上 的 结合 位 点 对 A 的 吸引 力 。 如 果 存 在 的 A 很 少 ， 那 么 起 始 结合 的 频
率 就 很 低 ， 因 而 将 只 有 少数 结合 位 点 被 A 占 据 ， 这 样 A~>B 的 转变 就 很 少 发 生 。
如 果 A 的 浓度 高 ， 第 一 个 结合 位 点 被 占据 从 而 增加 其 他 位 点 的 吸引 力 ， 这 些 位
点 将 迅速 被 A 充满 ， 而 当 一 个 A 转 变 成 B 后 ， 这 个 A 的 结合 位 点 立刻 重新 被 占
据 ， 所 以 A 少 度 转换 速率 也 很 高 。 血 红 和 蛋白 对 氧 的 结合 能 力 随 氧 的 浓度 增加 而
增加 就 是 一 个 重要 的 例子 。

3. 变 构 调节 的 两 种 机 制
变 构 的 变化 可 以 几 种 方式 发 生 ， 曾 提出 两 种 重要 的 模型 来 描述 这 个 机 制 ， 这
两 种 模型 叫做 对 称 (或 协同 ) 模型 和 连续 模型 。 两 种 模型 假设 如 下 : @ 假 设 每 个
亚 基 具有 形成 两 种 形式 的 能 力 ， 工 和 有 型 ,它们 分 别 以 低 的 和 高 的 吸引 力 与 A 结
合 。@ 当 和 A 牢 固 地 结合 到 一 个 亚 基 上 ， 这 个 亚 基 必 须 是 R 型 。
和

这 些 模型 在 几 种 方式 上 有 区 别 :

第 一 ， 协 同 模型 假设 工 和 了 两 种 形式 的 存在 最 初 是 平衡 的 。 只 有 R 型 亚 基
与 A 牢 固 结合 〈T 型 亚 基 与 A 的 结合 很 少 或 很 不 牢固 )， 并 且 与 一 个 R 型 亚 基 的
结合 可 引起 同一 蛋白 质 中 的 其 他 所 有 亚 基 从 工 型 变 成 型 ， 这 样 ， 平 衡 明 显 地
向 R 移动 。 相 反 ， 在 连续 模型 里 ， 假 设 A 首先 与 工 型 亚 基 结 合 〈 低 吸引 力 的 结
合 )， 并 且 这 种 结合 以 某 种 方式 诱导 这 个 工 型 (不 是 其 他 的 工 型 ) 转变 到 R 型
(可 强 有 力 地 结合 A)。 注 意 在 协同 模型 中 底 物 分 子 与 一 个 亚 基 的 结合 可 间接 影响
其 他 亚 基 的 形式 ， 而 在 连续 模型 中 ， 每 个 亚 基 都 只 能 直接 被 影响 而 不 能 间接 被 影
响 。

第 二 ， 结 合 位 点 没有 被 占 满 的 那些 变 构 蛋 白 可 能 存在 的 形式 的 数目 对 于 两 种
模型 来 说 是 不 一 样 的 : 在 协同 模型 中 认为 亚 基 排列 的 对 称 性 是 迫使 大 分 子 聚 集 稳
定 化 的 一 个 基本 因素 。 在 协同 模型 中 ， 一 个 R 型 亚 基 可 以 稳定 地 与 另 一 个 R 型
亚 基 相 互 作用 ， 两 个 工 型 亚 基 也 可 以 聚集 在 一 起 ， 但 一 个 R 和 一 个 工 则 不 能 形 .
成 稳定 的 一 对 。 只 要 这 些 亚 基 保持 接触 ， 一 个 R 型 亚 基 起 的 稳定 作用 就 能 引起
所 有 保持 着 工 型 的 亚 基 转 变 成 信 型 亚 基 ， 即 蛋白 质 聚 集 保 留 对 称 性 。 例 如 ， 对
一 个 四 聚 体 来 说 ， 协 同 模 型 只 允许 TITTT 和 RRRR 这 两 种 形式 的 复合 物 ， 而
TTTR、TTRR、TRRR 是 不 存在 的 。 在 连续 模型 中 ， 上 述 观点 就 不 适合 了 ， 一
般 认为 在 连续 模型 中 从 TITTT 变 成 RRRR 经 过 以 下 几 个 步骤 TTTT->TTTR~>
TTRR->TRRR… 一 RRRR。 在 这 个 过 程 中 ， 每 一 步 的 转变 都 需要 另 一 个 分 子 的
结合 (图 2-19)。

昱 落 可 习

图 2-19 变 构 的 主要 模型

。40

协同 模型 可 以 通过 一 个 简单 的 数学 形式 来 描绘 ， 即 被 结合 的 A 与 自由 A 的
浓度 有 关 。 关 于 连续 模型 中 的 平衡 则 更 为 复杂 。

实验 表明 ， 一 些 大 分 子 可 以 用 协同 模型 给 予 最 好 的 阐明 ， 而 对 另 一 些 大 分
子 ， 用 连续 模型 来 解释 要 好 些 。 但 是 有 许多 分 子 用 两 种 模型 都 不 能 很 好 地 解释 它
们 ， 这 样 的 一 些 分 子 以 两 种 以 上 的 状态 存在 ， 对 于 这 些 分 子 的 性 质 需 要 更 复杂 的
模型 来 解释 。

4. 一 种 变 构 酶 : 天 门 冬 酰胺 转 氨 甲 酰 酶

变 构 蛋 白 研究 得 最 清楚 的 例子 是 天 门 冬 酰胺 转 氨 甲 酰 酶 (ATCase)， 它 具有
结合 激活 物 和 结合 抑制 物 的 两 个 结合 位 点 ， 它 可 以 催化 谷 酰胺 合成 RNA 前 体 物
胞 喀 啶 核 苷 三 磷酸 (CTP)。 反 应 顺序 是 :

谷 酰胺 + CO; + ATP-> 氨 基 甲 酰 磷 酸 盐

天 门 冬 酰胺 转 氨 甲 酰 酶
天 冬 氢 酸 盐 ”一
CTP<-UTP<-UMP<- 甲 酰胺 天 门 冬 氢 酸

这 个 酶 分 为 两 类 ， 共 12 个 亚 基 组 成 。 其 中 6 个 是 催化 亚 基 (C，catalytic
subunit) 形成 两 个 三 聚 体 。 其 余 6 个 是 调节 亚 基 (R，regulatory subunit)， 调 节
亚 基 形 成 三 个 二 聚 体 。 ( 注 : 这 里 的 及 指 调节 亚 基 ， 不 是 前 面 讨 论 的 及 型 。) 每
个 及 二 聚 体 与 两 个 C 亚 基 接 触 ， 但 接触 的 两 个 C 亚 基 分 别 在 不 同 的 三 聚 体 中
(图 2-20)， 实 际 上 这 些 亚 基 的 排列 已 经 用 X 射线 衍射 研究 进行 证 明 (如 图 2-
20)，ATCase 比 只 由 一 种 类 型 的 多 肽 组 成 的 四 聚 体 要 完善 得 多 。 这 种 酶 的 行为 不
能 用 协同 模型 或 连续 模型 来 解释 ， 尽 管 它 们 的 变 构 原 理 都 是 一 样 的 。

十 6 68 69
二 聚 的 调节 亚 基

字条 雪 )i 国 已 外

(用 SS 人 合作

酶 的 无 活性 形式
图 2-20 ”天门 冬 酰胺 转 氨 甲 酰 酶 的 结构 与 亚 基 排 列

作为 一 个 变 构 酶 ，ATCase 以 下 述 方式 起 作用 ， 此 酶 被 RNA 的 前 体 物 ATP

-0

所 激活 ， 被 CTP 所 抑制 。CTP 不 是 中 间 产 物 而 是 终 产 物 (图 2-21)。 在 实验 室
条 件 下 ATCase 很 易 解 离 释 放出 两 个 C 三 聚 体 和 三 个 R 二 聚 体 ， 并 且 可 将 它们 分
离 提 纯 ， 提 纯 后 发 现 底 物 天 门 冬 氨 酸 只 结合 在 三 聚 体 上 (每 个 C 亚 基 上 只 结合
一 个 天 门 冬 氨 酸 )。ATP 和 CTP 分 别 只 与 二 聚 体 结合 (每 个 R 亚 基 上 有 一 个
ATP 结合 位 点 和 一 个 CTP 结合 位 点 )。 一 个 C 三 聚 体 单独 就 可 合成 氮 甲 酰 天 门
冬 氨 酸 ， 但 其 活性 不 受 ATP 和 CTP 浓度 的 影响 ， 所 以 酶 的 激活 和 抑制 需要 及 二
聚 体 和 C 三 聚 体 的 接触 。 同 样 ， 发 现 当 CTP 与 之 结合 时 ，R 亚 基 经 历 了 变 构 的
变化 ， 这 样 的 亚 基 如 果 与 C 三 聚 体 保 持 聚 集 ，C 亚 基 的 形状 也 将 发 生 改 变 ， 这 与
变 构 效应 的 原理 完全 一 致 。

+ATP ( 汶 泊 欣 ) 让

反应 速度

+CTP (抑制 物 )

天 门 冬 氨 酸 盐 浓 度

图 2-21 天 门 冬 酰 胺 转 氨 甲 酰 酶 的 变 构 效应
5. 真 核 细胞 中 蛋白 质 的 磷酸 化 是 导致 变 构 的 共同 方式

在 细菌 中 ， 例 如 在 大 肠 杆菌 中 的 蛋白 质 的 活性 调节 是 通过 细胞 中 无 数 的 小 分
子 结合 到 特定 蛋白 质 上 引起 蛋白 质 的 变 构 ， 从 而 控制 蛋白 质 的 活性 ， 以 这 种 方式
调节 的 许多 蛋白 质 是 催化 分 解 代谢 反应 的 酶 ， 另 一 些 是 传递 基因 开关 信和 号 的 蛋白
质 。 一 些 细菌 将 磷酸 基 团 共 价 结合 到 蛋 白 质 的 氨基 酸 侧 链 上 ， 因 为 每 个 磷酸 基 团
带 两 个 负电 荷 ， 因 此 可 以 吸引 多 肽 链 上 带 正 电荷 的 侧 链 徐 而 改变 蛋白 质 的 构 型 ，
从 而 以 这 种 方式 调控 蛋白 质 的 活性 。

真 核 细胞 中 蛋白 质 活 性 调节 的 主要 战略 是 蛋白 质 的 可 逆 磷 酸化 。 一 个 典型 的
哺乳 动物 细胞 中 约 有 10 000 种 蛋白 质 ， 其 中 10% 以 上 被 认为 是 被 磁 酸 化 了 的 。
蛋白 激酶 将 ATP 上 的 磷酸 基 团 转移 到 蛋白 质 上 ， 或 者 磁 酸 酯 酶 将 磷酸 基 团 从 蛋
白质 上 除去 。 真 核 细 胞 中 含有 许多 蛋白 激酶 和 磷酸 酯 酶 ， 这 些 酶 中 大 多 在 细胞 内
信和 号 传导 中 起 核心 作用 。

cdk (cyclin-dependent protein kinase) 蛋白 激酶 能 作为 一 个 微 凿 子 (mi-
crochip) 发 挥 作 用 。 在 真 核 细胞 中 有 数 百 种 蛋白 激酶 组 成 复杂 的 信号 途径 网 络 ，
该 途径 协调 细胞 的 活动 ， 驱 动 细胞 周期 ， 并 把 信和 号 从 细胞 的 外 环境 中 传递 到 细胞

。 42 ，

内 ， 许 多 被 传递 的 信号 需要 被 整合 和 放大 ， 单 个 蛋白 激酶 (和 其 他 信和 号 蛋白 ) 作
为 加 工 手 段 ， 或 者 “ 微 凿 子 ” 在 整合 过 程 中 起 作用 。

胞 环 素 〈cyclin) 依赖 的 蛋白 激酶 是 这 种 加 工 手 段 的 一 个 具 代表 性 的 例子 。
这 一 类 激酶 是 真 核 细 胞 中 细胞 分 裂 控制 的 核心 成 分 。 在 兰 椎 动物 细胞 中 ， 各 个
cdk 酶 在 整个 细胞 分 裂 周期 的 不 同时 期 按 程序 连续 地 打开 或 关闭 ， 当 它 打 开 时 ，
通过 它们 在 蛋白 质 上 磷酸 化 的 效果 而 多 方面 影响 细胞 行为 。

一 个 cdk 蛋白 ， 只 有 当 它 被 结合 到 被 称 为 胞 环 素 (cyclin) 的 第 二 种 蛋白 时 ，
才 具 有 蛋白 激酶 活性 。cdk 的 激活 有 三 种 不 同 的 方式 ， 胞 环 素 的 结合 只 是 其 中 之
一 ， 通 过 磷酸 化 和 去 磷酸 化 ，cdk 被 激活 从 而 驱动 一 套 特殊 的 细胞 成 分 一 一 胞 环
素 、 和 蛋白 激酶 和 蛋白 酯 酶 ， 使 之 处 于 合适 的 活性 状态 。 例 如 某 些 胞 环 素 的 总 量 在
细胞 周期 中 逐渐 增加 ， 直 到 在 细胞 周期 中 某 一 特定 点 突然 被 摧毁 。 一 个 胞 环 素 被
划 蛋 白 酶 突然 摧毁 将 立即 关闭 cdk 酶 活性 ， 这 是 控制 细胞 内 诸如 有 丝 分 裂 等 事件
的 二 个 重要 方法 。

cdk 的 三 维 结构 暗示 了 这 种 酶 调控 的 分 子 解释 。cdk 蛋白 本 身 有 ATP 结合 位
点 并 且 是 扭曲 的 ， 一 个 大 约 20 个 氨基 酸 的 易 弯 曲 的 环 可 封闭 蛋白 质 底 物 进入 到
活性 位 点 的 通道 。 胞 环 素 的 结合 即 能 消除 扭曲 又 能 允许 激活 的 磷酸 基 团 加 到 易 弯
曲 的 环 的 尖端 ， 于 是 一 般 认 为 该 磷酸 被 吸引 到 一 个 带 正 电荷 氨基 酸 的 袋子 中 ， 将
环 拉 低 以 便 允 许 底 物 进 入 到 活性 位 点 (图 2-22)。 胞 环 素 的 结合 也 允许 抑制 性 磅
酸 加 入 从 而 干扰 ATP 位 点 ， 这 就 保持 cdk 蛋白 处 于 无 活性 状态 。 当 一 种 磷酸 酯
酶 除去 抑制 磷酸 时 ， 这 种 激酶 最 终 被 激活 (图 2-23)。

结合 和 水 解 GTP 的 一 类 和 蛋白质 是 普遍 存在 的 细胞 调控 因子 。 我 们 已 经 讨论
了 细胞 如 何 利 用 磁 酸 化 和 去 磁 酸化 来 控制 该 蛋白 质 的 活性 。 和 蛋白 激酶 将 ATP 上
的 磷酸 基 团 直接 转移 到 蛋白 质 的 氨基 酸 侧 链 上 。 真 核 细胞 也 利用 其 他 方法 通过 磷
酸化 或 去 磷酸 化 来 控制 蛋白 质 活 性 。 在 这 种 情况 中 ， 磷 酸 基 团 不 是 直接 加 到 蛋白
质 上 ， 而 是 GTP 的 一 部 分 ，GTP 与 蛋白 质 紧 密 结合 。 结 合 GTP 的 蛋白 质 是 有 活
性 的 ， 当 GTP 被 其 结合 的 蛋白 质 水 解 成 GDP 时 ， 就 会 丢失 一 个 磷酸 基 团 ， 从 而
使 结合 GDP 的 蛋白 质 无 活性 。

GTP 结合 蛋白 (也 称 GTP 酶 ， 因 为 它 水 解 GTP) 组 成 一 个 蛋白 质 大 家 族 ，
这 类 和 蛋白质 都 有 类 似 的 GTP 结合 球状 区 域 。 当 它 结 合 的 GTP 被 水 解 成 GDP 时 ，
此 区 域 将 经 历 变 构 的 变化 而 使 蛋白 质 无 活性 。

一 种 小 的 GTP 结合 蛋白 称 Ras 蛋白 ，Ras 蛋白 在 细胞 信号 转 导 中 起 决定 性
的 作用 。 结 合 有 GTP 的 Ras 蛋白 是 有 活性 的 ， 它 能 刺激 细胞 内 蛋白 质 级 联 式 地
磷酸 化 。 然 而 蛋白 质 在 大 部 分 时 间 中 处 于 结合 GDP 的 无 活性 状态 。 只 有 当 细 胞
外 信号 诸如 结合 在 细胞 质 膜 受 体 上 的 生长 因子 作出 应 答 ， 它 结合 的 GDP 变 为
GTP 时 才 被 激活 。 如 此 Ras 蛋白 起 一 个 开关 作用 ， 它 的 活性 仅 取决 于 在 其 结合

-的 GDP 上 是 否 加 上 一 个 磷酸 。 这 和 cdk 蛋白 活性 控制 的 方式 一 样 。 其 他 一 些 蛋

司 汉 8

活化 磷酸 化 位 点

苏 氨 酸 上 激
活 磷酸 化 计 环
ud 入 多 肽 亚 基

磷酸 化 苏 氨 酸
(a) 分 子 的 精细 结构 人 b) 酶 激活 的 方式

图 2-22 cdk 酶 的 三 维 结构

AIE ， 环 封闭 底 物 位 点

结合 位 点
》
ct

无 活性 酶 关闭 活性 酶 打开
上

图 2-23 cdk 激活 的 精细 模型

白质 也 是 通过 结合 GDP 或 GTP， 来 控制 GTP 结合 蛋白 的 活性 。
正 像 cdk 香 白 的 活性 被 胞 环 素 、 和 蛋白 激酶 和 蛋白 磷酸 酯 酶 控制 一 样 ，Ras 和 蛋
白 和 其 他 GTP 结合 量 白 的 活性 也 是 取决 于 结合 GDP 还 是 结合 GTP。Ras 蛋白 被
GTP 酶 激活 蛋白 〈(GTPase-activating protein 或 GAP) 灭 活 ，GAP 结合 到 Ras 蛋
ee 44 折

白 上 并 诱导 它 对 结合 在 蛋白 质 上 的 GTP 水 解 ， 使 GTP 变 为 GDP， 且 牢固 地 结
合 在 上 面 。 因 此 该 Ras 蛋白 将 处 于 结合 有 GDP 的 无 活性 状态 ， 直 到 它 遇 到 一 个
鸟 苷 酸 释放 蛋白 (guanine nucleotide releasing protein，GNRP)，GNRP 能 结合 到
GDP-Ras 蛋白 上 ， 引 起 GDP 释放 。 因 为 空 出 的 核 苷 酸 结合 位 点 立刻 被 GTP 分 子
占 满 (在 细胞 中 GTP 比 GDP 多 很 多 )， 所 以 GNRP 是 间接 地 将 GTP 酶 水 解除 去
的 磷酸 又 加 回去 从 而 激活 Ras 蛋白 。 因 此 从 某 种 意义 上 讲 ，GAP 和 GNRP 的 作
用 分 别 和 蛋白 磷酸 酯 酶 和 蛋白 激酶 的 作用 类 似 。

EF-Tu 蛋白 中 的 变 构 转变 说 明了 一 个 小 的 变动 如 何 产生 大 的 移动 。

Ras 蛋白 是 单 体 调控 因子 GTP 酶 类 的 一 个 成 员 ， 这 个 家 族 中 每 个 成 员 均 有
大 约 20 个 氨基酸 的 GTP 结合 域 (domain)。 在 进化 进程 中 ， 这 种 区 域 也 可 以 加
入 到 其 他 蛋白 质 区 域 而 形成 一 个 GTP 结合 蛋白 大 家 族 ， 该 家 族 中 的 成 员 包 括 受
体 - 相 关 三 聚 G 蛋白 、 空 泡 和 细胞 内 小 室 之 间 的 交通 调控 蛋白 ， 结 合 到 RNA 上
的 这 类 和 蛋白质 对 核糖 体 上 的 蛋白 质 合 成 是 必需 的 。 这 类 和 蛋白 都 是 通过 Ras 类 区 域
中 的 GTP 的 水 解 而 引起 蛋白 质 构 型 改变 来 调控 重要 的 生物 活性 。

EF-Tu 蛋白 为 这 个 家 族 中 蛋白 如 何 工 作 提供 了 一 个 范例 。EF-Tu 是 细菌 细胞
中 丰富 的 分 子 ， 作 为 蛋白 质 生 物 合成 的 延伸 因子 ， 装 载 每 个 胺 酰 tRNA 分 子 进 入
核糖 体 。tRNA 分 子 与 结合 有 GTP 形式 的 EF-Tu 形成 紧密 复合 物 。 在 这 个 复合
物 中 ，tRNA 上 携带 的 氨基 酸 被 遮 藤 ， 当 随 着 结合 到 ET-Tu 上 的 GTP 水 解 ， 共 -
NA 被 释放 时 ， 核 糖 体 被 除去 遮蔽 并 暴露 出 氨基 酸 ， 这 对 和 蛋白质 的 合成 是 必需
的 。

已 经 用 射线 衍射 测定 了 结合 GTP 和 结合 GDP 形式 的 EF-Tu 的 三 维 结构 ，
研究 显示 出 了 tRNA 的 去 遮蔽 反应 是 如 何 发 生 的 。 随 着 GTP->GDP + Pi 的 反应 ，
无 机 磷酸 基 团 释放 ， 引 起 在 GTP 结合 位 点 的 几 十 分 之 一 毫 微米 的 滑动 ， 这 正如
在 Ras 蛋白 中 进行 的 那样 。 这 个 相当 于 一 个 氨 原 子 直径 几 倍 的 小 小 移动 ， 可 引起
一 个 构 型 改变 并 沿 着 该 蛋白 质 中 Ras 类 似 域 中 称 作 开关 螺旋 的 一 个 十 字形 螺旋
传递 。 这 个 开关 螺旋 似乎 可 以 作为 一 个 门 门 黏着 到 这 个 分 子 的 其 他 区 域 中 的 特殊
位 点 上 ， 使 蛋白 质 处 于 关闭 构 型 。GTP 水 解 引 起 开关 螺旋 变 构 使 两 个 区 域 分 开 ，
分 开 的 距离 大 约 4nm， 以 便 了 NA 释放 (图 2-24)。

从 这 个 例子 中 人 们 可 以 看 到 细胞 是 如 何 从 一 个 小 的 蛋白 质 区 域 上 发 生 的 简单
的 化 学 变化 发 展 成 具有 复杂 功能 的 大 蛋白 质 。

水 解 ATP 的 蛋白 质 在 细胞 中 做 机 械 功 。 像 用 于 调控 化 学 反应 一 样 ， 变 构 改
变形 状 也 可 用 于 调控 细胞 中 的 有 次 序 的 运动 。 例 如 ， 假 定 需要 一 个 蛋白 质 沿 着 像
DNA 这 样 的 分 子 一 样 的 细 线 “步行 ”， 那 么 变 构 蛋白 可 以 通过 一 系列 的 构 型 改变
也 许 能 完成 这 样 的 工作 。

如 何 使 一 系列 的 构 型 改变 呈 单 一 方向 ， 使 一 个 完整 的 循环 过 程 往 一 个 方向 进
村， 使 得 任何 一 步 都 不 可 逆 。 这 些 工作 所 用 的 机 制 正 如 通过 GTP 水 解 驱 使 一 个

SS

一 、

图 2-24 由 GTP 水 解 引 起 EF-TU 的 构 型 变化
(a) 结合 了 GTP 的 EF-Tu 的 三 维 结构 ， 在 Ras 同 源 结构 域 上 有 “螺旋 开关 ”; (b) 域 1 中 的
“螺旋 开关 ” 构 形 的 改变 引起 域 2 和 域 3 的 旋转 ， 释 放出 疏 NA。

1
直 ATP

PDT
水 解

SN 3

VGN

释放
ADe@ @

图 2-25 “一 个 变 构 马达 蛋白
。 46 ，

蛋白 质 构 象 变化 一 样 。 例 如 ， 因 为 当 GTP 被 水 解
时 ， 大 量 自 由 能 被 释放 ， 因 此 EF-Tu 蛋白 直接 地
将 一 个 磷酸 分 子 加 到 GDP 上 从 而 逆转 GTP 水 解 ，
这 几乎 是 不 可 能 的 。 同 样 的 原则 也 可 准确 地 用 于
ATP 的 水 解 ， 并 且 能 够 以 一 个 方向 长 距离 “ 步
行 ”的 和 蛋白质 〈( 叫 马达 蛋白 motor protein) 通过
水 解 ATP 完成 这 样 的 工作 。

在 图 2-25 中 ，ATP 结合 使 马达 蛋白 从 构 型 1
滑动 到 构 型 2。 结 合 的 ATP 接着 被 水 解 ， 产 生
ADP 和 无 机 磷酸 (Pi)， 引 起 从 构 型 2 到 构 型 3 的
变化 。 最 后 释放 出 ADP 和 无 机 磷酸 (Pi)， 驱 使
蛋白 质 从 构 型 3 回 到 构 型 1。 因 为 1->2->3~!1 的
转 位 由 水 解 ATP 提供 能 量 从 而 被 驱动 ， 因 此 在 生
理 条 件 下 〈 即 ADP 通过 1->2~>3->1 循环 再 与 Pi
联合 形成 ATP 的 可 能 性 很 低 )， 构 型 改变 将 是 有
效 和 不 可 逆 的 。 因 此 整个 循环 中 将 以 一 个 方向 前
进 ， 在 图 2-25 里 ， 引 起 蛋白 质 向 右 移 动 。 许 多 蛋
白质 以 这 种 方式 产生 方向 性 运动 ， 包 括 DNA 解

旋 酶 (DNA helicase)， 这 种 酶 以 每 秒 1000 个 核 苷 酸 的 速度 沿 着 DNA 自我 推进 。

肌 浆 球 蛋 白 的 结构 揭示 了 肌肉 如 何 产生 力 。 在 ATP 水 解 重复 循环 产生 的 能
量 的 驱使 下 ， 通 过 沿 蛋 白 纤 维 迅速 移 动 的 马达 和 蛋 日 产生 各 种 细胞 运动 (图 2-
25)。 马 达 蛋 白 是 肌 浆 球 蛋白 ， 它 沿 着 肌 动 蛋 白 纤维 的 移动 会 引起 细胞 内 的 运动
和 肌肉 的 收缩 。 在 肌 浆 球 和 蛋白 中 也 和 在 EF-Tu 中 一 样 ， 核 苷 酸 结合 位 点 上 的 一
个 小 的 移动 经 过 放大 效果 的 变 构 转 移 从 而 创造 扩大 的 有 次 序 的 蛋白 质 移动 。

ATP 驱使 的 变 构 蛋 白 起 离子 泵 作用 ， 也 能 反 过 来 合成 ATP。 除 了 产生 机 械
力 外 ， 变 构 蛋 白 能 利用 ATP 水 解 产 生 的 能 来 做 其 他 形式 的 工作 ， 将 特别 的 离子
和 泵 出 或 泵 入 细胞 。 例 如 ， 在 所 有 动物 细胞 质 膜 上 的 Na -K -ATPase， 在 ATP 水
解 驱使 的 构 型 变化 的 每 个 循环 中 ， 泵 出 三 个 Na* ， 泵 入 两 个 K- 。 在 大 多 数 细胞
中 这 种 ATP 驱使 的 泵 会 消耗 细胞 所 需 总 能 量 的 30%。 随 着 Na 的 不 断 泵 出 和
KK- 的 不 断 泵 入 ， 保 持 细胞 内 的 Na* 浓度 比 细胞 外 低 得 多 ， 而 细胞 内 的 K -浓度
比 细胞 外 的 高 得 多 ， 由 此 产生 跨越 细胞 质 膜 的 两 种 离子 梯度 (方向 相反 )。 路 越
细胞 质 膜 的 离子 梯度 能 够 储存 能 量 ， 正 像 一 个 水 坝 两 边 的 水 压 差 能 够 聚集 能 量 一
样 。 这 些 能 量 驱 使 那些 结合 在 膜 上 的 、 能 做 有 用 功 的 变 构 蛋白 发 生 多 种 多 样 的 构
型 变化 。 跨 越 细 胞 质 膜 的 巨大 的 Na 梯度 可 以 驱使 许多 其 他 的 质 膜 结 合 蛋 白质
和 泵 ， 该 泵 运输 葡萄 糖 或 氨基 酸 进 入 细胞 中 ， 在 Na-* 涌 入 的 同时 将 葡萄 糖 或 氨基
酸 运送 进 细胞 。

由 ATP 水 解 驱 使 的 膜 结合 变 构 泵 也 可 以 从 反面 来 工作 ， 使 用 离子 梯度 中 的
能 量 合成 ATP， 事 实 上 ， 跨 越 线粒体 内 膜 的 H* 梯度 以 这 种 方式 被 膜 结合 变 构 蛋
白 复 合 物 一 一 ATP 合成 酶 使 用 ， 它 合成 动物 细胞 所 需要 的 大 部 分 ATP。

蛋白 质 中 的 能 量 - 偶 联 变 构 使 其 行使 马达 (motor)、 时 钟 (clock)、 装 配 因子
(assembly factor) 或 信息 传感器 (transducers of information) 的 功能 。

蛋白 质 常常 形成 巨大 的 复合 物 ， 行 使 蛋 日 质 机 器 的 功能 。 在 体外 系统 中 可 以
看 到 细胞 内 每 一 个 核心 过 程 ， 诸 如 DNA 复制 、RNA 或 蛋白 质 的 合成 、 空 泡 的 出
芽 或 者 发 出 转送 膜 信 号 等 均 由 10 种 以 上 的 蛋白 质 催 化 。 在 这 样 的 蛋白 质 机 器 中
核 苷 三 磷酸 的 水 解 (ATP 或 GTP) 可 以 按 次 序 驱 使 各 种 蛋白 质 的 构 型 改变 ， 使
全 部 蛋白 质 协 调 移动 。 例 如 酶 可 以 以 这 种 方式 被 直接 移动 到 它 所 需要 执行 反应 的
每 个 位 置 上 ， 而 不 是 等 待 反应 所 需 的 各 个 分 散 成 分 的 随机 聚集 。

三 、 蛋 白质 重 要 的 结构 域
(一 ) 结构 域 的 化 学 概念
Wetlaufer 于 1973 年 根据 对 蛋白 质 结构 及 折 和 县 机 制 的 研究 结果 ， 提 出 了 介 于

二 级 结构 和 三 级 结构 之 间 还 存在 另 一 种 结构 层次 即 结构 域 (domain)。 他 定义 结
。 47 ，

构 域 为 蛋白 质 亚 基 结构 中 明显 分 开 的 紧密 球状 结构 区 域 ， 又 称 为 辖区 ; 可 以 通过
X 射线 晶体 衍射 或 电镜 识别 之 。 结 构 域 的 概念 现 已 被 生物 学 工作 者 普遍 接受 。 的
确 ， 在 一 些 较 大 的 蛋白 质 中 ， 往 往 存在 两 个 或 多 个 在 空间 上 可 明显 区 分 的 、 相 对
独立 的 区 域 性 结构 。 而 对 于 较 小 的 和 蛋白质 分 子 ， 结 构 域 和 它 的 三 级 结构 往往 是 一
个 意思 。 结 构 域 与 结构 域 之 间 常 常 有 一 段 长 短 不 等 的 肽 链 相 连 ， 并 且 在 两 个 结构
域 之 间 有 一 明显 的 “ 颈 部 ”或 称 为 “ 止 口 ”， 形 成 所 谓 匀 链 区 (hinge region)。 不
同 的 蛋白 质 中 ， 其 结构 域 的 数目 不 同 。 常 见 结构 域 的 氨基 酸 残 基数 在 100 一 400
个 之 间 ， 最 小 的 结构 域 只 有 40 一 50 个 氨基 酸 残 基 ， 最 大 的 结构 域 可 超过 400 个
氨基 酸 残 基 。 结 构 域 常常 具有 某 些 有 趣 的 结构 特征 ， 比 如 有 的 结构 域 的 特殊 氨基
酸 含 量 之 高 异乎 寻常 〈 富 含 Pro 结构 域 ， 酸 性 氨基 酸 结 构 域 和 富 含 Gly 结构 域
等 )， 有 的 结构 域 出 现在 多 种 蛋白 质 分 子 中 (Src 同 源 结 构 域 SH2 和 SH3 等 )，
有 的 结构 域 含有 特殊 的 二 级 结构 组 合 一 一 结构 花 式 。

有 时 也 可 以 从 功能 的 角度 给 结构 域 下 定义 : 结构 域 是 蛋白 质 分 子 中 具有 一 定
活性 的 小 区 域 。 例 如 ， 负 责 催 化 功能 的 区 域 (激酶 结构 域 等 )， 或 者 结合 功能 的
区 域 (DNA 结合 结构 域 ， 膜 结合 结构 域 等 )。 利 用 和 蛋白酶 将 蛋白 质 分 子 切 割 成 最
小 的 有 活性 的 片段 ， 是 常用 的 发 现 功能 性 结构 域 的 实验 方法 。 另 一 种 方法 是 ， 利
用 基因 诱 变 去 除 蛋白 质 分 子 的 部 分 肽 段 ， 再 检测 其 功能 。

结构 域 的 功能 性 定义 不 如 结构 性 定义 严格 。 然 而 ， 如 果 蛋 白质 分 子 的 三 维 结
构 尚 不 清楚 ， 功 能 性 结构 域 的 发 现 可 以 提供 有 用 的 蛋白 质 信 息 ; 因为 蛋白 质 活 性
通常 依赖 于 一 定 的 三 维 结构 ， 而 功能 性 结构 域 至 少 由 一 个 “〈 一 般 几 个 ) 结构 性 结
构 域 组 成 。

(二 ) 结构 域 与 恒 日 质 结构 与 功能

蛋白 质 的 生物 学 功能 是 以 其 化 学 组 成 和 结构 为 基础 的 。 一 种 蛋白 质 的 生物 功
能 的 实现 ， 不 仅 需要 一 定 的 化 学 结构 ， 而 且 还 需要 分 子 的 一 定 空间 构象 。 下 面 将
分 化 学 结构 与 功能 、 蛋 白质 构象 与 功能 的 关系 做 扼要 的 论述 。

1. 蛋白 质 的 化 学 结构 (一 级 结构 ) 与 功能

蛋白 质 实 现 其 生物 学 功能 ， 从 根本 上 说 决定 于 它 的 化 学 结构 。 如 蛋白 质 分 子
异常 而 导致 的 分 子 病 ， 多 肽 的 切割 加 工 ， 蛋 白质 的 化 学 修饰 等 都 从 一 个 侧面 反映
了 蛋白质 的 化 学 结构 与 其 功能 的 关系 。

(1) 一 级 结构 的 细微 变化 可 直接 影响 其 功能

某 些 蛋 日 质 分 子 中 个 别 氨基 酸 残 基 或 某 一 肽 段 的 被 切除 或 置换 即 导 致 活性 改
变 或 失 活 。 例 如 ， 胰 岛 素 分 子 病 是 由 于 胰岛 素 分 子 中 也 链 第 24 位 的 葵 丙 所 酸 被
亮 氨 酸 取代 ， 使 胰岛 素 成 为 活性 很 低 的 分 子 ， 不 能 降 血糖 。 镁 状 红 细胞 贫血 是 由

“8

于 血红 蛋白 基因 中 的 一 个 核 甘 酸 的 突变 导致 该 蛋白 质 分 子 中 8B 链 第 6 位 的 谷 氢 酸
被 顷 氨 酸 取代 。1988 年 ， 美 国 国立 瘤 症 研究 所 的 Barbacid 和 麻 省 理工 学 院 的
Weinberg 发 现 ;， 膀胱 癌 细 胞 中 的 一 种 P21 蛋白 (M,=21 000Da) 与 正常 细胞 中
的 这 一 蛋白 相 比 ， 也 仅仅 是 一 个 氨基 酸 的 差异 (第 12 位 甘氨酸 被 顷 氢 酸 取 代 )，
因而 发 生 癌 变 。 胃 蛋白 酶 分 子 中 的 Glu-Ser-Thr 肽 段 是 表现 消化 力 的 必需 结构 ，
一 经 破坏 ， 即 失去 活性 。

(2) 多 肽 的 切割 加 工

真 核 细 胞 中 ， 负 责 蛋白 质 合成 的 核糖 体 是 同 内 质 网 相连 的 。 在 核糖 体 上 合成
的 分 泌 型 蛋白 质 的 N 端 都 有 由 15 一 30 个 朴 水 性 氨基 酸 组 成 的 一 段 小 肽 ， 即 信和 号
肽 。 它 的 作用 是 使 蛋白 质 从 内 质 网 进入 高 尔 基 体 ， 在 高 尔 基 体内 信和 号 肽 被 信号 肽
酶 切除 。 此 时 分 泌 出 细胞 的 蛋白 质 就 具有 生物 学 活性 。 有 些 蛋 白质 只 经 过 一 次 加
工 切 除 信号 肽 还 不 表现 出 生物 学 活性 ， 还 要 经 第 二 次 加 工 。 例 如 ， 胰 岛 素 在 含 信
号 肽 时 称 为 前 胰岛 素 原 ， 切 除 信和 号 肽 后 生成 的 胰 名 素 原 还 要 经 过 加 工 方 能 成 为 有
活性 的 胰岛 素 。

(3) 蛋白质 的 化 学 修饰

蛋白 质 可 通过 化 学 修饰 来 调控 其 生物 学 活性 。 化 学 修饰 主要 有 磷酸 化 和 糖 基
化 两 种 形式 。@ 蛋白 质 磷酸 化 。 和 蛋白 激酶 将 ATP 末端 磷酸 基 团 转移 至 多 肽 链 中
的 氨基 酸 残 基 上 。 一 般 的 蛋白 激酶 是 将 磷酸 基 团 转移 到 丝氨酸 和 苏 氨 酸 的 残 基
上 ; 癌 基 因 编 码 产 生 的 蛋白 激酶 则 多 半 是 酷 氨 酸 激酶 ， 即 将 磷酸 基 团 转移 到 酷 氨
酸 残 基 上 。 磷 酸化 可 以 大 大 提高 酶 蛋白 的 活性 ， 如 RNA 聚合 酶 I 被 专 一 的 蛋白
激酶 磷酸 化 后 ， 其 聚合 活性 提高 了 3 一 4 倍 。 但 是 ， 也 有 本 在 被 磷酸 化 后 ， 其 酶
活性 会 降低 甚至 消失 。@ 蛋白 糖 基 化 。 许 多 重要 的 细胞 表面 蛋白 ， 识 别 蛋 白 和
分 泌 蛋 和 白 都 带 有 一 个 或 几 个 糖 基 。 蛋 白质 糖 基 化 后 其 构 型 通常 会 发 生变 化 ， 有 助
于 抵御 蛋白 酶 的 降解 作用 ， 并 可 提高 蛋白 质 的 可 溶性 ， 以 及 可 使 蛋白 质 准确 地 进
入 各 自 的 细胞 右 。

2. 蛋白 质 的 构象 与 功能

(1) 细胞 内 分 子 伴侣 辅助 蛋白 质 折 和 有 登 成 正确 构 象

在 体外 蛋白 质 一 般 不 能 正确 、 有 效 地 折 友 ， 只 有 少数 蛋白 质 能 在 几 分 钟 内 完
成 折 登 。 在 细胞 内 ， 蛋 白质 浓度 高 达 100mg/ml， 这 种 高 浓度 在 体外 将 造成 蛋白
质 沉 淀 ; 然而 大 约 95% 存 在 于 细胞 中 的 蛋白 质 显 示 天 然 构 象 。 蛋 和 白质 分 子 伴侣
(molecular chaperone) 的 广泛 存在 ， 可 以 解释 为 什么 在 细胞 内 蛋白 质 折 和 琶 如 此 有
效 。 分 子 伴 但是 一 个 新 发 现 的 蛋白 质 家 族 ， 广 泛 存 在 于 从 细菌 到 人 的 细胞 中 。 分
子 伴 侣 能 够 结合 各 种 蛋白 质 分 子 ， 可 以 参与 蛋白 质 的 一 般 折 释 过 程 。 分 子 伴侣 通
稍 以 下 面 的 两 个 方式 帮助 蛋白 质 分 子 折 友 : @ 结合 并 稳定 未 折 丢 的 或 部 分 折 笃
的 蛋白 质 分 子 ， 防 止 它 们 降解 ; @) 直接 促进 蛋白 质 分 子 折 丢 。

*。， 49 ，

分 子 伴侣 结合 并 稳定 其 靶 和 蛋白 的 能 力 具 有 特异 性 ， 并 且 依 赖 于 ATP 的 水 解 。

(2) 有 蛋白质 的 构象 与 功能

生物 体内 各 种 蛋白 质 都 折 生 成 特定 的 构象 是 与 它们 各 自 的 功能 相 适 应 的 ， 构
象 改 变 会 导致 重 白质 功能 改变 或 天 失 。 例 如 ， 核 糖 核酸 酶 因 高 浓度 的 尿素 的 影
响 ， 二 硫 键 被 破坏 ， 肽 链 伸展 ， 活 性 天 失 。 许 多 蛋白 质 行使 功能 时 需要 蛋白 质 内
亚 基 与 亚 基 之 间或 蛋白 质 与 蛋白 质 之 间 相 互 作 用 形成 同 源 或 异 源 多 聚 体 或 大 分 子
复合 物 。 在 相互 作用 时 ， 双 方 或 单方 的 结构 或 构象 发 生 改变 ， 进 而 影响 蛋白 质 生
物 功能 ， 如 血红 蛋白 和 原 瘤 基因 C-1jos 的 蛋白 产物 等 。

血红 蛋白 〈 包 括 人 及 马 的 血红 蛋白 ) 是 由 两 条 u- 肽 链 及 两 条 B- 肽 链 所 组 成 。
xu 和 B- 肽 链 各 分 为 A、B、C、D、E、F、G、H 八 段 ， 每 段 的 氨基 酸 的 残 基数 不
等 。 每 条 肽 链 各 连接 一 个 血红 素 形 成 一 个 亚 基 ， 亚 基 与 亚 基 之 间 有 8 个 盐 键 。 由
于 8 个 盐 键 的 存在 ， 使 整个 血红 蛋白 分 子 的 结构 相当 紧密 ， 不 易 与 氧 分 子 结合 。
但 当 氧 分 子 与 血红 蛋白 中 一 个 亚 基 的 血红 素 的 铁 〈Fe2+ ) 结合 后 ， 铁 原子 的 半
径 缩小 ， 就 能 进入 中 啉 环 中 的 空 穴 中 ， 并 与 它 相 邻 的 FF 肽 段 的 组 氨 酸 的 残 基
(His，F8) 相 吸 引 而 移动 ; 遂 使 它 所 在 的 亚 基 构象 发 生 大 的 改变 ， 导 致 亚 基 间 的
盐 键 破 裂 ; 从 而 使 原来 结合 紧密 的 血红 蛋白 分 子 变 得 松散 ， 易 于 与 氧 分 子 结合 。
盐 键 的 断裂 也 使 B- 亚 基 的 构象 发 生变 化 : 排除 了 El11Val 侧 链 对 氧 结合 部 位 的 空
间 障 碍 ， 使 B 亚 基 能 够 与 氧 结合 ;并 增加 与 氧 的 亲和力 ， 使 B 亚 基 与 氧 结合 的 速
度 加 快 数 百 倍 。 氧 合 反应 最 后 使 盐 键 全 部 断裂 ， 整 个 血红 蛋白 分 子 就 成 为 氧 合 血
红 蛋 白 的 构象 。 像 氧 合 血红 蛋白 这 样 由 亚 基 组 成 的 蛋白 质 ， 由 于 亚 基 构 象 的 改变
而 引起 其 余 亚 基 以 及 整个 分 子 的 构象 、 性 质 和 功能 的 改变 ， 就 是 蛋白 质 的 变 构 效
应 。 变 构 效应 不 限于 血红 蛋白 ， 许 多 酶 蛋白 在 催化 过 程 中 也 普遍 存在 着 这 种 效
应 。 原 癌 基 因 c-jos 的 蛋白 产物 是 人 酸 化 蛋白 ， 有 一 个 亮 氨 酸 拉链 区 ， 却 不 能 形
成 同 源 二 聚 体 。 可 是 ， 它 可 以 与 cj 的 蛋白 产物 中 的 拉链 区 形成 异 源 二 事 体 。
c-jos 的 蛋白 产物 本 身 不 能 同 DNA 结合 ， 可 是 一 旦 同 c-jxwz 的 蛋白 质 产 物 形成 拉
链 式 异 源 二 聚 体 后 ， 却 能 与 jun-jun 同 源 二 聚 体 一 样 具有 DNA 结合 能 力 ， 且 表现
出 更 高 的 亲和力 。

结构 域 作 为 蛋白 质 结 构 中 的 紧密 球状 结构 单元 ， 广 谤 存在 于 球状 蛋白 质 中 ，
其 域 间 连 接 从 IgG 的 松散 连接 到 木瓜 蛋白 酶 、 溶 菌 酶 等 小 分 子 蛋 和 白 的 紧密 连接 。
结构 域 作为 功能 单位 表现 在 不 同 的 结构 域 具有 特定 的 功能 、 如 结合 底 物 、 催 化 反
应 、 亚 基 间 相互 作用 及 活性 调节 等 。 结 构 域 作为 结构 和 功能 单位 ， 对 于 功能 复杂
的 蛋白 质 的 构成 具有 重要 意义 。 在 这 些 和 蛋白 质 中 结构 域 往 往 以 组 件 方式 相互 组 合
从 而 构成 具有 多 种 不 同 功能 的 分 子 。 多 功能 酶 DNA 聚合 酶 工 是 这 种 情况 的 典型
例子 (图 2-26)。

“0 。

区 es
聚合 酶 3-5' 外 切 核 酸 酶 5-3' 外 切 核 酸 酶
和
Klenow 片段

图 2-26_ 大肠 杆菌 DNA 聚合 酶 的 结构 域 结构 示意 图
(三 ) 蛋白 质 重要 的 结构 域

文献 中 已 介绍 多 种 重要 的 蛋 白 质 结构 域 ， 这 里 将 围绕 蛋 白 质 与 核酸 相互 作
用 ， 蛋 白质 与 蛋白 质 相 互 作用 集中 介绍 锌 指 结构 ， 亮 氨 酸 拉链 等 几 种 重要 的 蛋白
质 结 构 域 ， 以 加 深 读 者 对 结构 域 的 结构 与 功能 的 认识 。

1. 蛋白 质 的 DNA 结合 结构 域

(1) 锌 指 结构
“ 锌 指 ”(Zinc finger) 结构 由 重复 的 半 胱 氨 酸 和 组 氨 酸 或 重复 的 半 胱 氨 酸 在
一 个 金属 锌 离子 四 周 形成 一 个 四 面体 的 排列 。 由 于 在 锌 结合 位 点 上 突出 的 氨基 栈
环 的 形状 如 同 手指 ， 所 以 称 为 “ 指 状 ”结构 。 这 种 蛋白 质 结构 域 是 同 DNA (或
RNA) 结合 的 部 位 。 也 有 些 “ 锌 指 ”结构 与 蛋白 质 相 互 作用 有 关 。

“ 鲜 指 ”结构 最 初 是 在 爪 昌 (Xezopuws aevis) 的 RNA 聚合 酶 III 转录 因子
(TF IIIA) 中 发 现 的 。 这 是 九 个 串联 重复 的 锌 指 区 ， 每 个 单位 大 约 由 30 个 氨基
酸 残 基 组 成 。 许 多 种 调控 蛋白 质 都 有 数目 不 等 的 锌 指 结构 。 含 有 和 锌 指 的 蛋白 与
DNA 的 结合 方式 可 能 互 不 相同 ， 有 些 情 况 下 和 锌 指 结构 中 的 氨基 酸 残 基 参 加 对
DNA 顺序 的 识别 ， 有 些 和 蛋白 的 锌 指 却 只 是 促进 与 DNA 的 非特 异性 结合 ， 而 顺序
的 识别 是 由 蛋白 质 分 子 中 的 其 他 部 分 进行 的 。

锌 指 有 两 种 类 型 : CH，C4; 其 中 ，C 代表 Cys，H 代 表 His。

OO C 瑟 和 镑 指 。CzH2 锌 指 是 最 普遍 的 真 核 转录 因子 DNA 结合 结构 域 之 一 ，
迄今 发 现 的 含有 CzH， 锌 指 结构 的 高 等 真 核 生 物 蛋 白质 已 超过 1000 种 。 典 型 的
CH 约 由 23 个 氨基 酸 残 基 组 成 。 其 中 ， 保 守 残 基 是 结合 锌 离子 的 2 个 Cys 和 2
个 His， 以 及 1 个 Phe 和 1 个 Leu。 锌 离子 位 于 2 个 Cys 和 2 个 His 形成 的 四 面体
结构 的 中 心 (图 2-27)。Cz 了 HI 锌 指 一 般 为 连 串 重复 排列 ， 锌 指 之 间 通 常 有 7 一 8
个 氨基 酸 残 基 。 爪 蟾 的 SS RNA 转录 因子 TF IIIA 有 9 个 连续 的 锌 指 ; 果 蝇 调节
因子 ADRI 的 DNA 结合 结构 域 很 少 ， 只 有 2 个 CH2 锌 指 ; 尽管 CH 锌 指 蛋 白

有 多 个 锌 指 ， 但 不 一 定 每 个 锌 指 都 接触 DNA。 例 如 ， 人 GL1 蛋白 有 5 个 锌 指 ，
第 一 个 锌 指 就 不 接触 DNA。

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图 2-27 CH 型 “ 锌 指 ” 蛋 白 结 构

CE 锌 指 -DNA 晶体 结构 显示 ， 每 个 锌 指 的 N 端 部 分 形成 一 对 反 向 B 折 等 ;
而 C 端 部 分 形成 一 个 a 螺旋 同 DNA 的 大 沟 结合 ， 与 大 约 5 个 核 苷 酸 相 互 作用 ，
从 而 起 到 识别 并 结合 DNA 序列 的 功能 (图 2-28)。

@ C4 型 锌 指 。C3 型 锌 指 蛋 白 已 发 现 100 多 种 ， 主 要 是 类 固 醇 受 体 家 族 成 员
组 成 的 转录 因子 。C4 型 由 数目 不 等 的 Cys 同 金属 锌 离子 鳌 合 。C4 类 的 结构 同
CH 相似 : CX-C-Xi3-C-X-C， 由 13 个 氨基 酸 残 基 构 成 一 个 环 。C5 的 结构 是
C 交 -CC- 海 -他 殉 写 注 FGhuE5 的 结构 则 是 C- 友 -C-XcCXGC- 殉 号 汪 RS
可 能 有 多 个 金属 离子 与 Cys 鳌 合 。C4 锌 指 蛋白 通常 仅 含有 少量 锌 指 ， 识 别 DNA
短 回 文 序列 或 同 向 重复 序列 ， 以 同 源 或 异 源 二 聚 体 的 形式 行使 功能 ， 而 CH 和 锌
指 蛋白 含有 多 个 重复 排列 的 锌 指 ， 并 且 以 单 体形 式 结合 DNA。

糖 皮质 激素 受 体 和 肉 激 素 受 体 都 有 2 个 C 锌 指 ， 彼 此 间隔 7 个 氨基 酸 残 基 ，
锌 离子 位 于 每 个 锌 指 的 Cys 四 面体 结构 中 心 。 这 两 个 锌 指 的 两 个 wa 螺旋 折 释 成 球
形 ， 与 之 接触 的 是 B 折 赫 。 第 一 个 锌 指 右 侧 的 氨基 酸 残 基 (螺旋 ) 结合 于 DNA
大 沟 ， 而 第 二 个 锌 指 左 侧 的 氨基 酸 残 基调 节 其 形成 二 聚 体 的 能 力 。 在 糖 皮质 激素
受 体 锌 指 第 一 个 锌 指 的 右 侧 有 2 个 特异 的 氨基酸 残 基 Gly 和 Ser， 而 雌 激 素 受 体
的 相应 位 点 是 Glu 和 Gly。 这 两 个 残 基 以 及 附近 间隔 区 的 一 个 氨基 酸 残 基 决 定 受
体 DNA 结合 位 点 的 特异 性 ， 使 它们 分 别 结合 于 特异 的 应 答 元 件 (GRE 和 ERE)。
这 两 种 受 体 基因 碱 基 序 列 的 区 别 主 要 集中 在 第 一 个 锌 指 ， 特 别 是 上 述 3 个 氨基 酸
残 基 。 如 果 进 行 “ 特 异性 交换 ”(specificity swap) 实验 ， 使 肉 激 素 受 体 的 第 一 个

2 。

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图 2-28 “和 锌 指 ” 可 形成 螺旋 插入 DNA 大 沟 ， 另 一 侧 呈 8 片 层 结构

锌 指 缺 失 ， 代 之 以 糖 皮质 激素 受 体 的 第 一 个 锌 指 ; 结果 显示 新 蛋白 识别 糖 皮质 激
素 应 答 元 件 (GRE )， 这 证 明 两 种 受 体 的 第 一 个 锌 指 决定 DNA 识别 特异 性 。

Cs 冬 指 蛋白 以 酵母 转录 因子 Gal4 为 代表 。Gal4 以 二 聚 体形 式 结合 于 DNA_
两 个 单 体 通过 它们 的 a 螺旋 一 侧 的 疏水 侧 链 相互 作用 ， 形 成 卷曲 线 团 (coiled
coil)。 类 似 的 相互 作用 也 出 现 于 亮 氨 酸 拉链 蛋白 二 聚 体 。

一 个 蛋白 质 分 子 也 可 能 存在 两 种 指 状 结构 。 例 如 ， 类 固 醇 受 体 就 含有 两 个 显
然 是 相互 无 关 的 指 状 结构 ， 分 别 由 两 个 外 显 子 编码 。

(2) 螺旋 -拐角 -螺旋

这 是 第 一 个 经 过 详细 研究 的 DNA 结合 结构 域 ， 它 是 许多 原核 生物 调节 蛋白
中 蛋白质 与 DNA 相互 作用 的 重要 结构 ， 类 似 的 结构 域 也 存在 于 真 核 调节 蛋白
中 。 螺 旋 - 拐 角 - 螺 旋 (helix-turm_helix，HTH) 有 两 个 7 一 9 个 氨基 酸 残 基 组 成 的

3

ao 螺旋 ， 中 间 由 一 个 含有 睛 氨 酸 的 拐角 分 开 。 该 拐角 不 是 随机 的 构象 而 是 一 种 特定
的 结构 拐角 (turn)， 由 4 个 氨基 酸 组 成 ， 其 中 第 二 个 通常 是 甘氨酸 。 这 个 拐角
与 第 一 个 "螺旋 一 起 将 第 二 个 a 螺旋 以 一 定 方向 置 于 蛋白 质 表 面 ， 使 其 可 进入
DNA 分 子 大 沟 内 部 。 因 此 ， 这 第 二 个 w 螺旋 是 识别 螺旋 (recognition helixz)， 它
通常 含有 许多 能 和 DNA 相互 作用 的 氨基 酸 。 这 种 HTH 结构 通常 具有 约 20 个 氢
基 酸 ， 并 且 本 身 不 是 很 稳定 ， 但 它 是 较 大 的 DNA 结合 结构 域 中 起 关键 作用 的 部
人

和 鸣 菌 体 的 阻 遇 蛋白 就 有 这 种 DNA 结合 结构 域 。 在 阻 巡 蛋白 N 端 有 5 段 a
螺旋 ， 每 段 螺旋 之 间 折 转 成 一 定 角 度 相 连接 ， 其 中 两 段 负责 同 DNA 结合 (图 2-
29)。a 螺旋 3 由 9 个 氨基 酸 组 成 ， 与 前 面 的 由 7 个 氨基 酸 组 成 的 " 螺旋 形成 一 个
角度 。a 螺旋 3 通过 氨基 酸 侧 链 和 DNA 碱 基 之 间 的 氢 键 同 DNA 序列 相 结合 ，3
个 氨基 酸 识别 3 个 碱 基 ， 所 以 螺旋 3 被 称 为 识别 螺旋 。a 螺旋 2 则 是 通过 氢 键
同 DNA 的 磷酸 骨架 相 接触 。 这 种 相互 作用 对 于 同 DNA 结合 是 必需 的 ， 但 并 不
控制 对 靶 序 列 识 别 的 专 一 性 。

图 2-29 用 X 射 线 衍射 法 测定 的 入 阻 过 蛋白 N 端 结 构 域 的 结构
(a) 示 蛋 白 链 的 折 和 至 (二 维 )， 每 一 个 点 代表 一 个 氨基 酸 的 "- 碳 的 位 置 ， 链 上 有 5 个 w 螺 旋 区 ; (b) 示
用 和 匹 形 框 出 的 5 个 “螺旋 区 ; 〈(c) 结构 域 的 示意 模型 ， 圆 柱 体 代表 u 螺旋 区 ， 线 代表 非 螺旋 区 ，a 螺旋
3 从 表面 向 外 突出 。

(3) 同 质 异 形 结 构 域

同 质 异 形 结构 域 (homeodomain，HD) 也 叫 同 源 框 结构 域 或 同 源 域 ， 它 由
60 个 氨基 酸 残 基 组 成 ， 而 且 这 个 肽 段 里 的 氨基 酸 组 成 在 进化 上 是 高 度 保 守 的 ，
从 果 蝇 、 小 鼠 到 人 很 少 发 生 改 变 。 编 码 这 种 结构 域 的 DNA 顺序 叫做 同 质 异型 盒
或 同 源 异形 框 (homeobox)。 同 质 异 型 盒 相关 序列 和 HD 和 蛋白 ， 广 谤 分 布 在 从 酵
母 到 哺乳 动物 的 所 有 真 核 生 物 ， 仅 果 蝇 就 有 60 多 种 HD 蛋白 。HD 蛋白 对 真 核 生
物 发 育 和 分 化 调控 具有 十 分 重要 的 作用 。

人 3

不 同 基因 的 同 质 异 型 盒 序列 的 保守 性 可 以 改变 。 果 蝇 3 号 染色 体 有 两 个 主要
的 同 质 异 形 基因 簇 ANT-C 和 BX-C: ANT-C 有 5 个 基因 ， 负 责 头 部 -前 脑 的 发
育 ; BX-C 有 3 个 基因 ， 负 责 后 脑 -腹部 的 发 育 ， 这 些 基因 的 同 源 异 形 框 相当 保
守 ， 其 序列 有 80% 一 90% 的 碱 基 对 相同 。 但 在 其 他 含 同 源 异 形 框 的 果 蝇 基因 中 ，
同 源 异 形 框 之 间 的 相似 程度 很 低 。 动 物 有 几 种 转录 因子 含 HD， 但 果 蝇 和 哺乳 动
物 HD 之 间 的 氨基 酸 顺 序 保守 性 明显 下 降 [图 2-30，(a)]。 虽 然 酵 母 和 果 晶 HD
之 间 的 相似 性 只 有 大 约 30%， 但 其 识别 DNA 的 方式 却 相同 。

HD 识别 DNA 序列 的 机 制 与 入 阻 遇 蛋白 的 HTH 相似 。HD 的 60 个 氨基 酸 残
基 组 成 3 个 w 螺旋， 其 中 最 保守 的 螺旋 3 结合 于 DNA 双 螺 旋 的 大 沟 [图 2-30，
(b)]; 而 wa 螺旋 1 和 wa 螺旋 2 反 向 平行 排列 ， 位 于 双 螺 旋 外 面 。 在 结构 上 ，HD
和 原核 阻 遏 蛋白 HTH 的 区 别 在 于 : HD 的 螺旋 3 长 度 为 17 个 氨基 酸 残 基 ， 而
入 阻 过 蛋白 的 "螺旋 3 只 有 7 个 氨基 酸 。

A SKRGRTAYTRPQLVELEFERTHFNRYLIRPRRVE 其 ANLLCLTERQIKTIWRQNRRIEYKKDN
B REKRGRQTYTRYQTLELEKFEEHFNRYLTRRRRIEIAHVLCETERQIKIWRERNRRNENKKEN
C RKRGRQTYTRYQTLELEKEETHFNRYLTRRRRIETAHALCETERQIKIWRQNRRIEKNKKEN
D KPYREHRETKENVRIIESWEAKNPYLDTKGLENLIKNTSLSRIQIRNWYSNRRRKFKETIT

螺旋 2

图 2-30 同 源 框 结 构 域 (HD)
(a) HD 模 体 经 常 出 现 于 发 育 调节 因子 分 子 ， 例 如 ，A 为 哺乳 动物 小 鼠 MO-10 基因 、B 为 两 栖 动物
峙 MM3 基因 、C 为 昆虫 果 蝇 Antp 基因 和 了 为 酵母 MATa2 基因 ， 其 氨基 酸 顺 序 相似 ， 尤 其 是 wx 螺
旋 3 最 保守 ， 但 哺乳 动物 和 果 蝇 HD 之 间 的 相似 程度 明显 下 降 ;， (b) HD 模 体 由 3 个 w 螺旋 组 成 。
x 曙 旋 3 插入 DNA 大 沟 ，w 螺旋 1 和 螺旋 2 反 平 行 排列 ，HD 的 N 端 臂 与 DNA 的 小 沟 接触 。

2. 蛋白 质 的 RNA 结合 结构 域

RNA 结合 量 晶 的 主要 RNA 结合 结构 域 有 :

= 3 。

核糖 核 蛋 白 结构 域 [ribonuceloprotein (RNP) domain] 包括 4 个 B 链 和 2 个 wa
曙 旋 ， 其 顺序 是 B-o-B-B-o-B。 两 个 中 央 B 链 构成 与 RNA 分 子 的 主要 接触 。RNP
结构 域 是 最 普遍 的 RNA 结合 结构 ， 现 已 在 250 种 以 上 的 蛋白 质 中 发 现 。 由 于 此
类 RNP 只 存在 于 细胞 核 内 ， 因 此 可 能 与 RNA 在 核 内 的 滞留 有关 。 此 外 ， 由 于
这 种 RNP 与 被 剪 切 的 内 含 子 3 端的 多 聚 喀 喧 区 及 其 下 游 polyA 拼接 点 的 RNA 序
列 有 关 ， 所 以 可 能 参与 剪接 和 polyA 拼接 的 调控 。

RGG 盒 。RGG 盒 是 由 20 一 25 个 氨基 酸 组 成 的 RNA 结合 单元 ， 常 与 其 他 类
型 的 RNA 结合 结构 域 共同 存在 ， 最 早 发 现 于 hnRNPU 的 RNA 结合 结构 域 中 。
这 一 序列 的 特征 是 较 密 集 的 、 多 拷贝 的 Arg-Gly-Gly (RGG) 重复 序列 ， 间 隔 以
其 他 氨基 酸 ， 最 常见 的 是 芳香 族 的 氨基 酸 。 不 同 RNA 结合 蛋白 中 RGG 重复 序
列 可 达 6 一 18 次 。 在 核 仁 蛋白 中 ，4 个 RNP 基 序 可 特异 地 与 核糖 体 RNA 前 体 结
合 ， 而 核 仁 蛋白 中 唯一 的 RGG 盒 区 可 将 亲和力 提高 10 倍 。

双 链 RNA 结合 结构 域 (double-strande RNA binding domain，dsRBD) 与
RNP 结构 域 相 似 ， 但 其 结构 是 wpB-B-B-as 它 的 RNA 结合 作用 存在 于 结构 两 端的
ac 和 8B 间 ， 此 结构 发 现 于 结合 双 链 RNA 的 蛋白 中 ， 而 且 发 现 愈 来 愈 多 的 RNA 结
合 蛋白 含有 一 个 或 多 个 拷贝 的 双 链 RNA 结合 区 。 它 大 约 由 70 个 氨基 酸 残 基 组
成 ， 含 有 碱 性 和 玻 水 性 氨基 酸 ， 散 布 在 DSRM 区 内 。 哺 乳 动物 细胞 对 病毒 感染
的 重要 应 答 产 物 是 一 种 干扰 素 诱导 的 蛋白 激酶 ， 它 含有 两 个 DSRM， 能 与 RNA
双 链 结合 。 当 被 病毒 dsRNA 激活 时 可 封闭 宿主 蛋白 的 合成 ， 因 此 又 名 为 dsSRNA
激活 抑制 物 (DAI)。

k- 同 源 结 构 域 (k-homology domain) 结构 是 B-o-u-B-a-a， 结 合 功能 存在 于
螺旋 对 中 。 这 种 结构 并 不 常见 ， 但 存在 于 至 少 一 个 结合 蛋 自 中 。 在 人 的
hnRNP-K 蛋 白 中 发 现 ， 已 知 功能 的 KH 结构 蛋白 都 以 与 RNA 结合 的 形式 存在 ，
而 且 最 近 有 证 据 表明 KH 基 序 是 直接 接合 RNA 所 必需 的 。

在 某 些 蛋白 质 中 结合 DNA 的 同 源 异 形 结构 域 也 可 能 有 RNA 结合 活性 。 有
一 种 核糖 体 蛋白 用 相似 于 同 源 异 形 结构 域 的 结构 结合 RNA; 一 些 同 源 异 形 结构
域 蛋 白 ， 如 黑 腹 果 蝇 的 Bicoid 既 可 结合 DNA， 又 可 结合 RNA。

锌 指 也 有 RNA 结合 结构 域 的 功能 。 例 如 ， 一 些 蛋 白 通 过 和 锌 指 结合 真 核
mRNA， 起 到 翻译 阻 过 子 的 作用 。TEFIILA 为 含有 9 个 锌 指 结构 的 蛋白 质 ， 能 与
SS rRNA 及 其 基因 结合 ， 其 功能 与 SS rRNA 运输 或 RNA 聚合 酶 III 转录 有 关 。

3. 蛋白 质 -蛋白 质 相互 作用 结构 域
(1) 螺旋 - 环 -螺旋
螺旋 - 环 -螺旋 (helix-loop-helix，HLH) 结构 域 含 有 40 ~ 50 个 氨基 酸 残 基 ;
在 2 个 两 性 “螺旋 之 间 有 一 个 长 度 可 变 的 连接 区 (loop)， 每 个 螺旋 区 长 15 一
16 个 氨基 酸 ， 其 中 有 几 个 氨基 酸 残 基 是 保守 的 。 通 过 a 螺旋 之 间 相 互 作用 ，
四 50 四

HLH 蛋白 能 够 形成 同 源 或 异 源 二 聚 体 (图 2-31)， 环 的 存在 可 以 保证 两 个 v 螺旋
独立 地 起 作用 。

图 2-31 HLH 蛋 白 二 聚 体 结 合 于 DNA
两 个 HLH 蛋 白 单 体 的 两 性 w 螺旋 之 间 相 互 作 用 ， 形 成 HLH 蛋白 二 聚
体 ， 在 每 个 单 体 中 ， 两 个 两 性 螺旋 之 间 的 肽 段 呈 柔 性 的 环 状 结构 。

在 HLH 结构 域 附 近 ， 绝 大 多 数 HLH 蛋白 富 含 大 量 碱 性 氨基 酸 ， 在 15 个 所
基 酸 残 基 中 约 有 6 个 是 保守 的 ， 这 个 区 域 是 结合 DNA 所 必需 的 。 符 合 这 一 特点
的 HLH 和 蛋白 叫 做 “bHLH 和 蛋白"， 包 括 El12 和 E47 蛋白 、 原 瘤 基 因 c-zyc 的 表
达 产 物 Myc 蛋白 等 。 有 的 bHLH 蛋白 的 存在 没有 细胞 特异 性 ， 如 哺乳 动物 的
E12/E47 和 果 蝇 的 Da 等 。 但 有 的 bHLH 蛋白 具有 组 织 特异 性 ， 如 哺乳 动物 的
MyoD 和 果 蝇 的 Ac-s 等 。

bHLH 蛋白 二 聚 体 的 形成 及 其 结合 DNA 的 难 易 和 二 聚 体 的 伴侣 有 关 。 例 如
E47 同 源 二 聚 体 和 E12-E47 异 源 二 聚 体 都 容易 形成 ， 并 且 具 有 较 强 的 结合 DNA
能 力 。 而 E12 同 源 二 聚 体 虽 然 容 易 形 成 ， 但 难于 结合 DNA。MyoD 同 源 二 聚 体
正好 相反 ， 难 于 形成 却 易 于 结合 DNA。

另 一 种 类 型 的 HLH 蛋白 没有 碱 性 区 ， 并 且 含 有 破坏 其 DNA 结合 功能 的 氢
基 酸 残 基 Pro， 如 ID 蛋白 。 这 种 类 型 的 HLH 蛋白， 具有 像 bHLH 蛋白 一 样 的 形
成 二 聚 体 的 能 力 ， 但 是 二 聚 体 中 有 一 个 亚 基 没 有 碱 性 区 ， 这 个 亚 基 不 能 特异 地 结
侣 JINA'。

(2) 亮 氨 酸 拉链

亮 氮 酸 拉链 〈leucine zipper) 是 一 种 重要 的 和 蛋白质- 和 量 白 质 相 互 作用 的 结构
域 。 其 每 7 个 氨基 酸 中 的 第 7 个 氨基 酸 是 亮 氨 酸 ， 亮 氨 酸 是 朴 水 性 氨基 酸 ， 排 列
在 wx 螺旋 的 一 人 出， 所 有 带电 荷 的 氨基 酸 残 基 排 在 另 一 侧 。 当 2 个 蛋白 质 分 子平 行
排列 时 ， 亮 氨 酸 之 间 相 互 作用 形成 二 聚 体 ， 即 形成 拉链 (图 2-32)。 在 拉链 式 的
蛋白 质 分 子 中 ，C 端的 亮 氨 酸 拉链 本 身 并 不 能 结合 DNA， 结 合 DNA 的 是 N 端的

. 57

碱 性 氨基 酸 区 。 因 此 ， 这 种 结构 域 又 叫 碱 性 拉链 (basic zipper)， 即 bzip。 亮 氨
酸 拉链 广泛 存在 于 真 核 生 物 调 控 蛋 日 中 ， 已 发 现 几 个 原核 蛋白 也 含 亮 氨 酸 拉链 。

二 聚 体 疏 水 侧 的
亮 氨 酸 相互 作用

图 2-32 ”酵母 转录 因子 Gcn 4 的 亮 氨 酸 拉链
两 个 富 含 亮 氨 酸 的 螺旋 像 拉链 一 样 相互 作用 ， 形 成 的 Gcn 4 二 聚 体 呈 前 刀
状 夹 住 DNA， 另 一 个 与 大 沟 接触 的 " 螺旋 富 含 碱 性 氨基 酸 残 基 。

亮 氨 酸 拉链 (bzip) 蛋白 可 以 形成 同 源 或 异 源 二 聚 体 。 不 同 的 bzip 蛋白 所 含
有 的 Leu 重复 单位 数目 不 等 。C/EBP 二 聚 体 结合 于 CAAT 盒 或 SV40 增强 子 ，
它 的 亮 氨 酸 拉链 有 4 个 Leu 重复 单位 。 转 录 因 子 API 由 Jun-Fos 异 源 二 聚 体 组

e S8 四

成 ， 最 初 发 现 它 结合 于 SV40 增强 子 ， 它 的 亮 氢 酸 拉链 有 5 个 Leu 重复 单位 。

(3) SH2 和 SH3 结构 域

活化 RTK 的 轩 蛋 白 〈 细 胞 内 信和 号 蛋白 ) 的 结构 与 功能 形形色色 ， 但 是 它们
一 般 都 含有 两 个 高 度 保守 的 非 催化 性 结构 域 SH2 和 SH3。SH2 结构 域 能 识别 并
结合 活化 RIK 的 p-Tyr， 以 及 其 他 含有 p-Tyr 的 细胞 内 信和 号 蛋白 分 子 。 不 同
RTK 部 蛋白 的 SH2 结构 域 的 三 维 结构 十 分 相似 ， 它 们 结合 于 RTK 的 p-Tyr 周围
特异 的 氨基 酸 顺 序 ， 而 每 个 SH2 独特 的 氨基 酸 顺 序 决定 它 结合 于 哪些 特异 的 p-
Tyr。 例 如 ，Sirc 蛋白 紧 紧 的 结合 于 含有 核心 顺序 p-Tyr-Glu-Glu-lle 的 任何 多 肽 ，
这 四 个 残 基 形 成 的 空间 结构 正好 和 Src 蛋白 的 SH2 多 肽 结合 位 点 相 匹 配 ， 它 们 的
结合 类 似 于 一 个 两 相 的 电源 插头 〈 即 核心 顺序 中 的 p-Tyr 和 lle 侧 链 ) 和 电源 插
座 〈SH2 结构 域 )。SH2 肽 结合 位 点 有 一 个 能 容纳 p-Tyr 侧 链 的 孔 穴 ， 其 中 经 常
有 2 个 Arg 和 1 个 Lys 残 基 ， 它 们 和 p-Tyr 之 间 产 生 较 强 的 静电 引力 。 此 外 ，
SH2 还 有 一 个 容纳 Jle 侧 链 的 蔗 水 性 孔 穴 。 不 同 的 SH2 结构 域 的 结合 特异 性 ， 主
要 取决 于 组 成 其 疏水 性 孔 穴 的 氨基 酸 残 基 ， 这 些 氨基 酸 使 之 结合 于 和 p-Tyr 相 邻
的 特异 氨基 酸 顺 序 上 。

SH3 结构 域 的 蛋白 结合 位 点 大 约 有 10 个 氨基 酸 残 基 ， 其 中 含有 保守 序列 Pro-
XXPro。 人 们 对 SH3 结构 域 功能 的 认识 ， 来 自 对 一 种 小 接头 蛋白 的 研究 所 获得 的
启示 。 人 寄生 虫 线虫 Ceegaxs 有 一 种 小 接头 蛋白 Sem-$， 如 果 它 的 基因 发 生 突
变 ， 将 抑制 几 种 RTK 信和 号 传递 途径 ， 对 线虫 发 育 造成 很 大 的 影响 。 有 趣 的 是 ，
Sem-5 蛋白 的 SH2 结构 域 编码 序列 突变 产生 的 抑制 效应 ， 相 当 于 它 的 两 个 SH3 结
构 域 中 的 任何 一 个 发 生 突 变 ， 这 就 提示 : 这 两 个 SH3 结构 域 是 结合 下 游 信 和 号 蛋白
所 必需 的 。 事 实 上 ， 在 绝 大 多 数 的 动物 细胞 中 都 有 和 Sem-5 蛋白 同 源 的 接头 蛋白 ;
有 证 据 表明 ， 它 们 将 活化 的 RTK 和 重要 的 下 游 信 号 蛋白 Ras 连接 起 来 。

GAL4 酸性 结构 域

ER DSAAAHHDNSTIPLDFMPRDALH
GEDWSEEDDMSDGLPFLKTDPNNNGEF
SPI 谷 氨 酰 胺 结构 域
人 ER 0 ，QGQTPQRVSGLQGSDALNIQQNQTSGGSLQAGQQKEGEQNQQTQQQQL

Q
旭 | 实 9 。 QPQLVQGGQALQALQAAPLSGQTFTTQAISQETLQNLQAVPNSGPIIIRT
Q PTVGPNGQVSWQTLQLQNLQVQNPQAQTITLAPMQGVSLGQ
富 含有 睛 氨 酸 结构 域
了 和 RS

P P 了 PPHLNPQDPLKDLVSLACDPASQQPGCRLNGSGQLKMPSHCLSAQMLPPPP
了 GLPRLPPATKPATTSEGGATSPSYSPPDTSP

图 2-33 ” 几 种 恒 上 质 转录 活化 结构 域

。59 。

介 导 和 蛋白质 间 相 互 作用 的 结构 域 有 多 种 ， 除 上 述 三 类 结构 域外 ， 研 究 较 清楚
的 还 有 : 富 谷 氨 酰 胺 结构 域 (图 2-33)， 富 且 氨 酸 结构 域 (图 2-33)， 酸 性 结构
域 (图 2-33) 等 。 从 名 字 可 以 反映 出 这 些 结构 域 中 氨基 酸 残 基 的 组 成 特点 。

四 、 生 物 大 分 子 相 互 作 用 和 复杂 聚集 物 的 结构

在 前 面 章节 里 我 们 讨论 了 蛋白 质 及 核酸 的 结构 ， 也 介绍 了 具有 两 个 或 更 多 的
相同 或 不 同 亚 基 的 蛋白 质 。 核 酸 中 也 是 如 此 ， 尽 管 其 亚 基 的 数目 很 小 。 例 如 双 链
DNA 分 子 有 两 个 亚 基 ， 而 反 转 病毒 RNA 的 亚 基 数 比 其 他 任何 核酸 的 亚 基 数 都
多 ， 有 四 个 亚 基 。

有 机 体 的 细胞 内 外 普遍 存在 不 同 生 物 大 分 子 之 间 的 相互 作用 。 例 如 ， 核 酸 和 党
和 和 蛋白 质 结合 在 一 起 形成 DNA- 归 白 质 复 合 物 〈 染 色 体 )， 细 胞 外 的 病毒 核酸 被
包装 在 蛋白 质 外 壳 内 ， 骨 用 和 软骨 是 蛋白 质 和 其 他 生物 大 分 子 复杂 的 装配 体 。 和 蛋
白质 也 能 和 脂 相互 作 用 产生 膜 ， 如 将 细胞 内 含 物 与 外 环境 隔 开 的 膜 以 及 将 细胞 内
成 分 相互 隔 开 的 膜 。 多 糖 形成 像 细 菌 和 植物 细胞 壁 那样 极 复杂 的 结构 。

对 这 些 复 杂 结构 及 其 形成 的 研究 叫 结构 生物 学 。 有 少数 结构 几乎 完全 了 解 清
楚 了 ， 而 许多 其 他 结构 正在 积极 地 研究 中 。 本 节 只 讨论 少数 几 种 生物 大 分 子 聚 集
物 的 结构 以 阐明 生物 大 分 子 相 互 作用 的 重要 性 及 作用 的 基本 原理 。

1. 一 种 多 蛋白 装配 体 一 一 胶原 蛋白

胶原 和 蛋白 是 哺乳 动物 中 最 丰富 的 和 蛋白质， 也 可 能 是 世界 上 最 普通 的 香 白 质 。
它 是 妥 、 软 骨 、 骨 骼 、 皮 肤 和 血管 的 主要 蛋 日 质 成 分 。 其 主要 功能 是 提供 具 强 大
抗 张强 度 的 纤维 。 胶 原 蛋 白 是 一 个 由 亚 基 联合 形成 的 三 聚 蛋白 装配 成 的 蛋白 多 聚
体 ， 有 高 度 的 组 织 (organization); 三 聚 蛋 白 进 一 步 联合 形成 纤维 。 胶 原 蛋 白 由
成 纤维 细胞 合成 ， 以 称 为 原 胶 原 (procollagen) 的 前 体 被 分 泌 到 胞 外 ， 然 后 按 以
下 步骤 装配 ;

原 胶 原 细 丝 (procollagen filament) (0 一 4nm)
人 - CR (11 一 1Snm)
1 (microfibril) (30 一 200nm)
和 (collagen fibril) (0.2 一 0.4pmy)
纤维 ， (1 一 10wxm)

|

腿 、 骨 骼 、 软 骨 等 〈 肉 眼 可 见 )
*， 0600 ，

(1) 胶原 蛋白 的 氨基 酸 组 成 和 顺序

装配 成 胶原 蛋白 的 多 肽 链 的 氨基 酸 组 成 及 顺序 有 几 个 显著 特征 :

@ 每 条 链 含 有 近 1000 个 氨基 酸 ，1V3 的 氨基 酸 是 甘氨酸 ; 这 个 值 比 普通 蛋
白质 高 很 多 ， 普 通 蛋 白质 中 甘氨酸 只 占 S% 。 胶 原 和 蛋白 多 肽 链 的 氨基 酸 顺 序 可 表
示 如 下 :

…Gly-A-B-Gly-CD，Gly-E-F-Gly-G-H…

在 上 述 表示 中 ，A、B、C… 是 甘氨酸 外 的 其 他 氨基 酸 。

@1/4 的 氨基 酸 是 且 氨 酸 或 有 辅 氨 酸 的 衍生 物 羟 睛 氨 酸 。 且 氨 酸 在 其 他 和 蛋 日 质
中 很 少 遇 见 ， 而 羟 且 氨 酸 没 有 在 其 他 和 蛋 日 质 中 发 现 。

加 许多 赖 氨 酸 羟基 化 。

由 甘氨酸 - 且 氨 酸 - 羟 且 所 酸 顺 序 反 复出 现 ， 在 绝 大 多 数 其 他 蛋 日 质 中 是 很 罕
见 的 ， 这 种 氨基 酸 组 成 及 其 排列 方式 与 胶原 蛋白 重要 的 性 质 相 对 应 。

(2) 一 种 三 链 螺旋 单位 一 原 胶原 蛋白 (tropocollagen)

除了 胶原 蛋白 合成 的 某 一 阶段 外 ， 胶 原 蛋 白 的 单 链 单 体 在 天 然 条 件 下 是 不 存
在 的 ， 只 存在 由 单 体 联合 形成 的 原 胶 原 蛋 上 白 。

各 个 多 肽 链 中 存在 大 量 且 氨 酸 ， 从 而 影响 了 原 胶原 蛋白 分 子 结构 。 且 氨 酸 是
一 种 不 能 形成 典型 肽 键 的 氨基 酸 ， 这 些 键 的 结合 使 柔 蔬 降 低 因 而 使 肽 链 更 趋 于 伸
展 。 由 于 链 的 伸展 ， 肽 链 中 的 许多 可 相互 作用 的 基 团 暴露 在 外 ， 使 得 各 个 链 间 能
通过 链 内 的 氢 键 相互 作用 产生 三 链 螺旋 ， 这 是 形成 具有 强大 抗 张 力 纤 维 的 第 一
步 。 氢 键 和 范 德 华 力 将 各 个 链 拉 在 一 起 形成 一 个 非常 紧密 的 复合 物 ， 在 此 复合 物
中 ， 且 氨 酸 和 几乎 所 有 的 其 他 侧 链 氨基 酸 向 外 而 甘氨酸 向 内 。 稳 定 原 胶原 三 螺旋
的 力 除了 范 德 华 力 、 氢 键 和 链 间 的 共 价 交 联 外 ， 三 螺旋 的 结构 还 要 求 三 联 体 的 每
第 三 个 位 置 必须 是 Gly。 三 螺旋 内 侧 很 拥挤 ， 没 有 容纳 庞大 侧 链 氨基 酸 的 空间 ;
而 甘氨酸 没有 侧 链 〈 仅 是 H 原子 )， 因 此 甘氨酸 能 使 其 结构 最 大 限度 地 紧密 并 且
增加 其 强度 。

(3) 原 胶 原单 位 相互 作用 形成 纤维

原 胶 原 蛋白 分 子 在 胶原 纤维 中 都 是 有 规则 地 按 1/4 错位 、 首 尾 相 接 、 并 行 排
列 组 成 纤维 束 。 由 于 原 胶 原 肽 链 上 残 基 所 带电 荷 不 同 ， 因 而 电子 密度 不 同 ， 通 过
1/4 错位 排列 便 形 成 间隔 一 定 的 电子 密度 区 域 ， 而 呈现 横 纹 区 带 (图 2-34)。 原
胶原 蛋白 分 子 如 果 不 是 按 1/4 错位 排列 ， 而 是 每 对 分 子 的 头 及 尾 对 齐 排列 ， 那 么
外 力 很 易 将 该 纤维 打 断 ;而 1/4 错位 排列 使 得 纤维 不 易 被 打 断 。

此 外 ， 胶 原 蛋白 特殊 的 氨基 酸 一 一 羟 睛 氨 酸 和 产 赖 氨 酸 在 原 胶 原 蛋白 相 邻 的
多 肽 链 之 间 和 相 邻 的 原 胶 原 蛋 白 链 之 间 形 成 共 价 交 联 (图 2-35)， 而 加 固 其 1/4
错位 排列 。 很 显然 ， 胶 原 蛋 白 单 体 的 许多 结构 特征 联合 在 一 起 形成 一 个 具有 巨大
抗 张力 强度 的 大 分 子 装 配 体 。

胶原 蛋白 的 结构 特征 担负 另 一 个 特别 功能 。 在 每 个 以 1/4 错位 排列 连续 的 原

二

横 纹

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胶原 纤维

分 子 中 的
单 链 (左手 螺旋 )

图 2-34 “胶原 纤维 中 原 胶原 蛋白 分 子 的 排列

图 2-35 胶原 蛋白 分 子 链 内 及 链 间 的 交 联

胶原 蛋白 分 子 的 头 尾 之 间 是 一 个 空 除 ， 这 种 空隙 在 骨骼 形成 中 起 作用 。 骨 骼 是 由

羟基 磷 碳 石 结 晶 在 胶原 纤维 上 沉积 而 形成 的 ， 结 唱 过 程 可 以 在 体外 进行 。 发 现 其

在 胶原 纤维 上 以 670A 的 间隔 起 始 形成 微 结 晶 ， 这 个 距离 正好 是 一 个 胶原 蛋 日 衬
*， 02 ，

隙 的 大 小 。 结 唱 不 在 人 工 合成 的 非 1/4 错位 排列 的 胶原 纤维 的 空隙 处 形成 。
2. 复杂 的 DNA 结构

主要 简单 介绍 大 肠 杆菌 染色 体 和 真 核 细 胞 染色 体 及 染色 质 的 结构 。 大 肠 杆菌
和 大 多 数 细 菌 的 基因 组 只 含 一 个 环 状 超 螺旋 分 子 ， 环 状 分 子 的 总 长 度 大 约
1300wme。 一 个 圆 棒状 的 细菌 的 直径 和 长 分 别 是 lm 和 3um， 因 此 很 显然 细菌
DNA 在 一 个 细胞 里 是 高 度 折 释 的 。 细 菌 DNA 分 子 和 和 蛋白质 、RNA 相互 作用 形
成 紧密 的 结构 即 细菌 染色 体 。 这 种 紧密 结构 有 两 个 特点 : @ 在 外 围 全 部 是 DNA
超 螺旋 环 ; @ 在 近 染 色 体 中 心 位 置 是 密度 区 ， 称 作 骨 架 (scaffold) (图 2-36)。
细菌 DNA 采取 多 个 超 螺旋 折 和 县 方式 将 巨大 的 DNA 分 子 压缩 在 一 个 小 的 细菌 细
胞 里 。 当 DNA 分 子 上 产生 一 个 切口 ， 将 解 开 一 个 折 和 琶 中 的 超 螺旋 ; 产生 两 个 切
口 ， 将 产生 两 个 松弛 环 (图 2-36)。DNA 旋转 酶 (DNA gyrase) 在 DNA 复制 中
起 重要 作用 ， 负 责 形成 超 螺 旋 。

-1
N Wi 2
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大 肠 杆菌 染色 体

图 2-36 大肠 杆 菌 染 色 体 高 度 折 腹 超 螺旋

真 核 细胞 中 的 核 内 DNA 均 形 成 一 定数 目的 染色 体 ， 每 个 染色 体 含 有 单个 巨
大 的 DNA 分 子 。 例 如 果 蝇 的 一 个 染色 单 体 含 一 条 分 子 质量 大 于 100U、 长 达
1.2cm 的 DNA 分 子 。 染 色 体 的 结构 比 DNA 分 子 的 结构 紧密 得 多 ，DNA 分 子 不
是 自我 折 和 登 成 像 染色 体 那 样 致密 的 结构 。 真 核 染 色 体 中 的 DNA 分 子 与 组 蛋白 结
人 台 ， 形 成 的 复合 物 叫 染色 质 (chromatin )。 主 要 有 五 类 组 和 蛋白， H1，H2A，
H2B，H3 和 H4。 这 五 种 蛋白 质 的 性 质 见 表 2-4。

细胞 中 染色 质 的 结构 随 着 细胞 生长 周期 而 改变 。 静 止 期 的 细胞 中 的 染色 质 是
松散 的 ， 并 且 充 满 整 个 细胞 核 。 当 DNA 刚 开 始 复制 ， 染 色 质 浓缩 大 约 100 倍 ，
同时 染色 体形 成 。 染 色 质 是 细胞 间 期 核 中 DNA、 组 蛋白 、 非 组 蛋白 以 及 少量
RNA 所 组 成 的 一 串 念珠 状 的 复合 体 。 染 色 体 具 有 四 级 结构 ， 其 中 核 小 体 是 其 一
级 结构 。 每 个 核 小 体 包括 有 200bp 的 DNA 链 和 8 个 组 蛋白 分 子 (包括 4 种 主要
组 蛋白 H2A、H2B、H3 和 H4， 每 种 两 个 )。 这 些 球状 组 蛋白 分 子 互相 挤 在 一 起 ，
呈 小 圆 盘 状 ，DNA 链 就 绕 在 小 圆 盘 之 外 ， 缠 绕 1.75 圈 ， 由 146bp 组 成 ; 小 圆 盘
之 间 由 组 蛋白 H1 连接 。

表 2-4 组 蛋白 类 型

类 型 Lys/Arg 比 氨基 酸 数 分 子 质量 /kDa 位 置
HIl 20.0 2 2 连结 处
H2A jw25 129 14.5 核心
H2B 2 125 13.8 核心
H3 0.75 135 1 友 核心
H4 0.79 102 3 核心

核 小 体 链 呈 螺旋 形 缠绕 ， 形 成 超 微 螺旋 ， 称 为 “ 螺 线 管 ” (solenoid)。 这 种
超 微 螺 旋 的 直径 约 为 30nm， 内 径 10nm， 螺 距 为 11nm， 为 中 空 呈 管状 结构 。 这
种 螺旋 管 的 每 一 转 由 6 个 核 小 体 组 成 ， 它 是 染色 体 的 二 级 结构 。
曙 线 管 的 纤 丝 沿 着 它 中 央 的 蛋白 质 轴 发 射出 大 小 不 等 的 环 ， 像 灯 刷 染色 体 那
经 过 观察 证 明 ， 染 色 体 是 由 一 系列 的 环 状 的 域 (domain) 即 超 螺 线 环 组 成
这 种 结构 可 以 说 是 染色 体 的 三 级 结构 。
染色 体 〈 实 际 上 指 染 色 单 体 ) 的 形成 一 般 认 为 是 由 DNA 盘 绕 成 紧密 的 螺 线
(helixz) 和 一 系列 螺 线 管 纤 丝 (solenoidal fiber) 的 环 状 域 密集 地 组 装 成 染色 单
体 ， 就 是 四 级 结构 。 通 过 这 样 一 系列 的 过 程 ， 染 色 体 中 的 DNA 被 压缩 了 大 约
6000 到 8000 倍 。 下 面 表述 左 为 DNA 压缩 比率 ， 右 为 压缩 方法 。

样
的

Le

O

DNA 双 螺 旋
1 螺旋 化 (H2A，H2B，H3，H4)
核 小 体
1/6 曙 旋 化 (HI1)
螺 线 管
1/30 折 琶 和 螺旋 化
超 螺 线 环
1] 折 和 琶 和 曙 旋 化

合计 1/6300 染色 单 体
如 将 染色 体 中 的 DNA 和 组 蛋白 除去 就 是 留 下 的 蛋白 质 所 形成 的 骨架 。

3. DNA 与 一 个 识别 专 一 碱 基 序列 的 蛋白 质 的 相互 作用

我 们 知道 在 染色 质 的 形成 中 ， 组 蛋白 只 识别 普通 的 DNA 结构 而 不 是 与 专 一
的 碱 基 序 列 结合 ;然而 许多 蛋白 质 只 对 特定 的 碱 基 序 列 结合 ， 本 书 中 我 们 将 遇 到
很 多 这 类 蛋白质。 这 些 蛋 白质 有 三 种 类 型 : 四 聚合 酶 ， 它 们 在 特定 的 碱 基 位 点 起
台 DNA 和 RNA 的 合成 ; @ 调 节 和 蛋白， 打开 或 关闭 特定 基因 的 活性 ; @@ 限 制 性

wx 站 机 。

内 切 核酸 酶 ， 它 们 能 识别 4 或 6 个 核 苷 酸 序列 ， 并 在 两 个 相 邻 的 核 苷 酸 之 间 打 开
磷酸 二 酯 键 。

在 许多 DNA- 蛋 白质 复合 物 中 ， 蛋 白质 结合 的 专 一 序列 是 知道 的 。 这 里 特别
讨论 一 个 例子 ， 以 便 使 我 们 了 解 被 识别 的 DNA 序列 的 特殊 性 质 和 结合 的 模型 。

现 以 Cro 蛋白 对 入 鸣 菌 体 DNA 的 结合 为 例 。 大 肠 杆 菌 叹 菌 体 产 生 的 Cro 和 蛋
白 在 入 叹 菌 体 的 生活 周期 中 是 一 个 重要 的 调节 和 蛋白， 其 重要 性 就 是 因为 它 对
DNA 分 子 上 的 特殊 碱 基 序 列 进行 结合 。

Cro 是 个 小 分 子 质 量 蛋 白质 ， 由 66 个 氨基 酸 组 成 ， 它 识别 并 结合 ADNA 上
17 个 碱 基 长 的 专 一 序列 。 此 蛋白质 的 氨基 酸 序列 和 它 识别 的 17 个 碱 基 序列 都 已
知 ， 这 些 资料 使 得 蛋白 质 与 DNA 相互 作用 是 通过 结构 特征 这 个 假设 得 到 证 实 。

Cro 蛋白 的 三 维 结构 已 经 用 X 射线 衍射 技术 测定 ， 如 图 2-37。 与 大 分 子 蛋 白
相 比 ， 它 是 一 个 简单 的 结构 。 含 有 三 个 反 向 平行 的 B 层 (2 一 6、39 一 453 和 48 一
55 残 基 ) 和 三 个 wa 螺旋 (7 一 14、15 一 23 和 27 一 36 残 基 )， 由 于 63 一 66 残 基 无
次 序 ， 没 有 在 图 2-37 中 表明 (它们 与 CroDNA 相互 作用 没有 关系 )。

0 螺旋
必 _(15~23)

图 2-37 入 Cro 蛋白 的 三 维 结构
XCro 由 w 螺旋 和 8 折 释 组 成 ， 箭 头 指 的 P、Q 和 了 R 代表 其 他 三 个 侧面 的 轴 。

4

图 2-38 表示 出 入 DNA 上 与 Cro 蛋白 结合 的 17 个 碱 基 的 顺序 。

TIA- 到 EC 和 让- 人 1C1 且 AAA GTrGSGYA 让 友
AND IAAGhoT 人 CE EGGwcc TAN

图 2-38 入 Cro 和 蛋 自 的 结合 位 点 之 一 的 碱 基 序列

通过 3 种 技术 研究 Cro 蛋白 质 与 DNA 之 间接 触 处 的 某 些 特点 。 第 一 个 技术
是 纯化 Cro 蛋白 和 DNA， 并 且 在 能 引起 CroDNA 形成 复合 物 的 条 件 下 将 其 混
合 ; 这 些 CroDNA 复合 物 再 用 硫酸 二 甲 酯 处 理 ， 硫 酸 二 甲 酯 在 鸟 嗓 哈 环 的 N-7
位 点 和 腺 味 吟 环 的 N-3 位 点 加 上 甲 基 。 然 后 使 CroDNA 解 离 ， 除 去 Cro 蛋白 后
分 析 这 段 DNA 的 顺序 ，
DNA 复合 物 中 ， 因 为 Cro 蛋白 与 这 段 DNA 结合 保护 了 其 中 的 G 和 A 不 被 甲 基

图 2-39 入 DNA 上 与 Cro 蛋白
接触 的 OR3 区 的 位 点

*。， 66 ，

确定 G 和 A 的 位 置 。 那 些 未 甲 基 化 的 G 和 和 A 就 在 Cro-

化 。 第 二 个 技术 是 用 能 在 磷酸 上 加 上 一 个 乙 基 的
试剂 处 理 CroDNA 复合 物 ， 特 定 的 磷酸 被 乙 基 化
后 再 定位 。 仍 然 是 某 些 磷酸 不 被 乙 基 化 ， 这 也 可
能 是 由 于 Cro 蛋白 的 结合 使 这 段 DNA 中 的 磷酸 不
被 乙 基 化 。 前 两 个 技术 都 是 利用 DNA 上 与 蛋白
质 作 用 的 特定 位 点 已 被 Cro 蛋白 保护 。 第 三 个 技
术 与 前 两 个 不 同 ， 该 技术 是 利用 在 一 次 位 置 测定
中 ， 通 常 可 以 随机 改变 1 一 2 个 磷酸 ， 从 而 抑制
Cro 蛋白 的 结合 。 用 试剂 短暂 处 理 使 DNA 分 子 中
一 两 个 磷酸 被 随机 的 乙 基 化 ， 再 加 入 过 量 的 Cro
蛋白 ， 测 定 任 一 DNA 分 子 形成 CroDNA 复合 物
的 能 力 。 有 些 被 乙 基 化 的 DNA 分 子 能 与 Cro 和 蛋 昌
形成 复合 物 ， 但 另 一 些 则 不 能 。 测 定 不 能 形成 复
合 物 的 DNA 分 子 中 被 乙 基 化 的 位 置 ， 这 些 位 置
的 磷酸 被 乙 基 化 后 干 拓 了 Cro 蛋白 与 DNA 的 结
合 。 因 为 Cro 蛋白 只 和 没有 乙 基 化 的 磷酸 结合 ，
所 以 这 个 磷酸 区 一 定 就 是 接触 区 。 注 意 这 个 位 置
与 第 二 个 技术 中 乙 基 化 的 位 置 不 同 。 目 前 还 没有
关于 Cro 蛋白 与 胞 喀 啶 和 胸腺 喀 喧 结合 的 资料 。

图 2-39 表示 入 DNA 双 螺 旋 中 Cro 蛋白 结合 的
片段 。 当 Cro 蛋白 结合 时 ，G 和 A 不 被 甲 基 化 ，
图 中 还 指明 乙 基 化 的 磷酸 阻止 蛋白 结合 甲 基 化 位
局 愉 N-3 和 NA

图 2-39 说 明了 所 有 的 接触 点 都 处 在 DNA 双 螺 旋 的 一 边 ， 在 DNA 的 大 槽 中 ，
从 几何 学 来 看 是 合理 的 。XCI 蛋白 也 呈现 这 种 排列 ， 它 也 能 与 ADNA 结合 ; 还 有
开 .coi 的 CAP 和 蛋白 也 是 如 此 ， 它 结合 到 正 . coi DNA 的 某 一 调控 位 点 。 这 种 结
合 可 能 是 DNA- 蛋 白质 互相 作用 的 一 种 共同 特点 。 此 外 还 应 注意 几 点 : @DCro 蛋
白 所 结合 的 A 和 G 存在 于 两 条 链 上 的 ; DDNA 上 的 接触 点 差不多 是 对 称 排列 的 。

对 含水 结晶 的 Cro 蛋白 的 排列 分 析 指 出 ， 此 蛋白 的 列 阵 有 二 重 对 称 性 ， 这 个
列 阵 如 图 2-40 中 所 示 。Cro 蛋白 在 溶液 里 有 时 以 二 聚 体 存 在 ， 并 且 很 像 是 在 晶体
里 同样 的 两 个 单 体 分 子 聚 集 而 成 的 。 这 个 观察 很 重要 ， 因 为 Cro 蛋白 结合 尼
DNA 的 碱 基 顺 序 也 几乎 是 对 称 的 ，Cro 蛋白 的 对 称 排列 阵 式 对 于 它 与 一 个 对 称
碱 基 顺序 的 结合 是 合理 的 。 图 2-41 表示 出 了 Cro-DNA 复合 物 的 结构 。 在 图 2-39
中 结构 的 对 称 性 也 是 显而易见 的 。

图 2-40 ”一 个 蛋白 晶体 中 两 个 Cro 图 2-41 CroOR3 复合 物 的 假设 结构
蛋白 分 子 的 排列

仔细 观察 发 现 每 个 Cro 蛋白 单 体 中 的 氨基 酸 以 某 种 方式 使 其 处 于 能 与 碱 基 形
成 气 键 的 位 置 ， 由 此 赋予 它 们 结合 的 专 一 性 ; 而 Cro 蛋白 和 磷酸 基 之 间 的 静电 引
力 则 赋予 它们 结合 的 强度 。

。， 67 ，

Cro-DNA 复合 物 是 结构 最 先 被 和 弄 清 楚 的 序列 专 一 性 复合 物 之 一 ， 这 些 复 合
物 中 ， 结 合 也 发 生 于 特定 的 碱 基 序 列 。 大 部 分 被 特异 性 蛋白 识别 结合 的 序列 都 具
有 某 种 程度 的 对 称 性 ， 而 且 许多 序列 特异 性 的 DNA 结合 蛋白 是 多 亚 基 蛋白 。 因
此 我 们 意识 到 ， 蛋 白质 将 会 形成 对 称 排列 ， 从 而 有 利于 识别 对 称 序列 。 从 其 他 几
种 特异 的 或 非特 异 的 DNA 结合 蛋白 获得 的 初步 证 据 表 明 ， 这 些 蛋 白质 通常 在 表
面 有 2 一 3 个 伸展 的 “螺旋 区 。 因 为 每 个 Cro 蛋白 单 体 中 的 一 个 wa 螺旋 置 于 DNA
螺旋 的 大 槽 中 ， 由 此 推断 ， 一 个 w 螺旋 插 入 一 个 大 槽 中 可 能 是 DNA- 蛋 白质 相互
作用 的 一 个 普遍 特征 。 组 和 蛋白 在 染色 体 中 的 结合 也 是 如 此 。

4. 生物 膜

生物 膜 (biological membrane) 由 蛋白 质 和 脂 质 组 成 的 装配 体 组 建 而 成 。 生
物 膜 的 结构 具有 共同 的 特征 ， 但 不 同 功能 的 膜 存 在 小 小 的 差别 。

生物 膜 有 许多 种 ， 每 种 都 有 它 自己 的 功能 。 外 膜 的 最 基本 的 功能 就 是 将 细胞
内 含 物 质 与 外 环境 隔 开 。 然 而 细胞 需 从 环境 中 输入 养分 ， 因 此 外 膜 必须 是 可 透 性
的 。 而 膜 的 透 性 必须 是 选择 性 的 才能 控制 细胞 内 化 合 物 的 浓度 。 获 得 选择 性 的 透
性 是 通过 限制 大 部 分 细胞 内 外 物质 的 自由 通过 的 方法 ， 并 且 通 过 分 子 泵 、 通 道 和
隘口 来 允许 运输 特别 的 物质 。 外 膜 还 常常 具有 信和 号 分 子 的 受 体 ， 也 具有 传递 电子
的 功能 。

除外 膜 外 还 有 许多 种 内 膜 ， 内 膜 的 功能 是 将 细胞 内 不 同 的 化 合 物 分 室 以 及 提
供 吸 附 表面 使 一 定 的 分 子 进 行 化 学 反应 。 有 些 内 膜 包含 有 酶 系统 ， 如 植物 细胞 叶
绿 体 内 膜 中 发 生 光 合 反 应 的 酶 系统 。

细胞 膜 由 双 层 脂 质 分 子 构成 ， 膜 中 的 蛋白 质 与 脂 质 以 玻 水 作用 相互 结合 。 膜
蛋白 主要 是 螺旋 的 球状 结构 ， 而 不 是 B 折 春 结 构 。 膜 不 是 静态 的 ， 细 胞 膜 中 的
蛋白 质 和 脂 质 都 能 自由 运动 ， 这 就 是 流动 灸 符 模 型 (fluid mosaic model) 或 流动
脂 质 - 球 蛋 白 灸 嵌 模 型 。 这 是 个 动态 模型 ， 认 为 细胞 膜 由 灸 府 着 球 蛋白 分 子 脂 质
双 分 子 层 按 二 维 排列 的 液体 组 成 。 膜 双 分 子 层 大 部 分 为 轻 油 般 稠 度 的 液 状 体 ， 有 具
流动 性 ， 能 在 膜 平 面 进 行人 出 向 移动 而 不 是 上 下 移动 ， 这 样 可 保持 膜 的 不 对 称 构象
的 稳定 性 。 脂 质 双 分 子 层 中 ， 内 外 两 层 的 脂 质 分 子 是 非 对 称 性 的 。

有 的 膜 蛋白 分 子 的 非 极 性 端 谋 入 在 脂 质 双 分 子 层 的 疏水 区 ， 极 性 端 则 外 露 于
膜 的 表面 ;有 的 膜 蛋白 则 横 穿 膜 层 ， 其 两 端 露 于 膜 的 两 侧 (图 2-42)， 它 们 在 膜
中 的 分 布 也 是 不 对 称 的 。

生物 膜 的 流动 性 包括 膜 脂 和 膜 蛋 白 两 类 运动 状态 。 膜 脂 运动 有 几 种 方式 ;
人 由 脂 酰 烃 链 围 绕 C-C 链 旋转 而 导致 异 构 化 运动 ; @ 了 磷脂 分 子 围绕 与 膜 平 面相 垂
直 的 轴 左 右 摆动 或 作 旋 转运 动 ; @ 磷 脂 分 子 在 脂 膜 内 作 侧 向 扩散 或 侧 向 移动 ;
四 磷脂 分 子 在 脂 双 层 中 作 翻 转运 动 (flip-flop)。 膜 蛋白 的 运动 可 分 为 侧 向 扩散 和
旋转 扩散 两 种 。

四 08 四

中
3
9 入 AN

图 2-42 ”流动 镶 认 模型

影响 膜 脂 流动 的 因素 很 多 ， 除 温度 外 ， 还 有 膜 蛋白 、 遗 传 因 子 、pH、 离子
强度 、 金 属 离子 、 药 物 作 用 、 膜 脂 的 组 成 等 。 其 中 膜 的 组 成 影响 较 大 。

动物 细胞 由 一 个 结构 复杂 的 膜 包 围 ， 而 细菌 、 植 物 和 单 细胞 真 核 细胞 由 一 个
多 层 结构 的 细胞 壁 包围 住 。 细 胞 膜 作为 细胞 壁 的 其 中 一 层 。 细 胞 壁 包 含有 几 个 半
固态 层 ， 在 各 层 之 间 有 众多 自由 扩散 的 分 子 。 在 实验 室 里 处 理 细 胞 ， 破 坏 细胞 壁
中 的 一 层 或 多 层 ， 会 引起 物质 从 一 个 区 域 到 另 一 个 区 域 的 泄漏 或 从 细胞 内 向 细胞
外 泄漏 。

细菌 以 几 种 不 同 的 形状 存在 ， 每 种 形状 由 细胞 壁 中 特定 的 生物 大 分 子 决定 。
因此 对 于 细胞 壁 的 结构 很 难 作 一 个 准确 的 叙述 。 以 革 兰 氏 阴 性 菌 为 例 (如
瑟 . coi )， 其 细胞 壁 的 结构 如 图 2-43 所 示 。 而 革 兰 氏 阳 性 菌 和 革 兰 氏 阴 性 菌 不 同
的 细胞 壁 结构 如 图 2-44 所 示 。

本 | 闸
全 全 村 轩 作 鸭 多 全 二 Se

图 2-43 革 兰 氏 阴 性 菌 的 细胞 壁 结构 图

*， 6069 ，

(3) (b)

图 2-44 革 兰 氏 阳 性 菌 和 革 兰 氏 阴性 菌 的 区 别
(a) 革 兰 氏 阳 性 细胞 膜 ;，(b) 革 兰 氏 阴 性 细胞 膜 。

5. 复杂 聚集 物 的 自我 装配

前 边 已 描述 了 由 两 种 或 多 种 大 分 子 组 成 的 大 分 子 聚 集 物 及 其 精细 结构 ， 但 还
没 谈 及 它们 是 如 何 装配 的 。 复 杂 聚 集 物 的 形成 有 两 种 可 能 性 : @@ 由 亚 基 自 动 形成
结构 而 不 需 任 何 外 加 的 能 源 ， 这 就 称 为 自我 装配 (self-assembly); @ 在 酶 或 一 些
模板 指导 下 聚集 ， 需 要 能 源 。

两 种 方式 装配 例子 都 存在 ， 本 节 主 要 介绍 一 种 自我 装配 的 例子 一 一 烟草 花 叶
病毒 粒子 (tobacco mosaic virus，TMV) 的 自我 装配 。

烟草 花 叶 病 毒 是 一 个 长 3000A， 宽 180A 的 棒状 病毒 。 病 毒 的 蛋白 质 外 壳 含
有 2130 个 相同 的 亚 基 ， 这 些 亚 基 围 绕 一 个 含 6395 核 苷 酸 的 单 链 RNA 呈 螺 旋 排
列 形成 螺旋 对 称 结构 。 螺 旋 壳 体 中 央 有 直径 40A 的 轴 孔 ， 亚 基 呈 右手 螺旋 排列 ，
螺 距 为 23A， 每 一 螺 圈 上 亚 基 数目 为 161/3 个 。 大 约 每 三 个 核 苷 酸 结合 着 一 个 蛋
白质 亚 基 。

TMV 装配 的 最 简单 的 机 制 可 能 是 蛋白 质 亚 基 逐 步 加 到 RNA 上 。 但 这 个 机
制 从 逻辑 上 是 不 能 令 人 满意 的 ， 这 样 的 多 步骤 过 程 必定 很 慢 ， 大 约 17 个 蛋白 亚
基 必 须 在 这 个 复合 物 完成 之 前 靠 自身 力量 加 到 易 弯 曲 的 RNA 分 子 上 而 形成 一 个
螺旋 圈 ， 从 而 获得 稳定 性 。 这 个 问题 可 以 通过 许多 亚 基 先 形成 一 个 稳定 的 复合
物 ， 然 后 RNA 再 挫 入 的 方法 得 到 解决 。

实验 证 明 ，TMV 装配 反应 的 起 始 成 分 不 是 单个 的 亚 基 ， 而 是 在 近 生 理 条 件
下 (pH 7.0， 离 子 强度 0.1 一 0.3) 由 34 个 亚 基 聚集 形成 的 20S 双 盘 (double
disk) 结构 。 体 外 实验 表明 ， 若 缺乏 形成 双 盘 结构 的 条 件 ， 壳 体 蛋 白 与 病毒 RNA
则 不 能 发 生 结合 反应 。RNA 舱 入 距 20S 双 盘 中 心 40A 处 ，RNA 与 20S 双 盘 结构
的 结合 导致 圆 盘 结构 转 变 为 螺旋 结构 。 一 旦 这 种 装配 起 始 复合 物 形 成 ， 蛋 白质 亚
基 可 逐个 加 入 ， 完 成 RNA 的 包装 ， 最 后 成 熟 为 病毒 颗粒 。

装配 反应 开始 于 距 病毒 RNA 3“ 端 830 个 核 苷 酸 的 区 段 。 此 装配 起 始 部 位 有

下 70 站

一 发 严 结 构 (图 2-4$)。TMV 自我 装配 过 程 是 由 RNA 装配 起 始 部 位 的 发 严 结 构
嵌入 双 盘 结构 之 间 、 从 内 侧 与 双 盘 结合 开始 的 。

(3) (b) (c)

2-45 烟草 花 叶 病 毒 装 配 的 移动 环 模型
(a) RNA 起 始 区 的 发 夹 插入 20S 圆 盘 的 槽 内
(b) 圆 盘 结 构 转 变 为 垫圈 形 结构 骨 住 RNA
(c) 蛋白 质 先 将 5 端 装配 完成 后 ， 转 向 3 装配， 直到 完整 颗粒 产生 。

因 装 配 的 起 始 部 位 既 不 是 随机 的 ， 也 不 是 在 RNA 链 的 任 一 末端 ， 而 是 在
RNA 的 内 部 ， 所 以 装配 方向 必 是 从 内 部 起 始 部 位 双向 生长 。 实 验证 明 装 配 首先
是 向 5 端 进行 ， 当 5 端的 包装 完成 后 ， 才 继续 回 3 端 延伸 。

当 RNA 发 夹 结构 专 一 性 地 与 外 充 蛋 白 双 盘 结 构 结合 时 ，RNA 的 两 个 末端 不
是 分 别 在 装配 起 始 复合 物 的 两 边 ， 而 是 在 同一 边 出 现 两 条 链 : 一 条 是 5 端的 长
链 ， 男 一 条 是 3 端的 短 链 。 装 配 开始 后 ， 蛋 白 质 亚 基 加 入 装配 起 始 复合 物 ， 螺
旋 顶 端 不 断 生 长 。 由 于 蛋白 质 亚 基 与 RNA 的 结合 ， 使 5 端的 长 链 穿 过 正在 生长
的 曙 旋 结构 的 中 心 孔 ， 正 在 装配 的 颗粒 不 断 向 5 端 延伸 。 在 此 过 程 中 ， 装 配 过
程 的 主要 特征 是 在 颗粒 的 主要 生长 端 有 一 个 移动 的 RNA 环 (图 2-45)。 待 5 端
完全 拉 出 后 ， 沿 5 方向 的 装配 完成 ， 然 后 颗粒 转向 3 端 生 长 ， 直 到 完整 的 颗粒

3 7

第 三 量 革 传 物质

任何 一 种 生物 的 遗传 物质 都 携带 决定 该 生物 性 状 的 遗传 信息 。 它 们 从 亲 代 传
到 子 代 。 绝 大 多 数 生 物 的 遗传 物质 是 DNA。 少 数 细菌 鸣 菌 体 、 许 多 植物 病毒 和
一 些 动物 病毒 的 遗传 物质 是 RNA。

在 现代 分 子 生物 学 诞生 之 前 ， 很 多 人 认为 蛋白 质 分 子 可 能 是 遗传 物质 ， 因 为
在 当时 已 知 的 细胞 内 大 分 子 中 ， 只 有 蛋白 质 在 结构 和 化 学 性 质 方面 是 足够 复杂 和
多 种 多 样 的 ， 从 而 能 够 满足 遗传 物质 需要 变化 多 端的 信息 的 特点 。 当 时 并 没有 认
为 DNA 是 遗传 物质 ， 只 知道 DNA 在 细胞 核 内 ， 并 且 认 为 DNA 太 简单 不 可 能 作
为 遗传 物质 ， 从 而 推测 DNA 只 是 染色 体 的 一 些 结构 成 分 。 有 两 个 实验 结果 改变
了 对 遗传 物质 的 上 述 看 法 ， 正 是 因为 这 两 个 实验 工作 才 创 立 了 分 子 遗 传 学 。

第 一 他 ”遗传 物质 的 证 明
一 、 转 化 实验

认为 DNA 是 遗传 物质 的 思想 是 从 1928 年 F.Griffith 的 观察 开始 的 ， 他 研究
细菌 和 人 类 肺炎 的 关系 。 所 用 的 细菌 是 肺炎 双 球 菌 ， 这 种 细菌 的 毒 力 依赖 于 它们
有 无 鞠 膜 。 有 荚 膜 的 细菌 能 抵抗 机 体 对 它们 的 破坏 ， 这 种 肺炎 双 球 菌 在 琼脂 平板
上 长 成 的 菌落 是 光滑 型 (S 型 ，smooth edged)， 用 光滑 型 菌株 感染 小 鼠 能 使 小 鼠
致死 [图 3-1 (a)]。 后 来 Griffith 分 离 到 了 一 种 形成 粗糙 型 菌落 的 肺炎 双 球 菌
(R 型 ，rough edged) 突变 株 ， 接 着 他 做 了 一 个 很 重要 的 观察 。 他 用 加 热 杀 死 的
S 型 菌 注射 小 饼 ， 小 鼠 存活 下 来 。 但 把 加 热 杀 死 的 S 型 菌 和 活 的 民 型 菌 混 合 注射
小 鼠 后 ， 出 乎 意外 地 小 鼠 死 了 ， 而 且 从 血液 中 分 离 到 了 活 的 S 型 菌 ， 因 此 在 加 热
杀 死 的 S 型 菌 中 存在 一 种 使 活 的 R 型 菌 转变 成 S 型 菌 的 因子 ， 他 把 这 种 现象 称
为 转化 (transformation)。Griffith 解释 说 是 热 杀 死 的 S 型 菌 的 存在 导致 那些 活 的
R 型 菌 恢复 了 合成 莱 膜 的 能 力 。3 年 后 这 一 观点 得 到 了 验证 ， 因 为 只 要 把 S 型 菌
加 热 杀 死 后 加 入 到 体外 培养 的 R 型 菌 培 养 物 中 ， 也 可 使 R 型 转化 为 S 型 。 两 年
后 又 证 明 仅 把 S 型 的 细胞 提取 液 加 到 培养 有 R 型 菌 的 培养 物 中 也 发 生 R~>~S 的 转
化 (图 3-2)。

aa 。

(a) S 菌株 杀 死 小 白鼠

o

+ 活 鼠 - 盖 死 鼠
有 英 膜 的 S 菌株
(b) 无 芮 膜 的 R 株 不 杀 死 小 鼠
本 + 活 鼠 -> 活 忆
无 英 膜 的 R 菌株

(c) 加 热 杀 死 的 S 株 不 杀 死 小 鼠

加 热

过 2

(d) 分 开 时 都 不 能 杀 死 小 鼠 的 R 株 和 加 热 杀 死 的 S 株 ， 加 在 一 起 后 杀 死 小 鼠

+ 活 鼠 -一死 鼠

8 。。。

图 3-1 _Griffith 实验 表明 用 致 病菌 细胞 抽 提 液 处 理 非 致 病菌 使 其 转变 成 致 病菌

Be 裂解 沉淀 物 。 无 细胞 来 源 于 S 检
Q 抽 提 物 的 转化 性 物质
有 薄膜
的 S 株
把 转化 性 物质 加 到 R 株 中
@ @ 生长 和 国
十 @ 和 人
管 部 和 @ 四 @
S 转化 性 物质 细胞 培养 物 中 含 S
和 R 两 种 细胞
图 3-2 ”转化 实验

为 了 和 弄 清 这 种 转化 因子 的 化 学 本 质 ，Oswald Avery，Colin Macleod 和 Maclyn

MecCarty 对 S 型 细菌 细胞 提取 液 进行 了 分 离 。 他 们 发 现 用 一 系列 的 化 学 和 酶 学 方

法 把 提取 液 中 的 蛋白 质 、 类 酯 、 多 糖 、 核 糖 核酸 (RNA) 去 掉 后 ， 并 不 影响 R
。 73 ee

一 S 型 的 转化 。 最 后 他 们 对 提取 液 进一步 纯化 ， 发 现 只 要 把 纯化 的 S 型 菌 DNA
以 6x10-”g 的 剂量 加 到 R 型 菌 细胞 培养 物 中 就 足以 导致 R->S 的 转化 ， 因 此 他
们 认为 这 种 转化 因子 就 是 DNA。

Arvery 等 在 1944 年 发 表 这 个 结论 时 引起 了 人 们 的 争论 ， 因 为 在 这 之 前 从 未
有 人 考虑 过 DNA 是 遗传 物质 ， 认 为 DNA 只 是 简单 的 四 种 核 苷 酸 ， 与 淀粉 一 样
仅 是 些 简 单 重 复 的 大 分 子 ， 并 且 认 为 蛋白 质 可 能 是 遗传 物质 。 所 以 当 Avery 等 的
结论 发 表 后 不 仅 没 有 被 人 们 接受 ， 而 且 受 到 了 人 们 的 反对 。 反 对 者 认为 ， 无 论 怎
样 纯化 的 DNA， 仍 有 可 能 藏 留 一 丝 蛋 白质 ， 可 能 就 是 这 一 丝 蛋 白质 在 转化 中 起
作用 。Avery 为 了 印证 他 们 的 结论 做 了 大 量 工 作 ， 他 们 用 各 种 蛋白 水 解 酶 处 理 提
纯 的 DNA 都 不 影响 RS 的 转化 ， 但 只 要 用 脱氧 核糖 核酸 酶 稍微 处 理 一 下
DNA，R->~S 转 化 活性 就 立即 消失 ， 这 就 证 实 了 转化 因子 的 确 是 DNA。Avery 还
发 现 : @D 从 转化 了 的 细菌 中 可 以 提取 到 比 原来 高 许多 倍 的 转化 因子 ， 说 明 转 化 因
子 具 有 自我 复制 能 力 。@ 能 指导 细菌 合成 多 糖 ， 这 也 正 是 基因 所 具备 的 特点 。 因
此 ，Avery 的 转化 实验 实际 上 证 明了 DNA 是 遗传 物质 。

二 、 化 学 实验

1928 年 以 前 ， 科 学 界 普遍 认为 DNA 只 是 四 种 核 背 酸 组 成 的 物质 ， 人 们 相信
DNA 是 由 等 物质 的 量 的 腺 野 哈 (A)、 胸 腺 啶 (T)、 乌 味 哈 (G) 和 胞 喀 啶
(C) 组 成 。 这 个 不 正确 的 结论 主要 来 自 两 个 实验 ， 一 个 是 在 DNA 未 溶解 彻底 和
未 作 DNA 纯度 鉴定 之 前 就 进行 DNA 的 化 学 组 成 分 析 ， 这 样 使 定量 分 析 的 结果
很 不 准确 。 第 二 是 当时 用 于 碱 基 分 析 的 DNA 一 般 从 真 核 生 物 中 提取 ， 而 真 核 生
物 DNA 的 碱 基 是 由 四 种 碱 基 接 近 等 物质 的 量 组 成 的 。 后 来 Chargaff 广泛 地 使 用
了 多 种 生物 的 DNA， 并 且 采 用 纸 层 析 新 技术 分 离 各 种 碱 基 ， 用 紫外 光 吸 收 测定
每 种 碱 基 的 含量 ， 发 现 DNA 的 碱 基 组 成 很 不 一 样 ， 组 成 不 同 种 DNA 的 四 种 碱
基 的 物质 的 量 浓度 是 可 变 的 。 这 些 结果 初步 满足 了 DNA 作为 遗传 物质 的 需要 。
由 于 Chargaff 实验 结果 的 发 表 ，DNA 是 简单 四 核 苷 酸 聚 合 物 的 思想 很 快 消失 ，
同时 DNA 就 是 基因 的 思想 兴起 。 不 入 ， 同 一 实验 室 的 Alfred Mirsky 和 HansRis
及 另 一 实验 室 的 R Vendrely 和 A Boivin 分 别 发 现 各 种 不 同 的 有 机 体 体 细胞 中 的
DNA 是 精子 中 的 2 倍 ， 这 正 是 遗传 物质 应 有 的 特性 。 这 些 发 现 使 经 典 的 染色 体
遗传 学 原则 得 以 产生 。 这 个 结果 发 表 后 ，DNA 的 遗传 物质 性 质 很 快 变 成 了 流行
的 概念 。

三 、Blendor 实验

DNA 的 遗传 学 特性 的 最 有 力 的 证 据 来 自 于 大 肠 杆 菌 T2 噬菌体 实验 。 由 于 用
本 全

厨房 里 的 搅拌 器 (blendor) 作为 实验 装置 的 一 个 主要 部 件 ， 所 以 叫做 Blendor 实
验 。Alfred Hershey 和 Martha Chase 证实 注 入 到 细菌 中 的 噬菌体 粒子 DNA 含有
合成 子 代 鸣 菌 体 所 需要 的 全 部 遗传 信息 。

组 成 单个 喉 菌 体 的 DNA 包装 在 蛋白 质 外 壳 内 ， 在 噬菌体 粒子 中 只 有 DNA
是 含 磷 的 物质 ， 蛋 白质 外 壳 含 氨基 肽 ， 仅 甲 硫 氨 酸 和 胱 氮 酸 含 硫 原子 。 在 “P 标
记 的 培养 基 中 培养 能 得 到 ?2P 标记 了 DNA 的 鸣 菌 体 。 如 果 在 ”>S 标记 的 培养 基 中
培养 则 得 到 ”>S 标记 了 蛋白质 外 壳 的 叹 菌 体 。 用 这 两 种 不 同 标记 的 鸣 菌 体 分 别 去
感染 细菌 就 可 以 根据 其 放射 活性 在 被 感染 的 细胞 上 将 喉 菌 体 的 DNA 和 和 蛋 昌 质 定
位 。Herchey 和 Chase 证 明了 这 些 叹 菌 体 注入 细菌 细胞 内 的 是 “P 标记 物 而 不 是
”S 标记 物 。

第 一 个 实验 是 把 ”S 标记 的 叹 菌 体 与 细菌 混合 ， 吸 附 几 分 钟 后 ， 离 心 除去 没
有 吸附 的 唆 菌 体 ， 收 集 沉 淀 〈 噬 菌 体 -细菌 混合 物 )， 将 沉 尝 悬浮 后 再 一 次 离心 ，
收集 上 清 液 和 沉淀 ， 分 别 测定 放射 活性 。 发 现 80% 的 放射 活性 存在 于 上 清 液 中 ，
沉淀 中 只 有 20% 放射 活性 。 这 是 由 于 在 这 个 期 间 大 部 分 吸附 的 叹 菌 体 已 将 其
DNA 注入 细菌 而 蛋白质 外 壳 与 细菌 解 离 后 进入 上 清 液 ， 但 仍 有 少 部 分 蛋白 质 外
壳 还 留 在 细菌 细胞 壁 上 (图 3-3)。 后 来 证 明 沉 淀 中 的 20% 放射 活性 确实 是 由 于

被 感染 的 细菌

占 总 数 的 比例 /%

搅拌 时 间 /min
图 3-3 ”Blendor 实验 的 数据

鸣 菌 体 的 尾 丝 与 细菌 表面 结合 太 紧 ， 以 致 Blendor 也 不 易 将 它 除去 。 用 32P 标记 的
吹 菌 体 和 细菌 混合 ， 用 上 述 方法 同样 处 理 后 实验 结果 差别 很 大 ，70% 的 放射 活性
在 沉淀 里 ，30% 的 放射 活性 在 上 清 液 里 。 在 上 清 液 中 的 30% 的 放射 活性 可 能 是
由 于 搅拌 细菌 时 叭 菌 体 破损 产生 的 〈 几 年 后 发 现 一 些 缺 损 的 鸣 菌 体 粒 子 不 能 将 其
DNA 注入 到 细菌 中 )。 将 这 些 沉淀 悬 浮 在 生长 培养 基 中 重新 保温 ， 能 够 产生 子 代
噬菌体 ， 这 些 能 产生 子 代 鸣 菌 体 的 细菌 同时 可 以 从 亲 代 鸣 菌 体 转移 ?2P 到 子 代 细
菌 细胞 中 (图 3-4)。

另 一 类 实验 是 众所周知 的 转移 实验 (transfer experiment)， 也 证 明了 鸣 菌 体

呈 全 天

站
CSSCGO SS 训 轴

图 3-4 Blendor 实验

的 遗传 物质 含 “P 而 不 含 `S。 在 这 类 实验 中 ， 从 感染 了 ”>S 或 ”P 标记 的 叹 菌 体 的
细菌 中 分 离子 代 叭 菌 体 ， 对 它们 进行 放射 活性 分 析 ， 结 果 必 然 是 在 子 代 中 发 现 一
些 亲 代 的 遗传 物质 ， 在 子 代 叭 菌 体 中 没有 ”“S， 但 约 有 一 半 注 入 的 ”“P 转移 到 了 子
代 鸣 菌 体 中 ， 这 个 结果 说 明 ， 虽 然 “S 可 能 存在 于 叭 菌 体 感染 的 细菌 复合 物 上 ，
但 它 不 是 叹 菌 体 遗 传 物质 的 一 部 分 。 仅 有 一 半 ”P 被 转移 的 解释 是 : 子 代 DNA
是 随机 包装 到 蛋 白质 外 壳 中 的 ， 而 且 并 不 是 所 有 的 子 代 鸣 菌 体 DNA 都 能 被 成 功
地 包装 。

二 ， 壮 传 物质 的 性 质

作为 遗传 物质 首先 必须 具有 稳定 性 ， 其 次 必须 具有 多 样 性 ， 还 必须 具有 变异
性 。

一 、 遗 传 信息 由 DNA 储存 和 传递

一 个 细胞 中 DNA 携带 和 传递 的 遗传 信息 包括 以 下 几 类 : @ 细 胞 合成 的 每 一
种 蛋白 质 的 氨基 酸 顺 序 。@ 合 成 每 种 蛋白 质 的 起 始 和 终止 信号 。@ 决 定 在 某 一 单
位 时 间 里 合成 哪些 特定 的 蛋白 质 并 且 需 合成 多 少 蛋白 质 分 子 的 信号 装置 。

这 些 信 息 包含 在 DNA 分 子 的 碱 基 顺序 中 ， 但 这 些 氨 基 酸 顺序 和 起 始 、 终 止
信号 并 不 是 从 DNA 中 直接 获得 ， 而 是 从 RNA 中 间 物 中 获得 。DNA 为 信使 RNA
(mRNA) 提供 模板 ，mRNA 的 顺序 与 DNA 中 的 一 条 链 互 补 ， 蛋 白质 中 的 氨基
酸 顺 序 根据 mRNA 中 的 碱 基 顺 序 翻 译 。 碱 基 顺 序 以 三 个 碱 基 为 一 个 阅读 单位 ，
叫 三 联 密码 ， 每 一 个 三 联 密码 对 应 一 个 特定 的 氨基 酸 或 起 始 、 终 止 信号 。 这 种 分
两 步 走 的 过 程 具有 重要 作用 : 虽然 ， 蛋 白质 的 合成 是 连续 进行 的 ， 但 这 样 分 两 步
走 DNA 分 子 既 不 会 被 经 常 地 使 用 ， 也 不 会 直接 地 进入 蛋白 质 合 成 机 器 。 通 过 碱
基 配 对 ，DNA 上 的 顺序 可 以 很 容易 地 转录 到 RNA 分 子 上 。 在 酶 学 系统 中 ， 仅 仅
通过 互补 形成 氨 键 就 可 以 合成 RNA。 这 一 点 在 转录 一 章 将 详细 讨论 。DNA 的 局
部 变性 有 利于 碱 基 的 识别 过 程 ， 当 碱 基 对 暂时 打开 时 ，RNA 聚合 酶 能 够 穿 透 到
DNA 螺旋 中 阅读 碱 基 顺 序 ， 这 对 于 RNA 的 合成 是 必需 的 。

四 76 e

一 些 起 调控 作用 的 蛋白 质 分 子 也 能 识别 特异 的 碱 基 序 列 ， 决 定 蛋白 质 是 否 合
成 。 这 些 调控 蛋白 可 直接 结合 于 由 六 个 以 上 碱 基 对 组 成 的 序列 上 ， 而 且 并 不 需 碱
基 对 分 开 ， 与 结合 到 DNA 分 子 的 外 槽 内 相似 ， 这 些 调 挖 蛋白 能 识别 特异 的 电子
构 型 并 通过 电荷 、 范 德 华 力 、 世 水 作用 及 氢 键 与 DNA 序列 结合 ， 这 种 调控 蛋白
与 碱 基 序 列 结合 的 例子 有 : 入 DNA 与 Cro 蛋白 的 结合 、 抑 制 蛋白 如 LacI 蛋白 以
及 cAMP 受 体 蛋 白 等 与 特异 碱 基 顺 序 的 结合 。

二 、 遗 传 信 息 从 杀 代 传递 到 子 代

当 细胞 分 裂 时 ， 每 个 子 代 细胞 必须 含有 同样 的 遗传 信息 。 也 就 是 说 DNA 分
子 必须 变 成 两 个 同样 的 分 子 ， 并 且 每 个 分 子 都 携带 亲 代 细 胞 中 所 含有 的 遗传 信
息 ， 这 种 二 倍 化 过 程 叫 复制 。 复 制 只 通过 碱 基 互 补 形 成 氢 键 来 进行 。

三 、 携 市 遗传 信息 的 DNA 的 化 学 稳定 性

在 生物 进化 过 程 中 ， 一 种 简单 的 DNA 分 子 至 少 经 历 了 几 千 年 或 更 长 的 时
间 ， 在 这 数 百 万 年 中 这 些 含 有 遗传 信息 的 分 子 在 细胞 繁殖 的 传递 过 程 中 只 有 小 小
的 改变 ， 因 而 DNA 分 子 必须 有 很 高 的 稳定 性 。

DNA 分 子 的 脱氧 核糖 -磷酸 骨架 是 极端 稳定 的 。 脱 氧 核糖 中 的 C-C 键 可 以 抵
抗 所 有 条 件 下 的 化 学 攻击 ， 甚 至 能 抵抗 高 温 下 的 强酸 作用 。 虽 然 其 磷酸 二 酯 键 的
稳定 性 较 小 ， 在 室温 pH 2 条 件 下 可 水 解 ， 但 这 不 是 生理 条 件 。 由 于 磷酸 二 酯 键
的 稳定 性 较 小 ， 所 以 DNA 的 成 糖 是 2 -脱氧 核糖 而 不 是 核糖 。 在 碱 性 pH 条件
下 ，RNA 可 很 快 水 解 成 自由 的 单 核 苷 酸 ， 甚 至 在 pH 8 时 RNA 分 子 的 磷酸 二 酯
键 就 打开 而 形成 大 小 不 等 的 片段 ， 该 反应 叫做 B 消 除 反 应 ， 它 需要 糖 环 上 有 产
基 ， 除 了 未 端 核 苷 酸 上 的 3 -OH 外 ， 还 需要 在 RNA 骨架 中 有 2 -OH。DNA 中 的
2 -脱氧 核糖 中 没有 自由 -OH， 也 就 是 说 ，DNA 不 可 能 通过 这 个 途径 水 解 。 在 室
温 pH 7 一 9 条 件 下 检测 不 出 DNA 的 水 解 。 碱 基 在 化 学 结构 上 的 改变 意味 着 遗传
信息 的 丢失 。 在 一 个 细胞 里 有 大 量 的 化 合 物 能 攻击 自由 碱 基 ， 由 此 就 可 以 看 出
DNA 双 螺 旋 结 构 的 重要 意义 。DNA 是 两 条 链 ， 这 对 携带 遗传 信息 来 说 是 过 剩 的
分 子 ，DNA 分 子 的 一 条 链 与 另 一 条 链 互补 ， 细 胞 里 存在 修复 系统 ， 除 去 改变 了
的 碱 基 后 可 以 通过 阅读 互补 链 上 的 顺序 将 正确 的 碱 基 替换 上 去 ，DNA 双 螺 旋 更
重要 的 意义 在 于 双 螺 旋 性 质 为 碱 基 抵 抗 化 学 攻击 提供 了 保护 ， 碱 基 使 疏水 环 上 有
带电 基 团 ， 正 是 这 些 带 电 基 团 需要 保护 。 这 些 碱 基 基 团 的 每 对 之 间 的 氢 键 为 其 提
供 了 第 一 道 防线 ， 碱 基 的 朴 水 性 使 碱 基 堆 积 ， 大 大 减少 了 碱 基 被 化 学 攻击 而 受伤
的 可 能 性 。 氢 键 位 于 碱 基 堆 积 成 的 圆柱 体 的 中 心 ， 碱 基 堆 积 的 结果 使 水 完全 从 碱
基 排 列 的 方 阵 中 排除 出 去 ， 由 于 任何 潜在 的 有 害 化 合 物 通常 通过 溶 于 水 产生 毒害

oa 。

作用 ， 所 以 这 些 分 子 很 难 进 入 “ 干 ” 的 碱 基 堆 积 中 靠近 和 接触 碱 基 ， 使 这 些 化 合
物 攻 击 碱 基 的 可 能 性 很 小 。 糖 苷 键 位 于 DNA 的 碱 基 和 糖 的 二- 碳 原子 处 ， 除 了 极
端 pH 条 件 下 ， 糖 苷 键 很 稳定 ， 如 果 碱 基 不 是 环 状 ， 那 么 糖苷 键 的 稳定 性 将 降
低 ， 味 吟 环 上 7 位 氮 原 子 的 甲 基 化 极 大 地 降低 了 糖苷 键 的 化 学 稳定 性 ， 这 可 能 是
高 度 诱 变 和 高 度 毁 灭 性 的 作用 模式 。 氮 介子 和 硫 介子 曾 在 第 一 次 世界 大 战 中 使 用 ，
任何 一 种 介子 〈 所 介子、 硫 介 子 等 ) 都 提供 烷 基 基 团 ， 与 乌 味 叭 7 位 氮 原 子 接触 ，
使 鸟 味 叭 从 糖 环 上 脱落 ， 这 样 糖 环 上 在 1 位 碳 原子 上 剩 下 一 个 一 OH， 接 着 磷酸 二
酯 键 发 生 水 解 。

除 胞 喀 啶 外 ， 碱 基本 身 是 很 稳定 的 ， 胞 喀 啶 以 很 低 的 频率 脱 氨 基 形 成 尿 喀
啶 ， 脱 氨基 作用 是 个 灾难 性 的 变化 ， 因 为 脱 氨 基 后 变 成 尿 啶 ， 而 尿 喀 啶 与 腺 哄
叭 的 配对 机 会 比 它 与 乌 味 叭 的 配对 机 会 多 ， 这 样 会 引起 两 个 效应 : @ 不 正确 的 碱
基 将 出 现在 mRNA 中 ，@ 在 DNA 复制 时 A 代替 G 将 合成 一 条 新 的 DNA 链 (图
3-5)。 在 复制 一 章 中 将 讨论 到 在 细胞 内 DNA 复制 时 将 用 工 代 替 U， 这 就 消除 了
利用 脱 氨基 作用 形成 的 尿 喀 啶 的 可 能 性 ， 这 就 很 好 地 解释 了 为 什么 DNA 复制 中
利用 工 与 A 配 对 而 不 利用 癌 与 A 配 对 。 如 果 癌 是 DNA 中 的 正常 碱 基 ， 就 没有
办 法 鉴别 是 正常 的 U 还 是 C 通 过 脱 氨基 作用 形成 的 不 正确 的 U。 细 胞 遵循 一 个
原则 : RNA 利用 U 而 不 利用 T，DNA 利用 T 工 而 不 利用 其 他 碱 基 ， 但 产生 这 种 现
象 的 原因 并 不 清楚 。 这 可 能 是 进化 中 的 一 个 偶然 事件 ， 很 可 能 原始 的 RNA 和
DNA 都 只 含有 胞 喀 啶 和 尿 喀 啶 ， 当 时 只 有 这 两 种 喀 啶 可 以 利用 。 后 来 细胞 获得
了 把 尿 喀 喧 甲 基 化 形成 胸腺 喀 啶 的 能 力 ， 因 此 给 细胞 提供 了 一 个 消除 引起 C-~>T
转变 的 标准 。 胸 腺 喀 啶 核 苷 酸 合 成 的 最 后 一 步 是 脱氧 尿 喀 啶 核 苷 酸 的 甲 基 化 ， 这
是 重要 的 一 步 。 胸 腺 旷 啶 转变 成 三 磷酸 核 童 酸 才能 挫 入 到 DNA 中 。

C
TACOGATT TACGATT
ATGCTAA ATGUTAA
和 攻
脱 氢
| 复制 |
TACGATT TACGATT
亲本 ATGCTAA ATGCTAA 亲本
十 十
TACGATT TACAATT 2。
亲本 ATGCTAA ATGUTAA 突变 体

图 3-5 在 mRNA 分 子 和 两 个 子 代 DNA 分 子 中
胞 旷 啶 脱 氨基 形成 尿 喀 喧

*。， 78 ，

、 遗 传 物质 的 变异 性 (突变

单个 细胞 的 所 有 遗传 信息 都 存在 于 它 的 DNA 中 ， 而 细胞 要 能 够 进化 ， 其
DNA 碱 基 顺 序 必 须 是 可 变 的 。 并 且 这 种 变化 后 的 DNA 必须 是 持久 的 ， 能 传递 给
子 代 ， 这 样子 代 细 胞 才能 具有 这 种 新 DNA 的 性 质 。 这 种 碱 基 顺 序 的 改变 过 程 叫
突变 ， 突 变 有 两 种 重要 的 机 制 : @ 一 个 碱 基 的 化 学 变化 给 于 这 个 碱 基 新 的 氢 键 性
质 ， 使 新 复制 的 子 代 分 子 中 出 现 一 个 新 的 碱 基 。@ 复 制 错 误 使 一 个 不 正确 的 或 一
个 额外 的 碱 基 意外 地 插入 到 子 代 DNA 分 子 中 去 。

一 般 来 说 ， 突 变 是 有 害 的 ， 并 且 可 能 导致 细胞 死亡 。 所 以 突变 的 比率 必须 很
低 或 受到 控制 。 防 止 和 控制 突变 发 生 通 过 两 种 途径 完成 ， 第 一 ，DNA 分 子 无 水
的 玻 水 核 降 低 了 DNA 对 化 学 攻击 的 敏感 性 ， 这 一 点 如 前 所 述 ; 第 二 ， 细 胞 已 经
进化 了 几 种 修复 机 制 ， 使 变化 的 碱 基 或 在 复制 中 出 现 的 错误 及 时 纠正 。 这 些 修 复
体系 虽然 不 是 完全 有 效 的 ， 它 允许 以 很 低 的 频率 产生 突变 ， 但 是 这 种 很 低频 率 的
突变 对 于 生命 长 期 的 延续 是 有 用 的 。 不 过 正如 前 面 所 说 的 那样 ， 这 种 突变 一 般 来
说 是 有 害 的 ， 所 以 突变 时 不 丧失 亲 代 的 遗传 信息 是 很 重要 的 。 生 物 可 以 从 两 方面
防止 亲 代 遗传 信息 的 丧失 : @ 一 个 种 中 的 其 他 成 员 保留 亲 代 的 碱 基 顺 序 ，@ 双 链
分 子 中 的 一 条 链 是 元 余 的 。 通 常 DNA 双 链 中 只 有 一 条 链 发 生 改 变 ， 而 DNA 复
制 时 是 以 两 条 亲 代 链 为 模板 各 自 合成 一 条 新 链 ， 细 胞 分 裂 后 每 个 子 代 细胞 里 都 只
含有 亲 代 DNA 的 一 条 链 ， 这 样 可 以 形成 一 个 含有 正常 DNA 分 子 的 子 代 细胞 ，
而 另 一 个 子 代 细胞 的 DNA 是 突变 的 。 除 非 这 个 细胞 具有 亲 代 的 遗传 信息 ， 否 则
这 个 突变 体 可 能 不 能 存活 。 但 是 如 果 这 个 突变 体 在 生存 和 繁殖 方面 比 亲 代 生 物 或
这 个 种 的 其 他 任何 成 员 都 优越 的 话 ， 通 过 很 多 世代 之 后 ， 根 据 达 尔 文 的 适 者 生存

理

| |

N--H 一 N
和 EN TY
脱氧 核糖 二 史 NH N
人
腺 顺 叭 ( 亚 氨 式 ) 裤

CH，
NBS
二 Noise
脱氧 核糖 N 一 人 要 返 脱氧 核糖
ErO
区 册 几 三 订 胸腺 嗜 啶 ( 燃 醇 式 )
图 3-6 亚 氨基 形式 的 腺 味 哈 和 胞 喀 喧 及 烯 醇 式 的
胸腺 喀 喧 和 乌 嗓 叭 之 间 的 配对

79 和 人，

的 原理 终 将 导致 自然 界 中 突变 型 代替 亲 代 的 野生 型 。

突变 的 第 二 种 机 制 一 一 复 制 错误 ， 这 是 由 于 碱 基 A 和 工 的 异 构 化 性 质 形 成 的 。
A 的 亚 氨基 可 以 与 C 形成 稳定 的 氢 键 ， 而 烽 醇 式 的 工 可 与 G 形 成 配对 (图 3-6)，
产生 这 种 现象 的 原因 可 能 是 在 原始 的 海洋 里 ， 核 酸 分 子 也 有 自发 出 现 的 其 他 碱
基 ， 可 以 变 构 的 碱 基 被 保存 下 来 ， 因 为 它们 允许 突变 ， 使 生物 能 适应 环境 的 改变
以 及 适应 进化 的 要 求 。

三 节 中 传 物质 一 一 RNA

前 一 节 我 们 已 经 讨论 了 DNA 是 遗传 物质 ， 但 这 只 是 一 般 性 的 结果 ， 还 遗留
一 些 问 题 必 须 解 答 。

我 们 知道 有 的 动 、 植 物 病毒 及 有 些 噬菌体 不 含 DNA， 只 有 RNA。DNA 作
为 合成 蛋白 质 的 遗传 信息 的 携带 者 ， 并 且 在 DNA 到 蛋白 质 的 合成 途径 中 总 是 以
DNA 为 模板 合成 RNA 中 间 物 ， 即 中 心 法 则 ，DNA->RNA->~ 蛋 白质。 而 一 个 没
有 DNA 的 生物 只 能 利用 RNA 的 碱 基 顺 序 储 存 遗 传 信息 作为 合成 蛋白 质 的 模板 。
但 RNA 不 能 像 DNA->RNA->~ 蛋 白质 系统 中 那样 有 效 地 执行 这 两 种 功能 ， 那 么
RNA 作为 遗传 物质 是 如 何 行使 其 功能 呢 ? 下 面 我 们 将 讨论 这 个 问题 。

在 前 一 节 我 们 了 解 了 DNA 可 以 作为 遗传 物质 的 优越 条 件 ， 然 而 在 有 些 生物
中 它们 缺少 起 基本 保护 作用 的 双 螺 旋 ， 并 且 已 知 有 一 些 病毒 和 一 种 叹 菌 体 是 双 链
RNA。 在 细胞 生物 中 ，RNA 是 不 能 作为 遗传 物质 的 。 因 为 细胞 里 有 许多 可 对
RNA 产生 化 学 攻击 的 物质 降低 了 RNA 在 细胞 中 的 化 学 稳定 性 。 唯 独 在 鸣 菌 体 和
病毒 里 RNA 可 以 作为 遗传 物质 ， 因 为 它们 包装 在 一 个 不 溶解 的 蛋白 质 外 壳 里 ，
使 它们 在 环境 中 受到 保护 。 在 宿主 中 RNA 分 子 大 部 分 时 间 以 不 活动 的 粒子 状态
存在 ， 并 以 很 低 的 频率 复制 ， 当 繁殖 时 ， 复 制 非常 迅速 ， 在 很 短 时 间 里 产生 大 量
的 子 代 粒子 ， 以 其 绝对 的 数目 来 补偿 较 低 化 学 稳定 性 造成 的 RNA 的 不 足 。 这 样
RNA 叭 菌 体 和 RNA 病毒 逐渐 形成 补偿 特性 而 得 以 存活 。

第 四 记 ”可 转移 的 遗传 因子
病毒 、 质 粒 和 转 座 因子 都 是 染色 体外 的 可 以 移动 的 遗传 物质 ， 它 们 都 必须 依
赖 于 宿主 而 复制 。 这 一 节 我 们 主要 介绍 ; 质粒 的 一 般 性 质 、 复 制 机 制 以 及 几 种 原

核 和 真 核 细胞 中 的 质粒 ; 转 座 因子 的 特征 及 转 座机 制 ; 从 进化 角度 讨论 病毒 、 质
粒 及 转 座 因子 的 关系 。

。，80 ，

AN 避 质 -和 粒

质粒 〈plasmid) 是 在 许多 细菌 和 某 些 真 核 生 物 中 发 现 的 染色 体外 的 环 状
DNA 分 子 。 在 正常 情况 下 ， 质 粒 可 以 随 宿 主 细胞 的 分 裂 而 分 配 到 子 代 细胞 中 去 ，
但 在 细胞 分 裂 过 程 中 有 时 也 产生 无 质粒 的 细胞 ， 而 且 这 种 细胞 也 可 以 存活 ， 然 而
许多 质粒 含有 的 质粒 基因 在 某 种 条 件 下 对 于 宿主 的 生长 是 必需 的 。 例 如 R 质粒
携带 抗 抗生素 的 基因 ， 含 有 这 种 质粒 的 细胞 可 在 某 种 抗生素 存在 的 环境 中 存活 ;
有 些 质 粒 如 F'， 携 带 来 源 于 宿主 染色 体 上 的 几 个 基因 ， 例 如 携带 基因 /eu ， 这
样 的 质粒 对 于 ev 的 细胞 是 必需 的 。 还 有 许多 其 他 类 型 的 质粒 常常 可 以 通过 它
们 所 携带 的 基因 来 测定 。

1. 质粒 的 一 般 性 质 及 类 型

虽然 不 同 的 质粒 具有 互 不 相同 的 基因 和 调控 位 点 ， 但 它 也 像 噬菌体 一 样 ， 主
要 依赖 于 宿主 的 代谢 功能 进行 复制 ， 例 如 质粒 可 以 正常 地 利用 宿主 的 大 部 分 复制
机 器 。 然 而 每 一 种 质粒 都 有 控制 复制 时 间 和 控制 在 每 个 细胞 中 拷贝 数 的 基因 ( 严
紧 型 质粒 每 个 细胞 只 有 1 一 2 个 拷贝 ， 松 弛 型 质粒 每 个 细胞 有 10 一 100 个 拷贝 )。
在 细胞 分 裂 时 需 小 心地 控制 分 配 到 子 代 细 胞 中 的 质粒 个 数 ， 即 假如 一 个 细胞 内 的
质粒 已 为 细胞 分 裂 准备 了 两 个 质粒 分 子 ， 那 么 每 个 子 代 细胞 中 就 应 该 有 一 个 质粒
DNA 分 子 ， 如 果 这 一 过 程 出 现 差错 ， 分 裂 时 就 会 出 现 无 质粒 细胞 ， 这 种 情况 出
现 的 频率 是 10/ 代 。 质 粒 的 这 些 稳定 性 质 受 质粒 和 染色 体 的 联合 控制 ， 但 联合
控制 的 机 制 还 不 十 分 清楚 。

在 不 同 的 大 肠 杆菌 菌株 中 发 现 了 许多 类 型 的 质粒 ， 已 研究 得 较 多 的 有 三 种 ，
F、R 和 Col 质粒 。 这 些 质粒 虽然 具有 一 些 共 同 的 性 质 ， 但 也 有 许多 不 同 的 地 方 。
OF 性 因子 ， 能 将 染色 体 基因 和 它 本 身 转 移 到 无 质粒 的 细胞 中 。@R 抗 药性 因
子 ， 抗 一 种 或 多 种 抗生素 并 且 能 将 抗 性 转移 到 无 R 质粒 的 细胞 中 。@Col 大 肠 杆
菌 素 因子 ， 能 合成 大 肠 杆菌 素 ， 大 肠 杆 菌 素 可 以 杀 死 亲缘 关系 很 近 但 不 含 Col 质
粒 的 菌株 。

除 酵母 killer 质粒 为 RNA 分 子 以 外 ， 已 知 的 所 有 质粒 都 是 环 状 超 螺旋 DNA
分 子 ， 它 们 的 分 子 质量 从 105Da (小 质粒 ) 到 105Da (大 质粒 ) 不 等 。 表 3-1 列
出 了 目前 研究 得 比较 多 的 几 种 质粒 的 分 子 质 量 。 根 据 质粒 的 超 螺旋 性 质 ， 通 过 离
心 、 密 度 梯度 离心 和 电泳 很 容易 将 其 和 染色 体 DNA 分 离 。

通 稍 分 离 完整 DNA 都 要 经 过 去 蛋白 步骤 ， 但 从 大 肠 杆菌 中 分 离 质 粒 DNA
一 般 没 有 这 个 步骤 ， 大 约 有 一 半 的 超 螺旋 质粒 DNA 分 子 中 含有 三 个 紧密 结合
蛋白 质 分 子 ， 这 种 DNA- 蛋 白质 复合 物 称 作 松弛 复合 物 (relaxation complex)。 如
果 用 加 热 、 碱 、 蛋 白水 解 酶 或 去 污 剂 处 理 这 种 复合 物 ， 因 这 三 种 结合 蛋白 中 有 一

和

种 具有 核酸 酶 活性 ， 可 使 质粒 DNA 的 一 条 链 上 产生 切口 ， 使 超 螺旋 松弛 ， 形 成
环 状 切 口 形 式 。 这 个 切口 在 DNA 上 的 一 个 专 一 位 点 上 产生 。 在 超 螺 旋 松 弛 过 程
中 ， 两 个 小 蛋白 质 分 子 释 放 ， 而 一 个 大 蛋白 质 分 子 仍 共 价 结合 在 切口 DNA 的/
末端 。 松 弛 酶 只 能 使 超 螺 旋 DNA 分 子 专 一 位 点 上 产生 切口 ， 而 不 能 使 松弛 环 产
生 切 口 。 产 生 切 口 在 质粒 由 一 细胞 转移 到 另 一 细胞 的 接合 转移 中 起 作用 。

表 3-1 几 种 质粒 及 各 自 的 性 质
分 子 质量 / 自我 转

质粒 有 辣 : 拷贝 数 移 能 力 表 型 特征
Col
Col El 4.2 10 一 15 不 大 肠 杆菌 素 E1 ( 膜 改 变 )
Col E2 5.0 10 一 15 不 大 肠 杆 菌 素 E2 (Dnase)
Col E3 5.0 10 一 15 不 大 肠 杆菌 素 E3 (核糖 体 RNase)
性 质粒
F 62 1 一 2 能 性 纤毛
F'lac 95 1 一 2 能 性 纤毛 : lac 操纵 子
R 质粒
R100 70 1 一 2 能 Camr str Su Tet
R64 78 能 Tet Str
R6K 25 12 能 Ampr Str
PSC101 5.8 二 二 2 不 Ta
喉 菌 体质 粒
Xdv 4.2 50 入 基因 cro，CI，O, P
重组 质粒
pDM500 9.8 :20 不 果 蝇 组 蛋白 基因
pPBR322 289 人 20 不 高 拷贝 数
pBR345 0.7 、20 不 ColE1 型 复制
酵母 质粒
2pm 4.0 s60 不 不 知道 其 基因

2. 质粒 的 复制 机 制 及 其 拷贝 数 的 控制

从 表 3-1 中 可 以 看 到 有 些 质粒 有 转移 能 力 ， 而 有 些 质 粒 无 转移 能 力 。 一 般 分
子 质量 小 的 质粒 无 转移 能 力 ， 而 分 子 质量 大 的 质粒 有 转移 能 力 ， 如 分 子 质量 在
10x104U 以 下 的 质粒 一 般 无 转移 能 力 ， 而 分 子 质 量 在 25 x 104U 以 上 的 质粒 一
般 具 有 转移 能 力 ， 如 下 性 因子 和 R 抗 药 性 因子 。
在 遗传 结构 、 行 为 、 分 子 性 状 方面 研究 得 最 早 和 最 为 详细 的 质粒 是 大 肠 杆菌
的 性 因子 (F)， 具 有 这 种 质粒 的 细菌 能 形成 表面 毛 状 物 ， 通 过 表面 毛 状 物 介 导 ，
贡 于 多 区 天

细菌 在 与 其 他 细菌 接触 时 可 发 生 接 合作 用 ， 并 将 质粒 DNA 传递 给 对 方 。 在 下 因
子 的 基因 组 中 ， 具 有 一 些 容 易 与 其 他 DNA 发 生 重 组 的 特殊 结构 ， 常 和 寄主 染色
体 发 生 重组 ， 在 接合 传递 时 把 一 部 分 染色 体 转 入 受 体 菌 内 。

根据 下 因子 的 有 无 和 存在 状态 ， 可 以 把 大 肠 杆 菌 区 分 为 三 种 类 型 ， 即 下 - :
细胞 中 无 FF 因子 ; FE : 细胞 中 有 下 因子 ， 存 在 于 细胞 质 中 ; Hfr: 细胞 中 有 下 因
了 整合 在 染色 体 上 ， 即 所 谓 的 高 频 重 组 (high frequency recombination) 菌株 。
F“ 因 子 是 F 因子 上 带 有 寄主 染色 体 基因 ， 这 是 由 于 Hfr 错误 割 离 造 成 的 。

质粒 的 转移 过 程 可 分 为 四 步 : @ 有 效 接触 。 供 - 受 体 对 的 形成 。@ 动 员 。 为
质粒 转移 做 准备 。@DNA 转移 。 图 受 体 中 形成 一 个 有 复制 功能 的 质粒 (repli-
conation ) 。

许多 质粒 的 转移 并 不 具备 上 述 全 部 过 程 ， 所 以 有 几 个 名 词 需 要 说 明 。

接合 质粒 是 携带 有 有 效 接触 功能 基因 的 质粒 。 可 动员 质粒 是 能 够 为 转移 准备
自己 的 DNA 的 质粒 。 自 身 转 移 性 质粒 是 具备 接合 和 动员 两 种 功能 的 质粒 ， 如 下
因子 。 图 3-7 是 下 因子 转移 的 详细 过 程 。

当 质 粒 的 松弛 复合 物 中 的 切口 蛋白 在 质粒 DNA 的 一 条 链 的 特定 顺序 上 产生
切口 时 〈 这 个 特定 顺序 叫 转移 原点 )， 动 员 开 。 。 虹 相 下 归 打
始 。 环 状 DNA 从 切 点 处 开始 滚 环 复制 (切口
蛋白 仍 结合 在 5 末端 并 且 转 移 到 受 体 细胞 )， |
环 化 后 再 复制 形成 环 状 超 螺旋 质粒 DNA 分 子 。 |

在 接合 转移 中 ， 供 体 和 受 体 中 都 发 生 了
DNA 的 合成 。 供 体 中 的 DNA 合成 叫做 供 体 结
合 DNA 合成 ， 受 体 中 的 DNA 合成 叫 受 体 结合
DNA 合成 。 以 上 所 说 的 质粒 DNA 的 转移 指 的

| 生生

是 细胞 与 细胞 接触 后 的 转移 。 在 实验 室 中 把 自
由 质粒 DNA 和 适当 处 理 的 受 体 细 胞 混合 ， 质
粒 DNA 也 可 以 转移 ， 这 叫做 转化 。 如 果 细 苗
用 冷 CacCb 溶液 处 理 后 就 获得 了 吸收 DNA 分
了 的 能 力

我 们 知道 质粒 DNA 的 复制 在 很 大 程度 上 | 妆 轩 的 链 在
依赖 于 寄主 的 复制 机 器 ， 但 不 同 的 质粒 对 寄主
复制 机 器 的 利用 程度 不 同 ， 例 如 小 型 质粒 (人 @ )
ColE !1 可 以 在 体外 细菌 提取 物 中 复制 而 不 依赖
质粒 基因 本 身 编 码 的 蛋白 质 〈 当 然 不 能 排除 质
粒 蛋 白质 在 体内 对 于 质粒 的 复制 具有 必要 性 的
可 能 )。 另 一 些 质 粒 如 下 的 温度 敏感 突变 体 在
427 时 质粒 不 能 复制 ， 含 这 种 突变 体质 粒 的 细 图 3-7 F 因子 的 转移 过 程

菌 在 42 人 培养 几 代 之 后 ， 许 多 子 代 细胞 中 不 再 含有 质粒 。 许 多 质粒 的 复制 不 需
要 寄主 与 复制 有 关 的 全 部 基因 产物 ， 例 如 下 因子 可 以 在 下 .coii dnaA (Ts) 菌株
中 在 高 温 下 复制 ， 但 染色 体 DNA 则 不 复制 ， 这 说 明 下 因子 复制 不 需要 寄主 的
anaA 基因 产物 。 另 一 些 质 粒 复制 需要 寄主 基因 产物 ， 这 个 产物 对 寄主 也 是 需要
的 ， 如 细菌 突变 株 中 polI 活 性 降低 使 细菌 不 能 正常 生长 ， 也 不 能 支持 ColE 1 的
复制 。

不 同 的 质粒 的 复制 机 制 也 不 同 :

1) 复制 的 方向 纯粹 地 单 向 复制 和 纯粹 地 双向 复制 在 质粒 的 复制 中 都 曾 观察
到 。 还 有 些 质 粒 存 在 这 两 种 复制 方式 。 例 如 质粒 RK6 先 按 一 个 方向 复制 然后 在
同一 复制 起 始点 以 相反 的 方向 复制 后 边 的 部 分 。

2) 终止 按 单方 向 复制 的 环 状 DNA 分 子 ， 复 制 终点 就 在 复制 的 起 点 。 双 回
复制 的 环 状 DNA 分 子 的 复制 终点 有 两 种 类 型 ， 一 种 是 复制 又 延伸 到 同一 区 域 时
终止 ， 例 如 入 鸣 菌 体 。 另 一 种 是 在 固定 的 位 置 终 止 ， 常 常 是 一 个 复制 又 先 到 这 一
位 点 终止 ， 另 一 复制 叉 后 到 达 这 一 位 点 ， 目 前 对 这 种 固定 终止 的 信号 已 有 所 了
解 。

3) 复制 形式 。 在 对 复制 研究 得 清楚 的 质粒 中 ， 复 制 以 butterfly 模式 进行 ，
在 复制 的 部 位 解 旋 ， 不 复制 的 部 位 仍 为 超 螺旋 ， 复 制 时 的 形状 像 6。 所 以 称 为 8
复制 。 当 一 次 复制 完成 时 ， 其 中 一 个 环 必 须 被 切 开 (可 能 是 DNA gyrase 作用 )，
复制 后 产生 一 个 切口 环 状 分 子 和 一 个 超 螺旋 分 子 ， 切 口 环 状 分 子 随 后 再 被 连接 形
成 超 曙 旋 。 究 竟 这 是 不 是 质粒 复制 的 普遍 机 制 ， 目 前 还 不 清楚 。

质粒 拷贝 数 的 控制 。 我 们 知道 有 些 质粒 是 低 找 贝 (每 细胞 1 一 2 拷贝 )， 有 些
则 是 多 拷贝 (每 细胞 10 一 100 拷贝 )。 那 么 各 种 质粒 在 细胞 中 的 拷贝 数 是 如 何 控
制 的 呢 ? 有 人 提出 由 质粒 基因 编码 一 种 抑制 物 抑制 质粒 的 复制 ， 质 粒 进入 寄主
后 ， 在 质粒 基因 没有 表达 之 前 ， 质 粒 可 以 利用 寄主 复制 机 器 进行 复制 ， 复 制 一 到
两 次 后 ， 质 粒 基因 产物 (抑制 物 ) 表达 抑制 质粒 的 复制 。 这 样 细胞 分 裂 后 每 个 子
代 细 胞 中 只 有 1 一 2 个 质粒 ， 这 种 低 找 贝 数 质粒 可 能 只 需 受 抑 制 物 单 体 分 子 作 用 ，
所 以 对 复制 的 抑制 不 需要 高 浓度 抑制 物 的 存在 。 而 对 多 拷贝 质粒 来 说 ， 其 复制 的
抑制 受 多 聚 体 抑 制 蛋白 的 作用 ， 因 此 需要 抑制 物 达到 高 浓度 时 才能 抑制 其 复制 ，
因此 这 种 质粒 有 时 间 复 制 多 次 ， 产 生 高 拷贝 。

在 杂 合 质粒 pSC 134 中 可 以 看 到 质粒 拷贝 数 的 控制 情况 。pSC 134 是 由 完整
的 质粒 ColE 1 和 质粒 pSC 101 杂 合 组 建 的 。 这 两 种 质粒 的 拷贝 数 分 别 是 18 和 6
个 ， 从 pSC 134 中 可 以 得 到 以 下 三 个 事实 (图 3-8)。

质粒 pSC 134 从 ColE 1 的 复制 原点 进行 复制 具有 16 个 拷贝 ， 差 不 多 等 于
ColE 1 的 拷贝 数 。

@ 如 果 把 pSC 134 放 到 一 个 polA -细胞 中 ，ColE 1 原点 不 能 开始 复制 ，

*。 84 ，

正常 质粒 在 polA”* 或 polA 细胞 中 的 复制

三 人 Se)

口

AN

号 开罗 重组 技术 全 转化
惑

pSC131 或 pSC101 复制 的 影响

图 3-8 质粒 ColE 1、PpSC 101 和 重组 质粒 PSC 134
在 不 同 细胞 中 的 拷贝 数
图 中 数字 (1、6、16) 指 拷贝 数 。

pSC101 不 复制

pSC 101 的 拷贝 数 ， 这 两 个 结果 说 明 拷贝 数 的 控制 与 复制 原点 的 利用 有 关系 。

从 全 pSC 101 引入 到 一 个 含有 pSC 134 质粒 的 细菌 中 ，pSC 101 则 不 能
复制 ， 这 个 结果 表明 结合 在 pbSC 101 上 的 抑制 物 是 由 pSC 134 质粒 制造 的 。

相 人 人 点 必须 明白 ， 因 为 在 一 个 特定 的 细胞 中 同 种 质
粒 的 各 个 分 子 是 完全 相同 的 ， 抑 制 物 不 能 分 辨 是 这 个 分 子 还 是 那个 分 子 ， 当 有 活
性 的 抑制 物 分 子 的 浓度 比较 低 ， 不 足以 使 所 有 的 质粒 DNA 分 子 的 复制 受到 抑制
时 ， 抑 制 物 随 机 地 和 少数 DNA 分 子 结合 抑制 复制 。 如 果 一 个 质粒 复制 成 两 个 子
代 质 粒 ， 这 两 个 分 开 的 子 代 质 粒 也 和 其 他 质粒 一 样 具 有 复制 能 力 ， 因 而 实际 上 可
被 复制 的 分 子 也 是 从 整个 质粒 群体 中 随机 挑选 的 。

对 质粒 ColE !1 的 抑制 机 制 已 十 分 清楚 (图 3-9)。ColE 1 合成 的 起 始 过 程 是
从 复制 原点 上 游 651bp 处 转录 一 个 长 的 RNA ( 叫 RNAII) 开始 的 ， 这 个 RNA 分
子 的 合成 也 像 典型 的 RNA 聚合 过 程 一 样 ， 只 有 3 端 少数 几 个 碱 基 与 DNA 保持
配对 状态 。 由 于 分 子 内 部 的 互补 ， 释 放 的 RNA 形成 具有 几 个 葵 环 的 结构 ， 这 些

。， 85S ，

站
GO

形成 的 二 级 结构 以 某 种 方式 使 新 产生 的 RNA 与 DNA 保持 接触 〈 从 转录 起 始点
555 碱 基 开始 )， 大 约 100 个 碱 基 与 DNA 形成 RNA-DNA 杂 合 区 ，RNase 再 在 复
制 原点 处 的 RNA 链 中 产生 一 个 切口 ， 产 生 3-OH 末端 ， 确 保 在 3-OH 末端 加 上
脱氧 核 苷 酸 合成 DNA。

图 3-9 质粒 ColE1 复制 的 起 始

另 一 个 RNA 也 在 原点 区 转录 ， 这 个 RNA 分 子 叫 RNAI， 在 距 RNAII 转录
起 始点 右边 110 碱 基 处 从 右 向 左 转录 (图 3-9 中 的 方向 )。RNAI 有 108 碱 基 长 度
并 且 左 向 转录 ， 也 就 是 说 RNAI 的 DNA 模板 链 与 RNAII 的 模板 链 互补 ， 即
RNAI 与 RNAII 的 $ 端 互补 ，RNAI 可 以 与 RNAII 形成 双 链 结构 以 防止 RNAII
的 二 级 结构 形成 ， 从 而 影响 RNAII 与 DNA 形成 杂 合 双 链 而 使 RNase 百 不 能 在
复制 原点 产生 切口 ， 这 样 也 就 抑制 了 ColE 1 的 复制 从 而 控制 拷贝 数 。

另 一 调控 因子 一 一 质粒 编码 的 一 种 小 的 蛋白 质 Rom 也 是 很 重要 的 ， 但 作用
方式 还 不 清楚 ，Rom 决定 RNALRNAII 双 股 分 子 形成 的 速度 。 如 果 Rom 蛋白 的
浓度 太 低 ， 双 链 RNA 不 能 形成 ，RNAII 可 以 形成 茎 环 构象 ，RNase 百 可 以 切割
RNAII，DNA 的 合成 起 始 。

高 拷贝 数 质粒 可 以 表现 出 扩 增 现象 ， 如 果 把 毛 霉 素 或 别 的 蛋白 质 合成 抑制 剂
加 到 含 质粒 的 细菌 培养 基 里 ， 细 菌 染 色 体 的 合成 被 抑制 ， 但 质粒 DNA 的 合成 则
不 受 抑 制 ， 每 个 细菌 中 质粒 的 数目 可 增 至 1000 个 以 上 。 这 是 因为 与 细菌 DNA
合成 有 关 的 一 类 起 始 蛋白 (如 DnaA 蛋白 ) 不 能 合成 ， 但 如 果 质 粒 复制 只 是 利用
细菌 的 稳定 的 复制 蛋白 〈 诸 如 PolI、PolIII、RNase H、RNA 聚合 酶 ) 或 利用 质
粒 编码 的 一 些 稳定 的 蛋白 质 ， 质 粒 DNA 的 合成 就 会 继续 下 去 。 事 实 上 ， 控 制 质
粒 拷贝 数 的 控制 因子 (例如 Rom 蛋白 ) 是 浓度 依赖 性 抑制 物 ， 在 没有 和 蛋 自 质 合
成 的 情况 下 ， 抑 制 蛋 白 的 数量 不 足 ， 质 粒 DNA 的 复制 将 会 反复 地 起 始 而 不 受 控

辣 806 ee

制 。 由 于 没有 细菌 DNA 的 合成 ， 用 于 质粒 DNA 复制 的 细菌 的 复制 蛋白 效力 增
加 ， 加 上 不 稳定 的 RNA 分 子 如 RNAI 被 降解 ， 形 成 了 质粒 DNA 的 过 量 合成 。

关系 相近 的 两 种 质粒 不 能 在 同一 细胞 中 稳定 共存 ， 这 叫做 不 相 容 性 。 抑 制 物
模型 可 以 解释 这 种 现象 。 两 种 完全 不 相同 的 质粒 如 下 和 CoIE 1， 它 们 的 抑制 物
不 同 ， 所 以 两 种 质粒 的 复制 互 不 依赖 ， 因 为 一 种 类 型 质粒 的 抑制 物 (如 下 的 )
不 能 对 另 一 种 类 型 的 质粒 (如 ColE 1) 的 复制 进行 控制 ，F 和 ColE 1 是 相 容 性
质粒 。

这 种 质粒 相 容 性 的 情况 在 图 3-10 中 的 质粒 A 和 也 中 则 十 分 不 同 。A 和 电 的
抑制 物 可 以 互 为 调控 ， 而 且 抑 制 物 的 作用 是 随机 的 ， 所 以 分 裂 几 代 之 后 ， 就 有 可
能 产生 同一 种 质粒 存在 于 同一 细胞 的 情况 〈 图 3-10)。

第 一 次 复制 第 二 次 复制 细胞 分 裂 子 代 细 胞

|
人

二 5 ce

9 ) As 十

六
TD
一 2 二
1A3B 1B 1B 1A 1B

3-10 不 相 容 性 质粒 A 和 也 在 细胞 分 裂 过 程 中 可 能 的 分 配 情况

这 样 看 来 质粒 的 不 相 容 性 产生 的 原因
有 两 点 ， 吕 两 种 质粒 具有 类 似 的 抑制 物 ，
思 质 粒 DNA 的 复制 是 被 随机 选择 的 。

3. 几 种 质粒

(1) 性 质粒 FF 和 它 的 衍生 物
E 是 分 子 质量 为 62.$Sx105U (94.5Skb)
的 环 状 DNA 分 子 。 利 用 分 子 生 物 学 手段 已
测 出 了 下 因子 的 遗传 图 和 物理 图 (图
3-11)， 从 遗传 图 上 可 以 看 到 质粒 F 除 结构
基因 外 还 有 插入 顺序 IS2，1S3，78$， 这 些 图 3-11 F 因子 的 遗传 图
站 87 四

都 是 可 转 座 的 因子 ， 它 们 的 性 质 将 在 后 面 讨论 。

F 的 一 个 重要 性 质 是 它 能 整合 到 细菌 染色 体 上 形成 Hfr， 整 合 过 程 是 通过 互
相交 换 ， 就 像 入 鸣 菌 体形 成 溶 源 菌 一 样 。 但 下 与 细菌 染色 体 的 整合 方式 与 入 叹 菌
体 的 方式 有 以 下 几 点 不 同 : OOF 上 的 交换 位 点 不 是 单一 的 ， 虽 然 交 换 主 要 发 生 在
IS3 即 物理 图 上 94.5 的 位 置 ， 但 交换 也 发 生 在 其 他 位 置 上 的 IS3 和 ?8 处 。@@ 染
色 体 上 有 许多 位 点 能 够 发 生 整 合 ， 现 在 已 知 的 就 不 少 于 20 个 ， 但 下 对 每 个 位 点
的 亲和力 不 同 。GOF 因子 可 以 以 顺 时 针 和 反 时 针 两 个 方向 整合 ，F 因子 转移 到 受
体 细胞 中 去 是 从 一 个 原点 以 一 个 方向 进行 的 ， 有 些 Hfr 菌株 可 以 从 两 个 方向 转移
染色 体 。 事 实 上 ，F 因子 在 一 个 位 点 上 能 以 两 个 方向 整合 的 例子 很 少 。

F 因子 也 可 以 割 离 ， 但 是 很 罕见 。 这 个 过 程 很 像 入 吹 菌 体 从 染色 体 上 割 离 发
生 错 误 而 产生 转 导 型 吻 菌 体 一 样 ，F 因子 割 离 时 发 生 错误 后 可 产生 F' 因 子 。

F' 质 粒 在 最 初 的 分 子 遗 传 学 研究 中 是 非常 有 用 的 工具 ， 如 用 下 ' 做 部 分 二 倍
体 用 来 分 析 lac 操纵 子 。 它 们 在 研究 DNA 转移 中 也 有 重要 作用 。

(2) 抗 药性 质粒 (及 )

抗 药性 R 质粒 的 明显 特征 是 它 能 使 宿主 细胞 具有 抗 抗生素 能 力 并 且 具 有 自
身 转 移 的 能 力 。 许 多 R 质粒 由 两 个 邻接 的 DNA 片段 组 成 。 一 个 片段 叫 RTF ( 抗
性 转移 因子 )， 它 携带 着 控制 DNA 复制 和 拷贝 数 的 基因 ， 转 移 基 因 ， 有 时 还 携
带 抗 四 环 素 (tet) 基因 ， 其 分 子 质量 为 1 x 105Da。 另 一 个 片段 叫 抗 性 定子 (r
determinatant)， 其 大 小 很 不 同 〈 从 几 百 万 道 尔 顿 到 大 于 100 x 105Da)， 携 带 另 外
一 些 抗 生 素 抗 性 基因 ， 如 抗 青霉素 (Pen)、 抗 氨 葵 青霉素 (Amp)、 抗 氧 霉 素
(Cam)、 抗 链 坦 素 (Str) 以 及 抗 卡 那 霉 素 (Kam) 和 抗 磺胺 药物 (Sul)， 这 些 抗
性 基因 通常 以 一 个 或 多 个 结合 在 一 起 。 一 些小 的 抗 性 质粒 失去 了 转移 能 力 ， 但 仍
有 抗 四 环 素 抗 性 基因 ， 如 pSC101 分 子 质 量 为 $.8 x 10"Da， 常 用 于 基因 工程 中 。
双 组 分 R 因子 使 人 想到 下 "质粒 ， 但 R 质粒 的 抗 药性 基因 不 是 由 于 RTF 的 整合 和
错误 割 离 获得 的 ， 而 是 从 转 座 过 程 中 获得 的 。

(3) 产生 大 肠 杆 菌 素 的 质粒 〈Col 质粒 )

Col 质粒 是 可 产生 大 肠 杆菌 素 的 大 肠 杆 菌 质粒 ， 这 种 蛋白 质 能 过 制 不 含 这 种
质粒 的 大 肠 杆菌 菌 株 的 生长 ， 大 肠 杆菌 素 有 许多 种 类 ， 以 后 边 的 字母 来 区 别 不 同
的 种 类 ( 表 3-2)， 每 一 种 大 肠 杆菌 素 都 以 特有 的 方式 抑制 敏感 细胞 。 对 大 肠 杆
菌 素 的 产生 的 监测 类 似 于 对 叭 菌 体 的 监测 分 析 ， 将 产生 大 肠 杆菌 素 的 细胞 和 敏感
细胞 一 起 铺 平板 ， 在 产生 大 肠 杆 菌 素 的 菌落 周围 形成 敏感 菌 不 能 生长 的 亮 区 域 ，
称 为 抑 菌 圈 或 空 斑 。

大 肠 杆菌 素 可 能 有 两 种 类 型 一 一 真正 的 大 肠 杆菌 素 和 缺陷 的 喉 菌 体 粒子 ， 后
一 种 的 推论 来 自 于 对 许多 提纯 的 大 肠 杆菌 素 的 研究 。 当 用 电镜 检查 时 只 有 很 少 的
大 肠 杆菌 素 是 简单 的 蛋白 质 ， 其 他 的 类 似 于 鸣 菌 体 的 尾 ， 因 而 认为 是 残留 的 古老
鸣 菌 体 转 录 的 基因 产物 。 这 个 假设 认为 原 叭 菌 体 经 反复 突变 失去 了 复制 头 部 蛋白

。 88 。

和 裂解 有 关 的 基因 ， 但 还 完整 地 保留 了 编码 抑制 系统 和 尾部 的 基因 ， 大 概 这 些 叭
菌 体 负 责 吸附 但 不 注入 DNA 而 使 生物 大 分 子 合成 受到 抑制 。

表 3-2 ” 几 种 大 肠 杆 菌 素 的 性 质

大 肠 杆菌 素 大 肠 杆菌 素 的 作用
损坏 细胞 质 腊
大 肠 杆菌 素 b
| 以 一 种 未 知 的 作用 中 断 膜 上 依 赖 能 量 的 过 程
大 肠 杆 菌 素 K
大 肠 杆 菌 素 E2 降解 DNA
大 肠 杆菌 素 E3 切割 16S rRNA

Col 质粒 分 子 质量 只 有 几 百 万 道 尔 顿 ， 所 以 没有 自身 转移 能 力 。 研 究 得 最 清
楚 的 Col 质粒 是 ColE 1， 分 子 质 量 是 4.4Xx105Da。 它 的 全 序列 为 6646bp。ColE 1
被 广泛 地 用 于 DNA 重组 研究 。

ColE 1 是 一 个 具 动 员 能 力 但 无 结合 能 力 的 质粒 ， 它 为 质粒 转移 时 需要 由 质
粒 编码 的 核酸 酶 提供 了 可 靠 的 证 据 。ColE 1 的 核酸 酶 由 op 基因 编码 ， 酶 专 一
作用 的 一 段 碱 基 顺 序 叫 bbm， 关 键 性 实验 如 图 3-12。 在 图 中 ， 相 容 性 质粒 F 和
ColE 1 共存 于 同一 细菌 细胞 中 ，F 提供 ColE 1 缺少 的 结合 功能 ， 这 样 能 够 使
ColE 1 转移 。 图 3-12 中 (a) 表示 ColE 1 在 FE- 细胞 中 的 状态 ，zop 基因 转录 产
生 mob 产物 使 bom 位 点 产生 切口 (这 个 切割 位 点 叫 nic)，ColE 1 超 螺旋 环 状
DNA 变 成 切口 环 。 因 为 ColE 1 不 能 产生 性 纤毛 形成 接合 对 而 不 能 转移 。 图 3-12
(b) 中 细菌 含有 F 和 ColE 1 两 种 质粒 ，F 合成 纤毛 和 转移 装置 ; ColE 1 可 被 转
移 。 已 经 分 离 到 了 当下 提供 转移 装置 时 ColE 1 的 突变 体 (mob - ) 也 不 能 被 转
移 ， 遗 传 学 分 析 表 明 mob - 突变 是 隐 性 的 ， 这 说 明 zob 基因 编码 一 种 蛋白 质 ， 进
而 通过 分 离 到 的 这 种 突变 质粒 发 现 它 不 是 以 松弛 复合 物 形式 存在 。 图 3-12 中
(c) 表明 下 不 能 帮助 mob -突变 体 转移 ， 在 这 种 情况 中 ， 虽 然 下 能 提供 转移 的 装
置 ， 但 ColE 1 质粒 DNA 上 不 能 产生 切口 ， 另 一 种 ColE 1 突变 体 表 型 为 bom ，
它 是 一 种 顺 位 显 性 突变 ， 缺 失 了 bom 位 点 ，mob 蛋白 虽 能 产生 但 不 能 在 质粒
DNA 上 产生 切口 ， 因 而 也 不 能 转移 [图 3-12 (d)]。

(4) 土壤 细菌 质粒 Ti

在 许多 双子 叶 植物 中 发 现 的 根 苓 擦 伤 瘤 是 由 土壤 细菌 引起 的 。 这 种 可 引起 肿
瘤 的 活性 存在 于 质粒 Ti 中 ， 当 植物 被 感染 时 ， 这 种 细菌 进入 植物 细胞 ， 在 植物
细胞 中 生长 并 裂解 ， 将 它们 的 DNA 释放 到 这 个 细胞 中 。 此 后 Ti 质粒 的 一 个 含 复
制 基 因 的 小 片段 以 一 种 还 不 清楚 的 机 制 整合 到 植物 细胞 染色 体 上 ， 这 个 整合 片段
打破 了 控制 细胞 分 裂 的 激素 调节 系统 ， 使 细胞 变 成 肿瘤 细胞 。 这 种 质粒 目前 在 植
物 的 育种 中 非常 重要 ， 特 定 的 基因 可 以 通过 重组 DNA 技术 插入 到 Ti 质粒 上 ， 这

ee 89 最

G) __ 不 转移 ,因为 没有
转移 的 装置

mob 基因 被 切 开 的 bom
转移 装置
纤毛
CC
F*mob” bom” 转移 装置

F"mob”

各 不 转移 ，
(d) 人 G) \ 孜 :天 (E) 因为 bom 不 被 切 开

F*mob ”bom-

GC@F
加 因为 bom 不 被 切 开
无 切口

3-12 在 一 定 条 件 下 F 因子 能 使 质粒 ColE 1 变 成 可 移 的

些 基 因 有 时 又 可 以 整合 到 植物 的 染色 体 上 ， 从 而 永久 地 改变 这 种 植物 的 基因 型 和
表 型 。 可 以 用 这 种 方法 育 出 各 种 各 样 的 人 们 需要 的 有 经 济 价值 的 新 植物 品种 。

(S$) 真 核 生 物 中 的 质粒

已 知 单 细 胞 真 核 生 物 酵母 中 存在 质粒 ， 最 有 趣 的 质粒 之 一 就 是 killer parti-
cle， 它 是 分 子 质量 为 153 x 1056Da 左右 的 双 链 RNA 分 子 ， 它 是 已 知 唯一 不 含 DNA
的 质粒 。 这 个 质粒 含有 10 个 与 复制 有 关 的 基因 和 几 个 合成 杀伤 物质 的 基因 ， 这
种 杀伤 物质 类 似 于 大 肠 杆菌 素 。

另 一 种 研究 得 最 清楚 的 酵母 质粒 是 DNA 长 度 为 2 分子 质 量 为 4x105Da
的 质粒 ， 称 为 2 质粒 。 这 种 质粒 在 每 个 细胞 中 的 拷贝 数 是 60 个 ， 并 且 都 存在 于
酵母 的 细胞 核 中 ， 与 所 有 核 内 DNA 一 样 ， 这 种 质粒 DNA 也 和 组 蛋白 结合 在 一
起 ， 质 粒 DNA 显然 不 是 整合 到 宿主 DNA 上 的 。27 质粒 的 碱 基 顺 序 包含 两 个 反
向 重复 序列 ， 每 个 为 $99bp; 这 两 个 反 向 重复 顺序 被 两 个 单一 顺序 隔 开 ， 一 个 为
2346bp， 另 一 个 为 2774bp。 在 一 个 细胞 里 这 种 质粒 有 两 类 ， 这 两 类 质粒 由 其 中 一
个 单一 序列 的 方向 来 区 分 。 两 类 质粒 数目 相等 ， 由 于 反 向 重复 顺序 之 间 的 频繁 重
组 ， 两 类 可 以 互相 改变 ， 这 种 互 变 由 质粒 基因 jp 催化 。 互 变 的 功能 还 不 清楚 ，
在 实验 室 中 flp - 质粒 可 在 宿主 酵母 细胞 中 复制 ， 显 然 没 有 缺陷 。

27 质粒 的 复制 具有 与 其 他 质粒 明显 不 同 的 特征 ， 它 是 高 拷贝 数 质粒 ， 其 拷
贝 数 可 能 也 是 由 一 个 与 大 肠 杆菌 质粒 pSC 101 和 ColE 1 有 关 的 系统 来 调控 ， 但

es 90

是 对 于 2 质粒 来 说 不 存在 这 种 情况 ， 在 细胞 分 裂 的 每 个 周期 中 每 个 质粒 DNA
分 子 只 复制 一 次 。 它 是 如 何 调 控 的 还 不 清楚 。

大 部 分 真 核 生 物质 粒 像 原核 生物 质粒 一 样 是 环 状 DNA 分 子 ， 但 从 玉米 、 高
粱 和 几 种 真菌 中 分 离 到 的 少数 质粒 是 线 状 DNA 分 子 ， 这 样 的 分 子 有 一 个 复制 终
止 的 问题 ， 这 也 是 所 有 线 状 DNA 分 子 面临 的 问题 。 这 种 质粒 的 碱 基 序列 测定 显
示 出 的 独特 的 终止 结构 是 回 文 、 发 光 和 重复 序列 ， 很 像 酵母 和 四 膜 虫 的 端 粒 ， 也
许 这 些 质粒 终止 复制 的 方式 类 似 于 染色 体 中 所 用 的 方式 。

二 、 转 座 因 子

20 世纪 40 年 代 首 先 在 玉米 中 发 现 了 类 似 于 现在 的 转 座 因子 的 解 离 激活 因子
(DS-AC) 系统 以 后 ， 直 到 1967 年 才 在 研究 大 肠 杆菌 的 乳糖 操纵 子 中 第 一 次 发 现
称 为 插入 序列 的 转 座 因 子 。 已 在 细菌 中 发 现 两 类 转 座 因 子 : 复杂 转 座 因子 和 简单
转 座 因 子 。 插 入 序列 就 是 简单 转 座 因子 。

1. 插 人 顺序

插入 顺序 (insertion sequence，IS) 可 以 在 不 同 的 复制 子 之 间 转 移 ， 以 非 正
常 重组 的 方式 从 一 个 位 点 插入 到 另 一 个 位 点 ， 对 新 位 点 基因 的 结构 与 表达 产生 多
种 遗传 效应 ， 常 常 对 插入 点 的 基因 的 功能 表达 产生 极 性 效应 。

(1) 播 入 顺序 的 发 现

插入 顺序 最 早 是 在 1966 一 1967 年 研究 大 肠 杆 菌 半 乳糖 操纵 子 和 乳糖 操纵 子
的 自发 极 性 突变 时 发 现 的 。 当 时 发 现 一 些 极 性 突变 ， 在 恢复 突变 方面 与 一 般 的 点
突变 不 一 样 。 例 如 正 . coil 染色 体 上 rec 2 基因 发 生 突 变 后 ， 它 后 面 的 /acY、
laca 基因 不 能 表达 。

20 世纪 60 年 代 初 期 ， 在 大 肠 杆 菌 中 分 离 到 一 种 乳糖 操纵 子 的 突变 株 。 突 变
位 点 发 生 在 jec2 基因 上 ， 它 不 但 使 细菌 不 能 合成 rac2 基因 所 编码 的 有 活力 的 B-
半 乳 糖苷 酶 ， 而 且 也 使 xcY 基因 所 编码 的 半 乳 糖苷 透 性 酶 和 ?ac a 基因 所 编码 的
半 乳 糖 乙 酰 转 移 酶 的 合成 量 减少 ， 即 所 谓 的 极 性 效应 。 另 一 些 突变 株 的 突变 位 点
在 /xcY 基因 ， 这 些 突变 株 不 能 合成 B- 半 乳糖 苷 透 性 酶 ， 而 且 半 乳糖 苷 乙酰 转移
酶 的 合成 量 也 减少 了 ， 但 半 乳 糖苷 酶 的 合成 量 却 完 全 正常 。

经 研究 表明 是 由 于 在 突变 位 点 上 发 生 了 一 个 碱 基 的 突变 ， 结 果 使 转录 后 的
mRNA 产生 了 一 个 无 义 的 密码 子 ， 蛋 白 翻 译 到 此 处 时 ， 肽 链 的 延长 终止 ， 产 生
无 酶 活性 的 多 肽 片段 ， 并 且 影 响 同 一 操纵 子 中 后 面 的 酶 的 合成 。 这 种 类 型 的 突变
称 为 无 意义 极 性 突变 。

下 面 是 证 实 插入 顺序 的 实验 过 程 。 大 肠 杆菌 的 半 乳 糖 操纵 子 是 由 O 区 、P 区
及 结构 基因 正 、T、 开 组 成 的 。sga 正 、galT 和 galK 基因 编码 的 酶 催化 使 半 乳

*。， 91]1 ，

糖 变 为 葡萄 糖 -1- 磷 酸 的 反应 。

当 ga 基因 发 生 突变 时 ， 半 乳糖 -1- 磷 酸 与 尿 苷 二 磷酸 半 乳 糖 (UDP Gal)
在 细胞 中 积累 ， 这 两 种 糖 磷酸 酯 对 大 肠 杆 菌 有 毒性 ， 因 此 突变 株 不 能 在 含有 半 乳
糖 的 培养 基 上 生长 〈 对 半 乳 糖 敏感 )。 但 将 大 量 突变 株 涂 布 于 含 半 乳糖 的 平 血 时 ，
也 会 长 出 对 半 乳 糖 产生 抗 性 的 少数 菌落 。 研 究 证 明 ， 这 不 是 由 于 回复 突变 ， 而 是
由 于 gaT 基因 发 生子 突变 ， 使 该 突变 株 不 能 合成 galT 基因 所 编码 的 尿 苷 酸 转
移 酶 ， 并 且 使 saiK 基因 编码 的 半 乳 糖 激酶 的 合成 量 也 减少 ， 不 能 积累 UDP
Gal， 而 半 乳 糖 -1- 磷 酸 的 堆积 量 也 降低 到 对 细胞 无 毒性 的 水 平 ， 所 以 突变 株 能 在
含 半 乳糖 的 培养 基 上 生长 。 这 种 对 半 乳 糖 有 抗 性 的 突变 株 也 能 回复 成 对 半 乳 糖 敏
感 的 菌株 ， 因 此 这 种 突变 不 是 缺失 突变 。 但 是 它们 回复 突变 的 频率 不 能 像 无 意义
极 性 突变 那样 可 以 通过 碱 基 取 代 型 或 移 码 型 诱 变 剂 增加 ， 所 以 它们 也 不 是 无 意义
突变 和 移 码 突变 。 除 此 之 外 的 可 能 性 是 半 乳 糖 操纵 子 内 DNA 的 倒 位 、 重 复 或 由
于 半 乳 糖 操纵 子 以 外 的 DNA 片段 插入 所 引起 的 。 要 鉴定 这 三 种 可 能 性 ， 需 要 测
定 半 乳糖 操纵 子 的 DNA 含量 。 因 为 倒 位 并 不 增加 DNA 含量 ; 重复 则 增加 DNA
含量 ， 但 不 出 现 新 的 DNA 顺序 ; 而 操纵 子 以 外 的 DNA 的 插入 既 增加 半 乳 糖 操
纵 子 的 DNA 含量 ， 也 出 现 新 的 DNA 顺序 。

Jardan 在 1968 年 和 Shapiro 在 1969 年 分 别 比 较 了 半 乳 糖 操纵 子 与 带 极 性 突
变 的 半 乳 糖 操纵 子 的 DNA 的 分 子 质 量 。 他 们 制备 Xdgal 和 带 极 性 突变 的 Xdgal 的
DNA， 用 密度 梯度 离心 比较 这 两 种 DNA 的 密度 后 发 现 带 极 性 突变 的 Xdgal DNA
比 Xdgal DNA 密度 大 ， 说 明 极 性 突变 的 半 乳 糖 操纵 子 的 DNA 分 子 质量 的 确 是 有
所 增加 ， 这 就 排除 了 这 种 极 性 突变 是 由 于 倒 位 所 引起 的 可 能 性 。

Michaelis 在 1969 年 用 带 极 性 突变 的 Xdgal 的 DNA 体外 转录 ， 将 得 到 的
mRNA 与 亲 株 入 dgal (无 极 性 突变 者 ) 的 DNA 反复 杂交 ， 从 中 得 到 一 段 不 能 与
亲 株 杂交 但 能 与 带 极 性 突变 的 XdgalDNA 杂交 的 mRNA， 这 说 明 带 极 性 突变 的 半
乳糖 操纵 子 DNA 中 增加 的 DNA 片段 不 是 半 乳 糖 操纵 子 固 有 的 一 部 分 ， 即 突变
不 是 由 于 DNA 重复 所 引起 的 ， 而 是 由 于 增加 了 半 乳 糖 操纵 子 以 外 的 DNA 顺序
所 引起 的 。 并 且 还 有 研究 发 现 一 种 极 性 突变 的 Xdgal 所 转录 的 RNA 能 与 另 一 种
极 性 突变 的 Xdgal DNA 杂交 ， 表 明 此 种 顺序 是 专 一 的 ， 即 这 些 极 性 突变 都 是 由 于
插入 同一 种 DNA 顺序 所 引起 的 。 因 此 称 这 种 极 性 突变 为 插入 型 极 性 突变 。

Hirsch 等 在 1972 年 用 异 源 双 链 法 证 明了 插入 型 极 性 突变 的 插入 顺序 是 Xdgal
DNA 中 的 一 段 不 能 与 其 亲 株 Xdgal DNA 杂交 的 DNA， 它 能 在 异 源 双 链 中 形成 一

站 个 单 链 环 。 根 据 异 源 双 链 所 形成 的 单 链 环

全 ”的 大 小 可 以 测定 出 IS 的 大 小 ，IS 的 大 小 是

ss 768 一 7500bp。IS 除 带 有 转 座 必 需 的 遗传 信

转 座 栈 基因 ” 息 外 ， 不 带 任何 其 他 遗传 信息 ， 如 IS1 (图
图 3-13 IS1 的 结构 《 司 攻 力 民

<

” 子 的 异 源 双 链 ， 证 实 下 因子 的 0 一 17.6 区

(2) 大 肠 杆 菌 染 色 体 和 下 因子 上 的 IS

Saedler 等 在 1973 年 将 带 有 极 性 突变 操纵 子 〈( 即 含有 IS) 的 喉 菌 体 DNA 固
定 在 滤 膜 上 ， 同 时 用 3H 标记 细菌 染色 体 ， 将 制 成 的 [2H] DNA 与 固定 在 滤 膜 上
的 含 IS 的 喉 菌 体 DNA 杂交 ， 测 定 膜 上 的 ?5H 放射 活性 。 用 这 种 方法 计算 出 瓦 .
coii K12 染色 体 上 有 3 个 拷贝 的 IS1，5 个 拷贝 的 IS2 和 5 个 拷贝 的 IS3。

Davidson 等 在 1975 年 用 电镜 人 研究 下 因

段 存在 IS2 及 IS3， 并 且 这 个 区 段 是 F 因子
插入 寄主 染色 体 的 热点 (hotpoint)， 这 些
IS 全 部 在 重组 区 段 中 。 图 3-14 表示 下 因子
上 的 JIS 及 其 位 置 。

(3) JS 在 Hfr 和 Fo 因子 形成 中 的 作用

Hfr 是 F 因子 重组 到 细菌 染色 体 上 形成
的 。 如 图 3-15 所 示 ， 重 组 发 生 在 下 因子 的
FI 、Fs 和 染色 体 的 bb 、b, 之 间 。 发 生 传递
时 ,，F 因子 的 起 点 方向 〈 图 中 箭头 所 示 )
决定 移动 方向 。 按 图 中 所 示 的 例子 ，F 因
了 狂人 后 在 染色 体 上 标记 的 顺序 是 册 、bp、 和 2 和 间作 和 全 和
攻 、 ERA 杞 、 FT ET SR
b,_ 2。 下 因子 如 果 按 反方 向 插入 则 在 染色 体 上 标记 的 顺序 完全 站 倒 过 来 ， 变 成
下 人

如 果 发 生 与 上 述 过 程 相反 的 反应 ， 则 下 因子 由 Hfr 重新 回复 到 自主 复制 的 状
态 。 但 在 异常 割 离 时 ，F 因子 会 失去 一 部 分 DNA (图 中 失去 了 )， 代 之 以 染色 体
片段 (b, -1、b,) 而 生成 下 因子 。 如 果 异 向 割 离 发 生 在 染色 体 的 两 个 部 位 上 ，
那么 FF 因子 本 身 不 丧失 任何 部 分 ， 生 成 取得 染色 体 片段 的 FF" 因子 (图 中 为 b。 和
bi )。F 因子 失去 一 部 分 的 割 离 称 为 I 型 割 离 ，F 因子 没有 丢失 的 割 离 称 为 II 型
割 离 。 异 源 双 链 法 研究 证 明 F'8gal，F'lac 等 是 工 型 割 离 ; F'131ac，F'14ilv 是 II
型 割 离 。

上 面谈 的 是 Hfr 和 下 "因子 的 形成 。 下 面 再 来 讨论 IS 在 Hfr 和 下 ' 形 成 中 所 起
的 作用 。Davidson 等 将 几 种 F' 因 子 与 F 因子 并 列 排出 ， 发 现 F' 因子 中 与 寄主 染
色 体 的 接合 位 点 上 都 有 IS， 这 些 因 子 中 的 IS 位 点 有 对 应 关系 〈 图 3-16)。 由 图
可 见 各 种 下 因子 与 瑟 . coii 染色 体 的 连接 点 上 都 有 IS 参加 。

图 3-17 表示 三 种 F 因子 怎样 在 DOBRNTLOCNTLDTOG DR 半 帮 遇 翅 记 等 基因
之 间 挫 入 。Hfrp804 是 F 因子 上 处 于 93.2 位 点 的 IS3 和 寄主 染色 体 上 的 请
(IS3) 发 生 重 组 而 形成 的 ; Hfr103 是 F 因子 上 处 于 17.6 位 点 上 的 IS2 和 寄主 染

ER

图 3-15 下 因子 插入 及 割 离 模 型 、 缺 失 一 部 分 FE 因子 DNA 的
是 工 型 ， 完 全 不 缺失 FF 因子 DNA 的 割 离 是 II 型

se
已
上 己 虽 性 QQ n 广 串 虽 己
三 o nmns 广 它 它 忆 四 寸 虽 四 四 四 避 斑
CCo 一 一 一 一 思 \D 小 个 人 耻 司 0 一 一 一 一
Y6 mw
级 on 四
jp

民 罗 信人

人
FE'Zac 42=1

一 -一 -一 一
F'l4ily

图 3-16 下 因子 和 染色 体 的 连接 点

色 体 上 的 s8(IS2) 发 生 重 组 而 形成 的 ; Hfrp3 是 因子 上 处 于 93.2 位 点 上 的
IS4 和 寄主 染色 体 上 的 ps (IS4) 发 生 重 组 而 形成 的 。
由 此 可 见 F 因 子 整合 成 为 Hfr 和 割 离 形 成 下 因子 是 以 IS 片段 为 媒介 发 生 重
四 94 四

Pro 8 0 及 Zac ee Proc 。 fex PurE 有 人

也 位 P O 氏 Hfr 2
\ \/
R-4 103 \7/ Hfrp3

93.2 ， 17.6 93.2
图 3-17 Htfrp804、Hfrl03、Hfrp3 都 是 F 因子 和 寄主 染色 体 上 的
IS 插入 部 位 发 生 重 组 而 形成 的

组 的 。 这 就 解释 了 为 何 F 因子 的 IS 都 集中 在 重组 区 段 而 形成 插入 的 热点 。

(4) R 因 子 中 的 IS

在 抗 药性 因子 R 中 发 现存 在 IS， 例 如 R6、R1 等 均 发 现 其 中 存在 IS。 以 上
两 种 R 因子 在 变 成 失去 抗 药性 的 RTEF ( 抗 性 转移 因子 ) 时 ， 缺 失 了 决定 抗 药性
的 一 大 段 DNA ( 抗 性 定子 )。 在 抗 性 定子 与 RTF 的 结合 点 上 发 现存 在 IS1。IS1
在 它们 的 解 离 和 再 结合 中 起 重要 作用 。

R1 是 自然 产生 的 复杂 质粒 ， 它 含有 转 座 子 编码 的 抗 氯 霉 素 (Cm) 和 卡 那 霉
素 (Km) 的 基因 ， 并 且 还 含有 完整 的 转 座 子 Tn4 携带 的 抗 链 霉 素 (Sm)、 磺 胺
(Su) 和 所 他 青霉素 (Ap) 基因 (图 3-18)。

复制 基因 和 原点

图 3-18 R1 是 一 个 自然 产生 的 94kb 的 复杂 质粒 ， 它 抗
5 种 抗菌 素 (Cm、Km、Sm、Su、Ap)， 由 抗 性 定子 和
RTF 两 部 分 组 成

*。， 95 ，

2. 转 座 子

转 座 子 (transposon， 人 简称 Tn) 又 称 易 位 子 ， 由 两 个 重复 顺序 夹 着 一 个 或 多
个 结构 基因 组 成 ， 它 们 存在 于 R 因子 及 其 他 质粒 中 。 有 的 转 座 子 的 重复 顺序 就
是 IS。 转 座 子 也 和 IS 一 样 ， 能 从 一 个 位 点 转 座 到 另 一 个 位 点 ， 或 从 一 个 复制 子
转 座 到 另 一 复制 子 。

在 研究 R 因子 的 遗传 特性 时 ， 发 现 一 些 具 有 不 同 抗 性 类 型 的 R 因子 的 抗 性
基因 之 间 可 以 发 生 重组 ， 甚 至 还 分 离 到 了 R 因子 中 的 抗 性 基因 整合 到 P1 鸣 菌 体
基因 组 中 的 P1CM 鸣 菌 体 。Datta 等 1971 年 较 详细 地 研究 了 这 种 现象 ， 发 现 了
A4p 抗 性 基因 可 以 转 座 ， 认 为 一 个 可 以 转 座 的 DNA 片段 携带 编码 # 内 酰胺 酶 的
结构 基因 ， 并 称 这 一 遗传 结构 为 转 座 子 A。 此 后 ， 一 些 实验 室 先 后 在 不 同 的 质粒
中 发 现 了 几 十 种 转 座 子 。

(1) 转 座 子 的 结构 及 特征

转 座 子 都 比 IS 大 ， 约 4500 一 200 000bp。 将 带 有 Tn 的 DNA 变性 ， 再 进行
链 内 复 性 ， 在 电镜 下 可 以 看 到 一 个 有 双 链 的 共和 单 链 的 环 的 DNA 分 子 。 研 究 证
明 单 链 环 是 Tn 的 结构 基因 部 分 ， 双 链 葵 是 两 端的 一 对 重复 顺序 ， 这 些 重复 顺序
多 数 是 反 向 重复 ， 因 此 在 复 性 时 形成 双 链 的 蔡 。 用 这 个 方法 可 测 知 一 些 转 座 子 中
结构 基因 的 长 度 及 其 两 端 重复 顺序 的 长 度 。 所 有 转 座 子 都 有 两 个 结构 特征 : @ 两
端 有 20 一 40 个 核 苷 酸 的 反 向 重复 顺序 ;@ 具 有 编码 转 座 酶 的 基因 ， 这 种 酶 催化
转 座 子 插入 新 的 位 置 。 以 Tn3 为 例 ， 其 结构 如 图 3-19 所 示 。

mRNA

一天 一 一 2

转 座 酶 解 离 酶
靶 位 点 复制 9 结合 的 解 离 酶 蛋白 让 | 各 位 点 复 人

抑制 转 座 酶 基因 和
左 反 向 重 “” 它 本 身 的 转录 ,在 右 反 向 重
复 序列 和 全 人 二 夫 革 基 全 复 序列
站 -:
(38bp) 换 而 解 离 (38bp)

图 3-19 _Tn3 的 结构

(2) 转 座 频 率 的 调节

细胞 内 的 转 座 酶 浓度 很 低 ， 极 少 引起 转 座 。 每 个 细胞 每 世代 产生 的 转 座 酶 分
子 还 不 到 一 个 ， 引 起 自发 转 座 的 频率 只 有 10 次。 但 是 如 果 由 含 Tnl0 转 座 酶 基
因 的 工程 质粒 来 提供 更 多 的 转 座 酶 的 话 ，Tnl0 的 转 座 频率 可 以 提高 1000 倍 以
上 。 所 以 ， 很 可 能 是 转 座 酶 的 水 平 调控 转 座 子 转 座 的 频率 。

最 近 发 现 了 决定 转 座 酶 表达 与 功能 的 一 种 重要 因素 。Tn10 和 另外 一 些 转 座
子 的 转 座 酶 的 启动 子 DNA 含有 GATC 序列 ， 在 大 肠 杆菌 中 这 一 序列 的 A 是 甲 基
化 的 。 因 为 GATC 的 互补 链 也 是 GATC (都 从 5 一 3“ 读 )， 此 处 DNA 的 两 条 链 都

， 96 ，

甲 基 化 ， 在 此 情况 下 ， 启 动 子 便 被 相对 地 灭 活 。 但 在 DNA 复制 时 ， 新 合成 的
GATC 中 的 A 不 立即 甲 基 化 〈 可 能 有 Smin 或 更 长 )， 这 种 一 条 链 上 甲 基 化 另 一
条 链 上 没有 甲 基 化 的 启动 子 比 上 述 两 条 链 都 甲 基 化 的 启动 子 活 跃 ， 于 是 在 DNA
刚 复 制 后 出 现 少数 的 转 座 酶 。 与 此 类 似 ， 在 转 座 酶 的 作用 位 点 上 也 含有 GATC，
新 复制 的 DNA 是 转 座 酶 的 很 好 的 底 物 ， 因 此 Tnl10 在 DNA 刚 复制 后 易 发 生 转
移 。 目 前 尚 不 知道 是 否 细胞 其 他 条 件 影响 DNA 甲 基 化 而 改变 转 座 的 频率 ， 也 不
清楚 转 座 过 程 是 否 还 受 别 的 方式 调节 。

一 些 转 座 子 还 编码 第 二 种 酶 一 一 解 离 酶 ， 它 催化 转 座 过 程 的 第 二 阶段 (图
3-19)， 对 于 Tn3 来 说 ， 解 离 酶 蛋白 还 具有 第 二 种 独立 的 活性 ， 它 是 自身 基因 和
转 座 酶 基因 的 抑制 物 ， 用 于 维持 转 座 酶 正常 的 低 表 达 水 平 。 它 是 通过 结合 在 转 座
子 DNA 上 的 这 两 个 基因 之 间 的 一 个 结合 位 点 来 抑制 这 两 个 基因 的 表达 。

(3) 转 座 子 如 何 移动

细菌 转 座 子 如 Tn3 的 DNA 及 与 其 相 邻 接 的 DNA 的 序列 分 析 为 转 座 子 转移
机 制 提供 了 强 有 力 的 证 据 : @ 我 们 知道 转 座 子 携带 它 在 插入 时 的 所 有 序列 准确 转
移 ， 并 不 携带 邻接 的 任何 DNA。 这 只 有 在 转 座 酶 能 识别 转 座 子 两 端的 情况 下 才
能 发 生 ， 因 此 两 端的 序列 应 是 相同 的 ， 因 为 它们 是 同一 种 酶 的 结合 位 点 。@ 在 目
标 DNA 的 转 座 子 插入 位 置 上 准确 复制 3 一 12 碱 基 的 目标 DNA， 造 成 一 个 插入 位
点 ， 其 中 一 份 留 在 转 座 子 的 两 端 。 因 此 在 转 座 过 程 中 必须 发 生 DNA 复制 ， 创 造
出 双 份 目标 DNA， 造 成 插入 位 点 。 这 一 过 程 与 入 吹 菌 体 整合 过 程 中 的 位 点 特异
性 重组 是 明显 不 同 的 。@@ 大 多 数 转 座 子 在 移动 到 新 的 基因 组 的 任 一 区 域 时 ， 它 们
的 移动 并 非 完全 是 随机 的 ， 而 是 偏向 于 入 侵 一 定 的 DNA 序列 。 有 些 转 座 子 攻击
特殊 的 4 个 或 6 个 碱 基 对 的 对 称 序 列 ， 如 同 限制 性 内 切 核酸 酶 切割 DNA 那样 。

通过 对 一 些 能 将 DNA 链 打 开 并 重新 连接 的 酶 如 入 鸣 菌 体 的 整合 酶 和 DNA
拓扑 异 构 酶 的 研究 ， 使 人 联想 到 一 种 解释 转 座 酶 如 何 工 作 的 模型 (图 3-20)。 转
座 酶 结合 于 转 座 子 的 两 端 ， 同 时 也 与 目标 DNA 上 的 相应 的 序列 结合 ， 然 后 像 限
制 酶 那样 交错 切 开 目标 DNA 的 两 条 链 ， 同 时 也 在 转 座 子 的 两 端的 一 条 链 上 切
开 ， 但 两 端 切 的 并 不 是 同一 条 链 ， 转 座 子 的 两 条 链 的 自由 末端 分 别 和 目的 DNA
的 两 个 插入 点 的 未 端 连 接 在 一 起 ， 通 过 转 座 子 两 条 链 的 桥梁 作用 ， 新 老 两 个 目标
DNA 分 子 就 连接 在 一 起 。 由 于 生长 的 具体 条 件 不 同 ， 转 座 子 有 两 种 选择 : 一 种
是 简单 转 座 ， 在 转 座 子 与 原 目标 DNA 连接 的 末端 再 切 出 两 个 切口 〈 一 条 链 上 一
个 )， 转 座 子 完 全 转 座 到 新 的 目标 DNA 分 子 上 并 且 在 原来 的 宿主 目标 DNA 处 留
下 一 致死 性 的 缺口 ， 通 过 DNA 聚合 酶 的 作用 插 进 几 个 核 苷 酸 完 成 目标 位 点 的 倍
增 [图 3-20 (c) 和 图 3-20 (d)]。 因 此 简单 转 座 是 一 个 全 保留 的 过 程 。 第 二 种 可
能 是 复制 性 的 转 座 过 程 ， 在 此 过 程 中 ， 转 座 子 是 倍增 的 。 一 个 拷贝 转移 ， 另 一 个
拷贝 留 在 原来 的 宿主 DNA 上 ， 此 过 程 中 宿主 DNA 没有 被 弄 断 ， 转 座 子 DNA 没
有 被 第 二 次 切 开 ， 而 是 留 下 来 由 DNA 聚合 酶 复制 。DNA 聚合 酶 从 第 一 次 切 开 处

e 97 e

ER

开始 复制 ， 产 生 了 叫 共 整 合 〈cointergrate) 的 结构 ， 共 整合 结构 的 存在 是 这 种 转
座 过 程 的 有 力 证 据 。 解 离 酶 以 一 种 类 似 入 噬菌体 整合 的 反应 方式 催化 两 个 转 座 子
拷贝 之 间 的 位 点 特异 性 重组 ， 产 生 两 个 各 含 一 个 转 座 子 拷贝 的 分 离开 的 DNA 分
可

这 些 步骤 可 以 清楚 地 解释 转 座 子 的 其 他 活动 ， 例 如 ， 假 使 没有 解 离 酶 ， 那 么
终 产 物 就 是 两 个 分 子 连 在 一 起 的 结构 ， 或 两 个 连 在 一 起 的 分 子 错 误 地 分 开 成 两 个
独立 的 重 排 的 DNA 分 子 。 图 3-20 左边 的 模式 表明 ， 转 座 到 同一 分 子 的 另 一 位 置

的 过 程 中 会 造成 倒 位 和 缺失 。
靶 DNA( 两 条 链 )
驾 位 点
旧闻 位 点 复制
转 座 子
旧 宿 主 DNA
(3)

人
|
座 子 的 每 个 未 端 切 开 2
箭头 表示 此 处
单纯 转移 | 。 链 将 重组 新 连接
AR | 共 整 合
第 二 次 切割 把 在 靶 DNA 的
苇 座 子 和 旧 宿 靶 位 点 开始 切割 二
主 DNA 完全 分 @) 后 DNA 聚 全 酶 开 由 TRNA
cm 离开 始 复制 转 座 子 的 聚合 栈
新 合成

过
疡
汕
下
区
光
姓
监
区
山

图 3-20” 转 座 模 型

，98 ，

要 彻底 弄 清 转 座 的 机 制 ， 需 要 在 体外 对 每 一 个 步骤 进行 研究 。 由 于 细菌 鸣 菌
体 关 ( 它 既 是 喉 菌 体 又 是 一 种 转 座 子 ) 的 转 座 过 程 在 无 细胞 体系 中 也 可 以 发 生 ，
我 们 希望 这 一 发 现 能 使 我 们 进一步 精确 地 了 解 转 座 子 的 转 座 过 程 及 其 到 底 是 如 何
移动 的 。

最 近 的 实验 表明 ， 一 些 较 高 等 的 生物 的 转 座 子 ， 尤 其 是 反 转 病毒 ， 转 移 方式
与 细菌 的 转 座 子 如 Tn3 转移 方式 差别 很 大 。 低 等 真 核 生物 酵 母 菌 的 转 座 因子 Ty
是 先 转录 成 RNA， 再 反 转 录 成 DNA， 然 后 这 种 DNA 以 一 种 尚 不 清楚 的 机 制 重
组 到 宿主 染色 体 的 新 的 位 置 中 去 。 酵 母 的 Ty-I 转 座 子 也 称 为 retrotransposon。

(4) 转 座 因子 的 特征 和 遗传 学 效应

转 座 因子 的 共同 现象 以 及 它们 带 来 的 遗传 学 效应 有 以 下 几 个 方面 :

@ 以 10 一 10 ?频率 转 座 ， 引 起 插入 突变 。 各 种 IS、Tn 和 Mu 叹 菌 体 都 可
以 引起 揪 入 突变 ， 如 果 揪 入 的 位 置 是 一 个 操纵 子 的 前 端的 基因 ， 那 么 可 能 造成 极
性 突变 。 一 般 的 碱 基 置 换 突 变 没 有 极 性 效应 ， 只 有 终止 密码 突变 和 移 码 突变 才 有
极 性 效应 ; 通过 IS1 和 IS2 的 碱 基 序列 分 析 发 现 它 们 确实 存在 无 义 密 码 子 。IS2
以 任何 方向 插入 都 有 极 性 效应 ， 可 是 IS3 只 有 以 一 个 方向 插入 时 才 有 极 性 效应 ，
相反 地 也 有 关于 由 于 IS2 择 入 而 出 现 新 的 启动 子 的 报道 。

@ 插 入 位 置 上 出 现 新 的 基因 。 如 果 转 座 子 上 带 有 抗 药性 基因 ， 那 么 它 一 方面
造成 插入 突变 ， 另 一 方面 在 这 一 位 置 上 出 现 一 个 新 的 抗 药性 基因 。

@@ 造 成 插入 位 置 上 出 现 受 体 DNA 的 少数 核 苷 酸 对 的 重复 。 例 如 IS1 插入 基
因 acI 后 造成 9 个 核 苷 酸 对 的 重复 出 现 。

DEGREEOGCAGEAG. -TATEC

Lacf
GRIDONGCGCTCIC ATACG
个
IS1

CERNGUOSGCAGAC .GTIOcCAGAG- TATGC
IS1

[IEERNNOGOTCTC 二 CAGCGTCTC :ATACG

不 同 的 转 座 因子 插入 后 造成 重复 碱 基 对 数 不 等 ， 例 如 IS1、Tnl0 等 造成 9
个 碱 基 对 的 重复 ，IS2、Tn3、Mu、7 8 等 造成 5 个 碱 基 对 的 重复 ，IS3 造成 3 个
或 4 个 碱 基 对 的 重复 ，IS4 造成 11 个 碱 基 对 的 重复 。

由 转 座 后 原来 位 置 上 保持 原 有 的 转 座 子 。

@@ 转 座 因子 插入 染色 体 后 引起 其 旁边 的 染色 体 畸 变 。 最 初 在 IS1 中 发 现 由 于
IS1 的 存在 促使 它 的 旁边 发 生 缺 失 。 缺 失 发 生 的 频率 高 于 自发 缺失 突变 频率 的
100 一 1000 倍 ， 以 后 在 IS2、Tn3 等 转 座 子 中 都 发 现 有 这 一 现象 。

转 座 子 插入 染色 体 后 引起 染色 体 畸 变 的 原因 可 能 是 由 于 转 座 子 首先 以 相反 或

oOD ”~

相同 方向 转 座 到 邻近 位 置 上 ， 然 后 通过 某 种 方式 的 重组 产生 倒 位 或 缺失 (图

地 2 下 说
AH
d
a
世 b
d N 5 缺乏 复制 原点
复制 原点 = 解 离
>
C
S 功能 缺失
d

图 3-21 转 座 因子 引起 缺失 和 倒 位 模型

@@ 切 离 。 转 座 子 可 以 从 原来 位 置 上 消失 ， 这 一 过 程 称 为 切 离 。 切 离 可 以 是 准
确 的 ， 准 确切 离 的 结果 使 发 生 了 插入 突变 的 基因 恢复 突变 ， 如 果 这 个 转 座 因子 是
一 个 带 有 抗 药性 基因 的 转 座 子 ， 那 么 抗 药性 同时 消失 。 不 准确 切割 的 结果 使 发 生
了 插入 突变 的 基因 不 能 恢复 突变 ， 转 座 子 本 身 所 带 的 遗传 标志 消失 ， 这 是 不 准确
切 离 引起 染色 体 畸 变 的 结果 。 这 些 现象 均 已 在 插入 Tnl0 的 hisG 突变 株 的 恢复 突
变 中 得 到 了 证 明 。

@ 核 苷 酸 顺 序 。 如 前 所 述 ， 各 种 已 知 的 IS 的 长 度 在 768bp (如 IS1) 到
7500bp (如 Y6) 之 间 ， 它 们 两 端 都 有 18 一 41bp 反 向 重复 序列 。 已 知 转 座 子 的 长
度 在 2088bp (如 Tn1681) 到 20 500bp (如 Tn4) 之 间 ， 它 们 的 两 端 有 反 向 重复
序列 ， 某 些 转 座 子 的 两 端的 重复 序列 是 已 知 的 IS， 如 Tn9 和 Tn204 的 两 端 是
IS1， 也 有 一 些 转 座 子 的 重复 序列 不 是 已 知 的 IS。

IS1 的 全 部 核 苷 酸 顺序 已 经 在 1978 年 测定 ， 全 长 为 768bp， 两 端 是 35bp 的
反 向 重复 序列 。

由 于 IS1 的 两 端 是 反 向 顺序 ， 所 以 不 论 Tn 两 端的 IS1 是 反 向 还 是 顺 向 的 ，
它们 都 有 反 向 序列 ， 似 乎 两 端的 反 向 序列 使 它们 具有 转 座 子 功能 ， 而 且 许多 真 核
生物 的 转 座 因子 也 有 同样 的 结构 特性 。 不 过 也 有 例外 ， 如 酵母 菌 的 转 座 子 Tyl
的 两 端 没 有 反 向 重复 顺序 ，Mu 两 端 没 有 重复 顺序 。

(5$) 转 座 因子 在 遗传 学 中 的 应 用

转 座 因 子 除 了 本 身 在 遗传 学 中 的 意义 以 外 ， 在 许多 情况 下 是 遗传 研究 中 的 有
用 工具 。N.Kleckner 等 在 1977 年 总 结 了 这 方面 的 应 用 ， 下 面 列举 几 个 主要 方
面 : @ 用 于 难以 筛选 的 基因 的 转移 。@ 作 为 基因 定位 的 标记 。@@ 筛 选 插入 突变 。
由 构建 特殊 菌株 。@ 克 隆 难 以 进行 表 型 鉴定 的 基因 。(GOF 因子 处 在 特定 位 置 上 的

四 100 四

ee 人

Hfr 菌株 的 构建 。@ 带 有 特定 基因 的 转 导 只 菌 体 的 构建 。@ 特 定 区 段 缺失 的 菌株
的 构建 。

三 、 病 毒 及 其 与 质粒 、 转 座 因 子 之 间 的 关系

最 早 将 病毒 描述 为 仅 在 细胞 中 扩 增 并 且 能 通过 最 小 的 细菌 滤器 的 致 病因 子 。
所 有 病毒 都 含 核酸 ， 有 些 病毒 核酸 是 DNA， 有 些 是 RNA (图 3-22)。 这 些 病 毒
核酸 包装 在 蛋白 质 外 壳 中 ， 有 些 病毒 有 包 膜 ， 几 种 病毒 见 图 3-23。 病 毒 基 因 组
的 结构 和 复制 模式 在 病毒 中 存在 很 大 的 差异 。 病 毒 在 宿主 细胞 中 扩 增 最 终 摧毁 宿
主 细胞 ， 病 毒 感染 细胞 后 一 般 使 细胞 裂解 释放 有 感染 性 的 病毒 粒子 。 有 些 病毒 感
染 宿 主 后 将 其 基因 组 整合 到 宿主 染色 体 上 ， 成 为 宿主 染色 体 的 一 部 分 ， 随 宿主 染
色 体 复制 而 复制 ， 这 种 情况 中 的 病毒 称 为 原 病 毒 。

100 nm

图 3-22 “病毒 训 膜

由 于 许多 病毒 可 以 以 整合 方式 进入 染色 体 ， 也 可 以 割 离 后 而 离开 染色 体 ， 所
以 一 个 大 型 基因 组 上 可 能 含有 多 个 不 同 的 原 病 毒 ， 多 数 基 因 组 也 可 能 含有 多 种
不 能 形成 病毒 粒子 和 不 能 离开 细胞 的 可 移动 的 DNA 序列 ， 例 如 真 核 基因 组 中 存

1 党

单 链 RNA 单 链 DNA 双 链 环 状 DNA

双 链 RNA 单 链 环 状 DNA 双 链 DNA

末端 共 价 连接 蛋白 质
两 端 共 价 连 接 的 双 链 DNA 的 双 链 DNA
下

图 3-23 ”病毒 基因 组 的 几 种 类 型
在 的 长 短 不 一 的 重复 顺序 ， 大 小 在 几 百 到 几 千 个 碱 基 对 的 转移 因子 在 一 个 细胞 里

常 以 多 拷贝 存在 ， 这 些 转移 因子 可 在 它 自 身 编 码 的 酶 作用 下 转移 位 置 ， 但 转 座 频
率 很 低 ， 大 约 在 10- > 一 10 4。

本

转 座机 制 多 样 。 转 座 因子 的 一 个 大 家 族 利用 反 转 病毒 生活 周期 中 某 一 部 分 机

制 转 座 ， 这 种 转 座 因 子 叫 反 转 座 子 (retrotransposon)。 酵 母 中 的 Ty-l 因子 研究
得 最 为 清楚 ， 转 座 的 第 一 步 是 完整 的 转 座 因 子 的 转录 ， 产 生 一 个 5000 多 碱 基 的
RNA， 该 RNA 编码 反 向 转录 酶 ， 通 过 反 向 转录 ， 合 成 双 链 DNA (dsDNA)， 这
和 反 转 病毒 感染 后 的 早期 步骤 一 样 ， 该 dsDNA 在 整合 酶 作用 下 ， 整 合 到 染色 体
上 的 随机 位 点 。 虽 然 它 们 和 反 转 病毒 的 相似 性 引 人 注 目 ， 但 也 有 与 反 转 病毒 不 同
的 地 方 ，Ty-1 没有 蛋白 质 外 壳 ， 它 只 能 在 一 个 细胞 内 移动 并 产生 子 代 。 因 此 认
为 一 些 可 转移 因子 和 反 转 病毒 关系 密切 。

大 多 数 病毒 可 能 由 质粒 进化 而 来 ， 最 大 的 病毒 也 依赖 于 宿主 细胞 进行 生物 合
成 ， 因 而 细胞 必须 在 病毒 之 前 进化 。 第 一 个 病毒 的 前 身 可 能 是 一 个 小 的 核酸 片
段 ， 逐 步 发 展 成 具有 独立 于 宿主 细胞 染色 体 复 制 的 能 力 ， 这 种 能 自主 复制 的 因子
称 为 质粒 ， 能 在 细胞 染色 体外 自主 复制 。 质 粒 有 DNA 和 RNA 两 种 形式 ， 这 一
点 像 病 毒 ， 它 们 含有 一 段 特 别 的 核酸 序列 作为 它们 的 复制 原点 。 与 病毒 不 同 的
是 ， 它 们 不 能 制造 衣 壳 蛋白 ， 所 以 它们 不 能 像 病 毒 那 样 在 细胞 间 移 动 。

第 一 个 RNA 质粒 与 在 一 些 植物 细胞 中 发 现 的 类 病毒 类 似 ， 这 些 仅仅 300 一
400 核 苷 酸 大 小 的 环 状 RNA， 尽 管 不 编码 任何 蛋白 质 ， 但 可 复制 ， 没 有 衣 壳 ，

只 能 通过 受 体 和 供 体 的 受伤 的 细胞 表面 之 间 传 递 ， 因 受伤 处 无 细胞 膜 保护 。 这 些 本

可 自主 复制 的 因子 可 能 从 宿主 细胞 获得 一 些 核 背 酸 序 列 ， 可 以 利于 它们 的 复制 ，

也 包括 编码 衣 壳 蛋白 的 序列 。 目 前 发 现 的 有 些 质 粒 确 实 相 当 复 杂 ， 可 以 编码 控制
它们 复制 的 蛋白 质 和 RNA 分 子 ， 也 编码 控制 它们 进入 子 代 细胞 的 蛋白 质 。 已 知
最 大 的 质粒 是 大 于 100 000bp 的 双 链 环 状 DNA。

人

当 一 个 RNA 质粒 获得 编码 衣 壳 蛋白 基因 后 ， 就 可 能 出 现 第 一 个 病毒 。 但 一
个 衣 壳 只 能 把 有 限 的 核酸 包 在 里 面 ， 因 此 ， 一 个 病毒 所 含有 的 基因 的 数目 是 有 限
的 。 病 毒 被 迫 最 有 效 地 利用 它们 有 限 的 基因 组 ， 一 些小 病毒 发 展 重 芍 基 因 ， 在 同
一 DNA 序 列 内 利用 不 同 的 阅读 框 编码 两 种 以 上 的 蛋白 。

当 病 毒 能 在 不 同 种 宿主 之 间 转 移 它 们 的 核酸 后 ， 它 们 便 在 它们 感染 的 宿主 生
物 的 进化 中 起 了 重要 作用 ， 许 多 重组 经 常 是 在 它们 的 不 同 种 的 宿主 基因 组 之 间 进
行 ， 通 过 这 各 方式， 它们 随机 地 得 到 宿主 的 一 小 段 染 色 体 ， 并 把 它 带 到 不 同 的 细
胞 或 机 体 中 去 ， 有 些 整合 的 病毒 DNA 成 为 大 多 数 宿 主 基因 组 的 正常 部 分 ， 例 如
入 叭 菌 的 整合 ， 另 外 ， 在 肴 椎 动物 基因 组 中 发 现 了 大 量 拷贝 的 内 源 性 逆转 病毒 。
整合 的 原 病毒 可 不 再 产生 完整 的 病毒 ， 但 仍 能 产生 它 所 编码 的 蛋白 质 ， 有 些 蛋 白
对 宿主 是 有 用 的 ， 因 此 ， 像 有 性 生殖 一 样 ， 病 毒 通过 促进 基因 库 的 混合 而 加 速 进
优 。

通过 病毒 使 DNA 序列 在 不 同 的 宿主 细胞 基因 组 之 间 转 移 的 过 程 叫做 DNA
转 导 (DNA transduction)， 有 几 种 能 高 效 转 导 DNA 的 病毒 用 于 基因 在 两 种 细胞
间 的 转移 。

第 五 六 ”基因 和 基因 组

基因 一 般 是 指 表达 一 种 蛋白 质 或 功能 RNA 的 遗传 物质 基本 单位 。

原核 生物 的 基因 组 就 是 它 的 整个 染色 体 。 对 于 一 般 的 二 倍 体高 等 生物 来 说 ，
能 维持 配子 或 配子 体 正常 功能 的 最 低 数 目的 一 套 染 色 体 构成 一 个 基因 组 。

在 20 世纪 350 年 代 以 前 人 们 认为 一 般 情 况 下 每 一 基因 组 的 DNA 的 量 是 固定
的 ， 它 包括 数目 固定 、 位 置 固定 、 功 能 固定 的 一 系列 基因 ， 而 且 这 些 基 因 的 排列
是 随机 的 。1961 年 大 肠 杆 菌 乳 糖 操纵 子 的 发 现 说 明 大 肠 杆菌 的 染色 体 不 是 一 个
随机 排列 的 基因 集合 体 ， 它 由 许多 操纵 子 以 及 一 些 单独 的 基因 组 成 。

关于 基因 位 置 的 固定 性 问题 ， 在 20 世纪 40 一 50 年 代 研 究 玉 米 的 控制 因子 时
已 经 指出 某 些 遗传 因子 可 以 转移 位 置 ， 可 是 这 一 现象 当时 并 没有 受到 重视 。20
世纪 60 年 代 未 在 大 肠 杆菌 中 发 现 了 可 以 转移 位 置 的 插入 序列 ， 于 是 人 们 开始 认
识 到 基因 组 中 的 某 些 成 分 位 置 的 不 固定 是 一 个 普遍 现象 。

插入 序列 和 转 座 子 从 一 个 位 置 转 移 到 另 一 位 置 时 ， 原 来 位 置 上 的 这 些 结构 依
然 存在 ， 这 就 是 说 实际 上 转移 的 是 一 个 复制 品 ， 因 此 可 以 想像 一 个 基因 组 的
DNA 的 量 由 于 转 座 子 的 存在 可 以 继续 发 生变 化 。 事 实 上 用 Southern blot 和 分 子
杂交 法 测 得 同一 种 生物 的 不 同 个 体 的 基因 组 上 同一 插入 序列 或 转 座 子 的 数目 不 相
等 ， 于 是 又 使 人 们 认识 到 一 种 生物 的 基因 组 的 大 小 或 者 基因 数目 的 多 少 并 不 是 绝
对 固定 的 。

在 1922 年 已 经 发 现 沙 门 氏 菌 的 鞭毛 相 的 转变 现象 。 近 年 来 发 现 相 转变 和 基

2 >

因 组 上 一 小 段 DNA 的 位 置 颠倒 有 关 ， 这 一 事实 除了 说 明细 菌 的 基因 组 的 结构 并
不 是 绝对 不 变 的 以 外 ， 还 说 明 随 着 结构 的 改变 基因 的 功能 也 在 发 生变 化 。

近年 来 随 着 重组 DNA 技术 的 发 展 ， 基 因 组 结构 的 研究 也 迅速 发 展 起 来 。 这
些 研究 成 果 促 进 了 人 们 对 基因 组 结构 的 深入 了 解 。 目 前 人 类 基因 组 计划 、 全 序列
业已 完成 ， 正 在 进行 后 基因 组 研究 工作 。

原核 生物 的 基因 组 的 特点 是 : 四 小 ， 一 般 具 有 单一 DNA 复制 起 点 ; @ 单 个
染色 体 ， 一 般 呈 环 状 ; @@ 染 色 体 DNA 或 RNA 并 不 与 蛋白 质 形成 固定 的 结合 物 ;
@ 田 少量 重复 序列 ; @@ 功 能 上 密切 相关 的 基因 构成 操纵 子 或 高 度 集中 ， 并 且 常 转录
成 为 多 基因 mRNA。

愈 是 简单 的 生物 ， 它 的 已 知 基因 数 愈 是 接近 于 根据 它 的 DNA 分 子 质量 所 佑
计 的 基因 数 ， 它 的 DNA 的 含量 测定 也 愈 准 确 。 对 多 种 叹 菌 体 和 细菌 基因 组 的 研
究 表明 它们 的 基因 组 中 除了 控制 区 以 外 没有 不 编码 蛋白 质 的 DNA。

真 核 生 物 基 因数 不 确切 。 粗 糙 脉 移 菌 、 果 蝇 等 基因 组 中 编码 蛋白 质 的 DNA
估计 为 5% 左 右 。 人 的 基因 数 姑且 假定 是 30 000， 那 么 人 基因 组 中 编码 蛋白 质 的
DNA 大 约 为 0.5%， 即 使 假定 基因 数 是 300 000， 编 码 蛋白 质 的 DNA 也 不 过
5%。

原核 生物 中 很 少 有 不 编码 蛋白 质 的 DNA 序列 ， 真 核 生 物 中 进化 位 置 愈 高 的
生物 不 编码 蛋白 质 的 DNA 序列 愈 多 。

原核 生物 的 基因 组 的 另 一 特点 是 功能 相关 的 基因 高 度 集中 而 且 愈 简单 的 生物
似乎 愈 集中 。

和 喉 菌 体 的 7 个 头 部 基因 A 一 下 占有 相互 邻接 的 位 置 ， 调 控 基 因 N、CT、
CIT CIIT、Cro 也 集中 在 一 个 区 域 。 此 外 ， 结 构 基 因 与 它们 所 编码 的 蛋白 质 所 作
用 的 部 位 也 在 邻接 的 部 位 ， 例 如 整合 基因 ;zz 和 切 离 基因 zis 处 在 附着 位 点 att 的
旁边 ; 复制 基因 O 和 忆 处 在 复制 起 始点 旁边 。

细菌 的 基因 集中 程度 总 的 来 说 不 如 入 叭 菌 体 ， 但 与 真 核 生 物 相 比 则 比较 集
中 ， 在 作用 上 密切 相关 的 基因 都 组 成 操纵 子 ， 真 核 生 物 中 虽然 也 有 较 多 作用 上 密
切 相 关 的 基因 集中 在 一 起 的 情况 ， 可 是 关于 操纵 子 的 报道 还 绝无仅有 。

原核 生物 和 真 核 生物 的 基因 组 的 另 一 区 别 是 重复 序列 的 数量 。 原 核 生物 的 基
因 组 中 有 较 少 的 重复 序列 ， 而 真 核 生物 基 因 组 中 则 存在 大 量 的 重复 序列 。

”104 ，

第 四 章 _DNA 复制

无 论 是 只 含 一 个 染色 体 的 细胞 还 是 具有 多 个 染色 体 的 细胞 ， 在 细胞 分 裂 之
前 ， 其 完整 基因 组 DNA 必须 预先 复制 。 复 制 如 何 与 细胞 分 裂 周期 相关 ?

1) DNA 复制 的 起 始 保证 了 细胞 进一步 的 分 裂 ， 从 这 个 基本 点 出 发 ， 一 个 细
胞 产生 的 子 代 的 数目 是 由 一 系列 控制 DNA 复制 是 否 起 始 的 调节 因子 决定 的 。

2) 如 果 复 制 起 始 ， 在 复制 过 程 完 成 之 前 不 允许 细胞 分 裂 的 发 生 。DNA 复制
的 全 部 完成 可 能 给 细胞 分 裂 提 供 了 一 个 开关 (trigger)， 之 后 这 个 双 倍 基 因 组 分
配 到 每 个 子 代 细 胞 中 〈 真 核 中 的 有 丝 分 裂 )， 分 离 的 单元 是 染色 体 。

在 原核 细胞 中 ， 复 制 的 起 始 与 细菌 染色 体 DNA 上 一 特别 位 点 相关 ， 分 裂 过
程 通过 一 个 隔膜 的 发 育 完成 。 在 真 核 细 胞 中 ，DNA 复制 的 起 始 和 S 期 的 开始 相
一 致 ， 而 且 这 个 过 程 牵涉 到 许多 个 别 的 起 始 事件 ， 通 过 有 丝 分 裂 中 细胞 的 重新 组
织 (reorganization)， 建 立 细 胞 的 分 裂 活 动 。

第 一 六 DNA 的 复制 起 始 区

也 许 每 个 细胞 必须 做 出 最 重要 的 决定 : 是 否 合成 和 在 什么 时 候 合成 自己 的
DNA。 类 似 于 RNA 的 合成 和 其 他 生物 学 过 程 ， 复 制 的 起 始 是 被 控制 的 。 如 果 在
体内 DNA 的 复制 总 是 从 一 特定 位 点 起 始 ， 对 复制 的 起 点 进行 最 有 效 地 控制 。 电
镜 研 究 显 示 ， 动 物 病毒 DNA 复制 泡 的 中 心 总 是 几乎 位 于 同一 位 点 ， 同 样 的 结果
也 在 细菌 、 植 物 病毒 和 各 种 质粒 的 环 状 DNA 中 获得 。 更 详细 的 分 子 生 物 学 研究
指出 ， 实 际 上 DNA 的 复制 起 始 于 复制 泡 中 心 位 置 附近 的 特定 的 碱 基 序列 ， 称 为
复制 原点 。

为 了 了 解 复制 原点 的 结构 特点 和 一 般 性 质 ， 在 此 将 讨论 三 类 复制 原点 ， 大 肠
杆菌 〈 下 .coi) OriC、 酵 母 的 自主 复制 顺序 (yeast autonomously replicating se-
quences ARS) 和 猴 病 毒 SV40 的 复制 原点 。

大 肠 杆菌 的 复制 原点 OriC 是 存在 于 大 肠 杆 菌 DNA 复制 起 始 位 点 的 一 段 大
约 240bp 的 DNA 片段 ， 含 有 OriC 的 质粒 或 任何 其 他 环 状 DNA 分 子 均 可 在 大 肠
杆菌 中 自主 且 有 控制 的 复制 。 将 OriC 与 其 他 五 种 不 同 的 细菌 其 中 包括 亲缘 关系
和 还 的 Vibrio harrey (一 种 海 生 细菌 ) 相 比 较 ， 发 现 它 们 都 含有 9bp 的 重复 序列
和 13bp 的 A-T 丰富 序列 ， 归 类 为 9 聚 体 (dnaA box) 和 13 聚 体 (图 4-1)， 这 些
是 起 始 复制 的 DNA 蛋白 识别 结合 盒 (box)。 另 外 ， 正 .coii 染色 体 上 含有 一 段 与

* Oric 相 邻 的 A-T 相 对 丰富 的 DNA 片段 ， 这 些 DNA 容易 熔 链 而 使 复制 机 器 在 此

Fr 有 7

] [3 17 9 32 二 4
5 |GATCTNTTTATTT 国 GATCINTITNTATT 民 ScA 全
3'|CIAGANAAATAAA 门 CTAGANAANATAA 上 CTAGAGAATAATC

58 66
TGTGGATAA 上 一 /三 -一
ACACCTAITT 太一

166 174 201 209 240 248

TIATACACA TIIGGATAA TIATCCACAS 人 一
AATATGTGT AAACCTATIT AAIAGGJIGTNE 3

图 4-1 根据 对 六 种 细菌 基因 组 的 分 析 ， 细 菌 复制 原点 存在 很 短 的 一 致 性 序列

得 以 运行 。 因 此 ， 这 段 DNA 对 复制 的 起 始 很 重要 。

下 .coii DNA 复制 起 始 以 后 ， 两 个 子 代 双 链 DNA 上 的 复制 原点 与 细菌 细胞
质 膜 上 两 个 不 同位 点 上 的 特异 性 蛋白 质 相 连接 ， 这 种 连接 保证 了 细胞 分 裂 时 新 合
成 的 子 代 双 链 DNA 分 子 分 配 到 两 个 子 代 细胞 中 (图 4-2)。

细胞 分 裂 过 程

图 4-2 原核 中 的 DNA 复制 和 细胞 分 裂
(a) DNA 复制 ; (b) 细胞 分 裂 。

酵母 的 自主 复制 序列 。 酵 母 的 自主 复制 序列 (ARS) 就 是 酵母 DNA 的 复制
原点 。 与 所 有 的 真 核 染 色 体 一 样 ， 每 个 酵母 染色 体 有 许多 复制 原点 。 分 子 克 隆 实
验证 明 在 酵母 S. cerevuisiae 的 17 条 染色 体 上 存在 400 个 复制 原点 ; 特征 经 详细
鉴定 的 有 12 个 以 上 。 酵 母 的 复制 原点 ARS 对 于 DNA 分 子 在 酵母 中 的 复制 是 必

*。 吉 6。

需 的 。 用 精细 突变 分 析 方 法 研究 一 个 称 作 ARSI 的 大 约 180bp 的 ARS 的 结果 显
示 ， 仅 有 一 个 必需 的 元 件 ， 长 度 仅 仅 为 13bp， 定 名 为 元 件 A， 从 114 位 到 128
位 。 还 有 三 个 其 他 小 元 件 一 一 B1、B2 和 B3 元 件 ， 它 们 可 以 提高 ARSI 发 挥 功能
时 的 效率 。 比 较 了 许多 起 ARS 作用 的 、 功 能 必需 的 不 同 DNA 片段 ， 发 现 它 们 都
含 以 下 11bp 的 保守 的 识别 顺序 :

ALG2TETTAATS
ARSI 中 的 元 件 A 在 这 11bp 保守 顺序 中 有 10 位 是 相同 的 ， 元 件 B2 在 11bp 中 有
9 位 相同 。

DNase 足迹 法 研究 表明 ， 一 个 称 为 ORC (origin recognition complex) 中 有 六
种 不 同 蛋 自 质 复合 物 特 异地 与 ARSI 中 的 元 件 A 结合 ， 并 且 也 特异 地 与 其 他 ARS
结合 。 在 整个 细胞 周期 中 ， 该 复合 物 一 直 维 持 与 一 种 ARS 结合 在 一 起 ， 并 在
DNA 复制 期 间 与 其 他 复制 相关 蛋白 联合 ， 这 是 打开 DNA 复制 起 始 开关 的 一 个 明
显 事件 。 所 有 真 核 细胞 中 的 这 些 蛋 白质 都 是 同 源 的 ， 这 证 明了 它们 在 DNA 复制
中 的 重要 性 。

无 论 在 哺乳 动物 细胞 内 还 是 在 体外 系统 中 ，SV40 的 复制 原点 都 足以 启动
DNA 的 复制 。 突 变 研究 证 明 SV40 复制 原点 中 有 三 个 片段 是 启动 活性 所 必须 的 ，
用 带 有 SV40 复制 原点 的 质粒 DNA 和 哺乳 动物 细胞 内 蛋白 质 可 以 研究 DNA 复制
起 始 的 分 子 机 制 。

虽然 下 .co5i 、 酵 母 和 SV40 的 复制 原点 的 特异 的 核 苷 酸 顺 序 很 不 相同 ， 但 它
们 有 几 个 共同 的 特征 。 第 一 ， 复 制 原点 是 含有 多 个 短 重复 顺序 的 独特 的 DNA 片
段 ; 第 二 ， 这 些 短 重 复 顺序 可 被 多 聚 原点 结合 蛋白 所 识别 ， 这 些 蛋 白质 对 DNA
聚合 酶 与 其 他 复制 酶 在 复制 起 始 位 点 上 的 装配 有 关键 作用 ; 第 三 ， 复 制 原点 区 通
常 含有 A-T 丰富 区 ， 这 使 得 双 链 DNA 解 旋 更 容易 。 原 点 结合 蛋白 通过 指导 复制
机 器 在 染色 体 的 特殊 位 点 上 的 装配 来 控制 复制 的 起 始 。

二 节 DNA 复制 的 相关 和 电 日 质
在 DNA 复制 中 ， 酶 促 合 成 是 个 复杂 的 过 程 ， 因 为 这 个 过 程 需要 高 度 准确 的
复制 ， 并 且 在 复制 过 程 中 亲 代 链 必须 自然 分 离 ， 完 成 这 个 复杂 过 程 的 步骤 太 多 ，

不 可 能 由 一 个 酶 来 完成 。 事 实 上 ， 现 已 知道 约 20 多 种 蛋白 质 参 与 复制 。 表 4-1
是 与 大 肠 杆 菌 复 制 有 关 的 蛋白 质 。

一 、DNA 聚合 酶
DNA 聚合 酶 是 以 脱氧 核 苷 三 磷酸 为 底 物 催化 合成 DNA 的 一 类 酶 。 在 不 同 的

. 107 ，

表 4-1 与 大 肠 杆 菌 复 制 有 关 的 蛋白 质

分 子 质量 每 个 菌 中 ”蛋白质 含量 (以 细胞 湿
RE /103Da 人 加 汪 - 的 分 子 数 重 计 )/(mg/kg)

SSB 74 4 与 单 链 结合 300 20
i 蛋 白 80 4 预 引发 50 0.5
n 和 蛋白 25 1 预 引发 30
n' 蛋白 75 1 部 位 识别 , ATPase 70 0.3
n 蛋白 11 1 预 引发 =
dnaC 29 f 预 引 发 100
dnaB 300 6 移动 启动 子 , ATPase 20 0.3
引发 酶 60 1 引发 合成 50 0.2
pol II 全 酶
a 140 1 一
B 25 1 一
0 10 2 一

0.5
B 40 1 链 的 延长 300
Y 52 2 20
8 32 1
开 83 1
pol I 109 1 填补 缺口 和 切 去 引物 300 10
连接 酶 74 1 连接 300 10
拓扑 异 构 酶 II 400 4
a 210 2 引进 超 螺旋 250
B 190 2 25
rep 蛋白 65 1 解 开 双 链 50 0.6
解 链 酶 I 75 1 5000
dnaA 48 复制 起 始 200

* SSB, 单 链 结合 蛋白 ; pol, 聚合 酶 ;rep 蛋白 是 一 种 大 肠 杆菌 解 链 酶 。

生物 包括 细菌 、 植 物 、 动 物 中 都 发 现 了 这 种 酶 。 所 有 DNA 聚合 酶 的 作用 方式 基
本 相似 。 它 们 催化 脱氧 核 苷 三 磷酸 加 到 复制 中 的 DNA 链 的 3 羟基 末端 ， 合 成 方
向 从 5 一 3 ， 由 模板 决定 加 上 何 种 脱氧 核 苷 酸 。DNA 聚合 酶 催化 所 需要 的 条 件
是 : 四 种 脱氧 核 苷 酸 、 镁 离子 、 模 板 DNA 和 RNA 引物 。 还 没有 发 现 一 种 不 需
要 引物 就 能 重新 合成 DNA 的 DNA 聚合 酶 。

了

1. 大 肠 杆菌 DNA 聚合 酶 1

大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 [是 1956 年 Kornberg 及 其 合作 者 发 现 的 第 一 个 DNA
聚合 酶 ， 故 称 为 Kornberg 酶 。 在 各 种 DNA 聚合 酶 中 ， 这 种 酶 研究 得 最 透彻 。 它
的 一 些 特 点 代表 了 DNA 聚合 酶 的 基本 特点 。

纯 的 DNA 聚合 酶 I 由 分 子 质量 为 109 000Da 的 一 条 肽 链 构成 ， 每 个 大 肠 杆
菌 细胞 申 大 约 含 400 个 酶 分 子 。 用 枯草 杆菌 蛋白 酶 处 理 该 酶 ， 可 获得 两 个 片段 ，
大 片段 分 子 质量 76 000Da， 保 留 聚 合 酶 活性 和 3 一 $ 外 切 核酸 酶 活性 ， 大 片段 又
叫做 Klenow 片段 ， 广 泛 使 用 于 DNA 序列 分 析 中 。 小 片段 分 子 质 量 34 000Da，
具有 5 一 3 外 切 核酸 酶 活性 。

DNA 聚合 酶 有 多 种 活性 。

(1) 聚合 活性

在 模板 指导 下 ， 以 脱氧 核 苷 三 磷酸 为 底 物 在 引物 的 3 -OH 末端 加 上 脱氧 核
苷 酸 。 每 个 酶 分 子 每 分 钟 添加 1000 个 单 核 苷 酸 。 如 果 DNA 的 合成 是 由 聚合 酶
催化 的 ， 那 么 需要 下 面 的 条 件 : @ 模 板 ，@ 必 须 有 一 段 3-OH 末端 的 引物 ， 并
且 此 引物 必须 与 模板 正确 形成 氨 键 ， 图 合成 方向 从 $ 一 3“ 进 行 。 如 图 4-3 和 图 4-4
所 示 。

模板 产物
本 一 3 一 O
(a) 和 人
HO-3 一 3 一 不 已 成
SP 不 合成
P-5 一 -一 3 一 OH P-5 一 -一 一--，3-O0H
5
P-5 3 OH
(d) HO-3 f 5 一 P 不 合
切口
PE 5 4 7 3 一 OH 。 P-5 一 -一 一 一 一 -一 一 = 一 3OH
(e)HO-3， 5-P 。”HO23
柯 P-5 3OH P-5' 二 二 二 ->3-OH
HO-3 5S-P HO-3 5 一 P

图 4:3 不 同 的 模板 聚合 反应 的 效果

99

图 4-4 DNA 复制 中 模板 引物 和 合成 方 辐

合 酶 的 3 一 ~5' 外 切 核酸 酶 活性 也 叫 修 。

补 活 性 。
(3) $ 一 3 外 切 核 酸 酶 活性
从 图 4-6 中 可 以 看 到 DNA 聚合
酶 I 具 有 一 3 外 切 核 酸 酶 活性 ， 其
寺 点 是 : 四 只 能 在 S$-P 末端 一 个 接
一 个 地 切除 核 苷 酸 ; @) 能 连续 地 切除
多 个 核 苷 酸 ; 图 只 切除 配对 的 $-P

底 物
5 2
(a) 3
2
(bj 5
5 二 3

(c)

d

() 3
十

人 -二 全 让 人
如 3
，
S。 3
3， 可

一 人/
RNA
5- 芝 人
一 -一 一 一 人

(2) 3 一 外 切 核酸 酶 活性
在 没有 脱氧 核 苷 三 磷酸 底 物 时 ，
能 从 3-OH 开始 以 3 一 方向 水 解
DNA,， 产 生 $- 单 核 背 酸 。 实际 土
DNA 复制 时 ， 加 上 去 的 脱氧 核 苷 酸
不 一 定 每 次 都 正确 ， 有 许多 错误 的 机
会 ， 有 时 甚至 加 上 一 个 与 模板 不 配对
的 核 苷 酸 ， 当 3“ -OH 末端 的 碱 基 与 模
板 不 配对 时 聚合 酶 就 无 聚合 活性 ， 而
它 具 有 的 3 一 5 外 切 核 酸 酶 活性 可 以
切除 这 个 不 配对 的 核 苷 酸 ， 然 后 再 恢
复 聚 合 活性 ， 如 图 4-5 所 示 。 所 以 聚
3
GUI 开 汕 时 让 失主 公 本 和
AIEG

重 G
C 了
区
AL_ 被 3 一 5' 外 切 核

和 酸 酶 水 解 的 位 点

G
G

图 4-5 _DNA 聚 合 酶 I 的 3 一 S 外 切 核 酸 酶 活性

产物
5 忆
一 一 一 一
号 5$
3 站 3/
9/
5 3 过 3;
一 -一 一
>
和 3，
1
3 5$
3 王 a 汪
3，
一 一 无 外 切 酶 活性

图 4-6 DNA 聚 合 酶 I S 一 3 外 切 核 酸 酶 活性

2 0

末端 核 苷 酸 ， 不 切除 不 配对 的 单 链 $ -P 末端 核 苷 酸 ; 四 既 能 切除 脱氧 核 背 酸 也
能 切除 核 苷 酸 ; @ 对 只 具有 5 -P 末端 的 切口 也 有 活性 。

DNA 育 合 酶 I 的 5 一 3 外 切 核酸 酶 活性 和 聚合 活性 同时 作用 可 以 进行 切口
翻译 (nick translation)， 可 用 来 制造 放射 性 探 针 。 在 反应 物 里 加 入 同位 素 标记 的
脱氧 单 核 苷 酸 后 ，DNA 聚合 酶 I 首先 利用 5 一 3 外 切 核 酸 酶 活性 逐个 切 下 DNA
上 的 脱氧 核 苷 酸 ， 再 逐个 将 标记 的 脱氧 核 苷 酸 加 上 去 (图 4-7)。

切口 双 螺 旋
切口 双 螺 旋 &
LE HL

9 rn

et er
二
过 大 -二 二 人

图 4-7 ” 链 取 代 和 切口 翻译

控制 条 件 使 DNA 聚合 酶 I 在 缺口 处 只 具有 聚合 活性 不 具 外 切 核 酸 酶 活性 ，
使 新 生 的 链 取 代 亲 代 链 (strand displacement)。 链 取代 是 DNA 重组 中 的 一 个 重
要 步 又 。 在 体外 有 一 种 现象 带 常 伴随 着 链 取 代 反 应 发 生 ， 叫 模板 开关 (template-
switching)， 但 还 未 发 现 该 反应 的 生物 学 意义 。

(4) 内 切 核酸 酶 活性

DNA 聚合 酶 I 具 有 5 一 3 “外 切 核 GE G1
酸 酶 活性 ， 也 具有 5 一 3 内 切 核酸 酶

C
活性 ， 如 图 4-8 所 示 。 在 两 个 碱 基 之 En
间 切 开 从 而 产生 一 个 具有 5 -P 末端 0

9/ 忆
的 不 配对 碱 基 的 片段 。
很 多 实验 证 明 DNA 聚合 酶 I 不 图 4-8 DNA 聚 合 酶 I 的 内 切 核酸 酶 活性
是 大 肠 杆菌 复制 中 主要 的 合成 酶 ， 而

是 在 除去 RNA 引物 和 损伤 修复 中 起 重要 作用 。
2. 大 肠 杆 菌 的 DNA 聚合 酶 开

纯化 的 大 肠 杆菌 DNA 聚合 酶 II 分 子 质量 为 90 000 一 120 000Da， 由 一 条 肽
链 构成 。 它 从 $ 一 3 人 方向 合成 DNA， 当 四 种 脱氧 核 苷 酸 、Meg2+ 、NHX+ 和 一 个
带 50 一 200 碱 基 缺 口 的 双 链 DNA 存在 时 达到 最 大 活力 ， 当 缺口 加 大 时 反应 速度
降低 ， 但 加 入 DNA 结合 蛋白 后 能 恢复 到 原来 的 活力 ， 该 酶 也 需要 带 3 OH 未 端
的 引物 ， 具 有 3 一 $ 外 切 核酸 酶 活性 ， 但 没有 $ 一 3 外 切 核酸 酶 活性 。DNA 聚

合 酶 II 的 功能 是 在 应 急 修 复 〈(SOS) 应 答 中 起 作用 ， 这 个 酶 也 可 与 DNA 聚合 酶

I 一 样 填补 缺口 ， 并 且 在 DNA 的 损伤 修复 中 更 容易 利用 损伤 的 模板 直接 合成
DNA。

3. 大 肠 杆菌 DNA 聚合 酶 II

带 有 DNA 聚合 酶 III 的 温度 敏感 突变 (polC) 的 大 肠 杆 菌 在 限制 温度 下 不
能 存活 ， 从 这 种 菌株 得 到 的 裂解 液 也 不 能 合成 DNA， 当 加 入 正常 细菌 的 DNA 聚
合 酶 III 时 可 以 恢复 它 的 聚合 能 力 ， 因 此 与 DNA 聚合 酶 I 和 I 不 同 ， 聚 合 酶 III
是 体内 DNA 复制 所 必需 的 酶 。

大 肠 杆菌 DNA 聚合 酶 III 全 酶 由 多 种 亚 基 组 成 ， 组 成 全 酶 的 各 种 亚 基 及 其
功能 以 及 不 同 装配 体 的 符号 见 表 4-2。

表 4-2 ”DNA 聚合 酶 II 全 酶 组 成

亚 基 分 子 量 (kDa) 功能 亚 装配 体 及 符号
a 129.9 DNA 聚合 酶
E 07 sa 核心
6 8.6 促进 s 外 切 核酸 酶 惟 洒
r 在 活 核心 酶 二 聚 化
结合 y 复合 物
7 47.5 结合 ATP Po TI | TIT 全 兽
$ 38.7 与 8 结合 7 复合 物
8 36.9 与 y 和 8$ 结 合 | ( 依 末 DNA 的
X 16.6 与 SSB 结 合 “| ATPase)
出 5 2 与 X 和 7 结合
B 40.6 滑动

DNA 聚 合 酶 II 与 DNA 聚合 酶 I 类 似 ， 有 聚合 活性 以 及 3 一 5 和 5 一 3 的
外 切 核 酸 酶 活性 ，DNA 聚合 酶 III 的 作用 范围 如 图 4-9 所 示 。Ppol II 的 S 一 3 外
切 核酸 酶 活性 与 pol I 的 不 同 ，pol III 的 $ 一 3 外 切 核酸 酶 活性 只 对 单 链 DNA 有
作用 ， 因 此 不 能 用 于 切口 翻译 。

DNA 聚合 酶 III 全 酶 在 复制 中 十 分 重要 ， 它 可 以 在 DNA 模板 引物 的 3-OH
上 以 每 分 钟 约 60 000 核 苷 酸 的 速率 逐个 延伸 新 生 的 DNA， 三 种 酶 的 性 质 比较 见
表 4-3。

4. 真 核 生 物 中 的 DNA 聚合 酶

所 有 真 核 生物 中 的 聚合 酶 的 性 质 基 本 上 同 大 肠 杆 菌 中 的 聚合 酶 相似 ， 它 的 活
性 依赖 于 模板 ， 带 3 -OH 的 引物 ， 四 种 脱氧 核糖 核 苷 三 磷酸 。 动 物 细胞 的 DNA

5

聚合 酶 [
或 聚合 酶 III

聚合 酶 I 和 聚合 酶 III 的 活性

DNA 聚 合 酶 III 只 能 在 一 个 小 的 多 口 处 起 作用 。

表 4-3 ”三 种 大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 性 质 的 比较

二
大 疮 口
3，
小 宛 口
4-9
功能 ;5 一 3 聚合
3' 一 5 外 切
5 一 3 “外 切
焦 磷 酸化 和 PPi 交换
模板 -引物 :
完整 双 链
有 引物 的 双 链
有 断口 的 双 链 (多 聚 dAT)
有 缺口 的 双 链 或 5 端 突出 的 单 链 ，
单 链 长 度 < 100 核 苷 酸
单 链 长 度 >100 核 苷 酸
分 子 质量 /1000U
每 个 菌 体 中 的 分 子 数 (估计 值 )
结构 基因

聚合 酶 活性 分 布 在 几 个 不 同 的 细胞 级 分 中 ， 至 今 只 对 可 溶性 的 DNA 聚合 酶 研究
得 比较 多 。DNA 聚合 酶 v 在 迅速 增殖 的 细胞 中 活力 较 高 ， 这 个 酶 的 分 子 质量 在
165 000 一 175 000Da 之 间 。 它 的 最 合适 的 底 物 是 带 缺 口 的 双 链 DNA， 带 引物 的

变性 DNA 也 是 很 好 的 底 物 。

pol 工 pol III
一
一
一 十
一
一 一
120 140
10 一 20
zolB zolLC

5 全

DNA 聚 合 酶 B 是 一 个 分 子 质量 小 (43 000Da) 的 聚合 酶 ， 在 整个 细胞 周期
中 它 的 活力 没有 变化 ， 它 以 DNaseI 处 理 过 的 天 然 DNA 作为 模板 ， 对 变性 DNA
几乎 没有 活性 ， 也 没有 外 切 核酸 酶 的 活性 。

DNA 娟 合 酶 y 是 一 个 大 分 子 酶 ， 在 细胞 内 含量 很 低 ， 因 此 不 容易 纯化 。 这
个 酶 可 以 以 带 缺 口 的 DNA 作为 底 物 ， 但 以 多 聚 (A)、 守 聚 (dT)s_t 作 为 底 物
时 酶 活力 更 高 ， 因 此 它 更 像 是 一 个 反 转 录 酶 。

DNA 聚合 酶 v 可 能 是 真 核 生 物 DNA 的 复制 酶 ， 主 要 根据 是 聚合 酶 v 的 活性
随 细胞 周期 变化 而 变化 。 如 淋巴 细胞 中 聚合 酶 v 的 活力 和 DNA 合成 周期 是 一 致
的 ， 而 聚合 酶 B 活 力 的 升 高 要 后 随 一 段 时 间 。 在 Hela 细胞 中 ， 聚 合 酶 v 的 活性
从 G 期 开始 就 升 高 10 倍 ， 一 旦 S 期 结束 酶 活力 就 降低 ， 而 聚合 酶 B 的 活性 在 整
个 过 程 中 没有 变化 。

二 、DNA 连接 酶

DNA 连 接 酶 (DNA ligase) 催化 一 条 DNA 链 的 4 磷酸 基 团 与 另 一 条 DNA
链 的 3 关 基 形成 磷酸 二 酯 键 ， 但 是 这 两 条 链 都 必须 同时 与 另外 一 条 链 互补 结合 ，
而 且 两 链 必须 相 邻 ， 即 该 酶 只 能 连接 一 个 切口 (nick) 而 不 能 连接 一 个 缺口
(gap)， 如 图 4-10 所 示 。 连 接 酶 所 需要 的 能 量 来 自 NAD (如 大 肠 杆菌 ) 或 ATP
(如 T4 诱导 的 连接 酶 和 动物 细胞 中 的 连接 酶 )。T4 诱导 的 连接 酶 不 仅 能 在 模板
上 连接 DNA 和 DNA 之 间 的 切口 ， 而 且 能 连接 RNA 和 RNA 之 间 的 切口 ; 不 仅
能 连接 DNA 中 的 单 链 切 口 或 双 链 的 黏 性 末端 ， 而 且 也 能 连接 无 单 链 黏 性 末端 的
平头 双 链 DNA。 大 肠 杆 菌 连 接 酶 则 不 行 。

丢失 核 萌

0 天 本 和

连接 酶 密封 切口 连接 酶 不 封闭 一 个 缺口
无 活性

人

图 4-10 DNA 连接 酶 的 作用
只 连接 一 个 切口 ， 不 能 连接 一 个 缺口 。

DNA 连接 酶 在 DNA 复制 、 重 组 和 修复 中 的 作用 是 明显 的 ， 缺 乏 DNA 连接
酶 的 大 肠 杆菌 突变 株 中 会 发 生 囚 崎 片段 积累 ， 而 且 对 紫外 光敏 感性 增加 。 每 个 大
肠 杆 菌 约 有 300 个 连接 酶 分 子 ， 在 30Y 每 分 钟 能 连接 7500 个 切口 ， 而 在 实际 的

.114 ，

生命 活动 过 程 中 每 分 钟 大 约 只 有 200 个 切口 需要 连接 ,因此 连接 酶 的 含量 对 于
DNA 的 复制 而 言 是 足够 的 。

三 、 与 解 链 有 关 的 酶 和 和 蛋白质

DNA 是 双 螺 旋 链 ， 在 复制 过 程 中 双 螺 旋 要 解 开 ， 双 螺 旗 的 解 开 使 得 复制 又
前 面 产生 正 超 螺 旋 ， 这 些 应 力 如 果 不 以 某 种 方式 释放 将 妨碍 复制 又 的 前 进 。 如 有 果
让 这 些 超 螺旋 传 到 分 子 末 端 才 释 放 的 话 ， 对 大 肠 杆菌 而 言 ，DNA 分 子 必 须 每 分
钟 旋转 20 000 转 左右 ， 而 且 环 状 分 子 还 不 能 以 这 种 方式 释放 正 超 螺旋 ， 除 非 分
隆 内 有 一 个 切口 使 链 可 以 自由 转动 。 现 在 已 经 找到 一 些 酶 和 生日 质 ， 它 们 或 者 能
使 BDNA 双 链 变 得 容易 解 开 ， 或 者 可 以 使 超 螺旋 分 子 松弛 。 以 下 介绍 一 些 这 种 类
型 的 蛋白 质 。

1. 单 链 结合 蛋白

最 初 发 现 叹 菌 体 T4 的 基因 32 编码 的 蛋白 质 可 以 在 远 低 于 T。 的 温度 下 使 双
链 DNA 拆 开 并 牢固 地 结合 在 单 链 DNA 上 ， 后 来 发 现 许多 种 生物 中 都 有 这 类 蛋
白质 并 将 其 定名 为 单 链 结合 蛋 昌 〈single strand binding protein，SSB)。 在 文献 中
这 类 和 蛋白质 曾 用 过 多 种 名 称 ， 如 解 旋 蛋 白 〈unwinding protein)、 熔 化 蛋白
(melting protein)、 螺 旋 降 稳 和 蛋白 (helix destabizing protein)。

从 原核 生物 中 得 到 的 SSB 在 与 DNA 结合 时 表现 出 协同 效应 。 比 如 第 一 个
SSB 结合 到 DNA 上 去 的 能 力 为 1， 第 二 个 SSB 结合 的 能 力 就 会 高 达 103。 这 可 能
是 由 于 蛋 自 质 和 午 白 质 之 间 的 互相 作用 增强 了 结合 能 力 ; 也 可 能 由 于 第 一 个 SSB
的 结合 使 DNA 链 的 结构 发 生 了 变化 ， 有 利于 后 来 的 SSB 与 DNA 的 结合 ; 很 有
可 能 两 个 假设 原因 都 存在 。

但 失真 核 生 物 如 牛 、 鼠 和 人 细胞 中 得 到 的 SSB 蛋白 与 单 链 DNA 结合 时 不 表
现 为 协同 作用 。

SSB 蛋 自 能 刺激 同 源 的 DNA 育 合 酶 的 活力 ， 如 T4 的 基因 32 编码 的 蛋白 能
刺激 T4 DNA 育 合 酶 活力 ， 但 不 能 刺激 大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 的 活力 ， 反 之 亦

SSB 蛋白 能 使 天 然 DNA 的 熔点 降低 ， 这 可 能 不 是 它 在 生物 体内 的 唯一 功能 。
单 链 DNA 与 SSB 蛋白 结合 之 后 能 抵抗 核酸 水 解 酶 的 作用 ， 如 大 肠 杆菌 SSB 蛋白
能 保护 单 链 DNA 不 受 脱氧 核糖 核酸 酶 、 蛇 毒 磷酸 二 酯 酶 、S1 核酸 酶 、 红 色 链 孢
霉 内 切 核酸 酶 以 及 DNA 聚合 酶 1 和 III 的 3 一 $ 外 切 核酸 酶 的 降解 ， 但 对 小 球菌
核酸 酶 和 大 肠 杆 菌 外 切 核酸 酶 I 仍然 敏感 ， 因 此 SSB 蛋白 的 另 一 个 重要 生物 功能
可 能 就 在 于 保护 复制 中 的 DNA 单 链 部 分 不 被 核酸 酶 降解 。

真 核 生物 的 SSB 蛋白 和 原核 生物 的 SSB 蛋白 可 能 有 些 不 同 ， 原 核 生 物 的

SSB 蛋白 同 双 链 DNA 的 结合 能 力 很 弱 ， 而 真 核 生 物 的 SSB 蛋白 与 双 链 DNA 有
一 定 结合 能 力 ; 原核 生物 的 SSB 蛋白 能 促使 变性 的 DNA 复 性 ， 而 真 核 生 物 的
SSB 蛋白 没有 这 种 能 力 。 因 此 原核 生物 SSB 蛋白 的 作用 方式 是 先 结合 已 存在 的 单 链
区 从 而 侵蚀 双 链 部 分 ， 而 真 核 生物 SSB 蛋白 是 先 结合 DNA 双 链 然后 使 之 熔 解 。

2. 解 链 酶

通过 水 解 ATP 获得 能 量 来 解 开 双 链 DNA 的 酶 称 为 DNA 解 链 酶 。
解 链 酶 水 解 ATP 的 活力 依赖 于 单 链 DNA 的 存在 ， 如 果 双 链 DNA 中 有 单 链
击 寻 往 ， 末端 或 缺口 ， 则 DNA 解 链 酶 可 以 首
先 结合 在 这 一 部 分 ， 然 后 逐步 向 双 链
方向 移动 。 复 制 时 大 部 分 DNA 解 链
Re 上 名 人 大 工 上 li 等 。 酶 可 以 沿 着 后 随 链 模板 的 5'-*3' 方 向
随 着 复制 又 的 前 进而 移动 ， 只 有 rep
蛋白 是 沿 着 前 导 链 模板 的 3 一 $ 方向
移动 ， 因 此 在 复制 时 很 可 能 是 rep 蛋
白 和 某 种 DNA 解 链 酶 分 别 在 DNA
4-11 解 链 蛋 白 和 rep 蛋白 的 协同 作用 的 两 条 母 链 上 协同 作用 以 解 开 双 链
DNA (图 4-11)。

已 经 发 现 ， 有 些 DNA 解 链 酶 同时 还 有 引发 酶 的 功能 。 例 如 T7 的 基因 和 际 编
码 的 蛋白 质 可 以 优先 与 单 链 DNA 结合 并 在 母 链 的 $ 一 3 方向 靠 水 解 NTP 而 移动
并 解 开 双 链 ， 当 它 到 达 DNA 母 链 的 某 一 识别 位 置 时 就 可 以 按 模板 的 要 求 合成 小

片段 RNA 作为 后 随 链 的 引物 ， 比 较 多 的 引物 链 是 pppACCC 或 pppACCA。

3. 拓扑 异 构 酶 工

最 初 从 大 肠 杆菌 中 分 离 到 的 一 种 叫 。 蛋白 的 蛋白 质 可 以 将 共 价 闭 环 的 超 螺
旋 DNA 变 成 松弛 态 而 不 改变 其 化 学 组 成 或 结构 。 由 于 反应 的 产物 还 是 闭环
DNA， 因 此 酶 反应 机 制 只 可 能 是 先 切 开 双 链 DNA 中 的 一 条 链 ， 使 链 的 末端 沿 螺
旋 的 方向 转动 ， 然 后 再 把 切口 封 起 来 。 后 来 发 现 这 种 酶 广泛 存在 于 各 种 生物 中 并
将 其 命名 为 拓扑 异 构 酶 I (topo I)， 不 同学 者 曾 给 予 不同 的 命名 ， 如 转轴 酶
(swivelase) 、 松 旋 酶 (untwisting enzyme)、DNA 松弛 酶 (DNA relaxing en-
zyme)、 切 割 封 口 酶 (nicking-closing enzyme)。

Topo I 在 松弛 DNA 超 螺旋 时 不 需要 ATP， 它 可 以 催化 三 种 拓扑 转换 反应
(图 4-12)。

Topo I 在 复制 中 的 作用 还 不 十 分 清楚 ， 某 一 大 肠 杆 菌 的 突变 株 缺 失 Topo I
酶 基因 ， 但 它 的 生长 速度 只 比 正 常 细菌 稍 慢 一 点 ， 因 此 它 并 不 是 细菌 生长 必 不 可
少 的 酶 。

“6

LD

解 松 超 螺 旋

拓扑 结
-2
环 状 双 链
人
图 4-12 ”拓扑 异 构 酶 I 的 作用

4. 拓扑 异 构 酶 工

拓扑 异 构 酶 II 又 称 为 DNA 解 旋 酶 (DNA gyrase) 或 紧 旋 拓扑 异 构 酶
(twisting topoisomerase)， 它 由 两 个 亚 基 和 两 个 B 亚 基 组 成 。

拓扑 异 构 酶 I 可 以 在 水 解 ATP 的 同时 使 松弛 状态 的 环 状 DNA 转变 为 负 超
曙 旋 DNA， 其 反应 机 制 不 同 于 拓扑 异 构 酶 I， 每 次 引起 的 超 螺旋 变化 数 为 2 (图
4-13)。 这 种 反应 说 明 拓 扑 异 构 酶 II 每 次 能 使 两 条 DNA 链 同 时 切断 ， 让 其 中 一
条 双 链 DNA 穿 过 断口 ， 再 将 已 切断 的 末端 重新 封 接 起 来 ， 其 反应 过 程 可 参考 图
4-14。

物理 形变 (+) 切断 后 面 在 前 面 将
的 双 链

] 沁 寺
7) (-) 全 )

图 4-13 ”拓扑 异 构 酶 工 符号 变换 反应

1

DNA 穿 过
> 全 2

|

本 从 多- 风

部 分 DNA

图 4-14 ”拓扑 异 构 酶 江 的 作用 机 制

拓扑 异 构 酶 不 能 非常 专 一 地 识别 DNA 序列 ， 但 常见 的 识别 结构 是
5 一 TAT+ _ GNTN NT 一
一 ATA ”CNANA NA 一 9/

在 加 工 过 程 中 两 条 链 也 不 是 平行 的 〈 临 时 切断 处 用 箭头 表示 )， 而 且 两 条 链
之 间 相 差 四 个 核 苷 酸 。

Topo I 在 没有 ATP 时 可 以 使 超 螺旋 DNA 变 为 松弛 态 。

Topo I 广 泛 存 在 于 各 种 生物 中 ， 它 是 完成 复制 所 必需 的 一 种 酶 ， 至 少 可 以
分 开 完成 了 复制 的 两 个 子 代 环 状 双 链 DNA。 图 4-15 表示 SV40 DNA 在 Topo II
作用 下 的 复制 及 其 子 代 DNA 的 分 开 。

5. 5| 物 酶

大 肠 杆 菌 中 的 引物 酶 (primase) 是 DnaG 蛋白 ， 它 催化 在 DNA 复制 中 RNA
引物 合成 ， 是 DNA 复制 起 始 复合 物 中 的 复合 蛋白 之 一 。

6. 引发 前 体 蛋 白

引发 前 体 蛋 白 n、n” nm 、DnaB、DanC 和 ji 是 DNA 复制 起 始 过 程 中 装配 成
引发 前 体 的 蛋白 质 。

“TS

加 它 、

复制 起 始 本

图 4-15 ”拓扑 异 构 酶 工 的 功能 示意 图
垂直 箭头 表示 在 Topo II 作用 下 逐渐 拓扑 异 构 化 的 过 程 ，
横向 箭头 表示 DNA 合成 ， 最 后 得 到 两 个 分 开 的 超 螺旋 单 体 。

第 三 节 DNA 复制 的 起 始 、 延 伸 和 终止

一 个 DNA 分子 的 复制 当然 不 是 瞬间 就 能 完成 的 ， 它 是 一 个 在 空间 上 井然 有
序 的 复杂 的 生化 反应 过 程 。DNA 复制 是 以 复制 子 为 单位 进行 的 。

AD 复 直 制 汪 二

DNA 分 子 上 一 个 独立 的 复制 单位 叫做 复制 子 (replicon)。 一 个 复制 子 包括
一 个 复制 原点 (origin)， 也 可 能 包括 一 个 复制 终止 点 〈terminus)。

任何 一 个 与 复制 原点 连接 而 又 不 被 复制 终止 点 隔 开 的 DNA 序列 都 作为 该 复
制 子 的 一 部 分 而 被 复制 。 复 制 原点 是 一 个 顺 式 作用 位 点 ， 它 只 能 影响 它 所 在 的 那
条 DNA 分 子 。

在 原核 生物 中 ， 复 制 子 被 看 成 是 一 个 具有 一 个 复制 原点 和 一 个 编码 复制 调控
蛋 日 基因 的 单位 ， 而 用 于 真 核 生物 染 色 体 上 的 复制 子 的 一 般 描 述 为 : 含有 一 个 复
制 原 点 的 复制 单位 ， 其 反 式 作用 调控 蛋白 可 能 由 其 他 位 置 编码 〈 即 调控 蛋白 基因
不 包括 在 复制 子 中 )。

>

一 个 原核 细胞 的 基因 组 由 一 个 复制 子 组 成 ， 所 以 DNA 复制 和 细胞 分 裂 同时
发 生 。 最 大 的 复制 子 是 大 肠 杆菌 基因 组 ， 一 旦 细胞 分 裂 开 始 ，DNA 复制 也 就 从

所 以 这 种 复制 控制 类 型 叫做 单 拷贝 控制 。

有 些 细菌 中 除 自己 的 染色 体 以 外 还 可 能 含有 质粒 ， 质 粒 有 自己 的 复制 原点 ，
是 自主 复制 单位 。 质 粒 复制 子 可 以 与 细菌 染色 体 一 起 复制 ， 此 时 是 单 拷贝 控制 ;
但 质粒 也 可 以 是 多 拷贝 控制 。

每 个 噬菌体 或 病毒 的 DNA 也 可 以 组 成 一 个 复制 子 ， 在 一 个 感染 周期 中 ， 其
DNA 的 复制 可 以 起 始 多 次 。

复制 子 是 个 灵活 可 变 的 单位 。 细 菌 基 因 组 中 ，DNA 分 子 以 半 保 留 复制 产生
复制 品 ， 而 噬菌体 或 质粒 则 可 以 产生 单 链 单 体 或 多 聚 体形 式 的 基因 组 。 复 制 子 的
复制 模式 依赖 于 在 复制 原点 上 起 始 复制 的 那些 相互 作用 的 性 质 ， 复 制 一 旦 开始 ，
就 会 继续 下 去 ， 直 至 整个 基因 组 全 部 被 复制 。 复 制 起 始 的 频率 由 调控 蛋白 和 复制
原点 的 互相 作用 来 决定 。

真 核 基 因 组 中 含有 多 个 复制 子 ， 所 以 一 个 分 离 单 位 就 包括 许多 复制 子 ， 这 就
增加 了 其 控制 问题 的 复杂 性 。 在 一 个 细胞 周期 中 ， 染 色 体 上 的 所 有 复制 子 必 须 几
乎 同时 被 激活 ， 而 且 在 同一 个 周期 中 只 被 激活 一 次 。

必须 存在 一 些 信号 去 区 别 复制 过 的 复制 子 或 没有 复制 过 的 复制 子 ， 以 便 复 制
子 在 同一 周期 中 决 不 会 第 二 次 被 起 动 复制 。 因 为 许多 复制 子 是 单独 被 激活 的 ， 所
以 还 必须 存在 一 些 信和 号 来 指示 所 有 复制 子 的 复制 全 过 程 什么 时 候 已 经 完成 。

目前 收集 到 的 有 关 复 制 子 构建 和 有 关 复 制 子 之 间 关系 的 资料 还 极 少 ， 还 不 知
道 在 每 个 细胞 周期 中 复制 的 途径 是 否 相 同 ， 也 不 知道 是 否 所 有 的 复制 原点 总 是 被
使 用 ， 还 是 有 些 复制 原点 有 时 是 沉默 的 ， 更 不 知道 复制 原点 是 否 总 是 以 同样 的 次
序 起 始 。 如 果 存 在 不 同类 型 的 复制 原点 ， 那 么 又 由 什么 特征 来 区 别 它们 呢 ?

叶绿体 和 线粒体 DNA 复制 的 调控 更 像 在 一 个 细菌 细胞 中 存在 的 多 个 拷贝 的
质粒 那样 ， 细 胞 中 的 每 个 细胞 器 DNA 都 有 多 个 拷贝 ， 而 且 细胞 器 DNA 的 复制
调控 必须 和 细胞 周期 相关 联 。 在 所 有 的 系统 中 ， 关 键 的 问题 是 解释 作为 复制 原点
的 功能 序列 如 何 被 复制 装置 中 合适 的 蛋白 质 所 识别 。

用 同位 素 标记 方法 可 以 研究 复制 子 的 复制 起 始点 以 及 复制 方向 ， 也 可 以 研究
双向 复制 中 复制 速度 是 否 相 同 。 应 用 此 技术 已 证 明 DNA 复制 原点 最 常用 于 双向
复制 (图 4-16)。

细菌 基因 组 是 单个 复制 子 ， 一 个 细菌 基因 组 要 遗传 ， 其 复制 必须 满足 几 个 条
件 :， @ 一 个 复制 周期 的 起 始 ; @ 对 起 始 频率 的 控制 ; G@) 复 制 后 的 染色 体 分 配 到 子
细胞 。

前 两 个 条 件 由 复制 原点 来 实现 ， 分 离 则 可 能 是 一 个 独立 的 功能 ， 但 事实 上 ，
常常 由 复制 原点 邻近 的 序列 来 实现 〈 真 核 生 物 的 复制 原点 在 分 离 中 绝对 没有 作

。，120 ，

亲 代 DNA 复制 的 DNA N

区 借 坦 凡

复制 又 复制 叉

玫 > 关 NSON SS , * AN =
SN 间

UNCANANCNGRMN

图 4-16 复制 子 可 能 是 单 向 或 双向 ， 这 取决 于 在 起 始 区 是 形成 一 个 还 是 两 个 复制 又

用 )。 用 缺失 突变 的 方法 我 们 可 以 鉴定 出 每 一 个 与 分 离 有 关 的 序列 。

一 个 复制 原点 连接 到 任 一 DNA 分 子 上 都 可 以 支持 其 复制 ， 因 而 可 以 以 此 来
鉴定 复制 原点 。

在 真 核 细胞 中 ，DNA 复制 属于 细胞 周期 的 一 部 分 。 在 高 等 真 核 生 物 中 ， 细
胞 周期 的 S 期 占据 间 期 上 且 常 常 持续 几 个 小 时 ， 通 过 许多 独立 的 复制 子 的 复制 而 完
成 真 核 生 物 染 色 体 DNA 的 复制 。

细菌 中 ，DNA 复制 与 细胞 生长 相 协调 。 首 先是 调整 复制 周期 的 起 始 频率 使
之 与 细胞 生长 的 速率 相 适 应 ， 其 次 是 复制 周期 的 完成 与 细胞 分 裂 相 联系 。

二 、 半 保留 复制 和 半 不 连续 复制

在 细胞 分 裂 过 程 中 ， 亲 代 细 胞 所 含有 的 遗传 信息 原原本本 地 传递 给 两 个 子 代
.121 ，

细胞 。 我 们 知道 ， 细 胞 的 DNA 携带 了 细胞 的 一 切 遗传 信息 ， 因 此 ， 亲 代 DNA
也 必须 准确 无 误 地 复制 成 两 个 拷贝 ， 并 分 配 到 两 个 子 代 细胞 中 去 。 研 究 DNA 复
制 的 目的 就 是 要 了 解 : @ 子 代 DNA 为 什么 能 够 真实 地 获得 亲 代 DNA 的 遗传 信
息 ; @ 复 制 是 怎样 进行 的 ; 图 生物 体 是 怎样 对 DNA 复制 进行 调控 的 。

关于 前 两 个 问题 ，Watson 和 Crick 在 发 表 DNA 双 螺 旋 结 构 模 型 时 就 讨论 过
了 。 在 DNA 双 螺 旋 中 ，G 只 能 和 C 配 对 ，A 只 能 和 工 配对 ， 因 此 依照 碱 基 配 对
原则 ， 任 意 一 条 链 的 碱 基 序列 都 可 以 精确 地 决定 它 的 互补 链 的 序列 。 在 DNA 复
制 时 ， 只 要 简单 地 把 DNA 双 链 拆 开 ， 每 一 条 链 都 可 以 作为 模板 ， 从 而 合成 结构
上 完全 一 样 的 两 条 DNA 双 链 (图 4-17)。

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图 4-17 Watson 和 Crick 提出 的 DNA 复制 机 制

然而 ， 这 样 一 个 表面 上 看 来 很 简单 的 过 程 其 实 并 不 像 最 初 提出 时 那样 ， 可 以
像 拉 “拉链 ”一 样 很 容易 完成 而 不 需要 任何 酶 的 帮助 。 实 际 上 ， 复 制 过 程 十 分 复
杂 ， 它 涉及 许多 酶 和 蛋白 质 的 协同 作用 。 目 前 虽然 对 大 部 分 与 复制 有 关 的 酶 和 和 蛋
白质 的 结构 和 性 质 已 研究 清楚 ， 但 对 于 DNA 的 双 链 究竟 是 如 何 解 开 以 及 怎样 保

持 其 复制 的 真实 性 的 问题 仍 是 知 其 然而 不 知 其 所 以 然 。 以 下 事实 足以 表明 复制 过
程 的 复杂 性 : @ 需要 为 解 螺旋 提供 能 量 ; @ 单 链 DNA 倾向 于 链 内 碱 基 配 对 ;
Q@ 一 种 酶 只 能 催化 有 限 的 生理 生化 反应 ; 田 一 系列 的 防护 措施 既 能 防止 复制 错
误 的 产生 又 能 消除 偶然 出 现 的 错误 ; @ DNA 分 子 均 以 高 度 压 缩 状 态 和 环 状 超 螺
旋 状 态 存在 ， 必 须 解 决 由 此 给 复制 系统 带 来 的 强大 的 几何 强制 力 。 这 些 问 题 一 直
是 人 们 力求 弄 清 楚 的 问题 。

Watson 和 Crick 提出 的 DNA 复制 方式 称 为 半 保 留 的 复制 方式 。 在 理论 上 还
可 以 设想 其 他 一 些 复制 方式 ， 例 如 全 保留 复制 和 散布 式 复制 。

当 半 保留 复制 的 假设 提出 时 ， 人 们 并 不 了 解 DNA 能 变性 而 且 认 为 链 分 离 是
不 可 能 的 ; 链 不 可 分 离 的 思想 主要 由 于 对 解 螺旋 所 需要 的 时 间 的 不 正确 计算 ( 值
很 大 ) 和 对 DNA 变性 后 得 到 分 子 质量 不 等 的 DNA 实验 的 错误 解释 。 此 外 ， 一
个 细菌 细胞 的 DNA 的 长 度 大 约 是 1.3mm， 而 一 个 典型 的 杆菌 的 长 度 只 有
0.003mm， 所 以 认为 两 条 链 完 全 解 开 进行 链 分 离 的 想法 几乎 是 荒 雇 的 。

全 保留 复制 的 模型 认为 ， 在 复制 前 后 DNA 都 是 缠绕 在 一 起 的 ， 仅 仅 是 复制
位 点 解 开 几 个 碱 基 便 足以 使 多 聚 酶 阅读 并 产生 新 的 分 子 ， 而 亲 代 分 子 保持 完整 。
因此 在 全 保留 复制 中 ， 亲 代 DNA 分 子 完全 不 需要 解 链 。

散布 式 复制 模型 认为 亲 代 DNA 分 子 先 打 成 片段 然后 再 互 为 模板 复制 。 于 是
亲 代 DNA 片段 分 散在 子 代 DNA 分 子 中 : 这 个 模型 可 以 避 开 半 保 留 复制 中 的 一
些 问题 。

然而 以 下 几 个 著名 实验 证 明了 DNA 分 子 以 半 保 留 方式 进行 复制 。

Meselson_Stahl 实验 : 1958 年 Meselson 和 Stahl 设计 了 一 个 很 巧妙 的 实验 ，
证 明 DNA 复制 是 以 半 保 留 方式 进行 的 。 他 们 先 把 大 肠 杆 菌 在 9%6.5% 同位 素 纯度
的 SNH4ACI 培养 液 中 培养 15 代 ， 经 过 多 次 细胞 分 裂 使 所 有 细菌 DNA 都 被 SN 标
记 。 然 后 把 这 些 细胞 转移 到 正常 的 “NEH4CI 培养 液 中 培养 。 在 不 同时 间 取 出 样
品 ， 用 SDS 裂解 细胞 。 裂 解 液 进行 CsCl 密度 梯度 离心 ， 达 到 平衡 时 ，DNA 分 子
就 停 在 等 密度 区 不 再 移动 ， 紫 外 光 下 可 以 观察 这 条 吸收 带 。 含 有 3SN 的 DNA 分
子 密 度 在 1.71g/ems 左右 ， 大 于 14N 的 DNA 密度 ， 它 在 离心 管 较 低 的 部 位 形成
一 条 带 。 让 这 种 重 标记 的 DNA 在 !4N 培养 液 中 复制 一 代 ， 发 现 重 密度 带 消 失 了 ，
而 在 比 正 常 DNA 稍 低 的 地 方形 成 另 一 个 带 ， 我 们 称 它 为 中 间 密 度 带 。 在 XN 培
养 液 中 再 复制 一 代 ， 就 可 看 见 在 CsCl 密度 梯度 溶液 中 出 现 两 条 带 : 一 条 在 中 间
密度 区 域 ， 另 一 条 在 轻 密 度 区域 ， 而 重 密度 区 域 仍 然 无 带 。 随 着 在 2N 培养 液 中
培养 的 代数 的 增加 ， 中 间 密 度 区 带 的 量 逐 渐 减 少 ， 低 密度 区 带 的 量 逐 渐 增 加 ， 但
并 不 出 现 新 的 密度 区 带 。 这 个 实验 结果 (图 4-18)， 证 明 DNA 分 子 半 保 留 复 制
理论 是 正确 的 ， 排 除了 全 保留 复制 方式 的 可 能 性 ; 因为 全 保留 复制 方式 中 亲 代
DNA 毫 无 变化 地 转移 到 子 代 中 ， 那 么 重 密度 的 DNA 带 不 会 消失 。 在 半 保 留 复制
中 ，DNA 是 密度 杂交 分 子 ， 两 条 链 中 一 条 链 是 亲 代 SN 标记 的 重 链 ， 另 一 条 是

35

含 N 的 轻 链 ， 这 样 两 条 链 形成 密度 上 杂交 的 DNA。 因 此 所 有 子 代 DNA 的 密度
都 比 亲 代 DNA 的 密度 小 ， 但 又 比 正常 DNA 的 密度 大 ， 形 成 一 个 中 间 密 度 带 。
如 果 把 这 种 密度 杂交 的 分 子 在 AN 培养 液 中 再 培养 一 代 ， 按 半 保 留 复 制 方式 就 会
形成 SNIZLN 和 ZNIAN 两 种 分 子 ， 所 以 形成 两 条 带 ; 而 且 随 着 在 N 培养 液 中 复制
代数 的 增加 ，SNIN DNA 相对 量 减少 ， 而 4NI4N DNA 相对 量 增加 ， 但 不 出 现
新 带 ， 就 如 图 4-18 所 示 。

15 14 14 14 14 14 14 15

图 4-18 五 .co SN 培养 基 中 生长 几 代 后 转 入 4N 培养 基 中 ， 培 养 一 代 之 后 ， 全 部
DNA 呈 杂 交 密 度 。 右 边 是 不 同时 间 分 离 的 DNA 的 状态

DNA 浓度
所
is
SS
于

第 二 个 实验 是 : 把 5NIN 密度 杂交 DNA 加 热 至 100C 变性 ， 使 两 条 链 分
开 ， 然 后 在 CsCl 密度 梯度 中 离心 ， 变 性 的 密度 杂交 DNA 离心 后 出 现 了 两 条 带 ，
即 4N_DNA 和 35N-DNA 带 ， 结 果 如 图 4-19 所 示 。 这 说 明 在 IN 培养 液 中 第 一 代
复制 的 DNA 是 由 一 条 IN 轻 链 和 一 条 45N 重 链 组 成 的 ， 这 就 进一步 确证 了 DNA
的 复制 是 半 保 留 方式 。

1963 年 Cairns 用 放射 自 显影 的 方法 阐明 大 肠 杆 菌 DNA 是 环 状 分 子 并 且 以
半 保 留 方式 进行 复制 。1957 年 Taylor 用 3H 脱氧 胸 苷 的 溶液 标记 生长 中 的 答 豆 苗
证 明了 真 核 生物 的 染色 体 复 制 也 是 以 半 保 留 方式 进行 的 。

以 上 实验 得 出 一 个 共同 的 结论 ，DNA 是 以 半 保 留 方式 进行 复制 的 ， 无 论 是 恒
原核 还 是 真 核 都 是 如 此 。

DNA 半 保 留 复 制 已 经 确立 ， 现 在 我 们 面临 的 问题 是 如 何 解释 解 螺旋 。 下 面
将 讨论 这 个 问题 。

在 半 和 保留 复制 中 双 螺 旋 的 解 旋 存 在 一 个 机 制 问题 。 图 4-17 中 在 复制 又 处 两
条 链 必须 互相 绕 着 旋转 。 如 果 DNA 分 子 在 细胞 里 是 伸展 的 ， 事 情 还 简单 些 ; 然

. 124

巨 coli [NSN] 杂 合 DNA
天 然 的

LTL7

参照 DNA 密度
1.700

图 4-19 SNIN 双 股 DNA 分 子 和 单 股 多 核 苷 酸 链 的 密度
1.700 是 参照 DNA 的 密度 ， 下 部 是 SNANDNA 变性 后 ， 和 参照 DNA 一 起 密度 梯度 离心 的 结果 。

而 DNA 分 子 的 实际 长 度 是 它 在 细胞 中 长 度 的 600 倍 ， 这 样 一 个 高 度 被 压缩 的 分
子 要 进行 旋转 是 不 可 能 的 。 解 决 这 个 问题 的 简单 方法 是 在 复制 又 前 面 的 亲 代 链 上
造成 一 个 切口 ， 这 样 使 得 超 螺 旋 区 的 一 个 小 片段 发 生 旋转 ， 从 而 就 解决 了 它 的 几
何 学 问题 〈 图 4-20)。 在 此 之 后 还 需要 被 打开 的 链 重 新 连接 ， 而 且 这 个 切口 的 修
复 必 须 在 复制 又 到 达 这 个 切口 之 前 完成 ， 否 则 子 代 链 就 会 丢失 〈 图 4-20)。 细 胞
内 存在 相应 的 酶 和 蛋 自 质 能 切 开 DNA 单 链 并 且 能 把 切口 再 封 起 来 。

切口 不 封口 耻

一

AL 支 链 丢 失

图 4-20 复制 又 前 边 产生 切口 以 利 旋转 ， 如 果 切 口 不 被 封 上 ， 新 形成 的 子 代 链 将 丢失

“5

因为 DNA 双 螺 旋 的 两 条 链 是 反 向 平行 的 ， 因 此 在 复制 又 附近 解 开 的 DNA
二 条 链 一 条 是 $ 一 3 方向 ， 另 一 条 是 3 一 5 方向 。 由 于 模板 的 极 性 不 同 ， 是 不 是
一 种 DNA 聚合 酶 向 $ 一 3 方向 延伸 ， 另 一 种 DNA 聚合 酶 可 以 沿 3 一 5 方向 延伸
呢 ? 至 今 发 现 的 所 有 体内 DNA 聚 合 酶 都 只 能 以 $ 一 3 方向 延伸 。 而 且 由 于 复制
真实 性 的 要 求 ， 也 只 能 以 $ 一 3 人 方向 延伸 。

1968 年 冈 崎 〈(Okazaki) 发 现 : 大 肠 杆菌 用 3H 脱氧 胸 苷 短 时 间 标 记 的 DNA
变性 后 ， 用 超速 离心 方法 可 以 得 到 许多 8 一 10S 的 标记 小 片段 ， 这 些小 片段 被 称
为 冈 崎 片段 。 标 记 时 间 延 长 ， 冈 崎 片段 可 转变 为 成 熟 DNA 链 ， 因 此 它们 必然 是
复制 过 程 的 中 间 产 物 。 按 照 这 个 结果 ， 冈 崎 认为 DNA 合成 至 少 在 一 条 链 上 是 不
连续 的 。 以 复制 叉 向 前 移动 的 方向 为 准 ， 一 条 模板 链 是 3 一 $ 方向 ， 称 为 前 导 链
(leading strand)。 原 则 上 在 前 导 链 上 ，DNA 的 合成 能 以 $ 一 3 方向 ( 指 新 合成 的
DNA 链 的 极 性 ) 连续 合成 。 另 一 条 链 上 新 生 DNA 也 是 以 $ 一 3 方向 合成 ， 但 与
复制 又 前 进 的 方向 相反 ， 这 一 条 链 称 后 随 链 (lagging strand)。 随 着 复制 又 的 移
动 ， 后 随 链 上 不 连续 的 DNA 片段 可 以 连接 起 来 成 为 一 条 完整 的 DNA 链 。

此 外 发 现在 DNA 连接 酶 的 突变 株 中 积累 了 囚 崎 片段 ; 利用 电镜 技术 直接 观
察 到 复制 又 的 一 边 是 双 链 ， 另 一 边 是 单 链 ， 或 一 段 很 短 的 双 链 。 这 些 实验 也 证 明
复制 过 程 中 出 现 冈 崎 片段 。 这 种 前 导 链 的 连续 复制 和 后 随 链 的 不 连续 复制 在 生物
界 是 普遍 存在 的 ， 称 为 双 螺旋 的 半 不 连续 复制 。 很 多 因素 ， 如 模板 的 损伤 ， 复 制
蛋白 或 dNTP 供应 不 平衡 等 都 可 以 影响 前 导 链 的 连续 复制 ， 引 起 前 导 链 从 另 一 新
起 点 开始 。

三 、 不 同 的 复制 5| 友 机 制

DNA 复制 过 程 中 需要 合成 RNA 引物 ， 这 对 合成 后 随 链 也 同样 适用 。RNA
引物 的 合成 称 为 引发 。 后 随 链 的 引发 是 个 十 分 复杂 的 过 程 。

现在 知道 大 肠 杆 菌 DNA 的 复制 需要 多 种 蛋白 质 和 酶 的 协同 作用 ， 其 中 的 不
少 蛋 白质 都 与 引发 有 关 ( 表 4-1)。

由 于 大 肠 杆菌 的 引发 机 制 过 于 复杂 ， 人 们 首先 研究 了 大 肠 杆 菌 鸣 菌 体 的 引发
过 程 。 在 大 肠 杆 菌 中 ， 吹 菌 体 M13 DNA 可 以 利用 细菌 的 RNA 聚合 酶 ， 先 在
MI13 单 链 DNA 上 合成 一 小 段 RNA 引物 ， 然 后 在 DNA 聚合 酶 的 作用 下 ， 以 M13
为 模板 延伸 新 生 的 DNA 链 。 但 当 存 在 利 福 平时 ， 这 种 单 链 M13 DNA 变 为 双 链
DNA 的 反应 就 完全 被 抑制 了 ， 因 为 利 福 平 可 以 抑制 大 肠 杆 菌 RNA 聚合 酶 的 活
力 。 但 是 在 一 种 大 肠 杆 菌 突变 株 中 ，M13 DNA 的 合成 不 受 利 福 平 的 抑制 ; 而 且

rssegpgegpiieegereeeeeueiereeerecereeemeeeeresegySi

本

YAOAAensnpe

SA AS

单 链 G@X174 DNA 变 为 双 链 的 RF 型 也 完全 不 受 利 福 平 的 影响 ， 因 此 可 能 存在 一 旧

种 以 前 未 认识 到 的 DNA 合成 系统 。 深 入 研究 的 结果 导致 了 引发 体 (primosomey)
的 发 现 。 现 在 已 经 证 明 无 论 是 原核 还 是 真 核 生 物 ，DNA 复制 时 都 要 靠 引 发 体 来
2GL =

引发 。 引 发 体 包 括 引 发 前 体 (preprimosome) 和 引发 酶 (pimase)。 引 发 体 像 火车
头 一 样 在 后 随 链 上 向 分 又 的 方向 前 进 ， 并 在 模板 上 上 断断续续 地 引发 生成 后 随 链 的
引物 RNA 短 链 。

复制 又 处 有 两 个 下 .coii DNA 聚合 酶 III 核心 酶 ， 在 前 导 链 上 pol III 沿 着
5 一 3 滑动， 在 后 随 链 上 后 随 链 先 弯曲 。 使 得 pol III 移动 方向 与 前 导 链 上 的 合成
方向 一 致 ， 并 使 前 导 链 的 合成 的 速度 不 比 后 随 链 快 得 太 多 (图 4-21)。

SSB 蛋白 质

+
9 4
生 攻
机 和 AAA Ar
忆 AZ
AA
扩 六 TB At
有 1 CA ” A
N 2 AP IAA
2 有 7A GAOAAA
AZ
、 7
*
( 芝
me 和
生
《 生
、。.。 A/ 后 随 链 的 增长 方向
二

4-21 在 增长 的 复制 叉 处 下 .coli 复制 蛋白 之 间 的 关系 示意 模型
尽管 DNA 的 复制 要 人 靠 引 发 体 来 引发 ， 然 而 不 同形 式 的 DNA 复制 的 引发 及
复制 形式 却 不 尽 相 同 。 生 物 界 中 ， 许 多 生命 形式 的 遗传 物质 是 环 状 双 螺 旋 分 子 。
下 边 将 以 几 种 生物 为 例 来 了 解 它们 的 DNA 复制 的 引发 机 制 及 复制 形式 。

工 . 大 肠 杆 菌 DNA 复制 的 起 始

| 前 边 已 讨论 了 复制 原点 的 结构 特点 和 用 于 DNA 复制 的 酶 及 和 蛋白质， 现在 来
| 讨论 这 些 酶 和 蛋白 质 是 如 何 相互 作用 而 起 始 DNA 复制 的 。

首先 大 肠 杆菌 的 DnaA 蛋白 结合 到 oriC 的 9 聚 体 (9-mers， 9bp) 上 ， 有 利于
DNA 双 螺 旋 的 熔 解 和 链 分 离 ， 熔 链 的 位 置 发生 在 oriC 的 13 聚 体 〔(13-mers，
| 13bp) 处 ， 产 生 一 个 开放 复合 物 (open complex)， 这 个 过 程 需 要 ATP。 用 专 一
| 性 识别 单 链 DNA 的 内 切 核 酸 酶 处 理 大 肠 杆 菌 DNA 和 DnaA 混合 物 时 ， 该 DNA
.127. .

本

的 起 始 区 被 切 开 ， 证 实 起 始 区 处 于 熔 链 状态 。

DnaB 是 大 肠 杆菌 解 旋 酶 (helicase)， 是 同 亚 基 六 聚 体 ， 它 像 夹 钳 一 样 在 开
放 复 合 物 处 紧 紧 套 住 每 条 单 链 。DnaB 蛋白 在 开放 复合 物 上 位 于 DnaA 和 DrnaC 之
间 ， 它 对 DNA 的 结合 也 需要 ATP。Dnac 蛋白 由 anaC 基因 编码 ， 其 功能 是 将
DnaB 蛋白 护送 到 DnaA 处 ， 产 生 引 发 前 体 (图 4-22)。

负 链 超 螺旋 模板

图 4-22 大肠 杆菌 oriC 处 复制 起 始 模型

解 旋 酶 是 一 类 能 利用 ATP 水 解 的 能 量 沿 DNA 双 螺 旋 移 动 并 且 使 两 条 链 解 开
的 酶 。 被 解 开 的 单 链接 着 被 单 链 结合 蛋白 (SSB) 保护 而 阻止 退火 。 当 将 dzraB
的 温度 敏感 突变 株 转移 到 非 允 许 温度 培养 时 ， 解 螺旋 停止 ， 结 果 由 于 缺少 单 链 模
板 而 使 DNA 的 合成 也 立即 停止 。 像 DnaB 这 样 的 解 旋 酶 结合 于 单 链 DNA 上 并 沿
着 该 单 链 以 $ 一 3 人 方向 移动 ， 同 时 解 开 两 互补 链 之 间 的 氢 键 。 由 于 DnaB 蛋白 像
夹子 一 样 套 在 DNA 单 链 上 ， 因 此 它 不 容易 从 DNA 上 脱落 。

大 肠 杆菌 中 DNA 引发 酶 为 DNA 的 复制 合成 引物 。 大 肠 杆 菌 的 dwraG 基因
编码 引发 酶 ，DnaG 蛋白 首先 与 DnaB 结合 的 单 链 DNA 结合 ， 引 发 前 体 与 DnaG
结合 后 称 为 引发 体 ， 其 中 的 DnaG 以 单 链 DNA 为 模板 合成 短 的 RNA 引物 。

DNA 聚 合 酶 I 在 DNA 复制 期 间 填 补缺 口 ，DNA 聚合 酶 II 在 SOS 应 答 中 起
作用 ，DNA 聚合 酶 III 催化 链 延 伸 。DNA 聚合 酶 全 酶 是 由 10 个 亚 基 组 成 的 高 度
复杂 的 巨大 的 蛋白 质 : w 亚 基 有 催化 活性 ; s 亚 基 有 3 一 5 外 切 活 性 ， 在 DNA 复
制 中 除去 错 配 的 核 苷 酸 ; 6 亚 基 的 功能 尚 不 清楚 ; 其 余 亚 基 的 功能 是 将 只 能 合成
10 一 15 核 苷 酸 的 核心 酶 (distributive enzyme) 转变 成 能 合成 Sx 105 个 核 苷 酸 而
不 脱离 模板 的 酶 (processive enzyme)， 这 一 活性 对 于 前 导 链 和 后 随 链 的 合成 都 是
必要 的 ， 其 关键 在 于 8B 亚 基 二 聚 体 夹子 在 复制 叉 处 的 3 端 与 保持 催化 活性 的 核心
酶 发 生 联 合 。 与 B 亚 基 联 合 后 的 核心 酶 移动 时 ，B 亚 基 二 聚 体 就 像 戒指 套 住 一 个

sa .128

细 线 一 样 沿 着 DNA 自由 滑动 。 以 这 种 方式 核心 酶 在 复制 叉 处 具有 最 大 的 合成 长
链 DNA 的 活性 〈processive enzyme activity)。 其 余 的 六 个 亚 基 中 ，7、8S$、》 、x
和 山形 成 复合 物 ， 称 为 y 复合 物 。7y 复合 物 执行 两 个 任务 : @ 将 B 亚 基 运 载 到
DNA-RNA 引物 复合 物 上 ;CDNA 复制 完成 后 ， 钙 载 B 亚 基 夹 子 。B 亚 基 夹 子 的
装载 或 印 载 都 需要 将 夹 环 打开 ， 目 前 还 不 明确 y 亚 基 是 如 何 完成 这 个 任务 的 。*
亚 基 的 作用 是 使 两 个 核心 酶 二 聚 化 ， 这 对 保证 前 导 链 和 后 随 链 的 合成 同时 进行 是
必需 的 。

当 DNA 聚合 酶 将 脱氧 单 核 苷 酸 按 模板 要 求 逐 个 加 到 3 -OH 末端 时 ， 新 生
DNA 链 开始 合成 和 延伸 ， 延 伸 的 方向 是 $ 一 3 。 大 肠 杆 菌 环 状 DNA 基因 组 复制
从 oriC 开始 ， 进 行 双向 合成 。 复 制 中 的 大 肠 杆 菌 染 色 体 在 电镜 下 呈 6 形状 ， 因 此
也 称 为 6 复制 。

2. 猴 病 毒 SV40 的 复制

SV40 DNA 的 复制 起 始 于 复制 原点 〈 图 4-23)， 病 毒 编码 的 工 抗原 或 称 为
Tag 首先 识别 复制 原点 并 与 之 结合 〈 图 中 第 @ 步 )， 它 具有 解 旋 酶 活性 使 DNA 局
部 熔 链 。SV40 复制 原点 的 解 链 也 需要 ATP 和 复制 蛋白 A (replication protein A，
RPA)，RPA 是 由 宿主 编码 的 单 链 结合 恒 日 ， 功 能 类 似 于 大 肠 杆 菌 中 的 SSB 蛋白
(图 中 第 @O 步 )。 一 个 分 子 的 聚合 酶 (pola) 紧密 地 与 引物 酶 联合 ， 然 后 结合 到
每 条 单 链 模板 上 。 引 物 酶 合成 RNA 引物 ，pola 则 将 引物 延伸 一 小 段 ， 在 复制 原
点 处 以 相对 的 方向 形成 最 早 的 一 段 前 导 链 (图 中 第 @@ 步 )。pola 的 这 种 活性 被 复
制 因子 C (replication factor C，RFC) 所 激发 。 然 后 PCNA (proliferation cell nu-
clear antigen) 在 引物 -模板 (primer-template) 3 末端 结合 ， 取 代 两 个 前 导 链 模板
上 的 pola， 从 而 中 断 前 导 链 的 合成 〈 第 田 步 )。 接 着 ，pola 结合 到 正 增长 着 的 链
的 3 末端 ，pol8 与 PCNA 的 联合 增强 了 聚合 酶 合成 长 链 的 活性 ， 前 导 链 可 以 连
续 合 成 而 不 再 中 断 〈 第 @ 步 )。PCNA 与 大 肠 杆菌 中 DNA 聚合 酶 III 的 B 亚 基 高
度 同 源 ， 其 氨基 酸 顺 序 相 似 ， 都 能 形成 戒指 环 状 结构 ， 套 住 DNA 细 线 。 但 是 8B
亚 基 夹子 是 二 聚 体 而 PCNA 是 三 聚 体 。

随 着 Tag 六 聚 体 催 化 双 螺 旋 DNA 熔 链 的 进行 ，Tag 离开 复制 原点 而 前 进 。
pola 和 REFC 与 后 随 链 模板 结合 ， 合 成 后 随 链 (图 中 第 @ 步 )。 最 后 跟 原核 生物 一
样 ， 由 topo 酶 在 链 释放 和 链 分 离 中 起 作用 。SV40 的 复制 也 是 以 6 形式 进行 。

3. 线粒体 DNA 的 复制

无 论 是 原核 染色 体 还 是 真 核 染 色 体 ， 复 制 子 的 复制 原点 都 是 静态 结构 : 它们
是 位 于 双 曙 旋 形 式 的 DNA 中 ， 在 合适 的 时 间 用 于 被 识别 起 始 复制 的 DNA 顺序 。
起 始 需要 DNA 解 链 并 进行 双向 合成 ; 但 线粒体 中 ， 其 复制 原点 的 排列 与 其 他 染
色 体 不 同 。

=

0

SV40 DNA
SV40 原点
柚 3
二 上 二 51/
OO 二 在 原点 结合

起 始 Tag 解 旋 酶
4 3
3 了

双 螺 旋 松 旋 ，RPA 的
@ | 结合 使 模板 双 螺 旋 松 旋

前 起 始 复合 物 的 形成
了 (9 遇 厌 间 必 言语 区 二 和 3
2 aa
RPA

引物 酶 与 pol ca 的 结合
引物 酶 合成 引物
RFC 的 结合

日 合
REFC 促进 polo 合成 DNA 链

pola
在 前 导 链 的 5' 端 合成 引物 前 导 链

5 RFC\、 “引物 栈 3

引物

酶 -pola

夫 PCNA 的 结合 替换 引物

pol6 结合 PCNA-RFC 复合 物 和 前 导 链 的 合成

polo 和 RFC 对 后 随 链 模板
的 结合 和 后 随 链 的 不 连续 合成
前 导 链 和 后 随 有 pola
链 合 成 继续

N\

前 导 链 网 半 片 妥 一
(后 随 链 )

polo” pol5

图 4-23 ”由 真 核 的 酶 进行 的 SV40DNA 体外 复制 的 模型

线粒体 DNA 复制 也 是 从 复制 原点 开始 ， 但 起 初 只 复制 两 条 链 中 的 一 条 链
(哺乳 动物 线粒体 的 H 重 链 )， 仅 以 H 链 为 模板 先 合 成 一 小 段 (大 约 是 500 一
600bp)， 苦 换 原 来 与 H 链 互 补 的 工 轻 链 (图 4-24)， 这 种 区 域 的 这 种 状况 称 为
D 环 。 有 线粒体 不 止 一 个 D 环 ， 这 是 多 复制 起 始 区 的 缘故 。

D 环 复制 中 的 短 链 继续 扩展 ， 政 链 的 复制 被 延伸 。 当 五 链 复制 到 2/3 时 ，LL
链 上 的 复制 原点 被 起 始 ， 以 相反 的 方向 合成 H 链 ， 最 后 形成 两 个 环 状 子 代 分 子
(图 4-24)。

4. 某 些 鸣 菌 体 的 复制

复制 产生 的 结构 取决 于 模板 和 复制 又 之 间 的 关系 。 关 键 的 特征 是 究竟 是 环 状
DNA 还 是 线 状 DNA， 以 及 复制 又 究竟 是 同时 从 两 条 链 合成 还 是 一 条 链 合成 。

一 些 DNA 分 子 仅仅 复制 一 条 链 产生 许多 拷贝 。 环 状 DNA 分 子 的 一 条 链 上
产生 一 个 切口 ， 切 口 的 3-OH 末端 被 DNA 聚合 酶 延伸 ， 新 合成 的 链 与 模板 链 互
补 结合 替换 原来 的 亲 代 链 。 这 种 结构 叫 滚 环 (rolling circle)。

滚 环 复制 在 细菌 只 菌 体 中 是 普遍 的 ， 一 个 基因 组 单位 可 以 由 滚 环 复制 产生 的
尾巴 上 切割 产生 ， 切 割 的 单 链 被 包装 成 噬菌体 。 滚 环 复 制 最 早 是 在 鸣 菌 体
GOX174 复制 研究 中 发 现 的 。 实 验 发 现 鸣 菌 体 @X174 初始 合成 的 单 链 产物 比 单位
长 度 要 长 得 多 ， 而 且 和 亲 代 分 子 是 连 在 一 起 的 。

GOX174 是 单 链 环 状 DNA 叭 菌 体 ， 该 单 链 称 为 “+ ” 链 ; 在 复制 早期 ， 以
“二 ” 链 为 模板 合成 互补 链 ， 称 为 “-- ” 链 ， 连 接 后 形成 双 链 闭合 环 状 DNA ( 称
为 复制 型 ，replication form，RF)。 由 病毒 编码 的 蛋白 质 A 结合 于 RF 型 DNA 的
复制 原点 ， 在 “+ ” 链 上 产生 切口 ; 原来 的 5 端 可 以 附着 在 膜 上 ， 留 下 3-OH
作为 引物 ， 以 负 链 为 模板 连续 合成 比 原来 的 长 度 长 几 倍 的 正 链 。 滚 环 复制 中 ， 当
双 链 DNA 以 “- ” 链 为 模板 合成 时 ，“+ ” 链 以 上 述 方式 “ 滚 出 ”。 在 OX174
中 ,“ 滚 出 ”的 “+ ” 链 按 基因 组 单位 被 切割 、 环 化 和 包装 。 而 在 其 他 一 些 鸣 菌
体 如 入 鸣 菌 体 ， 感 染 早 期 其 线 状 双 链 DNA 环 化 ，6 复制 一 次 后 进行 滚 环 复制 。
复制 原点 产生 切口 ， 以 切 日 的 3 -OH 为 引物 、 以 未 被 切 开 的 链 为 模板 进行 合成 ，
忆 一 条 链 被 “ 滚 出 "， 再 以 “ 滚 出 ”的 链 为 模板 合成 双 链 DNA; 然后 由 专 一 的 蛋
自 识 别 专 一 位 点 切割 产生 基因 组 大 小 的 片段 并 进行 包装 。

S$. 线 状 DNA 复制 问题

前 边 我 们 所 讨论 到 的 主要 是 环 状 DNA (如 大 肠 杆菌 、 线 粒 体 及 有 些 病毒 )
和 长 的 线 状 DNA 分 子 中 一 个 片段 (如 真 核 染 色 体 ) 的 复制 。 但 是 线 状 DNA 包
括 真 核 DNA， 它 们 末端 的 复制 是 如 何 进行 的 ? 这 是 下 边 我 们 要 讨论 的 问题 。

众所周知 ， 核 酸 聚合 酶 (包括 DNA 聚合 酶 和 RNA 聚合 酶 ) 都 是 从 5 一 3 人 方
回合 成 DNA。DNA 聚合 酶 从 一 条 链 的 末端 开始 以 $ >3“ 进 行 聚合 反应 ， 等 合成

"=

工 链 H 链
起 2 秆 链 上 的 原点 _]

全 玫 宣 上 > 业

TEL
) [和 > 人 -ER 厅 变 的 3 末端

新 世 链 的 合成 ,通过 替换 亲 代 链 , 而 产生 D 环

D 环
当 被 替换 的 链 通过 工 链 上 的 原点 时 ，
新 互 链 开始 合成
新 世 0
产生 完整 双 螺 旋 环
杰 放 的 基因 组 是 部 分 复制 的
业 产生 完整 双 螺 旋 环 中
新 链 中 的 缺口 被 连接 GO)

图 4-24 动物 线粒体 DNA 复制 中 维持 一 个 开放 D- 环 ， 每 条 链 具 有 各 自 的 复制 原点

"区 22

完成 后 聚合 酶 可 能 从 DNA 上 掉 下 来 ， 那 么 另 一 条 链 又 怎么 起 始 合成 呢 ? 因此 必
须 有 一 特别 的 机 制 用 于 线 状 DNA 的 复制 。 可 以 设想 几 类 模型 来 适应 线 状 DNA
末端 复制 的 需要 。

1) 将 线 状 DNA 转换 成 环 状 或 多 分 子 DNA 来 避 开 这 个 末端 复制 问题 ， 和 鸣
菌 体 和 T4 叹 菌 体 DNA 的 复制 就 是 采取 这 种 方式 。

2) 线 状 DNA 可 以 形成 一 个 发 夹 结构 ， 这 样 一 来 实际 上 就 不 存在 末端 ， 草 履
虫 属 的 线 状 线粒体 DNA 中 就 牵涉 到 连锁 的 形式 。

3) 线 状 DNA 的 末端 是 可 变 的 ， 其 末端 存在 许多 短 的 重复 序列 ， 这 些 重复 单
位 的 数目 可 以 改变 ， 可 以 增加 或 减少 几 个 重复 单位 ， 从 而 使 复制 不 必 从 准确 的 末
端 开 始 。 真 核 染 色 体 可 能 采取 这 种 方式 。

4) 最 直接 的 解决 办 法 是 蛋白 质 的 干预 ， 使 从 真正 的 末端 起 始 复制 成 为 可 能 。
好 几 种 病毒 的 线 状 核酸 的 $ 末端 碱 基 共 价 结合 有 和 蛋白质， 如 腺 病毒 DNA、 和 9
DNA 和 肴 艇 灰质 炎 病 毒 RNA。

以 腺 病毒 为 例 ， 腺 病毒 DNA 复制 实际 上 是 从 两 个 真正 的 末端 起 始 ， 利 用 链
替换 机 制 ， 在 一 端 开 始 合成 一 条 链 替 换 原 来 的 与 其 模板 配对 的 那 条 链 。 当 复制 又
到 达 另 一 端 时 ， 被 替换 的 那 条 旧 链 作为 一 个 自由 单 链 被 释放 出 来 ; 这 种 自由 单 链
末端 之 间 有 短 的 碱 基 互 补 顺序 ， 可 形成 锅 柄 式 的 结构 ， 双 链 区 作为 复制 原点 可 独
立地 复制 该 自由 单 链 (图 4-25)。

有 几 种 病毒 使 用 以 下 这 种 复制 机 制 ， 即 有 一 种 蛋白 质 分 别 结合 在 DNA 分 子
两 个 末端 。 腺 病毒 中 有 一 种 SSKDa 的 蛋白 质 (terminal protein， 末 端 蛋白 ) 通过
磷酸 二 酯 键 跟 丝氨酸 的 结合 而 与 成 熟 病毒 的 DNA 相连 接 (图 4-26)。 同 样 的 情
襄 也 在 叹 菌 体 电 9 中 发 现 。 在 兰 人 灰 质 炎 病毒 中 ， 是 一 种 只 有 22 个 氨基 酸 的
Vpg 蛋白 ， 能 通过 酷 氨 酸 的 羟基 与 9 末端 碱 基 相 连接 。 这 类 连接 的 蛋白 均 是 病
毒 编码 的 。

在 腺 病毒 复制 时 DNA 链 上 结合 的 蛋白 质 是 80kDa， 比 从 病毒 粒子 中 分 离 的
这 种 蛋白 质 要 大 。 这 种 80kDa 蛋白 质 是 DNA 复制 起 始 相关 和 蛋白， 在 病毒 成 熟 过
程 中 则 被 切割 成 较 小 的 分 子 (5SkDa) 留 在 病毒 粒子 中 。

蛋 自 质 对 DNA 的 接触 是 如 何 克 服 线 状 DNA 分 子 复制 的 起 始 问题 呢 ? 体外
实验 发 现 ，80kDa 蛋白 能 与 腺 病毒 感染 细胞 的 抽 提 物 中 的 dCTP 结合 ， 同 时 这 种
量 自 也 与 另 一 140kDa 的 DNA 聚合 酶 蛋白 紧密 结合 ， 这 些 结果 引 出 了 图 4-27 中
的 起 始 模型 。

此 80kDa 蛋白 与 140kDa 的 聚合 酶 形成 复合 物 ， 该 复合 物 携 带 着 dCTP 结合
到 腺 病毒 DNA 的 末端 。dCTP 的 自由 3-OH 末端 用 以 起 始 在 DNA 聚合 酶 作用 下
的 延伸 ， 产 生 一 个 5 末端 连接 有 C 的 新 链 。 (这 个 反应 实际 上 牵涉 到 DNA 上 末
端 结合 蛋白 的 替换 而 不 是 重新 结合 ， 腺 病毒 DNA 的 $ 末端 已 被 上 一 轮 复制 时 的 末

9

线 状 DNA

DNA 的 合成 在
左边 5' 端 起 始

复制 又 前 进

当 复 制 叉 到 达 末
端 时 单 链 被 替换

末端 碱 基 配 对 形成 了
双 螺 旋 复制 原点 3，

DNA 的 合成 前 进 3 TTTT~

3 二 二 二 二 上 二 才 二 二 二 考 上 二 上 二 上 二 上 一 -LS

图 4-25 ” 腺 病毒 DNA 复制 从 两 端 分 别 起 始 ， 并 通过 链 蔡 换 前 进

上 丝氨酸 人
N 本
多 肽 链 一 。 改 昌 一 疏 多 及 链

人
本
|

|
腺 病毒 DNA

图 4-26， 腺 病毒 DNA 每 个 5 磷酸 末端 均
与 SSkDa Ad- 结 合 蛋白 中 的 丝氨酸 共 价 和 连接

. 134 ，

端 结合 蛋 昌 所 结合 ， 在 新 一 轮
的 复制 时 ， 新 的 末端 结合 蛋白
蔡 换 旧 的 末端 结合 蛋白 。)

80kDa 末端 结合 蛋白 结合
到 DNA 末端 的 9 一 18bp 之 间
的 区 域 ， 这 个 核心 序列 也 同样
在 宿主 核 DNA 中 发 现 ， 位 于
17 一 18bp 之 间 的 侧 旁 序列 对 宿
主 和 蛋白 核 因子 1 的 识别 结合
必须 的 ， 这 种 结合 对 复制 的 起
始 同样 重要 ; 因此 ， 起 始 复合
物 可 能 在 DNA 末端 上 9 一 48bp
之 间 形 成 ， 离 开 末 端 有 一 个 固
定 的 距离 。

ATTRA
二
四- 全 是 LEN 过 DNA 聚 忠 酶
忆 大 让 六 全 下 让 下 六
也 SS 入

图 4.27 腺 病毒 未 端 蛋白 结合 于 DNA 的 5 末端 为 新 DNA 链 的 合成 提供 一 个 COH 作 引 物

四 、 复 制 的 延伸 和 终止

链 的 延伸 是 在 DNA 聚合 酶 催化 下 进行 的 ， 它 可 在 引物 的 3 -OH 上 一 个 接 一
个 地 按 模 板 要 求 延 伸 新 生 链 。 大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 III 是 延伸 DNA 的 主要 酶 。
在 复制 中 由 DNA 聚合 酶 [的 $ 一 3“ 的 外 切 核酸 酶 活性 去 除 引 物 RNA， 由 其 聚合
活性 填补 去 除 引 物 的 空缺 。 连 接 酶 连接 切口 ， 拓 扑 异 构 酶 则 使 DNA 分 子 分 离 。

环 状 双 链 DNA 双向 复制 中 存在 一 个 问题 : 复制 在 什么 地 方 终止 ?

一 般 来 说 ， 链 的 终止 不 需要 特定 的 信号 ， 也 不 需要 特殊 的 蛋白 质 来 参与 。 双
回 等 速 复制 的 环 状 双 链 DNA 分 子 其 复制 终点 就 在 离 其 复制 起 点 180" 的 位 置 上 。
缺失 突变 的 入 鸣 菌 体 DNA 的 复制 证 明了 这 一 点 。

大 肠 杆菌 DNA 复制 的 终止 具有 自己 的 特征 。 一 般 从 复制 原点 开始 在 各 复制

”全 了 下

染色 体 一 半 的 位 点 两 复制 又 相遇 ， 并 且 复 制 在 此 终止 。 一 个 有 趣 的 问题 是 ， 由 什
么 东西 来 保证 复制 DNA 正确 穿 过 复制 叉 相遇 的 区 域 呢 ?

研究 发 现 大 肠 杆菌 上 存在 引起 终止 的 顺序 叫 ter 位 点 ， 一 个 ter 位 点 含有
23bp 左右 的 短 序列 ， 在 体外 可 引起 复制 终止 。ter 位 点 序列 只 引起 一 个 方向 的 终
止 。 终 止 还 需 ixs 基因 编码 的 蛋白 质 ， 该 蛋 自 识别 ter 位 点 一 致 性 序列 并 与 之 结
合 防止 复制 又 的 进程 (图 4-28)。

2 攀
terD,terA
终

复制 又 1

一

入 terC,terB
ax]

估 2 0 -人参
人 2
4

复制 又 2 原点 复制 又 1

图 4-28 政 .coli 中 复制 终止 区 位 于 复制 叉 实际 相遇 处 的 两 侧

大 肠 杆菌 染色 体 有 两 个 分 别 对 应 于 两 个 复制 又 的 终止 区 (terD，terA 和
terC，terB)， 分 别 位 于 相遇 位 点 两 侧 100bp 的 地 方 。 每 一 个 终止 区 为 一 个 方向 移
动 的 复制 又 所 特有 ， 而 且 以 这 种 方式 安排 每 个 复制 又 将 必须 通过 另 一 个 复制 又 的
终止 区 以 便 达 到 其 敏感 的 终止 区 。 这 种 存在 两 个 终止 区 的 安排 使 即使 由 于 某 种 原
因 一 个 复制 又 变 慢 ， 另 一 较 快 的 复制 又 也 会 在 其 终止 区 等 待 慢 的 复制 叉 的 到 达 。

第 四 节 DNA 复制 的 调控
分 子 生物 学 家 们 并 不 满足 于 对 DNA 复制 过 程 的 观察 和 描述 ， 而 是 希望 了 解

复制 过 程 中 各 种 酶 和 蛋白 质 的 作用 ， 它 们 与 DNA 的 关系 以 及 复制 是 怎样 受到 调
136 ，

节 和 控制 的 。

现 以 入 DNEA 为 例 来 说 明 原 核 生 物 中 DNA 复制 是 怎样 调节 的 。

喉 菌 体 入 以 及 其 他 若干 种 温和 鸣 菌 体 是 非常 令 人 感 兴趣 的 。 因 为 它们 具有 进
行 自 主 复制 和 处 于 溶 原状 态 两 种 方式 ， 所 以 这 类 温和 性 鸣 菌 体 成 为 我 们 了 解 原核
生物 中 DNA 复制 调控 过 程 的 良好 实验 材料 。

Jacob 等 人 首先 研究 了 复制 子 的 调节 ， 发 现 其 中 有 一 个 特定 的 复制 起 始点 可
以 作为 一 个 整体 而 被 复制 。 最 简单 的 复制 子 之 一 是 入 噬菌体 中 占 10% 的 一 段
DNA， 称 为 Xdtv。xdv 是 人 工 制造 的 环 状 DNA (图 4-29)。 它 包括 O 、P 、cT、
OR PR Cro、cIT、o、O、P 等 基因 。 其 中 cIT 不 是 自我 复制 所 必需 的 基
因 ,， 但 OR、PR、Cro、O、P、or 基因 都 是 必 不 可 少 的 。xdv 与 转录 的 控制 基
因 紧 挨 在 一 起 。 这 是 一 个 自我 复制 子 ， 调 控 是 通过 Cro 基因 产生 的 Cro 蛋白 结合
在 PROR 处 ， 阻 遏 Cro 本 身 的 产生 ， 同 时 也 能 调节 P、O 两 个 产物 的 生成 ， 因 为
这 两 个 基因 也 是 从 PROR 开始 转录 的 。 基 因 O 和 的 产物 是 复制 的 引发 蛋白 ，
和 基因 Cro 是 同步 转录 的 。 从 PR 转录 一 次 ， 不 仅 产生 新 的 O 和 了 蛋白 使 DNA
复制 一 次 ， 而 且 产生 更 多 的 Cro 蛋白 ， 使 其 浓度 增加 ， 作 为 一 个 阻 遏 蛋白 阻止 了
新 的 0 和 了 P 和 蛋白 的 产生 (图 4-29)。

O O
了 玉 开
2

图 4-29 XDNA 的 复制 控制 区

MDNA 带 有 较 多 的 基因 ， 因 此 复制 的 调控 比较 复杂 。 现 在 已 经 明确 入 DNA
进入 大 肠 杆 菌 后 不 久 ， 细 菌 内 就 会 产生 若干 种 阻 遏 蛋白。 它们 是 <IT 基因 和 Cro
基因 的 产物 ， 能 作用 在 入 DNA 的 OR 和 Oi 位 点 上 阻止 XDNA 的 转录 ， 阻 遏 蛋白
的 多 少 可 以 通过 调节 O 蛋白 的 含量 来 决定 DNA 采取 哪 一 种 复制 方式 。 在 寄主 受
到 吹 菌 体 入 感染 的 早期 O 蛋白 浓度 较 高 ， 这 时 入 DNA 可 以 双向 复制 。 在 后 期 O
蛋 自 浓度 较 低 ， 则 入 DNA 以 单 向 的 滚 环 方式 复制 。 早 期 DNA 的 复制 以 6 方式
进行 。 这 时 复制 需要 O 和 了 产物 ， 以 及 寄主 的 蛋白 如 dnaB 蛋白 、RNA 聚合 酶 、
引发 酶 和 DNA 聚合 酶 II 等 。 当 入 DNA 整合 到 寄主 染色 体 上 时 ， 则 失去 自主 复
制 能 力 ， 随 寄主 DNA 复制 而 复制 。

通过 对 吹 菌 体 和 病毒 的 研究 ， 人 们 现在 对 原核 生物 中 DNA 复制 的 调控 过 程
有 了 一 些 了 解 ， 当 然 原 核 生 物 DNA 复制 要 比 病毒 和 鸣 菌 体 复杂 得 多 。 原 核 生物
生长 和 莹 殖 可 以 有 不 同 的 速率 ， 这 取决 于 培养 的 条 件 ; 但 是 一 旦 DNA 开始 复
制 ，DNA 链 的 延伸 速率 却 是 相对 恒定 的 。

真 核 生 物 DNA 的 复制 又 比 原核 生物 复杂 得 多 ， 至 今 我们 还 不 清楚 真 核 生物

” 灌 办 。

中 DNA 复制 是 怎样 控制 的 ; 为 什么 胚胎 细胞 会 迅速 地 生长 而 成 年 细胞 生长 很
慢 ， 有 的 成 年 细胞 甚至 几 十 年 里 都 不 生长 ; 什么 因素 会 使 一 个 正常 细胞 转变 为 亚
性 生长 的 肿瘤 细胞 ， 这 些 都 是 生命 世界 向 人 类 提出 的 挑战 性 问题 。 近 年 来 真 核 生
物 DNA 的 复制 和 基因 的 调控 正 受到 越 来 越 多 的 重视 ， 很 可 能 这 方面 的 研究 会 为
细胞 分 化 、 再 生 、 衰 老 等 现象 提供 说 明 ， 也 可 能 为 肿瘤 的 预防 和 治疗 提供 有 价值
的 线索 ， 从 而 为 生物 世纪 的 来 临 铺 平 道路 。

8

第 五 章 _DNA 损伤 修复 和 基因 突变

紫外 线 引起 的 DNA 损伤 修复 大 臻 通过 四 种 途径 : @ 四 在 损伤 部 位 就 地 修
复 一 光复 活 (photoreactivation); @ 取 代 损 伤 部 位 一 一 暗 修复 或 切除 修复 (ex-
cision repair); @@ 越 过 损伤 部 位 而 进行 修复 重组 修复 (recombination repair) ;
图 应 急 修 复 一 一 SOS 修复 。 这 四 种 修复 途径 如 图 $-1 所 示 。 在 光复 活 修 复 中 由 光
供 能 ， 而 其 他 三 种 修复 中 由 ATP 水 解 供 能 。 光 复活 和 切除 修复 是 修复 模板 ， 重

二 聚 体
本
RS
一 一人 下
光 激 活 切除 修复 复制 后 重组 SOS 修复
| | |
光 激 活 酶 结合 切 开 复制 复制
-和 雹 本
本 一 一 上
| |
光 吸 收 切 开 二 聚 体 。。 修复、 复制 和 切除 重组 二 聚 体 对 面 插入 任何 碱 基
人 na
一 和 一 本 < ER ES
NS RS ER
| | |
酶 释放 连接 修复 复制 下 一 轮 复 制
天 计 十 的 机 小 -二 上 纺 二 寺 :
SSs
| | | 突变
复制 复制 下 一 轮 复制 +

5-1 修复 喀 啶 二 聚 体 的 四 种 主要 机 制

”全 9“

组 修复 是 形成 新 模板 ，SOS 修复 则 为 了 形成 一 个 不 中 断 的 模板 来 代替 有 害 的 模板
从 而 不 顾 由 此 带 来 的 危险 。SOS 修复 是 唯一 导致 突变 的 一 种 修复 系统 。

基因 突变 的 研究 很 早 就 和 DNA 损伤 以 及 损伤 的 修复 的 研究 相伴 随 。 诱 变 的
研究 从 辐射 的 诱 变 作 用 开始 。 说 明 辐 射 的 诱 变 机 制 的 最 早 的 理论 是 所 谓 的 靶子 学
说 ， 它 认为 辐射 的 杀伤 和 诱 变 作用 都 是 辐射 对 于 细胞 中 的 某 些 靶子 击 中 的 结果 。

光复 活 作 用 的 发 现 使 人 们 认识 到 紫外 线 所 造成 的 DNA 损伤 并 不 就 是 突变 本
身 。 这 些 损伤 无 非 是 前 突变 ， 前 突变 通过 某 些 代谢 过 程 才 成 为 突变 或 导致 死亡 。
以 后 又 陆续 发 现 其 他 的 DNA 损伤 修复 作用 ， 这 些 修 复 作 用 的 研究 都 有 助 于 对 基
因 突 变 机 制 的 了 解 。

对 于 某 些 诱 变 剂 (如 $- 省 脱氧 尿 喀 啶 、 亚 硝酸 等 ) 所 造成 的 前 突变 来 说 ，
前 突变 通过 DNA 复制 而 形成 突变 。 这 些 前 突变 损伤 起 着 引起 编码 错误 的 作用 。
这 种 诱 变 作用 可 以 称 为 错误 编码 诱 变 (miscoding mutagenesis)。
” 对 于 另 一 些 诱 变 剂 〈 例 如 紫外 线 、 丝 裂 霉 素 C) 所 造成 的 前 突变 来 说 ， 前 突

变通 过 SOS 反应 的 复杂 过 程 而 形成 突变 。 这 些 前 突变 不 起 编码 作用 ， 这 种 诱 变
作用 可 称 为 非 编 码 诱 变 (noncoding mutagenesis) 。

20 世纪 40 年 代 以 前 对 于 突变 的 研究 几乎 仅 限 于 真 核 生物 。40 年 代 中 期
M.Demerec 等 在 大 肠 杆 菌 中 进行 了 系统 的 基因 突变 研究 。20 世纪 50 年 代
S.Benzer 进行 了 叭 菌 体 的 基因 突变 的 研究 。 在 DNA 双 螺 旋 结 构 理论 的 推动 下 ，
下 . Freese 在 1969 年 提出 基因 突变 的 碱 基 置 换 理 论 ， 第 一 次 在 分 子 水 平 上 说 明了
基因 突变 的 机 制 。

20 世 纪 70 年 代 以 来 由 于 分 子 遗传 学 的 发 展 ， 很 多 问题 已 初步 得 到 半 明 。
DNA 损伤 修复 和 基因 突变 的 关系 ， 特 别 是 应 急 修 复 (SOS) 方面 正在 进行 广汉
深入 的 研究 ， 这 方面 的 研究 不 但 将 加 深 我 们 对 于 DNA 损伤 修复 和 突变 机 制 的 认
识 ， 而 且 可 能 对 于 癌变 的 认识 也 会 有 所 帮助 。

第 一 他， 如 免 差错 的 DNA 损伤 修复
一 、 光 复活 作用 和 切除 修复

1927 年 发 现 射线 诱发 基因 突变 ， 第 二 年 就 发 现 了 260nm 波长 的 紫外 线 具 有
最 强 的 杀菌 力 ， 而 这 一 波长 正 是 味 哈 和 喀 啶 吸收 最 强 的 波长 ， 因 而 认识 到 DNA
分 子 受 到 损伤 是 导致 细菌 死亡 的 主要 原因 。1944 年 通过 细菌 转化 研究 证 明了
DNA 是 遗传 物质 ， 因 而 进一步 认识 到 遗传 物质 的 损伤 是 导致 死亡 的 主要 原因 。

1944 年 发 现 经 紫外 线 照 射 后 的 细菌 可 以 由 可 见 光 的 照射 而 提高 存活 率 ， 说
明 受 到 照射 的 DNA 可 以 被 修复 。1950 年 病毒 学 家 R. Dulbeco 发 现 被 紫外 线 照 射
的 叭 菌 体 所 感染 的 细菌 用 强 的 可 见 光照 射 ， 存 活 的 噬菌体 数 便 大 为 增加 ， 这 种 间

"140 ，

接 的 DNA 损伤 修复 效应 暗示 具有 DNA 损伤 修复 功能 的 酶 可 以 被 可 见 光 所 激活 。
体外 实验 结果 接着 证 实 了 这 一 结论 。

R.B.Setlow 在 1954 年 首先 报道 了 细菌 的 DNA 经 紫外 线 照 射 后 出 现 的 损伤
主要 是 形成 喀 啶 - 喀 啶 〈 环 丁 烷 ) 二 聚 体 ， 尤 其 以 形成 胸腺 喀 啶 二 聚 体 为 主 。 光

复活 酶 则 作用 于 二 聚 体 而 使 它 复原 为 喀 喧 。

。 同年 R.B.Setlow 又 发 现 大 肠 杆菌 的 突变 型 uvrA、uvrB 和 uvrC 对 于 紫外 线
的 杀伤 作用 格外 敏感 。 为 了 说 明 原 因 ， 他 把 ?H- 胸 腺 啶 标记 的 uvr 突变 型 和 野
生 型 细菌 用 紫外 线 照射 ， 培 养 一 段 时 间 后 分 别 测定 它们 的 胸腺 喀 啶 二 聚 体 的 量 ，
发 现 uvr 突变 型 和 野生 型 细菌 的 培养 物 的 总 二 聚 体 的 量 并 无 区 别 ， 然 而 突变 型 的
培养 液 中 的 二 聚 体 的 量 显然 比 野 生 型 的 少 。 这 说 明细 菌 除了 可 以 通过 光复 活 作用
而 使 二 聚 体 复 原 以 外 ， 还 可 以 通过 把 二 聚 体 切除 来 修复 受到 损伤 的 DNA。 随 后
证 明了 worB、zwmrC 编码 内 切 核 酸 酶 。 另 外 一 些 实验 证 明了 被 切除 的 部 分 必须
通过 DNA 合成 来 修补 。

了 解 得 最 清楚 的 切除 修复 的 例子 是 大 肠 杆菌 的 uvrABC 系统 。 图 $-2 前 明了
uvrABC 系统 是 如 何 对 损伤 的 DNA 进行 修复 的 。 首 先 两 分 子 的 Uvr A 和 一 个 分
子 的 UvrB 形 成 复合 物 ， 然 后 结合 到 DNA 上 ， 复 合 物 的 形成 和 与 DNA 的 结合
都 需要 ATP。

UvrA-Uvr B 复合 物 似乎 是 首先 与 无 损伤 的 DNA 结合 并 沿 着 DNA 双 螺 旋转
移 直 到 一 个 复合 物 可 以 识别 的 变 弯曲 的 部 位 ; 沿 双 螺 旋 的 转移 过 程 同 样 需 要
ATP。 与 UvrA-UvrB 复合 物 结 合 的 DNA 损伤 区 在 ATP 作用 下 ， 构 型 变化 使
DNA 骨 架 产生 弯曲 。 当 UvrA 二 聚 体 解 离 后 ， 具 有 内 切 核酸 酶 活性 的 UvrC 蛋白
结合 到 损伤 位 点 。UvrC 和 弯曲 的 DNA 的 相互 作用 被 认为 是 开放 DNA 中 的 空间
人 允许 酶 的 残 基 进 入 其 靶 位 点 的 过 程 (图 $5-3)。 切 割 的 准确 位 点 已 经 测定 ，Uvr C
切割 喀 啶 二 聚 体 两 侧 的 两 个 磷酸 二 酯 键 : 一 个 位 于 $ 端 距 损伤 处 8 个 核 苷 酸 处 ，
另 一 个 位 于 3 端 距 损伤 处 4 一 $ 个 核 苷 酸 处 。 当 损伤 链 的 两 个 位 点 被 切割 之 后 ，
这 个 被 切 下 的 片段 和 UvrBC 复合 物 一 起 被 DNA 解 旋 酶 移 去 并 且 被 降解 ， 链 中 的
缺口 通过 DNA 聚合 酶 I 和 连接 酶 的 联合 作用 来 修复 。

UvrABC 也 能 切除 丝 裂 霉 素 C、 补 骨 脂 素 和 亚 硝 酸 所 造成 的 DNA 损伤 。 对
于 真 核 生物 来 说 ， 紫 外 线 等 对 遗传 物质 造成 的 损伤 和 原核 生物 没有 多 大 区 别 ， 不
过 由 于 真 核 生 物 中 的 染色 体 蛋 白质 与 DNA 构成 了 复杂 结构 ， 所 以 修复 过 程 也 比
原核 更 为 复杂 ， 特 别 是 涉及 多 种 酶 的 切除 修复 更 是 如 此 。

20 世纪 50 年 代 发 现 了 酵母 的 光复 活 现象 ， 后 来 发 现 了 酵母 有 关 光 复活 的 基
因 ，70 年 代 又 发 现 了 切除 修复 现象 。

着 色 性 干 皮 症 〈 一 种 人 的 遗传 性 疾病 ) 是 典型 的 由 于 切除 二 聚 体 的 能 力 的 缺
损 而 带 来 的 疾病 ， 而 且 主 要 是 由 于 内 切 核 酸 酶 功能 丧失 的 结果 。 通 过 测定 异 核 体
细胞 的 修复 功能 ， 可 以 把 干 皮 症 基因 区 分 为 7 个 互补 群 ， 这 说 明 真 核 生 物 的 切除

. 141 ，

移 ATP ADP+Pi

-一 一 > 降解 成 单 核 背 酸

| DNA 聚合 酶

(8) DNA 连接 酶

图 $-2 由 开 .coi UvrABC 进行 的 DNA 切除 修复 的 机 制

.142 ，

T-T 二 聚 体 腺 嘎 叭

5-3 根据 X 射 线 结晶 学 分 析 叭 菌 体 T4 内 切 核 酸 酶 V 和 含有
TI 二 聚 体 的 13bp DNA 片段 形成 的 复合 物 模型

修复 系统 可 能 比 原核 生物 更 为 复杂 。

从 切除 的 机 理 来 看 ， 整 个 过 程 也 显得 更 为 复杂 。 因 为 在 核 小 体 部 分 的 二 聚 体
DNRA 损伤 切除 前 ， 核 小 体 结构 必须 先行 解 开 而 使 损伤 部 分 暴露 ， 损 伤 部 分 经 切
除 并 进行 修复 合成 以 后 又 重新 装配 成 核 小 体 。

二 、 重 组 修复

A.J.Clark 等 在 1965 年 发 现 了 大 肠 杆 菌 的 重组 缺陷 型 recA， 并 且 发 现 recA
对 于 紫外 线 的 杀菌 作用 格外 敏感 。 不 过 recA 和 uvr 突变 型 不 同 ， 它 和 野生 型 一
样 能 进行 光复 活 修复 和 切除 修复 ， 说 明细 菌 除了 光复 活 修复 和 切除 修复 以 外 还 有
另 一 些 修复 功能 ，recA 细菌 由 于 这 种 修复 功能 的 丧失 而 使 它 对 紫外 线 格外 敏感 。

把 uvr 突变 型 细菌 用 紫外 线 照射 并 在 3H- 胸 腺 喀 啶 核 苷 的 培养 基 中 培养
10min， 提 取 DNA 并 在 碱 性 蔗糖 梯度 溶液 中 离心 ， 发 现 它 比 未 经 照射 的 细菌
DNA 沉降 得 慢 ， 但 经 70min 培养 后 两 者 DNA 的 沉降 速度 相同 。 对 于 上 述 现象 的
解释 是 DNA 复制 过 程 中 新 合成 的 单 链 在 二 聚 体 的 位 置 留 下 空隙， 因此 紫外 线 照
射 后 最 初 合成 的 单 链 是 不 连续 的 ， 在 进一步 培养 过 程 中 由 于 发 生 了 重组 而 出 现 连
续 的 子 链 ， 这 就 使 得 它 的 沉降 趋 于 正常 。

实验 结果 还 说 明 在 DNA 复制 过 程 中 二 聚 体 会 随机 地 分 布 到 新 合成 的 子 链
中 ， 与 此 同时 切除 修复 也 继续 进行 。 可 见 重组 修复 并 不 能 除去 二 聚 体 ， 它 不 过 能

.143

使 细菌 在 依赖 切除 修复 来 消除 所 有 的 二 聚 体 之 前 便 能 出 现 正常 复制 的 细胞 。

真 核 生物 中 也 发 现 有 类 似 的 现象 。 可 是 真 核 生物 有 多 个 复制 起 点 ， 每 个 复制
单位 进行 双向 复制 ， 因 而 在 正常 复制 过 程 中 DNA 子 链 本 来 就 是 一 段 一 段 地 连接
而 成 的 ， 这 为 实验 结果 的 解释 带 来 了 困难 ， 因 此 关于 真 核 生 物 中 的 重组 修复 还 有
争论 。

三 、N- 糖 音 酶 和 DNA 损伤 修复

DNA 聚 合 酶 [和 聚合 酶 III 在 DNA 复制 过 程 中 对 于 dTTP 和 dUTP 的 分 辩
能 力 很 差 ， 因 此 少量 dUTP 可 能 挫 入 到 DNA 分 子 中 去 。 大 肠 杆菌 虽 然 具 有
dUTPase， 它 能 使 dUTP 变 为 dUMP， 但 是 由 于 它 的 效率 很 低 ， 所 以 仍然 不 能 完
全 避免 dUTP 的 摊 入 。 此 外 胞 旷 啶 经 脱毛 基 作用 后 可 以 形成 尿 喀 啶 。 对 于 DNA
分 子 上 出 现 的 尿 啶 ， 细 胞 中 的 尿 喀 喧 N- 糖 苷 酶 〈uracil Nglycosylase) 可 以 把
它 除 去 。

N- 糖 苷 酶 有 多 种 。 大 肠 杆 菌 的 3- 甲 基 腺 唆 叭 -DNA 糖苷 酶 II (3-methylade-
nie-DNAglycosylase II) 是 一 种 诱导 酶 ， 它 的 专 一 性 不 强 ， 对 于 7- 甲 基 乌 味 哈 、3-
甲 基 乌 叶 哈 和 7- 甲 基 腺 味 叭 也 有 作用 。 它 由 基因 akA 所 编码 。 这 种 诱导 不 依赖
于 SOS 反应 。

另外 一 种 修复 烷 基 化 作用 所 造成 的 DNA 损伤 的 诱导 酶 是 0.6- 烷 基 鸟 味 叭 -“

DNA-DNA- 烷 基 转 移 酶 ， 这 也 是 一 种 与 SOS 反应 无 关 的 诱导 作用 产生 的 修复 功
能 。

此 外 还 有 一 种 糖苷 酶 3- 甲 基 腺 哄 叭 -DNA 糖苷 酶 I， 它 专门 作用 于 3- 甲 基 腺
味 哈 ， 为 iag 基因 所 编码 。 它 在 大 肠 杆菌 中 不 需 诱 导 便 能 行使 修复 功能 。

过 去 认为 胸腺 喀 啶 二 聚 体 的 修复 与 糖 基 化 酶 无 关 ， 近 年 来 的 研究 结果 说 明 在
二 聚 体 切除 修复 中 同样 涉及 N- 糖 苷 酶 和 Ap 内 切 核酸 酶 (apurinic endonuclease，
Ap endonuclease)。

修复 作用 首先 通过 N- 糖 苷 酶 的 作用 把 $ 端的 胸腺 喀 啶 和 五 碳 糖 之 间 的 N- 糖
苷 键 打开 ， 然 后 在 Ap 内 切 核酸 酶 的 作用 下 把 无 味 吟 位置 的 3 端的 磷酸 二 酯 键 打
开 ， 进 一 步 又 分 解 不 带 有 碱 基 的 磷酸 脱氧 核糖 ， 然 后 在 聚合 酶 I[ 和 连接 酶 的 作用
下 完成 修复 作用 。

四 、 校 读 作用

在 DNA 复制 过 程 中 偶然 地 可 能 把 一 个 不 正常 的 核 苷 酸 加 到 3-OH。 实际 十
大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 III 的 w 亚 基 在 体外 复制 系统 的 错误 挫 入 率 为 17104， 大 肠
杆菌 一 个 基因 的 大 小 平均 为 103bp， 其 复制 时 的 错误 挫 入 率 为 /10， 然 而 细菌 细

. 144 ，

胞 检测 出 的 突变 频率 要 低 得 多 ， 聚 合 10? 个 核 苷 酸 只 有 一 个 错误 ， 也 就 是 说 每 个
基因 每 世代 的 突变 频率 为 10 一 10 。

这 种 在 体内 复制 准确 度 的 增加 主要 是 由 于 大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 的 校 读 功
能 。 大 肠 杆菌 DNA 聚合 酶 工 的 3 一 外 切 活 性 可 将 正在 合成 中 的 引物 - 模板 复
谷物 的 新 链 3“ 未 端的 错 配 碱 基 切 除 。DNA 聚合 酶 III 核心 酶 的 s 亚 基 也 有 这 种 功
能 。 当 DNA 合成 期 间 一 个 不 正确 的 碱 基 被 挨 入 ， 聚 合 酶 的 聚合 活性 暂停 ， 将 正
在 增长 的 链 的 3 末端 转移 到 其 外 切 活 性 位 点 ， 错 配 的 碱 基 在 此 被 除去 ， 然 后 该
孚 未 端 再 被 转移 到 聚合 酶 活性 位 点 ， 在 此 正确 的 碱 基 被 掺 入 (图 5-4)。 校 读 功 能
是 所 有 DNA 聚合 酶 的 一 个 性 质 。 动 物 细胞 中 DNA 聚合 酶 3》 和 也 具有 校 读 活
性 ， 但 DNA 聚合 酶 w 无 此 校 读 活 性 ， 这 些 功能 似乎 是 所 有 细胞 为 避免 过 多 的 遗
传 损 伤 而 必 不 可 少 的 。

大 拇指

图 5-4 DNA 聚 合 酶 校 读 功能 示意 模型
所 有 的 DNA 聚 合 酶 都 有 类 似 的 三 维 结构 ， 它 们 装配 成 一 个 半 张 开 的 右手 形状 。 手 指 和 模板 的 单 链 片段
结合 ， 聚 合 酶 在 手指 与 手掌 交界 处 发 挥 作用 ， 当 一 正确 碱 基 挨 入 到 增长 链 的 3 末端 ，3“ 末 端 留 在 聚合
活性 位 点 。 当 不 正确 的 碱 基 摊 入 时 ， 聚 合 活性 停止 ，3“ 未 端 被 转移 到 3 -5' 外 切 活 性 位 点 ， 错 配 碱 基 被
除去 后 又 回 到 聚合 活性 位 点 继续 进行 链 的 延伸 。

喉 菌 体 T4 的 一 个 增 变 基因 便 是 编码 聚合 酶 I 的 基因 (基因 43 ) 发 生 突变 的
结果 。

大 肠 杆 菌 另 一 个 增 变 基因 da 编码 腺 味 吟 甲 基 化 酶 (DNA adenine Imethy-
lase)， 这 一 事实 说 明 腺 味 叭 甲 基 化 酶 是 其 校 读 系 统 的 一 个 成 员 。 关 于 dax + 基因
在 校 读 中 所 起 的 作用 以 及 da 是 增 变 基因 的 解释 是 这 样 的 : DNA 的 甲 基 化 是 限
制 修饰 功能 的 一 部 分 ， 甲 基 化 发 生 在 DNA 合成 以 后 ， 细 胞 中 的 DNA 都 是 已 经
在 前 一 轮 复制 中 被 甲 基 化 了 的 。 新 合成 的 DNA 逐步 被 甲 基 化 ， 越 是 靠近 复制 又
处 甲 基 化 程度 越 低 ， 错 配 修复 系统 能 识别 甲 基 化 和 未 甲 基 化 的 DNA。 不 正常 的
核 苷 酸 不 能 和 正常 的 核 苷 酸 配 对 ， 因 此 被 聚合 酶 I 识别 并 被 切除 。 可 是 对 于 某 些
不 正常 的 核 苷 酸 来 说 ， 聚 合 酶 不 能 把 它 和 正常 的 核 苷 酸 区 别 开 来 ， 在 这 种 情况 下
聚合 酶 I 就 有 可 能 把 正常 的 核 苷 酸 切 除 而 造成 校 读 的 错误 。 错 配 修复 系统 能 识别

. 145

甲 基 化 和 未 甲 基 化 的 DNA， 这 就 保证 了 切除 的 核 苷 酸 是 新 合成 的 ， 即 不 是 正常
的 核 苷 酸 。 由 于 这 一 缘故 ， 失 去 甲 基 化 能 力 的 细菌 更 容易 发 生 突变 ， 这 就 是
dazz 是 增 变 基 因 的 原因 。

细菌 和 真 核 细 胞 都 具有 错 配 修复 系统 ， 可 以 识别 并 修复 除 CC 以 外 的 所 有

单 碱 基 错 配 ， 同 样 也 可 以 修复 一 个 小 的 插入 和 缺失 。 大 肠 杆 菌 中 甲 基 化 指导 的 错

配 修复 系统 常 被 归 类 为 Mut HLS 系统 。
在 大 肠 杆菌 DNA 中 ，GATC 短 序列 中 的 A 在 第 6 位 被 甲 基 化 ， 在 合成 过 程
中 DNA 聚合 酶 将 一 个 未 甲 基 化 的 A 挫 入 到 DNA 中 ， 新 复制 的 DNA 中 只 有 亲 代
链 中 的 A 是 被 甲 基 化 的 。 子 代 链 中 GATC 序列 中 的 A 到 几 分 钟 后 被 专 一 性 酶 即
Dam 甲 基 转 移 酶 ( Dam methyltransferase) 甲 基 化 ， 在 后 随 期 中 ， 新 复制 的
DNA 含有 半 甲 基 化 的 GATC 序列 :
CH3
5 一 G 一 A 一 T 一 C 一 3 亲 代 链
3 一 C 一 工 一 A 一 G 一 5 子 代 链
大 肠 杆菌 的 一 种 蛋白 质 MutH 专 一 性 地 与 半 甲 基 化 的 子 代 链 结合 。 如 果
DNA 复制 期 间 发 生 错 误 从 而 引起 在 GATC 附近 产生 错 配 ， 另 一 种 蛋白 MutS 则
结合 到 这 个 不 正常 配对 的 片段 上 (图 S-$)。MutSs 的 结合 会 引起 MutL 的 结合 ，
MutL 是 一 个 连接 蛋白 ， 它 可 以 与 附近 具有 MutH 的 MutS 蛋白 连接 。 这 种 交叉

连接 可 以 激活 MutH 潜在 的 内 切 核酸 酶 活性 从 而 专 一 性 地 切割 未 被 甲 基 化 的 子 代

链 ， 随 之 这 个 含有 错 配 碱 基 的 子 代 链 会 被 切除 而 正确 的 DNA 序 列 则 取而代之 。
缺乏 MutH、MutS 或 MutL 和 曙 白 的 大 肠 杆菌 的 自发 突变 频率 比 野生 型 要 高 。
当然 不 能 合成 Dam 甲 基 转 移 酶 的 菌株 的 自发 突变 率 也 较 高 。
真 核 生 物 同 样 有 DNA 甲 基 化 酶 ， 其 甲 基 化 曾 被 认为 与 DNA 的 复制 和 重组
等 过 程 有 关 。 真 核 生 物 可 能 具备 比 原 核 生 物 更 为 复杂 的 校 读 系统 。

五 、 交 联 的 修复

8- 氧 甲 基 补 骨 脂 (8-methoxypsorolen) 能 典 入 DNA 分 子 中 ， 在 360nm 光照
下 很 容易 和 邻近 的 两 个 碱 基 发 生 反应 使 它们 交 联 ， 交 联 发 生 在 两 条 DNA 单 链 之
间 。 丝 裂 霉 素 C 也 有 这 样 的 作用 。 交 联 会 阻碍 DNA 复制 ， 这 也 是 一 种 具有 致死
效应 的 DNA 损伤 。

对 交 联 的 修复 目前 尚 不 清楚 ， 一 种 模型 认为 交 联 的 修复 既 包 括 一 条 单 链 上 一
部 分 核 苷 酸 的 切除 ， 也 包括 重组 。

真 核 生 物 必然 也 有 交 联 修复 功能 。 因 为 离 体 培养 的 Fanconi 氏 贫 血 症 患者 的
细胞 对 补 骨 脂 的 杀伤 作用 格外 敏感 ， 由 此 说 明 它 的 交 联 修复 系统 有 缺陷 ， 很 明

"” 146 ，

MutS |

| 由 解 旋 酶 和 单 链 外 切 核 酸 酶 除
去 子 代 链 上 错 配 的 碱 基

后

二 -一 一 一 一 -一 一 一 一 一 一 一

由 DNA 聚合 酶 和 DNA

连接 酶 补 平 缺 口

将 甲 基 转 移 到 被 修复 的
子 代 链 的 A 上

图 5-5 通过 开 .co MutHLS 系统 错 配 修复 的 模型

显 ， 正 常人 是 具有 交 联 修复 功能 的 。

一 ~ 十 |-

一 厂 ” 避 免 差错 的 DNA 损伤 修复 和 基因 突变

光复 活 作用 是 使 喀 啶 二 聚 体 分 解 而 恢复 DNA 分 子 的 原来 结构 ， 这 一 简单 的

147 ，

过 程 并 不 会 带 来 基因 突变 ， 是 一 种 避免 差错 的 DNA 损伤 修复 作用 。

切除 修复 过 程 是 否 会 带 来 基因 突变 ， 这 可 以 从 uvr 突变 型 的 诱 变 行为 中 找到
答案 。uvr 突变 型 对 紫外 线 的 杀伤 作用 格外 敏感 。E.Witkin 1969 年 报道 了 紫外
线 对 uvr 突变 型 和 野生 型 的 杀伤 和 诱 变 效应 的 比较 ， 结 果 野 生 型 对 紫外 线 的 杀伤
和 诱 变 作用 都 不 敏感 ， 但 uvr 突变 型 却 格外 敏感 。 这 说 明 切 除 修复 过 程 中 并 不 带
来 基因 突变 ， 相 反 ， 保 留 着 喀 啶 二 聚 体 的 细菌 却 容 易 发 生 突变 。 这 一 事实 暗示 了
依赖 于 recA 的 修复 过 程 可 能 会 带 来 突变 ， 因 为 通过 实验 已 经 确定 recA 突变 型 能
进行 切除 修复 ， 可 是 却 对 紫外 线 的 杀伤 作用 格外 敏感 。 而 正好 和 uvr 突变 型 情况
相反 ，recA- 细菌 对 紫外 线 的 诱 变 作 用 不 敏感 ， 而 recA- 则 是 敏感 的 。 这 一 事实
说 明了 在 依赖 于 recA 的 修复 过 程 的 进行 中 似乎 带 来 了 基因 突变 。 可 是 从 1971 年

开始 得 到 的 一 些 实验 结果 却 否定 了 这 一 论断 。@，ecB 和 ecC 突变 型 对 紫外 线 的

诱 变 作 用 的 敏感 性 接近 野生 型 。 已 知 vecA、xrecB、>recC 是 属于 同一 重组 途径 的

三 个 基因 ， 所 以 recB 和 recC 似乎 应 该 和 recA 相似 ， 可 是 事实 上 它们 却 和 野生 型

相似 。 因 此 对 此 只 能 理解 为 : recA 突变 型 之 所 以 对 于 紫外 线 的 诱 变 作用 不 敏感

不 是 由 于 它 是 重组 缺陷 型 的 ， 也 就 是 说 并 不 是 由 重组 修复 过 程 带 来 基因 突变 ， 造 一

成 基因 突变 的 原因 可 能 是 与 recA 功能 有 关 的 另 一 种 修复 功能 。@ 自 从 在 大 肠 杆
菌 中 发 现 了 可 以 通过 recF 途径 实现 重组 过 程 以 后 ， 就 应 考虑 紫外 线 也 可 以 通过
recF 的 重组 修复 而 诱发 突变 这 一 可 能 性 。 可 是 事实 上 recAr recB -recF 细菌 对 紫

外 线 的 诱 变 作用 是 敏感 的 ， 这 一 结果 同样 说 明 重 组 修复 并 不 导致 基因 突变 。rec4
基因 在 紫外 线 诱 变 中 的 作用 并 不 是 由 于 它 在 重组 中 的 作用 ， 而 是 由 于 它 在 其 他 方

面 的 作用 。 这 就 是 我 们 下 节 要 讲 的 应 急 修复 功能 。
第 三 节 “应急 修复 反应

以 上 两 节 所 讨论 的 DNA 损伤 修复 功能 都 是 不 需 诱 导 的 功能 。 早 在 20 世纪
50 年 代 〈1953 年 ) Weigle 发 现 如 果 用 经 紫外 线 照射 的 入 鸣 菌 体感 染 经 低 剂 量 的

紫外 线 照 射 过 的 大 肠 杆菌 ， 存 活 的 噬菌体 数 便 大 为 增加 〈 这 一 效应 称 为 Weigle 和

复活 效应 或 W- 效 应 )， 在 存活 的 叹 菌 体 中 出 现 较 多 的 突变 型 (Weigle 诱 变 效应 或
W- 诱 变 效应 )。 如 果 感 染 的 是 未 经 紫外 线 照 射 的 细菌 ， 那 么 存活 噬菌体 和 突变 型
的 量 都 较 少 ， 可 见 这 些 效应 是 经 紫外 线 诱导 后 出 现 的 。 这 些 反 应 就 是 所 谓 的 SOS
反应 〈 应 急 修 复 反 应 )，SOS 反应 除 上 述 两 种 效应 外 ， 还 有 其 他 效应 ， 包括 入 溶
源 菌 释放 噬菌体 、DNA 损伤 修复 、 细胞 分 裂 的 抑制 等 。

这 一 诱导 现象 和 大 肠 杆菌 的 诱导 酶 诱导 合成 现象 类 似 。 如 果 用 经 紫外 线 照射
的 入 鸣 菌 体感 染 含 有 和 氧 霉 素 的 培养 液 中 的 细菌 ， 那 么 W- 效 应 就 不 出 现 ， 这 说 明
诱导 将 会 伴随 着 新 的 蛋白 质 的 合成 。 在 B 半 乳糖 苷 酶 的 诱导 合成 中 已 经 被 诱导 的
大 肠 杆菌 如 果 不 再 继续 接触 诱导 物 ， 那 么 酶 的 活性 又 会 逐渐 下 降 到 未 经 诱导 的 水

， 148

平 。 双 -效应 也 是 一 样 ， 经 紫外 线 诱导 后 逐渐 出 现 ， 隔 了 几 十 分 钟 后 又 逐渐 消失 。
这 些 现象 都 说 明 SOS 反应 类 似 于 诱导 酶 的 诱导 合成 作用 。

一 、rec4 和 ex4 基因

recA 和 lexA 突变 型 都 不 呈现 W- 效 应 ， 说 明 这 两 个 基因 都 是 WwW- 效 应 所 必需
的 ， 它 们 分 别处 在 大 肠 杆 菌 和 遗传 图 的 58min 和 9lmin 位 置 上 。”ecA 基因 是 重组
基因 ，frecA 突变 型 也 称 为 recA (Del)， 它 既 失 去 了 接合 重组 能 力 ， 又 失去 了 W-
效应 ， 而 且 对 紫外 线 格外 敏感 。lexA (In) 也 失去 了 W- 效 应 并 对 紫外 线 敏 感 ，
可 是 它 的 接合 重组 能 力 还 是 正常 的 。 可 见 W- 效 应 和 接合 重组 并 没有 直接 关系 ，
recA 蛋白 则 在 两 方面 都 起 作用 。

7ecA /7ecA+ 杂 合 因 子 呈 现 SOS 反应 ， 可 见 recA 是 显 性 的 ， 说 明 ”ecA 基
因 具 有 正面 作用 的 功能 。/ezA - /erA - 杂 合 因子 不 呈现 SOS 反 应 ， 可 见 /erA 是
隐 性 的 ， 说 明 ezA 基因 起 反面 作用 的 功能 。

根据 recA 有 正面 功能 和 71ezrA 有 反面 功能 这 一 假设 ， 可 以 认为 ezrA 编码 一
种 阻 晕 蛋白 ， 这 一 阻 遏 蛋白 阻 遇 与 SOS 反应 有 关 的 一 系列 基因 的 表达 ，7ecA- 则
编码 分 解 LexA 蛋白 的 酶 。

RecA 蛋白 在 1978 年 已 被 分 离 出 来 ， 在 用 入 溶 源 性 细菌 诱导 的 研究 中 发 现在
X 的 诱导 释放 的 同时 会 出 现 一 种 分 子 质量 为 40 000Da 的 蛋白 质 X， 这 一 蛋白 质 就
是 RecA 蛋白 ， 它 能 分 解 入 阻 遇 蛋白 和 LexA 蛋白 。1979 年 分 离 鉴 定 了 LexA 和 蛋
白 ， 分 子 质量 为 24 000Da。

SOS 反应 包括 一 系列 反应 ， 这 一 事实 暗示 LexA 蛋白 能 阻 遇 一 系列 的 基因 。
可 以 设想 被 诱导 激活 的 RecA 和 LexA 蛋白 ， 于 是 一 系列 基因 的 阻 遏
钙 消 除 从 而 引发 一 系列 的 SOS 反应 。 通 过 大 量 的 遗传 学 研究 ， 估 计 与 SOS 反应
有 关 的 基因 可 能 占 大 肠 杆菌 全 部 基因 总 数 的 0.5% 。 通 过 对 SOS 基因 的 离 体 研
究 ， 已 经 确定 了 LexA 蛋白 在 DNA 上 的 结合 部 位 。RecA 和 LexA 在 SOS 反应 中
的 作用 见 图 5-6。

二 、S$SOS 反应 过 程

根据 对 于 SOS 有 关 的 基因 的 突变 效应 的 研究 以 及 一 些 离 体 研 究 的 结果 ， 可
以 把 SOS 反 应 归纳 为 以 下 过 程 : 四 诱导 前 。 在 未 经 诱导 的 大 肠 杆菌 细胞 中 与
SOS 反 应 有 关 的 全 部 基因 都 受到 LexA 蛋白 的 阻 遇 ， 包 括 lexA 本 身 。 不 过 由 于
各 个 基因 和 LexA 蛋白 的 亲和力 不 同 以 及 其 他 原因 ， 阻 遏 并 不 都 是 完全 的 。 ec4
基因 虽 和 LexA 亲和力 最 大 ， 可 是 在 未 经 诱导 的 细胞 中 RecA 蛋白 仍然 会 少量 合
成 以 供 正 常 遗 传 重组 中 的 需要 ; @ 诱 导 。 紫 外 线 、 丝 裂 霉 素 C 等 都 直接 造成

”149 ，

调节 路 径 靶 基 因 状 态

二 到: 大: 省 本 本 本 拓 于 诈 捉 ) 汪 本 和 于 十 抽 本 二 : 汪 王 下: 二 本 十 惠 竹 看 汪 5 轩 : 生 :全

,

抑制 靶 基 因

列 看 者 | 四 : 闫 : 委 ! 本 本 状 本 :下 : 丰 : 韦 ; 忆 ,各 :二

1
eoee 《和

全 全 交 本

激活 RecA
ASASANAASNANARAASASAwAUAARAAAY ALANAVWAAWLAVA
被 诱导 的 rec4 基因 lex4 基因 役 基 因 的 表达

图 5-6 ”LexA 蛋白 抑制 包括 修复 功能 在 内 的 许多 基因 ， 也 包括 recA 和 1erA。RecA
蛋白 导致 LexA 的 水 解 切 割 而 所 有 这 些 被 抑制 的 基因 被 诱导

DNA 损伤 ， 它 们 都 是 SOS 反应 诱导 物 。 胸 腺 旷 啶 缺陷 型 在 胸腺 啼 啶 供应 不 足 时
或 者 一 些 DNA 复制 突变 型 (例如 dnaBts) 在 42Y 中 也 会 出 现 SOS 反应。 可 以 设
想 这 些 因素 会 促使 细胞 中 产生 一 种 诱导 信号 ， 而 这 一 诱导 信和 号 才 是 真正 的 诱导
物 。 有 一 种 看 法 认为 由 于 这 些 处 理 而 出 现 的 DNA 分 子 中 的 单 链 部 分 是 诱 导 信
号 ， 此 外 ， 复 制 完 成 后 复制 叉 位 置 上 被 分 解 的 DNA 片段 可 能 也 是 一 种 诱导 信
号 。 细 胞 中 经 常 存在 的 少量 RecA 蛋白 结合 在 这 些 单 链 部 分 后 ，RecA 蛋白 便 被
激活 。 激 活 的 RecA 蛋白 作用 于 LexA 蛋白 和 入 阻 遇 和 蛋白 。LexA 蛋白 被 分 解 后 ，
SOS 网 络 中 的 一 系列 基因 便 开 始 转录 ， 如 果 这 是 一 个 入 溶 源 性 细菌 ， 那 么 入 阻 遏
蛋白 被 分 解 后 ， 入 溶 源 细菌 中 的 入 便 开 始 复制 。@ 诱 导 状 态 。 由 于 阻 遏 消除 而 首
先 转录 的 是 worA、sxLA 等 基因 。zwvr 基因 编码 切除 修复 的 内 切 核 酸 酶 ， 由 于
wzr 的 转录 ， 切 除 修复 加 强 ， 这 就 有 利于 DNA 的 损伤 修复 。 如 果 诱 导 物 剂量 较
低 或 者 不 再 存在 ， 那 么 DNA 损伤 修复 之 后 ， 诱 导 信 和 号 也 就 不 存在 ， 细 胞 就 恢复
正常 。sxlA 是 和 细菌 分 裂 有 关 的 基因 ， 它 编码 一 种 抑制 细胞 分 裂 的 蛋白 质 从 而
抑制 细胞 分 裂 。 诱 导 物 的 继续 存在 或 者 在 细菌 接触 高 剂量 的 诱导 物 的 情况 下 ， 细
胞 可 以 进入 充分 诱导 状态 ，LexA 蛋白 进一步 分 解 使 SOS 网 络 中 的 更 多 基因 消除
全

阻 遏 ， 其 中 包括 与 诱 变 作用 有 关 的 基因 以 及 作用 还 不 清楚 的 一 些 基 因 。 人 外 恢复 状
态 。 诱 导 物 不 再 存在 时 ， 诱 导 信和 号 不 再 增加 ， 同 时 由 于 DNA 损伤 的 修复 ， 原 有
的 信号 随 之 消失 ， 于 是 RecA 蛋白 回 到 不 激活 状态 ， 抑 制 细 胞 分 裂 和 诱发 突变 有
关 的 基因 又 被 阻 允 ， 于 是 整个 细胞 又 恢复 正常 状态 。

三 、SOS 反应 和 细胞 分 裂

引起 SOS 反应 的 因素 都 使 DNA 复制 不 能 正常 进行 ， 而 SOS 反应 一 方面 促
进 细 胞 的 修复 功能 ， 另 一 方面 又 产生 一 种 抑制 细胞 分 裂 的 物质 一 一 伴随 修复 的 分
裂 抑 制 物 。 一 种 观点 认为 SOS 反应 中 产生 抑制 细胞 分 裂 的 物质 是 为 了 使 受到 损
竹 的 细胞 不 产生 无 DNA 的 细胞 ， 或 者 使 细胞 中 有 更 多 的 进行 重组 修复 的 机 会 。

、SOS 反应 和 DNA 复制

紫外 线 照射 使 DNA 分 子 上 出 现 喀 啶 二 聚 体 ， 从 而 阻碍 DNA 复制 的 进行 ，
但 紫外 线 照射 却 又 能 促使 两 种 特殊 形式 的 复制 的 出 现 而 使 DNA 合成 能 继续 进
行 : 一 种 是 依赖 于 发 生变 化 的 DNA 聚合 酶 的 DNA 复制 ， 另 一 种 是 不 依赖 于 蛋
自 质 合成 而 发 动 的 DNA 复制 ， 即 所 谓 稳定 的 DNA 复制 。 用 紫外 线 照 射 、"H- 胸
腺 喀 啶 标记 和 加 氧 霉 素 处 理 等 方法 证 明了 不 依赖 于 蛋白 质 合成 的 DNA 复制 的 发
动 是 一 种 SOS 反应 。

对 于 这 种 不 依赖 于 蛋白 质 合成 的 DNA 复制 的 发 动 的 解释 有 以 下 两 种 : 其 中
一 种 是 DNA 复制 机 器 〈 称 为 复制 体 replisome) 是 由 不 同 的 anra -基因 编码 的 蛋
自 质 所 组 成 的 一 种 不 稳定 的 复合 物 ， 这 里 包括 破坏 复制 体 的 蛋白 质 ， 复 制 一 结束
它 就 使 复制 体 解体 ， 因 此 每 次 复制 发 动 前 必须 进行 蛋白 质 合成 ，SOS 诱导 物 则 使
这 种 蛋白 质 消失 或 破坏 ， 因 而 复制 的 发 动 前 便 不 需 蛋 白质 的 合成 。 另 一 种 可 能 是
紫外 线 诱导 激活 RecA 蛋白 使 之 具有 蛋白 水 解 酶 活性 ， 由 于 专 一 性 地 作用 这 一 成
分 从 而 使 复制 的 发 动 不 需 蛋白 质 的 合成 。

这 些 诱 导 的 出 现 使 DNA 复制 在 遇 到 阻 遇 时 仍 能够 继续 进行 ， 它 们 的 生物 学
意义 是 显而易见 的 。

五 、SOS 网 络 中 的 基因 和 诱 友 突 变

SOS 的 研究 从 W- 诱 变 效应 开始 ， 当 时 观察 到 寄主 细胞 的 SOS 系统 对 于 所 感
染 的 入 鸣 菌 体 具 有 修复 和 诱 变 作 用 ， 后 来 又 发 现 SOS 系统 也 对 细菌 本 身 的 DNA
损伤 进行 修复 和 诱发 突变 。

经 研究 发 现 除了 recA 和 1ezA 基因 以 外 还 有 xm 基因 参与 SOS 系统 。 转 座

子 的 插入 可 以 诱发 wx 突变 ， 说 明 wx -基因 具 某 种 正面 功能 ， 有 促使 基因 发
生 突变 的 作用 。wmz 基因 可 以 为 丝 裂 霉 素 C 所 诱导 ， 它 们 的 调控 区 的 结构 和
recA 、lLerA 以 及 sxLA 基因 都 相似 ， 这 说 明 它 是 SOS 系统 中 的 一 员 。UmuD 蛋白
可 被 RecA 蛋白 切割 而 被 激活 ， 并 且 也 可 以 激活 倾向 差错 的 修复 系统 〈error

prone repair System )。

六 、 二 聚 体 和 诱发 突变

SOS 反应 是 一 种 倾向 差错 的 DNA 损伤 修复 反应 ， 那 么 突变 发 生 的 位 置 是 否

就 是 受到 损伤 的 位 置 呢 ?

紫外 线 的 杀伤 作用 主要 是 由 于 它 可 以 使 DNA 分 子 上 出 现 胸腺 旷 啶 环 丁 烷 三
聚 体 ， 这 些 二 聚 体 的 修复 依赖 于 光复 活 作 用 、 切 除 修复 和 重组 修复 ， 这 些 都 是 避
免 差错 的 修复 作用 。 紫 外 线 还 造成 另 一 些 损伤 ， 其 中 一 种 损伤 是 喀 啶 - 喀 啶 (6-4)
二 聚 体 ， 大 部 分 是 TC 和 C-C 二 聚 体 。 实 验 结果 发 现 紫 外 线 诱 发 的 突变 都 发 生
在 形成 二 聚 体 的 位 置 ， 尤 其 是 喀 啶 - 喀 啶 (6-4) 二 聚 体 。

七 、 无 嗓 叭 位 点 和 基因 突变

应 用 @X174DNA 所 进行 的 一 系列 实验 说 明 ， 通 过 SOS 反应 而 导致 突变 的 另
一 种 DNA 损伤 是 无 味 叭 位 点 (AP)， 脱 味 叭 作用 可 由 烷 化 剂 和 低 pH 等 因素 引

起 。 用 完成 脱 噶 吟 反应 后 的 @X174DNA 转 染 脱 细胞 壁 的 细胞 ， 加 入 DNA 聚合

酶 I 和 [au P] 标记 的 四 种 单 核 苷 酸 测定 脱 味 叭 作用 对 DNA 合成 的 影响 ， 发 现 ，

随 着 脱 叮 叭 位 点 的 增加 ， 每 一 模板 合成 的 核 苷 酸 相应 减少 ， 说 明 脱 味 叭 与 二 聚 体
一 样 能 阻 遏 DNA 的 复制 。 另 外 ， 回 复 突变 的 频率 却 随 无 味 叭 位 点 的 增加 而 增
加 ， 说 明基 因 突变 是 在 通过 无 味 叭 位 点 的 复制 过 程 中 发 生 的 。 这 个 过 程 正 是 SOS
反应 的 一 部 分 ， 因 为 脱 细胞 壁 的 细胞 必须 经 过 紫外 线 照射 才能 发 生 回复 突变 ， 而

和

且 这 一 过 程 依赖 于 recA 基因， 回复 突变 不 发 生 在 不 经 紫外 线 照 射 的 脱 壁 细胞
中 ， 而 突变 是 在 无 味 叭 位 点 的 复制 过 程 中 发 生 的 。 无 味 叭 位 点 像 二 聚 体 一 样 阻碍

复制 的 进行 ， 由 此 可 见 SOS 反应 还 包括 通过 这 些 DNA 损伤 部 位 的 DNA 复制 。
八 、DNA 聚合 酶 和 基因 突变

从 经 趴 啶 酮 酸 诱导 的 大 肠 杆菌 中 曾 分 离 到 一 种 DNA 聚合 酶 I ， 这 种 聚合 酶

和 未 经 诱导 的 细菌 中 的 DNA 聚合 酶 I 十 分 相似 。 曾 用 多 核 苷 酸 共 聚 物

poly (dA)、poly (dT) 作 模 板 来 比较 在 正常 的 DNA 聚合 酶 或 者 在 DNA 聚合 酶

[的 作用 下 dAMP、dTMP 的 互补 挫 入 量 和 dGMP 的 非 互补 掺 入 量 ， 发 现 对 于
"2

互补 挫 入 量 来 说 两 者 并 无 明显 的 差别 ， 可 是 对 于 非 互 补 摊 入 量 来 说 DNA 聚合 酶
“六 显 然 高 出 DNA 聚合 酶 [的 10 倍 。
证 述 结果 说 明 在 经 SOS 诱导 的 细菌 中 会 出 现 一 种 新 的 DNA 聚合 酶 ， 这 种 育
合 酶 能 够 有 效 地 通过 DNA 损伤 位 置 进行 DNA 复制 而 避免 了 死亡 ， 可 是 另 一 方
面 却 发 生 了 更 多 的 突变 。

SOS 诱 导 使 DNA 聚合 酶 的 外 切 核 酸 酶 的 活力 下 降 ， 这 样 即使 在 二 聚 体 的 相
对 位 置 上 出 现 了 不 正常 的 核 苷 酸 ，DNA 复制 仍然 继续 前 进 。 可 是 同时 在 这 个 位
置 上 却 增加 了 出 现 不 正常 核 苷 酸 的 机 会 ， 因 此 便 带 来 了 更 多 的 突变 。 大 肠 杆 菌 聚
合 酶 了 I 在 反应 中 也 起 作用 ， 并 且 该 酶 也 缺少 某 些 外 切 核酸 酶 活性 。

第 四 节 ，” 诱 变 剂 、 诱 变 、 基 因 突 变 和 突变 体
在 讨论 基因 突变 时 常常 涉及 四 个 名 词 ， 即 诱 变 剂 、 诱 变 、 突 变 和 突变 体

(mutagen、mutagenesis、mutation 和 mutant)。

诱 变 剂 是 指 能 诱发 产生 突变 的 物理 和 化 学 因素 ， 例 如 紫外 线 照射 和 一 些 化 学
药品 如 咱 喧 类 等 ， 它 们 造成 DNA 损伤 或 改变 碱 基 配 对 性 能 ， 这 些 物质 就 叫做 诱
变 剂 。

诱 变 是 指 用 诱 变 剂 处 理 从 而 产生 突变 的 过 程 。

突变 是 指 存在 于 一 个 突变 体 中 的 DNA 结构 上 的 任何 改变 ， 这 种 改变 能 产生
一 个 突变 表 型 。 突 变 常 常 是 改变 了 DNA 的 碱 基 顺 序 ， 绝 大 多 数 是 碱 基 的 替换 、
增加 、 重 排 、 减 少 等 。

突变 体 是 指 某 个 有 机 体 的 遗传 状态 ， 正 和 的 个 体 称 为 野生 型 ， 那 么 某 一 表 型
特征 与 野生 型 不 同 的 个 体 则 称 为 突变 体 ， 例 如 大 肠 杆 菌 有 利用 半 乳 糖 作 碳 源 的 性
质 ， 它 的 野生 型 状态 是 Gal* ，Gal- 则 不 能 利用 半 乳 糖 ， 这 个 Gal -就 是 突变 体 。

突变 的 类 型 和 它们 的 标志

突变 可 用 几 种 方法 来 分 类 ， 一 种 方法 是 根据 碱 基 改 变 的 数目 ， 仅 有 一 对 碱 基
的 改变 叫 点 罕 变 ， 一 个 点 突变 可 以 是 一 个 碱 基 对 的 替换 、 一 个 碱 基 的 增加 或 减
消 。 但 点 突变 这 个 术语 常常 是 指 一 个 碱 基 对 的 替换 。

第 二 种 分 类 方法 是 根据 所 编码 的 氨基 酸 的 顺序 的 改变 ， 例 如 ， 如 果 编 码 的 蛋
自 质 中 一 个 氨基 酸 被 替换 ， 这 种 突变 叫 误 义 突变 (missense mutation)， 如 氨基 酸
被 蔡 换 后 的 产物 一 蛋白质 在 一 种 温度 (典型 的 是 30C) 下 有 活力 而 在 高 温
(通常 是 42 ) 下 则 无 活力 ， 这 种 突变 叫 温度 敏感 突变 (temperature-sensitive 或
ts mutation)。 根 据 惯 例 ， 把 Gal - 的 温度 敏感 突变 写 为 Gal- (Ts)。 有 些 碱 基 被
蔡 换 后 就 会 使 原来 编码 某 一 氨基 酸 的 序列 不 再 编码 任何 氨基 酸 ， 这 种 新 的 碱 基 序

后 史 “

列 使 蛋白 质 的 合成 在 这 一 点 终止 ， 这 种 突变 叫做 链 终止 突变 (chain termination
mutation ) 或 者 叫 无 义 突变 (nonsense mutation ) 。 无 义 突变 有 三 种 ， 每 一 种 对 应
于 一 种 三 核 苷 酸 ， 它 们 分 别 是 琥珀 (amber Am)、 赭 石 (ochre O8) 和 半 透 明
(opal)。 一 个 Gal 的 琥珀 或 灰 石 突变 分 别 写成 Gal-” (Am) 或 Gal- (0O?)。

一 个 实验 中 如 果 分 离 了 很 多 突变 株 ， 比 如 说 分 离 了 很 多 Gal 突变 株 ， 那 么
可 以 把 每 株 编 上 号 ， 如 Gal4、Gall82 (Am)、Gall23 (Ts) 等 。

突变 株 的 基因 型 常用 某 一 特性 的 英文 名 称 的 前 三 个 小 写字 母 表 示 ， 表 型 也 用
前 三 个 字母 表示 ， 但 第 一 个 字母 要 大 写 。 例 如 色 氨 酸 的 基因 表 型 用 Trp* 表 示 ，
合成 色 氨 酸 由 几 个 酶 完成 ， 不 同 的 酶 在 Trp 后 边 再 加 一 个 字母 如 TrpA、TrpE、
GalK、GalT 等 。 对 TrpA 的 突变 株 103 则 可 写成 TrpAl103。

二 、 突 变 株 的 租 选

检查 突变 株 的 方法 有 多 种 ， 而 对 于 细菌 突变 株 可 以 利用 它们 是 否 抗 链 霉 素 或
能 和 否 利用 某 种 糖 作 碳 源 来 检测 。

一 个 链 霉 素 抗 性 菌 (streptomycin-resistant Str-r) 很 容易 在 含有 链 霉 素 的 培
养 基 中 被 选 出 来 。 因 为 只 有 发 生 了 突变 的 菌株 才能 在 此 培养 基 上 生长 。 对 于 能 利
用 某 种 糖 作 碳 源 的 突变 株 可 以 用 其 在 选择 培养 基 平板 上 形成 菌落 的 颜色 来 租 选 。
如 不 能 利用 乳糖 作 碳 源 的 突变 菌株 (Lac- ) 在 EMB 平板 上 形成 白色 菌落 而 野生
型 则 形成 紫红 色 菌 落 。

糖 利 用 能 力 的 突变 型 可 以 在 缺乏 这 种 糖 而 添加 其 他 碳 源 的 培养 基 上 生长 ， 而
对 于 某 种 氨基 酸 的 营养 缺陷 型 如 亮 氨 酸 (Leu ) 突变 株 就 不 能 利用 上 述 在 缺少
氨基 酸 的 培养 基 上 生长 的 方法 来 筛选 。 因 为 这 种 突变 株 在 这 种 培养 基 上 并 不 能 生
长 。 对 于 这 种 突变 株 的 筛选 必须 采用 平板 复印 技术 ， 选 出 的 在 基本 培养 基 上 不 能
生长 而 在 完全 培养 基 上 能 生长 的 菌落 为 氨基 酸 突 变 株 。 平 板 复印 技术 也 可 以 用 于
Ts 突变 株 的 筛选 。 鸣 菌 体 突 变 株 可 根据 喉 菌 斑 的 形态 来 鉴定 。 温 度 敏 感 突变 株
可 根据 在 低温 下 能 形成 斑 而 在 高 温 下 不 形成 斑 来 鉴定 。

在 一 个 细菌 的 群体 中 ， 突 变 体 的 数目 比 未 突变 的 数目 要 低 得 多 ， 两 者 比例 只
有 10-”， 因 此 要 从 这 么 多 的 菌 中 分 离 出 一 株 突变 体 是 很 难 的 。 假 设 一 个 平板 上
长 200 个 菌落 的 话 ， 那 么 从 10"” 个 细菌 中 分 离 一 个 突变 体 就 需要 倒 5Sx 104 个 平
板 〈 直 径 9cm 平 阵 )， 这 样 分 离 一 个 突变 体 的 工作 量 太 大 。 那 么 如 何 才能 提高 分
离 效率 呢 ? 可 以 采取 杀 死 野生 型 而 不 杀 死 突变 型 的 培养 基 来 富 集 突变 株 。 一 种 适
合 于 细菌 突变 株 筛选 的 方法 是 青霉素 筛选 技术 ， 这 个 方法 主要 的 根据 是 青霉素 对
细菌 细胞 壁 的 合成 的 干扰 ， 当 在 培养 基 中 加 青霉素 时 ， 野 生 型 细菌 因 不 能 合成 细
胞 壁 而 细胞 内 其 他 物质 均 能 合成 ， 结 果 细 胞 会 破裂 而 死亡 ， 而 氨基 酸 缺 陷 型 如
Leu 由 于 培养 基 中 无 亮 氨 酸 使 细菌 不 能 合成 蛋 折 质 ， 因 此 Leu - 菌 在 青霉素 培养

"13

基于 不 会 由 于 不 合成 细胞 壁 而 胀 破 死亡 。 把 含有 Leu 的 菌 悬 液 先 在 含 青霉素 的
“ 接 养 基 上 培养 使 野生 型 菌 先 死亡 ， 然 后 再 转 入 无 青霉素 而 加 亮 氨 酸 的 培养 基 中 培
养 ， 这 样 便 可 大 大 富 集 Leu 突变 体 。

二 .是 “这

突变 体 的 产生 需要 碱 基 顺 序 发 生变 化 ， 这 种 变化 可 以 由 于 DNA 复制 的 错误
而 自发 地 产生 ， 或 者 由 以 下 五 种 途径 促进 产生 : 吕 插 入 的 不 能 正确 配对 的 碱 基 未
被 除去 ; @ 插 入 的 一 个 异 构 化 的 碱 基 在 接 下 来 的 复制 过 程 中 可 以 发 生 替 换 ;@ 先
播 入 的 碱 基 发 生化 学 变化 成 为 具有 不 同 配对 特性 的 碱 基 ; @ 四 在 复制 期 间 一 个 或 多
个 碱 基 的 缺失 或 插入 。 下 面 我 们 将 分 别 讨论 诱 变 剂 及 部 分 诱 变 机 制 。

诱 变 剂 有 以 下 几 种 类 型 ， 表 5-1 说 明了 各 类 诱 变 剂 的 作用 。

表 5-1_ 诱 变 剂 的 类 型

诱 变 剂 作用 模式 结果
在 复制 期 间 蔡 换 一 个 标准 碱 基 ， 1 AT_G.C 和
碱 基 类 似 物 | 并 且 引 起 在 下 一 代 的 子 代 细胞 中 2 所 丰硕 办 G'C-A'T
出 现 一 个 新 的 碱 基 和 3 时 A.T->G:C
-aminopurine)
亚 硝 酸 G.C->A. 工 和
Cnitrous acid) A:T->G:C
产 胺 G:C->A:T
(hydroxylamine) CA
以 化 学 方法 改变 一 个 碱 基 , 从 而 SR
化 学 生变 章 | 引起 在 下 一 代 的 子 代 细 胞 中 出 现 | 开 天 下 本本 二 5 网
新 的 碱 基 配对 ethyl methane GCTA
sulfonate (EMS) ]
NNG 和 EMS 同
紫外 线 所 有 单个 碱 基 对 的 改变
(ultraviolet light) 都 是 可 能 的
插入 试 利 | 增加 或 减少 一 个 或 多 个 碱 基 对 移 杠

任何 单个 碱 基 对 的

增 变 基因 过 多 插入 不 正确 碱 基 或 者 对 插入

错误 碱 基 的 修复 缺失 改变 都 是 可 能 的

5- 甲 基 胞 喀 啶 的 自发 脱 氨基 作用

无 诱 变 剂 [ spontaneous ”deaminatian ”of G'MeC->~A:' 工
S-methylcytosine (MeC ) ]

1. 碱 基 类 似 物 诱 变 剂 诱 变

碱 基 类 似 物 作 为 一 种 非 标准 核 苷 酸 底 物 在 DNA 聚合 酶 作用 下 被 组 建 到 DNA
分 子 中 去 ， 这 种 底 物 必须 能 与 正在 复制 中 的 互补 链 上 的 碱 基 配 对 ， 聚 合 酶 的
. 155 ，

3 一 3 校对 功能 可 能 将 它们 除去 ， 然 而 这 种 类 似 物 如 果 能 够 异 构 化 或 者 有 两 种 氢
键 模式 ， 它 将 是 诱 变 剂 。

5- 澳 脱氧 尿 旷 啶 (BU) 是 胸腺 喀 啶 〈T) 的 结构 类 似 物 ， 它 具有 的 溴 和 胸腺 ，
喀 哇 上 的 甲 基 一 样 具有 范 德 华 力 〈 图 5-7)。

宾
5 五 3 5 卫
N N N
O
(a) 胸腺 喀 喧 5- 溴 脱氧 尿 喀 啶 ( 坪 式 )
H 口 -2A 订 汪 人
N\ CS - 妈 Y 有
NE22N N 过 CH 区 写 ，
人 PC 2 站 六- 大 -a
2 二 E
力 N
也 O 理 开
(b) 腺 味 叭 胸腺 喀 喧 (c) 鸟 味 叭 5- 溴 脱氧 尿 喀 啶 ( 醇 式 )

图 5-7 ”5- 溴 脱氧 尿 喀 喧 的 不 同形 式 下 的 配对 性 能

在 DNA 复制 过 程 中 ，BU 可 以 像 工 一 样 与 A 配 对 。BU 有 两 种 形式 ， 当 处
于 酮 式 时 类 似 于 T， 与 A 配 对 ; 而 当 它 处 于 烯 醇 式 时 ( 较 少 见 ) 类 似 于 C， 能 与
G 配 对 。

如 果 BU 处 于 炳 醇 式 ，DNA 第 一 次 复制 时 BU 以 烯 醇 式 挫 入 与 G 配 对 ， 因
此 最 终 使 C:G 对 变 成 A: 工 对 (图 5-8)。

当 第 一 次 复制 时 挫 入 的 BU 为 酮 式 ， 则 可 使 A: 工 对 变 成 G:C 对 (图 5-8)。

无 论 BU 是 引起 A:T-> G:C 的 变化 还 是 引起 G: C-> A: 工 的 变化 都 要 在 BU
掺 入 DNA 分 子 后 再 经 两 次 复制 才 会 发 生 ， 因 为 只 有 BU 在 DNA 复制 过 程 中 配对
性 能 发 生 改 变 才能 在 子 代 中 产生 新 的 碱 基 对 。

以 上 所 说 的 碱 基 对 的 改变 无 论 是 A:T->G:C 还 是 G:C->A:T， 都 是 由 味 吟 -
喀 喧 到 味 吟 - 喀 喧 的 变化 ， 这 种 由 一 种 味 叭 - 喀 啶 变 为 另 一 种 味 叭 - 喀 啶 的 变化 叫做
碱 基 的 转换 (transition)， 如 果 是 味 叭 - 喀 啶 转变 为 喀 啶 - 味 叭 的 变化 则 叫做 碱 基 的
颠 换 (transverstion ) 。

碱 基 类 似 物 除了 5- 溴 脱氧 尿 喀 啶 以 外 还 有 2- 氢 基 呀 哈 ，2- 氨 基 嗓 吟 是 腺 唆 吟
的 结构 类 似 物 ， 它 能 和 胞 喀 啶 及 胸腺 喀 喧 配对 (图 $-9)。2- 氨 基 味 叭 (AP) 也
能 引起 两 个 方向 的 转换 ， 不 过 主要 是 引起 A:T-> G:C 的 变化 〈 图 5-10)。

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(a) 复制 中 的 错误 A:T 一 G:C (b) 复制 中 的 错误 G:C 一 A:T

图 $-8 5- 溴 脱氧 尿 啶 引起 A:T->G:C 和 G:C->A:T 的 诱 变 机 制

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图 5-9 腺 叶 叭 的 类 似 物 2- 氨 基 味 叭 与 胞 喀 啶 和 胸腺 喀 啶 的 配对 模式
2. 化 学 诱 变 剂 诱 变

化 学 诱 变 剂 能 够 改变 DNA 分 子 中 的 碱 基 形成 氢 键 的 特性 。 四 种 最 有 效 的 化
学 诱 变 剂 是 亚 硝 酸 (nitrous acid)、 羟 腕 (hydroxylamine HA)、 甲 基 础 酸 乙 酯
(ethylmethane sulfonate EMS) 和 N- 甲 基 -N 硝 基 -N- 亚 硝 基 县 (NNG)。 它 们 的 化
学 结构 如 图 $-11 所 示 。

首先 亚 硝 酸 通过 氧化 脱 氨 作用 将 氨基 转变 为 酮 基 ， 这 样 ， 胞 喀 啶 (C)、 腺
味 叭 (A) 和 乌 味 叭 (G) 经 脱 氨基 就 可 以 转变 成 尿 喀 啶 (U)、 次 黄 嘎 叭 (H)
和 黄 野 哈 〈(X)， 这 些 碱 基 可 以 形成 碱 基 对 U:A-> HIC 和 X:C。 因 此 C 和 A 分 别
脱 氨基 后 会 引起 G:C> A:T 和 A:T-> G:C 的 转变 。 由 于 G 和 X 都 能 和 C 配对 ，

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图 5-10 2- 氨基 嗓 叭 的 诱 变 机 制

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N N S 0O=N 一 N 一 C 一 N 一 NO，
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OH 2 4 |

亚 硝酸 产 胺 甲 基 磺 酸 乙 脂 N- 甲 基 -N 硝 基 - 亚 硝 基 肌

图 5-11 四 种 化 学 诱 变 剂 的 结构

所 以 G-> X 的 转变 不 引起 突变 。 这 些 改变 都 是 碱 基 的 转换 (图 $-12)。

产 胺 专 一 地 修饰 胞 旷 啶 ， 使 它 仅 能 与 A 配 对 ， 所 以 HA 引起 G:C-> A:T 的
转变 ， 这 种 转变 的 化 学 机 制 是 复杂 的 。

EMS 和 EES 都 是 烷 化 剂 ， 它 们 可 以 与 G 甚至 有 时 也 与 A 反 应 ， 将 烷 基 加 到
” 嗓 吟 环 的 N-7 位 上 并 在 这 个 位 置 上 形成 季 胺 ， 促 进 此 环 离子 化 〈 如 图 $5-13)， 离
子 化 的 烷 基 鸟 味 叭 能 与 工 配 对 而 不 与 C 配 对 。 这 样 就 引起 G:C~> A:T 工 的 转换 。
另外 ， 烷 基 叶 叭 也 有 N- 糖 苷 键 ， 很 容易 水 解 产 生 脱 味 叭 位 点 ， 因 此 在 DNA 复制
时 可 以 插入 任何 一 个 碱 基 ， 原 来 的 G:C 对 在 复制 两 次 后 可 能 变 成 C:G 对 、A: 工
对 或 者 T:A 对 (如 图 $-13)。

NNG 是 一 种 非常 有 效 的 诱 变 剂 ， 它 起 烷 基 化 作用 ， 对 任何 一 个 基因 的 诱 变
效率 都 可 达 1%， 用 NNG 诱 变 细菌 常常 会 引起 多 基因 突变 。 例 如 NNG 诱导 的
Gal 突变 体 浓 党 也 是 Pro ， 突 变 常 分 布 在 相 邻 的 基因 。 对 这 种 现象 研究 后 发 现
NNG 在 复制 又 处 发 挥 最 大 效力 ， 因 此 细菌 在 接触 NNG 时 ， 复 制 又 处 易 发 生 突
变 。 由 于 诱 变 处 理 都 是 在 非 营 养 的 缓冲 液 里 进行 ，DNA 复制 很 慢 ， 所 以 突变 的

SS

上 上
HNO， THNO，
| 脱毛 基 | 脱 氨 基
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图 5-12 ” 亚 硝 酸 诱 变 的 两 种 机 制

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(3a) 烷 化 的 鸟 味 吟 离子 化 形成 (b) 离子 化 的 烷 化 鸟 味 叭

[ 烷 化 脱 味 叭 复制
转换 颠 换
图 5-13 ” 烷 化 剂 的 诱 变 机 制
基因 常常 是 一 个 接 一 个 。NNG 的 优点 是 易 找到 突变 体 ， 但 它 的 缺点 是 分 离 的 一
个 突变 株 常常 带 有 不 希望 的 另 一 种 突变 。

3. 紫外 线 诱 变

紧 外 线 照 射 引起 TT 二 聚 体 或 其 他 喀 啶 二 聚 体 的 产生 。RecA -细菌 经 紫外 线
诱 变 后 不 产生 突变 体 ， 因 为 RecA -细菌 经 紫外 线 照 射 后 不 进行 SOS 反应 ， 通 常
认为 紫外 线 诱 变 主要 是 由 于 SOS 修复 过 程 引 起 的 。

和 县

4. 插 和 人 类 物质 诱 变

嘱 喧 栖 、 前 黄 素 和 叫 啶 黄 (图 5-14) 等 “ 叫 喧 类 药物 ”都 是 三 环 平面 分 子 。
它们 可 以 插入 到 DNA 分 子 的 两 个 碱 基 对 之 间 ， 将 两 个 本 来 相 邻 的 正常 碱 基 对 隔
开 ， 隅 开 的 距离 正好 相当 于 一 个 碱 基 对 的 距离 (图 5-15)。 这 类 物质 的 插入 常 引
起 碱 基 的 插入 或 缺失 (图 5-16)， 当 DNA 复制 之 前 插入 ， 就 造成 碱 基 的 插入 ;
如 果 正 在 复制 时 插入 将 引起 碱 基 的 缺失 。

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图 5-14 ”两 类 叫 喧 类 生生 物 的 结构

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图 5-15 插入 叫 喧 分子 后 两 碱 基 对 分 开

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图 5-16 ”一 个 叫 喧 分 子 插入 ， 复 制 时 将 增加 一 对 碱 基 ， 因 而 引起 密码 改变
碱 基 的 插入 或 缺失 都 将 引起 移 框 突变 ， 也 就 是 遗传 密码 的 阅读 框 (reading

“2

frame) 向 前 或 向 后 移 一 格 。

除了 上 述 物 理 和 化 学 因素 引起 的 突变 以 外 ， 在 DNA 中 插入 可 转移 因子 以 及
在 大 肠 杆菌 突变 体 状 态 中 有 一 些 基因 引起 突变 的 频率 比 遗 传 图 上 其 他 基因 要 高 得
多 ， 这 就 是 所 谓 的 增 变 基因 引起 的 突变 。

、Oligo 诱导 的 定点 突变

用 合成 的 DNA 在 DNA 序列 的 特定 位 点 诱导 突变 的 方法 始 于 20 世纪 70 年
伐 未 期 ， 这 一 方法 受到 70 年 代 初 用 野生 型 DNA 片段 对 GX174 吹 菌 体 的 突变 株
进行 标记 拯救 研究 的 启发 ， 人 们 自然 想到 ， 既 然 可 以 用 野生 型 的 DNA 片段 使 突
变型 DNA 转变 成 野生 型 ， 当 然 就 能 用 含 突 变 的 DNA 片段 使 野生 型 DNA 发 生 突
恋 。 到 80 年 代 中 后 期 ， 这 一 方法 随 着 DNA 测序 和 MI13 系统 、DNA 杂交 等 技术
的 发 展 得 到 较 大 的 改进 和 提高 ， 这 些 改进 和 提高 主要 有 如 下 三 点 : @ 发 展 了 一 套
用 重组 M13 单 链 DNA 为 诱 变 模 板 的 技术 。G@ 用 标记 的 诱 变 引 物 为 探 针 通过 原 位
杂交 法 从 平板 中 筛选 变异 的 喉 菌 斑 技 术 。@ 改 进退 火 条 件 ， 提 高 野生 模板 与 诱 变
罕 聚 核 苷 酸 错 配 形成 异 源 双 链 的 效率 。20 世纪 80 年 代 末 期 发 展 的 方法 实际 上 已
经 使 大 们 可 以 随心 所 欲 地 在 已 知 DNA 序列 中 导入 任意 的 突变 ， 目 前 这 些 方法 在
世界 上 广泛 采用 。 我 们 在 初期 也 直接 采用 这 些 方法 ， 但 发 现 这 些 方法 存在 一 些 缺
点 ， 主 要 是 : @ 产 生变 异 的 频率 仍然 不 够 高 。 用 诱 变 反 应 混合 物 转 染 TG1 感受
态 细 菌 ， 即 使 是 技术 熟练 、 经 验 很 丰富 的 研究 者 获得 的 最 好 的 结果 ， 突 变 的 空
一 般 也 只 能 在 40% 一 60% 范围 ， 如 果 采 用 JM107 菌株 效率 就 更 低 ， 我 们 用
JM107 最 高 达到 10% 的 变异 率 。 此 外 ， 由 于 整套 技术 过 程 长 、 涉 及 的 步骤 多 ，
对 于 条 件 稍 差 的 实验 室 和 经 验 不 足 的 研究 者 来 说 ， 事 实 上 很 难 获得 所 需 的 突变 。
四 反应 混合 物 直 接 稀释 后 转 染 感受 态 菌株 ， 获 得 的 空 斑 效率 极 低 ， 从 0.5ug MI13
模板 出 发 获得 的 空 斑 数 有 时 只 有 2 一 3 个 ， 情 况 好 时 也 只 有 10 一 20 个 。@@ 用 诱 变
Oligo 作 探 针 通过 原 位 杂交 筛选 变异 的 喉 菌 班 时 ， 要 定 出 一 个 非常 严格 的 杂交 温
度 ， 低 1=2C 时 可 以 与 野生 型 DNA 杂交 ， 高 出 1 一 2 时 可 以 造成 不 杂交 ， 尤 其
是 只 有 一 个 核 苷 酸 替 换 的 情况 下 用 杂交 筛选 就 更 加 困难 了 。

针对 上 述 问题 ， 我 们 在 历时 两 年 多 的 对 Oligo 诱导 的 诱 变 研究 过 程 中 ， 对 目
前 流行 的 Kunkel 和 Zoller 的 方法 作 了 一 些 修 改 ， 效 果 相 当 明显 ， 我 们 采用 改进
的 方法 对 HCMV DNA 聚合 酶 基因 不 同 区 域 和 HIV U3R 启动 子 共 进行 了 10 种 不
同 的 诱 变 ， 其 中 2 一 4 个 核 苷 酸 替 换 的 突变 频率 可 高 达 80% 一 8$% 。 诱 导 连 续 4
个 氨基 酸 缺 失 (缺失 12 个 核 苷 酸 ) 的 突变 频率 也 高 达 40% 一 50% 。 由 于 突变 频
率 很 高 ， 就 可 以 直接 挑选 3 一 5 个 空 斑 ， 扩 增 后 提取 DNA 进行 序列 测定 来 筛选 ，
一 般 从 5 个 空 斑 中 可 以 获得 2 一 4 个 突变 。

下 面 将 我 们 改进 后 的 一 套 方法 的 步骤 介绍 如 下 :

1. 含 U 掺 人 的 单 链 M13 DNA 的 制备
@ 吸取 出 一 个 含 目标 DNA 片段 〈 即 要 进行 诱 变 的 DNA 片段 ) 的 MI13 室 ，

斑 ， 放 入 0.5ml 的 2YT 中 ， 涡 旋 振 荡 10s， 放 4X 冰箱 过 夜 ， 次 日 离心 3mim

(10 000g), 吸出 含 喉 菌 体 的 上 清 。@) 在 20ml 含 S0wl/ml 尿 苷 (uridine) 的 2YT
中 接种 一 环 CJ236 菌 ，37? 培养 过 夜 ， 然 后 在 1.Sml 含 50xl/ml 屎 苷 的 2YT 中
接种 3$Swl CJ236 菌 ， 并 和 20wl 的 上 述 M13 上 清 混 匀 后 静 置 20min，37? 振 功 培
养 6h。@ 离心 3min 去 除 菌 体 ， 上 清 放 4 保存 作为 毒 种 。 这 时 如 果 用 CJ236 和
JM107 作 空 斑 数 比 较 ， 在 JM107 中 存活 的 叹 菌 体 数 大 约 有 5$% 一 10%。 轩 在 含
50wg/ml 尿 苷 的 2YT 中 接种 CJ236 培养 过 夜 ， 次 日 取 125 风 接种 在 Sml 含
100wg/ml 尿 苷 的 2YT 中 ， 再 加 入 50 岂 含 UM13 的 毒 种 ，37? 振荡 6h。@ 离心
去 菌 体 ， 上 清 用 于 制备 诱 变 模板 单 链 DNA。 这 样 获得 的 上 清 中 的 M13 在 JM107
中 的 存活 率 只 有 在 CJ236 中 存活 率 的 1% 一 2%。

2. 诱 变 合成 反应

@ 退火 : 在 一 支 1.5$ml 的 塑料 离心 管 中 ， 加 入 1wl 10xbuffer (200mmol 开
Tris pH7.5 100mmoVL MgCb，50mmoyL NaCl，10mmoVL DTT)、0.5wg MI13
模板 DNA、2 一 3ng 诱 变 Oligo (模板 与 Oligo 分 子 数 比 为 1:10 以 上 ，Oligo 经 聚
丙烯 酰 胺 尿素 凝 胶 电 泳 纯 化 以 及 Kinase 反 应 在 5 加 上 磷酸 基 )， 补 水 至 10ml。 于
65f 保 温 Smin， 转 移 到 37 水 浴 Smin， 取 出 放 室 温 10min， 然 后 插入 冰 中
Smin， 离 心 Smin， 加 入 10Xbuffer (100mmoVL MgCb，100mmoyL DTT) 1
dNTP 混合 物 (每 种 2.SmmoyL) 4ul (最 终 浓度 每 种 S00umoVL)，Klenow 片段
2.5 几 l， 补 水 至 总 体积 20w1， 混 合 后 离心 Ss， 揪 入 冰 中 10min， 放 入 16 人 水 浴 合
成 8h。O@) 取出 插入 冰 中 继续 维持 8h。

3. 酚 - 氛 仿 抽 提

在 反应 混合 物 中 加 入 10 由 ITE， 用 酚 - 毛 仿 抽 提 一 次 ， 加 入 1710 的 3molI 西
酸 钠 (pH 5.2) 和 2 倍 体积 冷 乙 醇 ，- 70C 放置 30min， 离 心 10min， 沉 淀 溶 于
TE 中 。

4. 转化
用 JMI107 细胞 转化 ， 平 亚 空 斑 法 同 前 。
s. 筛 选 和 鉴定

挑选 3 一 5 个 空 斑 分 别 扩 增 ， 提 取 DNA 作 序 列 测 定 。
上 述 方法 的 改进 处 在 于 : @ 含 U 挫 入 的 M13 诱 变 模板 DNA 制备 。 使 野生

5 2

型 M13 模板 DNA 在 JM107 细胞 中 的 存活 率 比 原 方 法 降低 为 原来 的 1/13， 这 样 就
使 得 最 后 转 染 产生 的 空 斑 中 野生 型 空 斑 的 比例 显著 降低 。@ 诱 变 合成 反应 中 ， 采
_ 取 分 级 退火 、 在 冰 中 巩固 异 源 双 链 结构 和 在 冰 中 预先 合成 ， 后 加 T4 DNA 连接
酶 等 措施 ， 可 以 提高 诱 变 Oligo 与 模板 DNA 形成 异 源 双 链 的 效率 ， 同 时 也 减少
T4DNA 连 接 酶 对 Klenow 片段 活性 的 干扰 从 而 提高 Klenovw 片段 合成 DNA 的 能
力 。@@ 把 直接 用 反应 混合 物 转 染 改 为 经 酚 - 氯 仿 抽 提 后 再 进行 转 染 ， 由 于 去 除了
DNRA 结合 蛋白 Klenow 片段 和 T4 DNA 连接 酶 ， 转 染 效率 提高 了 20 倍 以 上 。 我
们 曾 把 合成 反应 的 混合 物 分 成 2 份 ， 一 份 按照 原 方法 直接 稀释 转 染 JM107， 只 获
得 2 个 空 班 ; 另 一 份 用 酚 - 氯 仿 抽 提 后 转 染 JM107 获得 78 个 空 斑 。

我 们 在 进行 HCMV DNA 聚合 酶 的 结构 与 功能 分 析 中 ， 用 上 述 改进 的 方法 作
了 9 个 不 同位 置 、 不 同形 式 的 突变 都 获得 了 很 好 的 效果 ， 发 现 并 证 实 了 酶 的 一 些
重要 功能 位 点 。 诱 导 DE80 突变 ， 缺 失 4 个 连续 氨基 酸 密码 (12 个 核 苷 酸 )， 随
机 挑选 个 空 班 ， 通 过 DNA 测序 证 实 有 2 个 突变 ， 频 率 为 40%。DE96 诱导 9
个 连续 核 苷 酸 缺 失 ， 突 变频 率 为 S0% (随机 挑选 4 个 空 斑 ， 测 序 后 鉴定 出 2 个
突变 )， 如 果 诱 导 1 一 2 个 核 苷 酸 替 换 ， 突 变频 率 可 达 85% 以 上 ， 诱 导 HIV U3R
的 4 个 核 苷 酸 蔡 换 ， 随 机 挑选 10 个 空 班 ， 经 DNA 测序 确定 有 8 个 突变 。 实 践 应
用 证 实 我 们 改进 的 方法 与 原 方法 相 比 可 提高 一 倍 以 上 的 效率 ， 使 初学 者 也 容易 获
得 所 需 的 基因 突变 。

第 五 节 ”基因 突变 的 校正

所 谓 校正 或 抑制 (suppression ) ， 就 是 使 突变 了 的 基因 在 一 定 条 件 下 表达 。
这 和 恢复 突变 在 本 质 上 不 同 ， 它 没有 改变 基因 型 ， 基 因 表 达 的 条 件 是 存在 相应 的
抑制 基因 。

一 、 无 义 突变 的 校正

具有 校正 〈 或 抑制 ) 基因 的 细胞 产生 一 种 饰 变 了 的 tRNA， 这 种 了 RNA 可 以
识别 无 义 密码 子 ， 并 将 无 义 密码 子 翻 译 成 某 种 氨基 酸 ， 从 而 使 多 肽 链 的 合成 得 以

细胞 中 的 抑制 基因 并 非 细胞 原来 固有 的 ， 而 是 另 一 种 突变 。 它 不 是 编码 某 种
蛋 自 质 的 基因 发 生 了 突变 ， 而 是 编码 RNA 的 基因 发 生 了 突变 ， 使 得 原来 不 能 识
别 无 义 密码 子 的 反 密 码 子 环 变 成 可 以 识别 无 义 密码 子 的 反 密码 子 环 。

例如 ， 大 肠 杆 菌 中 有 一 个 菌株 具有 抑制 基因 Sv; ， 它 能 使 对 应 于 一 个 无 义
玉 珀 突变 的 位 置 上 出 现 一 个 酷 氨 酸 ， 从 而 使 蛋白 质 的 合成 能 够 通过 无 义 密码 子 继
续 进 行 。 栈 氨 酸 的 密码 子 是 UAC， 酷 氨 酸 tRNA 的 反 密 码 子 是 AUG， 如 果 栈 氨

“和

酸 了 RNA 基因 发 生 突变 使 反 密 码 子 变 成 AUC， 它 就 能 识别 琥珀 密码 子 UAG， 从
而 把 一 个 酷 氨 酸 放 到 UAG 位 置 上 ， 只 要 这 一 氨基 酸 的 替代 对 于 酶 的 活性 影响 不
大 ， 这 一 tRNA 基因 突变 型 就 是 琥珀 突变 型 的 一 个 抑制 基因 。

按照 置换 突变 只 改变 一 对 碱 基 的 原理 ， 可 以 设想 在 终止 密码 子 位 置 上 出 现 的
这 些 氨基 酸 的 密码 子 应 该 和 终止 密码 子 只 差 一 个 碱 基 ， 以 前 发 现 的 大 肠 杆菌 的 抑
制 基 因 确 实 有 这 一 特性 ， 在 抑制 基因 作用 下 ， 在 终止 密码 位 置 上 出 现 的 氨基 酸 是
丝氨酸 (UCG)、 谷 氨 酰 胺 (CAA、CAG)、 酷 氨 酸 (UAU，UAC)、 亮 氨 酸
(UUG)、 霜 氨 酸 (AAG、AAA) 和 色 氢 酸 (UGG) 这 些 氨基 酸 的 密码 子 确实 只
与 终止 密码 子 相 差 一 个 碱 基 。

二 、 错 义 突变 的 校正

抑制 基因 产生 的 饰 变 了 的 下 NA 能 识别 另 一 种 氨基 酸 的 密码 子 而 将 野生 型 握
基 酸 插入 多 肽 链 ， 因 而 使 合成 的 生 白 质 恢 复 野 生 型 的 活性 。

例如 ， 色 氢 酸 合成 酶 基因 的 As 突变 导致 一 种 无 活性 蛋白 质 的 产生 ， 野 生 型
的 蛋白 质 在 这 个 位 置 上 应 该 是 甘氨酸 (Gly)， 而 Aa6 在 这 个 位 置 上 却 插入 了 一 个
精 氨 酸 (Arg)， 但 当 As6 突 变 株 与 Sua6 组 成 部 分 二 倍 体 以 后 ， 就 可 以 在 这 个 位 置
上 仍 挫 入 Gly， 因 而 恢复 蛋白 质 的 活性 。

三 、 移 码 突变 的 校正

移 码 突 变 的 抑制 机 制 还 不 是 十 分 清楚 ， 但 在 沙门 氏 菌 中 曾 发 现 若干 能 抑制 移
码 突变 的 基因 ， 它 们 对 无 义 突变 和 错 义 突变 均 无 抑制 作用 。 可 以 这 样 设想 : @@ 突
变 了 的 tRNA 的 反 密 码 子 环 不 是 三 联 体 而 是 四 联 、 二 联 或 五 联 体 ， 因 而 可 以 把 正
常 的 氨基 酸 插 入 到 相应 位 置 去 。 例 如 甘氨酸 密码 子 GGG 突变 后 成 为 GGGG， 而
突变 的 tRNA 的 反 密 码 子 环 是 CCCC。@ 饰 变 后 的 tRNA 结构 扭曲 ， 占 据 少 于 或
多 于 三 联 密码 子 的 空间 。@ 突 变 后 的 tRNA 在 翻译 同 种 碱 基 序 列 时 发 生 位 移 。

移 码 突变 的 几 个 抑制 基因 〈 用 Suj 表示 )。
Sx 丰 A PrOG 9Szx 1D) Gly GCC
Sx 厂 ICG 二 已 友 太 甩 -
SujC 一 Su 太 下 Gly

164 ，

第 六 章 “DNA 重组

目前 ， 我 们 可 以 把 DNA 重组 归纳 为 四 种 类 型 : 位 点 特异 性 重组 、 同 源 重
组 、 转 座 重 组 和 不 正 稍 重组 。 这 四 种 重组 的 特点 可 归纳 如 表 6-1。

表 6-1 四 种 DNA 遗传 重组 的 特征

类 型 是 否 需 要 同 源 序列 是否 需要 RecA 蛋白 是 否 需要 序列 特异 性 的 酶
位 点 特异 性 重组 于 =
同 源 重 组 十 十 =
转 座 重 组 = 一 四
不 正常 重组 = -

同 源 重组 有 两 个 基本 特点 ， 首 先是 发 生 重 组 的 两 个 DNA 分 子 必 须 有 相当 长
的 一 段 序列 (大 约 几 百 个 碱 基 对 ) 是 相同 或 接近 相同 的 ， 也 就 是 说 ， 发 生 互相 作
用 的 两 段 DNA 序列 必须 是 同 源 的 ; 其 次 ， 这 种 重组 过 程 需要 宿主 某 一 基因 产物
起 作用 ， 在 大 肠 杆菌 中 的 这 种 基因 称 为 xcA，DNA 配 对 需要 ecA 基因 的 产物 。
类 似 的 基因 也 曾 在 其 他 细菌 中 发 现 。 所 以 ， 同 源 重 组 也 常 被 称 为 依赖 于 rec4 的
重组 。 其 余 的 三 种 重组 类 型 都 不 需要 recA， 也 不 需要 或 仅 需要 极 有 限 的 同 源 序
列 。 例 如 在 入 鸣 菌 体 的 位 点 特异 性 重组 中 ， 需 要 整合 酶 的 作用 和 7 个 碱 基 对 的 同
源 序 列 ， 在 转 座 重 组 中 ， 某 一 DNA 片段 在 一 个 DNA 分 子 内 不 同位 置 间 移动 或
在 三 倍 体 细胞 中 的 不 同 DNA 分 子 之 间 移 动 (这 种 现象 称 为 转 座 ) 也 不 需要 同 源
序列 和 7ecA ; 不 正常 重组 是 指 非 同 源 DNA 序列 之 间 的 交换 ， 之 所 以 简单 地 把 它
称 为 “不 正常 重组 "， 是 由 于 人 们 对 这 种 重组 过 程 知之 甚 少 。DNA 重组 过 程 似 乎
是 复杂 的 ， 这 些 过 程 在 原核 和 真 核 细 胞 中 必然 是 不 完全 相同 的 ， 目 前 我 们 对 这 些
过 程 的 了 解 还 相当 少 ， 本 章 中 我 们 将 以 讨论 同 源 重组 为 主 。

第 一 六 同 源 重组 的 机 制
一 、 断 裂 重 接 和 异 产 双 链
用 高 倍 显微镜 对 玉米 减 数 分 裂 重组 的 早期 研究 表明 ， 在 整个 过 程 中 染色 体 是
先 断 裂 然 后 再 重新 装配 的 。 后 来 发 现 噬菌体 杂交 中 裸露 的 DNA 分 子 之 间 也 可 以

发 生 重组 。 重 组 可 以 发 生 在 一 个 基因 中 甚至 可 以 不 委 失 任何 碱 基 对 ， 因 而 推断 重
.165

组 的 机 制 一 定 是 十 分 复杂 的 。 两 个 巨大 的 DNA 分 子 如 何 能 平行 排列 并 且 配 对 ?
断裂 重 接 如 何 能 够 在 两 个 DNA 分 子 的 同一 个 位 置 上 准确 地 发 生 ?” 这 些 都 是 研究
同 源 重 组 的 主要 问题 。

用 两 种 类 型 的 入 鸣 菌 体 做 实验 ， 一 种 是 A“R ， 其 DNA 以 重 同 位 素 标记 ;
另 一 种 是 A-R-* ， 其 DNA 以 轻 同 位 素 标记 ， 这 两 种 噬菌体 均 是 int- 和 red -突变
型 ， 失 去 了 鸣 菌 体 本 身 的 全 部 重组 功能 ， 但 由 细菌 决定 的 重组 功能 还 存在 ， 这 样
就 能 专门 用 于 测验 细菌 重组 系统 及 其 重组 机 制 。 在 这 个 实验 中 ， 鸣 菌 体 和 细菌 都
带 有 阻止 DNA 合成 起 始 的 突变 ,因而 DNA 密度 的 变化 只 能 由 DNA 的 物理 交换
来 引起 ， 而 不 能 由 DNA 复制 引起 。 用 这 两 种 鸣 菌 体感 染 细菌 ， 子 代 叹 菌 体 只 含
有 亲 代 的 DNA。 用 氧化 铭 平衡 梯度 离心 法 测定 所 有 鸣 菌 体 粒 子 DNA 的 密度 ， 发
现 重 组 喉 菌 体 (A*R* 和 A-R-) 的 密度 范围 从 全 重 到 全 轻 ， 说 明 重 组 粒子 中 含
有 来 源 于 两 个 亲 代 的 物质 ， 也 就 是 说 在 形成 的 重组 子 中 发 生 了 物理 交换 。 如 果 在
A 和 有 R 之 间 还 有 一 个 C 标 志 , 即 A*C+R- 和 A-C*R+， 那 么 要 得 到 ACT+R + 重
组 子 ， 必 须 在 两 条 DNA 分 子 的 右 端 即 C 和 有 之 间 发 生 一 次 断裂 重 接 。 另 一 个 实
验 是 用 int* red 入 叭 菌 体 (细菌 是 recA- )， 也 是 在 复制 缺陷 系统 中 进行 。 重 组 仅
发 生 在 入 噬菌体 的 附着 位 点 (att) 之 间 。 这 种 重组 叹 菌 体 只 分 为 两 个 不 同 的 密
度 ， 这 是 由 于 每 个 DNA 分 子 在 入 噬菌体 附着 位 点 断裂 重 接 的 结果 。

和 蒜 册 上 述 实验 中 观察 到 的 另 一 重要 现象 是 ，

A (5 =

7 接 ， 产 生 杂 合子 ， 即 鸣 菌 体 粒子 同时 带 有
图 61 C 基 因 近 旁 发 生 断 C 和 C- 两 个 标志 ， 也 就 是 说 杂 合子 双 链
裂 重 接 产 生 杂 合子 DNA 分 子 中 有 一 个 一 条 单 链 上 是 .On 而 导

之 互补 的 另 一 条 单 链 上 是 C- 的 异 源 双 链 区
(图 6-1)， 带 有 这 种 异 源 双 链 区 的 重组 噬菌体 必须 在 DNA 复制 受到 抑制 时 才能
被 发 现 ， 因 为 只 要 DNA 进行 复制 ， 这 种 异 源 双 链 就 会 分 开 ， 杂 合子 将 不 存在 。
吹 菌 体 - 吻 菌 体 和 其 他 类 型 的 重组 实验 确凿 地 表明 断裂 重 接 是 同 源 重组 的 所
有 模型 中 一 个 必需 的 步骤 ， 并 且 异 源 双 链 区 结构 常常 是 中 间 体 。 图 6-2 表示 了 在
酶 作用 下 的 典型 的 重组 模型 。 这 个 模型 的 机 制 虽 然 还 不 十 分 清楚 ， 但 概述 了
DNA 交换 的 一 系列 特征 。

二 、 支 链 迁 移

在 第 二 章 中 已 经 讨论 过 DNA 分 子 中 存在 泡 泡 (breathing)， 支 链 迁 移 是 在
breathing 基础 上 ， 双 螺旋 区 中 的 一 条 碱 基 配 对 的 链 被 另 一 条 也 是 配对 的 链 代替
的 现象 。 如 图 6-3 所 示 ，w 链 是 一 条 连续 的 分 子 ， 两 条 单 链 I 和 II 都 和 丈 链 互
补 ， 它 们 和 w 链 结合 的 长 度 超 过 了 w 链 。 如 图 6-3 中 单 链 I 和 II 中 的 粗 线 部 分

。 166 ，

在 DNA 上 C 基 因 的 近 旁 频繁 地 发 生 断 裂 重

一 一 和 = = 至 兴 5
| 狼 人
| 连 扩 本寺

图 6-2 ”断裂 重 接 的 简单 模型

都 与 w 链 中 的 虚线 部 分 互补 。 当 breathing 发 生 在 右 端 时 工 链 迅速 与 w 链 分 开 而
下 链 则 与 w 链 结合 [图 6-3 (〈c)]，Pbreathing 可 再 次 发 生 ， 根 据 其 发 生 的 位 置 以
及 两 条 链 与 w 链 的 结合 可 能 出 现 图 6-3 中 (a)、(b)、(c) 等 不 同情 况 。 在 大 部
分 重组 模型 中 支 链 迁移 起 重要 作用 。

图 6-3 支 链 迁 移

三 、 碱 基 对 的 错 配 及 消除

异 源 双 链 区 含有 对 应 于 野生 型 位 点 的 突变 而 产生 错 配 的 碱 基 对 。 这 样 的 错 配
是 不 能 持久 的 ， 它 们 将 被 复制 或 错 配 修复 所 消除 。

销 配 修复 最 初 是 在 和 鸣 菌 体 的 实验 中 发 现 的 〈 图 6-4)。 从 两 种 和 噬菌体 突变
体 中 提取 DNA， 变 性 后 分 离 纯化 互补 单 链 ， 将 含有 一 个 突变 等 位 基因 的 单 链 和
含有 必 一 突变 等 位 基因 的 互补 单 链 复 性 ， 用 此 复 性 DNA 去 转 染 重组 缺陷 型 细
菌 ， 培 养 后 再 检查 被 感染 细菌 中 的 野生 型 噬菌体 。 转 染 后 复制 应 产生 数目 相等 的

.167 ，

两 种 单 突变 噬菌体 ， 但 是 ， 如 果 在 复制 之 前 发 生 了 错 配 修复 ， 那 么 将 会 产生 一 些
野生 型 鸣 菌 体 。 产 生 野 生 型 噬菌体 的 细菌 有 三 类 : 含有 野生 型 和 a 突变 ， 含 有 野
生 型 和 b 突变 和 只 含有 野生 型 噬菌体 (图 6-4)。

二 sii6- -
上 b 链 分 离 、 纯 化 、。 司
| 验 贱 挨
a_ Y 补 杂 合 链 十
汪汪。
3
十 b
b 的 修复 ( 口 一 曙 ) 9 a 的 修复 (一 @) 独立 修复
a 十 十 十 十 十
下 -| 一 和
二 下 三 司 十 加
1/24+ 172a+
1/2++ 1/2+b 全 部 ++

图 6-4 错 配 修复 实验

错 配 修复 是 通过 切除 异 源 双 链 区 上 的 一 个 单 链 片段 来 完成 的 。 我 们 可 以 根据
图 6-4 中 的 各 种 实验 来 估计 在 错 配 修复 过 程 中 切除 了 的 碱 基 对 数目 。 实 验 中 引入
了 第 三 个 标记 并 且 与 前 两 个 标记 之 一 紧密 连锁 ， 然 后 检测 被 感染 的 单个 细胞 中 的
子 代 鸣 菌 体 ， 看 第 三 个 标记 的 修复 是 否 常常 伴随 着 与 其 紧密 连锁 的 标记 的 修复 ，
即 看 具有 ar*b-c /a bc 基因 型 的 异 源 双 链子 代 a*b* (b 和 c 是 紧密 连锁 的 )
是 否 也 常常 是 a+b+c+ ( 蜡 源 双 链 中 的 b- 改正 为 b+ )， 发 现 共 改正 (bc 改 为
brc+ ) 的 频率 依赖 于 两 个 标志 的 间隔 和 它们 的 相对 位 置 。 对 一 系列 标记 的 检查
结果 表明 ， 当 在 一 个 特定 的 错 配 位 点 起 始 错 配 修复 时 ， 修 复 将 沿 着 此 单 链 以
5 一 3 人 方 向 继续 进行 ， 延 伸 大 约 3000 个 碱 基 对 。 现 已 发 现在 大 肠 杆 菌 中 有
Mut H_Mut S 和 Mut 工 三 种 蛋白 质 参与 错 配 修复 ， 具 体 修 复 过 程 见 第 五 章 第 一
节 中 有 关 错 配 修复 的 内 容 。 在 对 错 配 修复 的 研究 中 观察 到 一 个 有 意思 的 特征 ， 即
在 对 不 同 标记 的 实验 中 观察 到 了 改正 的 方向 选择 ， 对 于 某 些 标记 来 说 ， 错 配 修复
将 野生 型 改 为 突变 型 ， 而 对 另 一 些 标记 来 说 则 是 将 突变 型 改 为 野生 型 。 这 个 现象
还 未 得 到 解释 ， 也 许 错 配 碱 基 周围 的 碱 基 序列 决定 了 这 个 链 中 的 切割 位 置 。

四 、DNA 分 子 的 配对

DNA 分 子 的 配对 对 于 所 有 同 源 重组 模型 都 是 必需 的 。1965 年 分 离 到 了 一 株
忆 .co F 突变 株 ， 它 不 能 作为 Hfr 的 受 体 ， 突 变 基 因 定 为 rec4，1976 年 分 离 出
了 RecA 和 蛋白 。

6

RecA 蛋白 有 两 个 主要 的 生物 学 活性 : @ 与 单 链 DNA 结合 ; @ 具 有 蛋白 水
故 酶 活性 。 与 单 链 DNA 结合 是 它 与 重组 有 关 的 一 个 特性 ， 而 另 一 活性 是 起 调节
作用 。 当 RecA 蛋白 起 DNA 结合 蛋白 的 作

DNA 9。 联 会 前 结合 前 结合 RecA 核 蛋白
用 时 可 以 介 导 DNA 分 子 的 非 专 一 性 配对 和 的 各。 mmmmmmr
同 源 依赖 性 链 入 侵 。 用 纯化 的 RecA 蛋白 和 ReeA 各 和
DNA 分 子 在 室温 下 作用 ， 二 者 由 于 互补 碱 &3
基 ATGC 配对 而 保持 在 一 起 ， 这 种 结构

是 很 稳定 的 。 对 图 6-$ 中 所 示 的 三 种 互相 作

用 的 研究 以 及 对 没有 互相 作用 的 DNA 分 子

配对 的 研究 表明 ， 稳 定 的 配对 依赖 于 两 个 人
条 件 : ODNA 分 子 必 须 是 单 链 或 具有 单 链
区 ; @ 两 个 分 子 都 必须 具有 自由 末端 。 第 一
个 条 件 常 由 缺少 自由 末端 的 超 螺旋 DNA 提
供 ， 第 二 个 条 件 排 除了 单 链 环 入 侵 双 链 环 链 交换

的 可 能 性 。RecA 介 导 的 这 种 相互 作用 分 三 :而
步 完 成 : RecA 蛋白 与 联 会 前 的 单 链 DNA

结合 、 联 会 以 及 联 会 后 的 链 交换 (图 6-5)。
这 些 步 又 是 通过 最 初 对 鸣 菌 体感 染 的 细胞 图 6-5 RecA 介 导 的 配对
申 双 链 环 状 DNA 分 子 与 叹 菌 体 的 单 股 正 链

之 间 的 配对 研究 得 到 前 明 的 。

1. RecA 和 蛋白 在 单 链 DNA 上 结合

如 果 将 RecA 蛋白 和 单 链 DNA 混合 ，RecA 蛋白 将 覆盖 此 单 链 DNA 形成 核
蛋 自 细 丝 ， 此 结 梅 呈 现 带 状 ， 表 明 它 有 很 大 的 规律 性 。 每 条 带 含 有 6 一 8 个 RecA
蛋 自分 子 ， 对 应 于 20 个 核 苷 酸 。 这 个 被 RecA 蛋白 覆盖 的 DNA 分 子 的 长 度 是 它
在 双 链 状态 时 的 长 度 的 1.5 倍 。

2. 联 会

在 ATP 作用 下 ， 核 蛋白 和 双 链 环 状 DNA 分 子 形成 复合 物 ， 最 初 的 相互 作用

不 是 在 同 源 区 之 间 进 行 的 ， 非 序列 依赖 性 作用 之 后 ， 两 个 DNA 分 子 相 对 移动 直

到 同 源 序列 接触 到 一 起 ， 这 叫 同 源 结 合 。 当 同 源 序列 排列 在 一 起 时 ， 这 两 条 链 也
不 绰 绕 在 一 起 。

3. 联 会 后 链 交 换

同 源 排列 但 互 不 缠绕 的 两 条 链 只 是 很 弱 地 结合 在 一 起 ， 这 种 结构 是 很 不 稳定
的 。 在 体外 ， 五 .co 拓扑 异 构 酶 工 能 使 之 形成 正确 缠绕 的 双 螺旋 ， 但 不 知道 在 体

“9 天

内 是 和 否 也 是 这 样 。 一 旦 在 单 链 的 一 端 形成 同 源 排列 区 ，RecA 蛋白 就 积极 地 启动
双 链 分 子 中 一 条 链 的 替换 和 新 链 的 同化 ， 这 个 反应 的 机 制 还 不 清楚 ， 但 RecA 起
解 旋 酶 (helicase) 的 作用 这 一 点 已 经 很 清楚 了 ， 它 在 形成 异 源 双 链 的 进程 中 能 解 开
双 链 DNA 的 螺旋 。 同 化 过 程 是 一 种 极 性 过 程 ， 移 动 只 以 $ 一 3 的 方向 进行 。

我 们 在 图 6-$ 中 看 到 的 每 一 种 相互 作用 的 过 程 〈 单 链 DNA 与 双 链 DNA 的 三
种 作用 过 程 ) 都 可 以 用 上 述 RecA 介 导 的 多 步 过 程 来 解释 。 但 这 似乎 与 两 个 双 链
DNA 分 子 之 间 的 同 源 配对 没有 明显 的 关系 ， 双 链 DNA 分 子 的 这 两 种 配对 发 生 在
减 数 分 裂 、 鸣 菌 体 与 噬菌体 重组 、 转 导 和 接合 过 程 中 。 所 以 ， 由 RecA 介 导 的 同
源 重组 中 同时 需要 单 链 DNA 和 一 个 自由 的 末端 。 我 们 会 看 到 ， 几 乎 所 有 的 重组
模式 都 包括 一 个 早期 步 又， 在 这 一 步骤 中 ， 一 条 DNA 链 被 切 出 一 个 缺 日 ， 并 由
以 不 同 的 方式 从 缺口 处 解 开 螺旋 。

第 二 节 ” 细 霄 转化 中 的 重组
、 细 菌 中 的 转化

前 文 所 述 的 RecA 介 导 的 单 链 入 侵 结 合 、 支 链 迁 移 和 错 配 修复 也 同样 构成 了
细菌 转化 中 的 重组 机 制 。 外 源 DNA 和 染色 体 DNA 重组 在 肺炎 双 球 菌 的 转化 中
了 解 得 最 早 也 最 为 清楚 。 关 于 肺炎 双 球 菌 的 转化 过 程 及 其 在 分 子 生 物 学 中 的 重要
意义 前 面 已 经 论述 过 ， 现 将 细菌 转化 中 的 重组 模式 以 图 解 表 示 〈 图 6-6)。 从 图

重 供 体 1 DNA

SG) 一 GE

轻 受 体 细菌
TREE
AT 转换
Te ii
OA
DNA 支 链 | DNA 链
支 链 迁移 和 修剪
| | | | [ | | II
连接 酶
错 配 修复

图 6-6 细菌 转化
“170 ，

中 可 以 看 出 外 源 DNA 被 转 入 细胞 中 以 后 ， 其 中 一 条 链 被 降解 ， 只 有 一 条 链 与 受
体 DNA 相互 作用 ， 后 者 为 什么 能 够 抵抗 核酸 酶 的 降解 目前 还 不 清楚 ， 很 可 能 是
这 条 单 链 被 单 链 结合 蛋白 结合 而 受到 保护 。 单 链 入 侵 的 过 程 与 RecA 蛋白 介 导 的
配对 一 样 ， 首 先是 切断 被 替换 的 单 链 ， 然 后 经 支 链 迁 移 、 修 前 配对 除去 自由 未
端 ， 最 后 由 连接 酶 连接 切口 ， 产 生 一 个 含有 错 配 区 的 双 链 。 供 体 的 标记 能 否 在 受
体 中 出 现 要 根据 错 配 修复 能 否 发 生 而 定 ， 如 果 错 配 修复 能 发 生 ， 那 么 要 看 究竟 是
供 体 的 还 是 受 体 的 碱 基 被 除去 。 对 于 一 些 高 效能 的 标记 ， 错 配 既 能 被 改正 为 与 供
体 基 因 型 相 匹配 ， 而 且 也 很 少 被 修复 。 在 不 被 修复 的 情况 下 ， 随 着 细胞 的 分 裂 会
从 别 产生 一 个 供 体 基因 型 和 一 个 受 体 基因 型 的 细胞 。 由 于 选择 培养 基 只 人 允许 重组
体 生 长 ， 所 以 形成 的 菌落 只 由 重组 体 组 成 。 对 于 低 效 能 标记 来 说 ， 错 配 修复 常 除
去 来 自 于 供 体 的 错 配 碱 基 ， 而 细胞 只 保留 受 体 基因 型 。 自 从 在 肺炎 双 球 菌 中 发 现
转化 以 来 ， 在 其 他 种 属 细菌 中 也 发 现 了 转化 ， 如 流感 嗜 血 杆 菌 和 枯草 杆菌 等 ， 但
还 有 许多 其 他 种 属 的 细菌 不 出 现 转化 。 在 能 进行 转化 的 细菌 中 也 只 有 少数 菌株 可
以 作为 有 活性 的 转化 受 体 ， 而 这 些 菌 株 也 只 有 在 生长 状态 的 一 定 阶 段 才 变 为 可 转
化 状态 ， 即 所 谓 的 感受 态 。

一 定 的 外 界 因素 也 可 以 使 通常 不 具有 感受 态 的 受 体 表现 感受 态 。 例 如 使 用
Ca 和 改变 温度 可 以 使 忆 .col 细胞 更 容易 接受 外 源 DNA。 又 如 聚 乙 二 醇 6000
可 以 促进 原生 质 体 摄 入 DNA， 这 种 技术 可 用 于 重组 DNA 的 许多 类 型 的 转化 ， 但
必须 在 原生 质 体重 新 形成 细胞 壁 并 在 培养 基 中 形成 菌落 时 才能 用 于 转化 实验 。 用
于 转化 的 外 源 DNA 分 子 的 分 子 质量 要 比较 大 ， 分 子 质 量 小 于 105Da 时 转化 效率
很 低 ， 一 般 要 达到 10"Da 左右 ，DNA 分 子 的 转化 效率 才 比 较 高 ， 此 外 双 链 DNA
分 子 的 转化 效率 也 比较 高 。 来 自 质粒 的 双 链 环 状 超 螺旋 DNA 分 子 也 可 以 使 感受
态 细 胞 、Ca 处理 细胞 和 原生 质 体 转化 ， 但 必须 具备 自己 的 复制 原点 。

关于 感受 态 的 本 质 有 两 种 假设 ， 即 局 部 原生 质 化 假设 和 酶 受 体 假设 。 这 两 种
假设 都 有 实验 证 据 ， 特 别 是 酶 受 体 假设 ， 由 于 已 经 分 离 到 了 感受 态 酶 而 得 到 有 力
证 明 。 感 受 态 的 出 现 与 细菌 的 代谢 、 生 长 阶段 和 遗传 背景 有 关 。

二 、 酵 母 中 的 转化

酵母 中 转化 的 机 制 与 肺炎 双 球 菌 中 的 十 分 不 同 ， 曾 用 一 种 带 有 一 小 段 酵母 ，
DNA 的 正 .col 质粒 作为 供 体 ， 酵 母 细胞 作为 受 体 来 研究 酵母 的 转化 。 酵 母
DNA 缺少 复制 原点 ， 而 细菌 的 复制 原点 在 酵母 中 是 失 活 的 ， 因 此 在 已 . coli 质粒
中 的 那 段 酵母 DNA 要 在 酵母 细胞 中 表现 必须 发 生 重组 ， 酵 母 转化 的 下 述 特点 与
其 他 转化 系统 是 明显 不 同 的 。@ 整 个 质粒 被 摊 入 到 细胞 中 ， 交 换 只 发 生 在 酵母
DNA 同 源 序 列 之 间 ， 交 换 的 位 置 可 以 分 布 在 同 源 区 域 中 的 任何 地 方 。@ 酵 母 中
的 转化 效率 远 低 于 肺炎 球菌 中 的 转化 效率 ， 但 是 如 果 用 限制 性 内 切 核酸 酶 把 质粒

0

中 的 酵母 DNA 序列 切断 ， 转 化 效率 就 可 以 提高 几 和 干 倍 ; 相反 ， 双 链 断 开 的 DNA
在 肺炎 球菌 中 以 及 在 所 有 已 知 的 细菌 转化 系统 中 转化 效率 都 会 降低 很 多 倍 。@ 双
链 断 开 的 DNA 除了 转化 效率 提高 外 ， 还 产生 了 一 种 交换 位 点 的 倾向 性 。 例 如 ，
如 果 质 粒 上 含有 两 个 酵母 基因 A 和 再， 当 在 质粒 的 A 基因 切断 双 链 DNA 时 质
粒 DNA 就 被 插入 到 酵母 染色 体 的 基因 A 中 ; 如 果 在 基因 B 中 切 开 ， 质 粒 就 揪
入 酵母 染色 体 的 B 基因 中 。 在 上 述 两 种 情况 中 都 会 使 转化 的 酵母 细胞 具有 两 个
基因 A 和 两 个 基因 再 ， 这 种 结果 说 明 在 重组 过 程 中 需要 双 链 DNA 断裂 被 修复 和
断裂 附近 发 生 交 换 。

下 述 实验 使 我 们 看 到 一 些 在 酵母 中 发 生 重组 的 过 程 (图 6-7)， 在 这 一 实验
中 ， 供 体 〈 质 粒 ) DNA 带 有 A- 3B -等 位 基因 ， 酵 母 细 胞 中 带 有 ,A++ 了 B 等 位 基
因 ， 在 质粒 DNA 的 A -基因 中 切 开 ， 去 除 大 部 分 A 基因， 使 A 产生 大 范围 的
缺失 ， 这 样 的 DNA 和 双 链 断裂 的 DNA 一 样 可 以 使 转化 效率 提高 几 千 倍 。 值 得
注意 的 是 在 转化 的 细胞 中 不 但 含有 两 个 也 基因 ， 而 且 含 有 两 个 A 基因 ， 两 个 又
基因 都 是 受 体 的 A+ ， 缺 失 的 A -等 位 基因 消失 了 。 这 种 基因 倍增 表明 由 两 种 酶
切割 产生 的 缺口 被 修复 了 ， 这 种 修复 过 程 是 一 个 以 受 体 的 A 等 位 基因 为 模板 的
复制 过 程 。 实 验 中 另 一 受 体 等 位 基因 为 负 ， 质 粒 的 等 位 基因 为 正 ， 在 转化 的 细胞
中 总 是 发 现 两 个 拷 册 的 受 体 等 位 基因 ， 这 种 称 为 “ 双 链 断裂 修复 模式 ”被 提出 来
解释 酵母 中 的 重组 过 程 。 这 一 模式 的 要 点 如 下 : @ 通 过 两 次 独立 的 复制 过 程 修复
双 链 断裂 的 DNA， 每 次 各 复制 一 条 单 链 。@ 在 双 链 断裂 的 DNA 修复 的 地 方 的 两
侧 各 形成 异 源 二 聚 物 区 域 。@) 形 成 两 个 Holliday 交叉 链 的 中 间 体 。 轿 通过 解决 两
个 Holliday 接头 而 完成 重组 过 程 。

和 汉 昌 2
| ) 质粒
两 个 切 点 A
0 [天 兴

图 6-7 酵母 中 的 转化

”2

三 节 ” 同 源 双 链 DNA 分 子 之 间 的 交换

目前 已 知道 了 单 链 DNA 与 双 链 DNA 之 间 转 化 的 交换 机 制 。 但 双 链 DNA 分

子 之 间 的 交换 更 为 普遍 ， 例 如 整合 酶 启动 的 双 链 DNA 中 的 专 一 位 点 的 交换 ， 这

种 专 一 位 点 交换 的 两 个 DNA 分 子 大 部 分 是 不 同 源 的 (如 入 吹 菌 的 整合 )。 双 链

DNA 分 子 之 间 的 交换 以 同 源 交换 类 型 为 主 ， 如 细菌 的 接合 转移 、 ee
有 裂 交 换 ， 但 机 制 还 不 完全 清楚 。

一 、 吃 菌 体 的 整合

它 是 通过 入 DNA 上 少数 碱 基 对 与 宿主 染色 体 DNA 上 的 同 源 性 ， 在 鸣 菌 体 编
码 的 整合 酶 的 作用 下 发 生 的 DNA 双 链 之 间 的 交换 重组 。 整 合 模型 如 图 6-8， 图 中
PP' 是 入 喉 菌 体 DNA 的 att (attachment) 位 点 ，BB“ 是 细菌 染色 体 上 的 att 位 点 。
入 唆 菌 体 att 位 点 的 碱 基 顺 序 是 ;

GCTTITITTIATACTITAA
CGAAAAAATATIGATITI

细胞 接触 位 点
噬菌体 接触 位 点
整合 的 原
中 ) 整合 酶 噬菌体 品 P
一 B'
久

交换 位 点
图 6-8 细菌 喉 菌 体 入 DNA 的 整合

可 以 看 出 这 个 顺序 中 AT 碱 基 对 非常 丰富 。 关 于 入 DNA 的 整合 机 制 还 不 清
楚 ， 但 交换 发 生 在 BB' 和 PP' 之 间 ， 交 换 后 产生 两 个 重组 的 位 点 BP' 和 PB-
(图 6-8)。 图 中 只 表明 了 重组 的 方式 ， 但 并 没有 说 明 重 组 的 机 制 。 重 组 发 生 在 核
心 部 分 〈 同 源 的 13bp)， 核 心 的 两 旁 虽然 没有 显示 顺序 的 保守 性 ， 但 体外 实验 证
明 它 们 也 可 影响 重组 。 用 核酸 酶 逐渐 缩短 att PP' 和 BB' 长 度 后 再 进行 重组 实验 ，
结果 证 明了 的 必要 长 度 是 160bp (0 一 160bp)，P“ 的 必要 长 度 是 80bp (0 一 80bp)，
B 和 了 B 的 必要 长 度 都 是 11bp。 这 些 结果 说 明 虽 然 重组 发 生 在 核心 序列 中 ， 但 是
重组 蛋白 不 只 作用 于 核心 序列 。 实 验 还 证 明 一 条 链 上 的 断裂 重 接 位 点 是 +4， 另
一 条 链 上 是 2。 整合 酶 可 以 与 attP 结合 并 且 具 有 拓扑 异 构 酶 I 的 性 质 ， 除 整合 酶

.173 ，

外 ,整合 还 需要 入 主 编码 的 和 宿主 整合 因子 。 根 据 整 合 酶 的 拓扑 异 构 酶 I 的 性 质 ，
可 以 设想 两 个 att 位 点 发 生 联 会 以 后 ， 在 整合 酶 作用 下 两 个 DNA 分 子 的 每 一 单

链 断 裂 ， 在 一 瞬间 旋转 以 后 仍然 在 整合 酶 作用 下 连接 成 为 半 交 叉 〈(Holliday 结

构 ， 见 重组 模型 )， 另 两 条 单 链 以 同样 过 程 断 裂 重 接 ， 完 成 全 部 重组 过 程 。

二 、 细 菌 接合 转移 中 的 重组

虽然 许多 实验 证 明 供 体 菌 Hfr 与 受 体 菌 F- 进行 接合 转移 过 程 中 最 初 转移 到
受 体 菌 中 的 染色 体 DNA 是 单 股 ， 但 在 与 受 体 菌 染 色 体 发 生 同 源 重组 之 前 已 进行
了 复制 ， 因 此 供 受 体 DNA 发 生 的 重组 也 是 双 链 DNA 之 间 的 交换 重组 (图 6-9)。

人
F DNA 放 2 F 纤毛
整合 。 隔离
Hfr 细胞
细菌 染色 体

图 6-9 Hfr 和 FEF- 之 间 的 接合 转移

三 、 转 导 中 的 重组

无 论 是 专 一 性 转 导 还 是 普遍 性 转 导 ， 都 是 双 股 DNA 分 子 与 染色 体 之 间 的 重
组 ， 即 双 链 DNA 分 子 之 间 的 重组 。 转 导 中 的 重组 与 转化 中 的 重组 不 一 样 ， 在 转
导 重 组 中 染色 体 DNA 双 链 必须 打开 ， 由 于 对 转 导 中 的 重组 机 制 了 解 得 很 少 ， 不
便 进 一 步 讨论 。 下 边 将 对 不 同 的 转 导 类 型 特征 及 转 导 在 遗传 分 析 中 的 应 用 略 作
介绍 。

转 导 分 两 种 类 型 ， 一 种 是 转 导 噬菌体 ， 只 能 转 导 细 菌 染色 体 上 某 一 特定 基因
片段 ， 这 种 转 导 称 为 专 一 性 转 导 (或 称 限 制 性 转 导 )， 专 一 性 转 导 最 早 由 Leder:
berg 发 现 ， 他 用 紫外 光照 射 野生 型 大 肠 杆菌 忆 .co0 (入 )， 将 得 到 的 裂解 液 感染
下 .co0i K12 的 各 种 非 溶 源 的 突变 株 ， 发 现 只 有 gal -突变 株 有 10 -的 几率 被 转 导
成 了 galj-， 其 他 突变 体 均 不 被 转 导 成 野生 型 ， 说 明和 鸣 菌 体 只 能 转 导 供 体 菌 染色
体 上 特定 基因 ， 所 以 叫 专 一 性 转 导 。

为 什么 入 鸣 菌 体 只 能 进行 专 一 性 转 导 呢 ? 这 与 入 叹 菌 体 的 溶 源 状 态 和 整合 割

和 到

离 特点 有 关 ， 入 噬菌体 整合 位 点 附近 刚好 是 ga 基因 ， 在 菜 种 条 件 下 ， 整 合 的 入
叹 菌 体 可 以 从 染色 体 上 割 离 下 来 ， 割 离 可 以 是 正常 的 也 可 以 是 错误 的 ， 正 常 割 离

后 产生 完整 的 入 基因 组 (图 6-10)， 错 误 割 离 的 几率 是 10-56， 错 误 割 离 后 产生 带

有 一 段 染色 体 基 因 (如 go!) 同时 缺失 了 入 本 身 一 部 分 基因 的 入 鸣 菌 体 的 基因 组
(图 6-11)， 这 种 由 于 错误 割 离 产 生 的 入 叭 菌 体 就 是 转 导 型 只 菌 体 ， 也 称 和 dg。 用
这 种 方法 得 到 的 入 裂解 液 转 导 频率 很 低 (10“)， 称 低频 转 导 (LEFT)。 如 果 用
X dg 和 入 同时 感染 下 .coii K12， 可 得 到 双重 溶 源 菌 dg/ 入 ， 诱 导 这 种 双重 溶 源 菌
所 得 到 的 裂解 液 中 有 $0% 是 转 导 型 叭 菌 体 ， 称 为 高 频 转 导 (HFT)， 双 重 溶 源 菌
的 形成 如 图 6-12 所 示 。

El 本 RA j BAWEED

gal 3 N Rmn'A J 3 bio
人 BP | PB
att
目
gal N
对 R
mm
mm A gal att N R m'
一 一 一 一 一 一 一

图 6-11 错误 割 离 产 生 转 导 型 噬菌体

普遍 性 转 导 是 Lederberg 和 他 的 学 生 Zinder 1951 年 研究 鼠 伤寒 沙门 氏 菌 时 发
现 的 ， 他 们 的 目的 是 研究 鼠 伤寒 沙门 氏 菌 和 叭 菌 体 的 整合 与 割 离 中 是 否 存在 接合

5 ，

EIETINNE :II N 有 人 A gal- bio

图 6-12 ”双重 溶 源 菌 的 产生

转移 现象 ， 结 果 发 现 了 这 种 菌 中 存在 一 种 滤 过 性 因子 ， 能 转移 细菌 的 任何 基因 ，
后 来 证 明 这 种 滤 过 性 因子 就 是 温和 性 叭 菌 体 P22。 由 于 P22 能 转 导 任 一 基因 ， 所
以 称 普 遍 性 转 导 。 除 了 P22 外 ，P1 鸣 菌 体 也 能 进行 普遍 性 转 导 ， 并 且 P1 可 以 感
染 .coa， 所 以 用 了 Pl 来 研究 普遍 性 转 导 更 为 方便 。

P1 和 P22 为 什么 能 转 导 任 一 基因 呢 ? 这 是 因为 P1 是 在 细胞 质 中 溶 源 〈 就 像
质粒 和 细菌 共存 一 样 )。P1 转 导 型 史 菌 体 的 形成 是 由 于 错误 包装 。 当 诱导 P1 浴
源 菌 时 ，P1 噬菌体 在 宿主 细胞 中 复制 ， 将 宿主 染色 体 打 成 片 段 ， 包 装 时 将 与 PI

]
|
|

基因 组 大 小 一 致 的 染色 体 片 段 包 入 P1 头 部 ， 这 样 就 形成 了 转 导 型 的 鸣 菌 体 ， 为

了 证 明 这 一 点 ， 将 thy 菌 分 别 在 胸腺 喀 喧 和 5- 溴 脱氧 尿 喀 啶 的 培养 基 中 培养 。
共 三 份 : A 中 加 胸腺 喀 哇 ，B 和 C 中 加 5- 溴 脱氧 尿 喀 啶 ， 培 养 后 用 P1 去 感染 ，
其 中 也 份 中 P1 感染 时 转 入 胸腺 喀 喧 中 培养 ， 将 裂解 液 在 CsCl 中 密度 梯度 离心 ，
达到 平衡 时 分 部 收集 鸣 菌 体 并 且 分 析 各 组 分 中 有 侵 染 力 的 和 有 转 导 作用 的 P1 颗
粒 。 结 果 发 现 也 份 中 有 侵 染 力 的 密度 与 A 份 中 的 相同 ， 而 有 转 导 能 力 的 Pl 的 密
度 与 C 份 中 的 相同 ， 这 就 充分 证 明了 转 导 型 P1 包装 的 是 宿主 的 DNA。

P1 只 菌 体 的 头 部 能 够 包装 下 .co1i 染色 体 上 2min 的 长 度 ， 所 以 染色 体 上 两
个 相距 很 近 的 基因 可 以 同时 转 导 ， 这 叫 共 转 导 (cotransduction)。 两 个 基因 相距
个 相距 很 近 的 基因 之 间 的 距离 。 根 据 这 个 原理 Yanofsky 和 Lennox 等 绘制 了
巨 .colii trp 区 段 的 精细 结构 遗传 图 。

、 减 数 分 袭 重 组

在 子囊 菌 中 ， 每 一 次 减 数 分 裂 的 产物 包含 在 一 个 子 吉 中 ， 而 且 以 一 定 的 顺序

排列 ， 因 而 用 子 吉 菌 作 材料 来 研究 减 数 分 裂 中 的 重组 机 制 比较 方便 。
， 176 ，

在 20 世纪 30 年 代 中 期 就 出 现 了 关于 染色 体 交 换 的 两 种 假设 : 断裂 重 接 和 复
制 选择 模型 。

按照 断裂 重 接 模型 ， 两 个 染色 单 体 在 同一 位 置 上 断裂 ， 然 后 彼此 和 另 一 染色
单 体重 新 连接 起 来 。 按 照 复 制 选择 模型 ， 两 个 染色 单 体 作为 复制 的 模板 进行 复
制 ， 在 复制 过 程 中 相互 交换 模板 ， 从 而 造成 交换 。

两 个 模型 的 重要 区 别 是 ， 断 裂 重 接 模 型 认为 重组 可 以 在 DNA 不 进行 复制 时
进行 ， 而 复制 选择 模型 则 认为 重组 必须 在 DNA 复制 时 进行 。

现在 已 知道 染色 体 复 制 在 间 期 已 经 完成 ， 而 交叉 出 现在 减 数 分 裂 的 早期 ， 这
一 事实 支持 断裂 重 接 模型 。 另 外 ， 用 标记 叹 菌 体 进行 实验 ， 发 现 重 组 与 DNA 复
制 无 关 ， 也 支持 断裂 重 接 模 型 。

在 粗糙 链 移 霉 等 子 吉 菌 中 ， 杂 交 子 代 的 子 赛 有 六 种 类 型 ; AAAAaaaa，
aaaaAAAA，AAaaAAaa，aaAAaaAA，AAaaaaAA 和 aaAAAAaa， 而 且 每 一 对 孢子
的 基因 型 总 是 相同 的 。 后 来 在 面包 酵母 和 姜 生 闫 壳 菌 等 菌 中 发 现 一 些 不 正常 的 分
离 现象 。 在 姜 生 美 壳 菌 的 野生 型 黑色 子宫 孢子 和 突变 型 灰色 子宫 抱 子 的 杂交
(gxXg ) 中 ， 曾 观察 了 200 000 个 子 赛 ， 其 中 绝 大 部 分 属于 正常 的 4:4 类 型 ，
不 正常 的 分 离 类 型 包括 : 5$:3120 个 ， 占 0.06%; 6:2100 个 ， 占 0.05% ; 不 规则
的 4:416 个 , 占 0.008%。

图 6-13A 表示 一 个 不 正常 的 4:4 子 襄 ，

其 中 gr 和 g 的 分 离 是 不 正常 的 ，A 和 a 的 | earaamr
分 离 是 正常 的 。 图 6-13B 表示 一 个 5:3 不 | 人

正常 分 离子 圳 ， 其 中 从 上 往 下 数 第 三 对 息 oa 重组 子
子 对 于 接合 型 来 说 是 正常 的 ， 可 是 对 于 g | CO ER
来 说 则 是 不 正常 的 ， 说 明 在 这 里 分 离 发 生 “| 人)

在 减 数 分 裂 后 的 有 丝 分 裂 过程 中 ， 所 以 称 8A 重 组 和 子
为 减 数 分 裂 后 分 离 。 一 个 等 位 基因 的 6:2 | 人 2 ga 非 重组 孢子
和 5:3 分 离 也 叫 基因 转换 。 对 几 种 真菌 和 Co/

果 蝇 的 不 同性 状 的 观察 使 人 想到 基因 转换 | /、

过 程 与 减 数 分 裂 后 分 离 及 交换 是 相互 联系

的 ， 这 种 关联 是 同一 步骤 所 产生 的 结果 ， 图 6813 未 让 站 分 离子 豆

即 单 链 多 核 苷 酸 之 间 的 配对 和 交换 ， 并 且

形成 异 源 双 链 区 。

异 源 双 链 区 的 形成 可 用 来 解释 减 数 分 裂 后 分 离 ， 也 可 以 用 来 解释 转换 ， 这 两
种 现象 的 区 别 在 于 异 源 双 链 区 形成 的 步骤 。

异 源 双 链 区 是 由 于 交换 造成 两 个 仅 一 个 bp 不 同 的 标志 (如 b 和 B) 而 形成
的 ， 这 样 形成 一 个 错 配 的 碱 基 对 (图 6-14)。 〇 DI 中 没有 错 配 修复 ， 这 样 每 个 错 配
的 链 复制 后 产生 一 个 带 野生 型 等 位 基因 的 DNA 分 子 和 一 个 带 突变 型 等 位 基因 的

.177 ，

机 二 人 9 人 :
二 工 二 间 和 | 1 1 1
Al | A | 1a 1a A A a | 1 al
和 11 ， 减 数 分 裂 1
b||b 二 b b|,BB!|b B|，
NS 上 1 |
d||4d | ID 11D d 加 十 沁 D|，
了 1
IJ 四
L 无 错 配 修复 IT 一 个 错 配 被 修复 bB 乓 全
和 | 有 丝 分 列 | 有 丝 分 列
Abd Abd Abd
Abd Abd Abd
AbD ABD ABD
ABD ABD ABD
aBd aBd aBd
abd abd aBd
aBD aBD aBD
aBD aBD aBD
B:b=4:4 B':6=5:3 瓦 :二 祭 :2

图 6-14 在 三 种 不 正常 子 赛 形成 中 错 配 修复 的 作用

DNA 分 子 。 因 为 两 个 分 子 带 有 错 配 碱 基 对 ， 所 以 减 数 分 裂 产生 两 对 含 不 同 成 员
的 孢子 ，B:b 是 4:4， 但 子 吉 是 不 正常 的 4:4 类 型 。@II 中 错 配 修复 将 分 子 2 异
源 双 链 区 中 的 b 改正 为 B (b 被 切除 ，B 作 模 板 )， 结 果 产 生 含 不 同 成 员 的 驳 隆
对 ，B:b 是 $:3。@ 在 III 中 两 个 错 配 碱 基 对 被 以 同样 的 方向 修复 ， 即 b 改 成 B，
所 以 所 胸 子 对 均 含 相同 成 员 ，B:b 是 6:2。

图 中 的 不 正常 4:4 与 两 旁 标志 重组 的 转换 子 吉 相 关联 ， 另 外 图 中 有 一 半 非 正
常 子囊 中 的 侧 旁 标志 是 非 重组 的 ， 对 于 这 些 问 题目 前 的 解释 如 下 : 在 DNA 分 子
配对 的 某 一 步 形 成 异 源 双 链 区 ， 配 对 分 子 的 分 离 需要 在 每 条 多 核 苷 酸 链 中 产生 两
个 切口 ， 这 样 可 能 发 生 两 种 排列 方式 ， 一 种 是 产生 侧 旁 标志 重组 子 吉 ， 另 一 种 是
产生 非 重组 子囊 。

第 四 节 ，” 同 源 重 组 模型

1964 年 Robin Holliday 的 创新 模型 中 首次 提出 形成 的 异 源 双 链 区 随后 被 错 配
修复 。Holliday 模型 的 一 个 重要 推论 是 预言 了 一 个 结构 ， 现 已 证 明 这 个 结构 是 存
在 的 。 现 在 Holliday 模型 已 被 修改 多 次 ， 本 节 叙 述 的 第 二 个 模型 是 重要 的 修改 模

178 ，

型 之 一 ， 虽 然 此 模型 的 细节 可 能 会 因为 所 获得 的 更 多 的 资料 而 被 修正 ， 但 它 总 能
很 好 地 描述 发 生 在 真菌 中 的 交换 过 程 。

一 、Holliday 模型

Holliday 模型 和 以 后 的 修改 模型 都 是 为 了 说 明正 常 子宫 、 基 因 转 换 和 减 数 分
裂 后 分 离 的 原因 和 说 明 不 正常 子宫 与 交换 的 关系 。Holliday 模型 如 图 6-15。 模 型
申 的 步骤 如 下 : @ 联 会 中 的 两 条 染色 体 ( 双 链 DNA 分 子 ) 中 的 两 条 单 链 在 同 源
位 置 被 一 种 目前 还 不 清楚 的 机 制 打 断 。@ 在 每 个 断裂 的 地 方 双 螺旋 稍微 解 开 ， 释
放出 单 链 。@ 释 放 的 单 链 通过 与 另 一 分 子 中 没有 断裂 的 链 互补 配对 而 在 两 个
DNRA 分 子 间 进 行 交 换 ， 形 成 一 个 由 于 单 链 交叉 而 使 两 个 DNA 分 子 连 结 在 一 起 的
结构 。 多 对 称 地 产生 切口 ， 两 个 DNA 分 子 分离 。 切 口 可 以 在 两 个 不 同 的 位 置 产
生 [图 6-15 (b) 中 所 示 ]， 如 果 从 箭头 1 和 2 处 切 开 ， 产 生 〈c) 中 的 两 个 非 重
组 分 子 ， 而 如 果 从 箭头 3 和 4 处 切 开 ， 产 生 (d) 中 的 两 个 重组 分 子 。 这 种 使 两
个 参与 重组 的 DNA 分 子 分 离 的 切割 过 程 叫 解 离 。

(3) 入

3
二 的 Te 2 于/ 到 抽 直 填 aa

(b) 1 一 X 一 :2 Holliday 中 间 体

加
在 箭头 1 和 2 产生 在 箭头 3 和 4 产生
切口 并 正确 连接 切口 并 正确 连接

(9) (d)

(e) 8 形 Holliday 中 间 体

图 6-15 ”Holliday 模型

Holliday 模型 为 不 正常 分 离 和 交换 之 间 的 联系 提供 了 分 子 基础 。 基 因 转 换 和
减 数 分 裂 后 分 离 是 由 于 含有 异 源 双 链 区 的 DNA 对 称 结构 中 的 一 条 或 两 条 染色 体
上 发 生 错 配 修复 或 无 错 配 修复 而 产生 的 。 此 模型 已 解释 了 在 侧 旁 标 志 不 重组 的 情

3

况 下 发 生 5:3 和 6:2 的 分 离 。 如 图 6-15 (b) 中 ， 一 个 Holliday 交叉 通过 切口 配
对 可 产生 两 侧 标志 重组 或 不 重组 的 子 吉 ， 如 果 以 东西 方向 切割 (箭头 ] 2 处 六
则 产生 侧 旁 标志 不 重组 的 子宫 ， 如 果 切 割 以 南北 方向 (箭头 3、4 处 ) 进行 ， 则
侧 旁 标志 重组 。 如 果 这 两 种 切割 大 致 相等 ， 将 可 观察 到 有 一 半 的 5:3 和 6:2 子宫
的 侧 旁 标志 是 重组 的 。

这 种 交叉 区 已 在 几 种 生物 DNA 中 得 到 证 实 ， 这 种 结构 叫 Holliday 交叉 ， 也
称 为 Holliday 结构 ， 当 交叉 以 一 个 “ 开 - 盒 ” (open-box) 构象 存在 时 非常 容易
辨认 ， 当 Holliday 结构 的 一 个 组 成 部 分 旋转 180" 时 ， 将 产生 “ 开 一 盒 ” 式 分 子
(图 6-16)。

图 6-16 ”Holliday 结构 的 不 同 构象
(a) 按 箭 头 方向 旋转 后 产生 开 盒 结构 。(b) 入 噬菌体 DNA 分 子 之 间 形 成 交叉 的 电镜 照片 。

二 、 不 对 称 链 转移 模型

不 对 称 链 转移 模型 保留 了 Holliday 模型 的 同 源 单 链 连 接 、 存 在 异 源 双 链 区 、
产生 Holliday 交叉 、 切 割 分 离 和 错 配 修复 等 特征 ， 不 同 的 是 最 初 的 配对 是 不 对 称
的 ， 主 要 是 根据 对 酵母 等 研究 的 数据 。 在 最 初 的 相互 作用 中 ， 只 为 受 体 DNA 分
子 提供 一 个 单 链 ， 异 源 双 链 区 只 在 入 侵 的 分 子 中 形成 。 随 着 入 侵 链 复制 的 扩大 和
支 链 迁 移 ， 异 源 双 链 区 扩大 并 以 新 的 形式 重 排 〈 异 构 化 )， 在 两 个 分 子 中 形成 蜡
源 双 链 区 。 第 二 个 区 别 是 某 些 转换 子宫 可 以 不 通过 错 配 修复 而 形成 。 不 对 称 链 转
移 模 型 如 图 6-17， 具 体 步 又 如 下 :

1) 两 个 分 子 中 其 中 的 一 个 单 链 上 产生 切口 。 该 模型 中 假设 只 有 一 条 链 被 打
靳 ， 而 在 Holliday 模型 中 ， 两 个 分 子 中 都 产生 切口 。

2) 替换 (displacement)。 在 一 种 DNA 聚合 酶 的 作用 下 ， 切 口 3-OH 自由 来
端 加 上 一 些 核 苷 酸 替 换 了 原来 的 多 核 苷 酸 ， 从 而 产生 一 单 链 分 支 ， 此 分 支 用 于 下
一 步 的 互补 配对 。

3) 侵入 (invasion)。 可 能 在 RecA 类 和 蛋白 的 帮助 下 ， 单 链 分 支 侵入 到 双 链
分 子 中 。

"， 晶 80

引 太 环 切割 (loop cleavage)。 在 单 链 分 一
术 炎 和 后 由 被 侵 六 的 双 链 分 子 中 的 一 条 链 ) 和 TI
册 十 侵入 者 所 代替 ， 被 替代 的 链 在 酶 作用 下 一

除去 ， 除 去 过 程 可 能 是 起 初 断 开 ， 随 后 被 |

内 切 核酸 酶 或 外 切 核酸 酶 或 两 种 酶 作用 -

除去 。 ER
ESD) 二 述 第 不 乾 中 一 一，

形成 的 缺口 的 3-OH 可 被 DNA 聚合 酶 延长 |

有 步 中 所 述 过 程 相同 )， 并 被 连接 酶 js
过 本 到 侵入 的 那 条 DNA 链 上 ， 进 而 献 D NAN
全 侵 大 链 与 被 侵入 分 子 能 更 多 地 一，
配对 ， 在 这 一 点 形成 对 称 中 间 体 。 配 对 是 |

稳定 的 ， 但 只 存在 一 个 异 源 双 链 区 ( 指 上
面 分 子 中 )， 因 为 复制 过 程 由 于 填补 了 缺口
而 引起 下 面 分 子 中 的 一 条 链 的 移动 和 转移 。
在 Holliday 模型 中 ， 缺 口 通过 上 面 分 子 中
的 一 条 链 癌 下 转移 来 填补 ， 所 以 可 以 存在
两 个 异 源 双 链 区 。

6) 异 构 化 。 参 与 重组 的 两 个 DNA 分 ||
于 的 每 荣 链 发 生 重 排 并 且 形 成 Holliday 交 -一 _ ”-
又 。Helliday 结构 中 的 链 交换 变 成 新 的 骨架 ， yx，
链 ， 前 边 的 骨架 链 变 成 新 的 Holliday 交 叉 。 ES

7) 支 链 迁 移 。Holliday 交叉 迁移 (如 图 人 |
和) 产生 一 个 具有 两 个 异 源 双 一 一 一 一 一 一
链 区 的 对 称 排列 ， 这 是 由 于 在 同化 和 支 链 迁 > 7
移 中 碱 基 配 对 的 移动 。 当 解 离 发 生 时 ,切口 “一 ------
本
0 图 6-17 ”不 对 称 链 转移 模型

8) 解 离 (resolution)。 分 子 分 离 与 Holliday 模型 中 一 样 ， 也 存在 选择 南 -北向
或 东 - 西 向 切割 的 问题 。

6-18 可 以 用 不 对 称 链 转移 模型 解释 真菌 中 减 数 分裂 重 组 的 结果 。 图
6-18 (〈a) 表 明 通 过 异 构 化 而 没有 支 链 迁 移 形 成 的 不 对 称 中 间 体 解 离 的 产物 。 不 对
称 链 转移 模型 南 - 北 切 割 侧 旁 标志 不 是 重组 体 ， 而 东 - 西 切割 产生 重组 体 ， 两 种 情
总 下 ， 两 个 分 子 中 只 有 一 个 异 源 双 链 区 ， 重 组 排列 在 左边 可 以 解释 不 对 称 的 5:3 分
离 。 图 6-18 (b) 表明 通过 异 构 化 和 支 链 迁移 所 形成 的 对 称 中 间 体 产物 的 交替 配对 。
存在 两 个 异 源 双 链 区 的 结构 通过 错 配 修复 产生 错误 的 4:4，5:3 和 6:2 分 离 。 不 对

。 181 ，

称 链 转移 模型 不 包括 对 称 中 间 体 经 过 支 链 迁 移 而 不 经 过 异 构 化 形成 过 程 的 可 能 性 ，
在 这 种 情况 [图 6-18 (c)] 中 ， 重 组 和 非 重组 体 的 形成 分 别 通过 南 - 北 和 东 - 西 切割
过 程 。
(a) 不 对 称 中 间 体 经 过 异 构
作用 无 支 链 迁 移
3 在 1 和 2
， 产生 切 昌 下
站
SR

人 在 3 和 4 十 | sa

4 产生 切 卓 一半

(b) 对 称 中 间 体 经 过 异 构
化 作用 和 支 链 迁 移

全 - | maz
1 一 XCe2
村 3 和 4 产 、 一 时 | +

(c) 对 称 中 间 体 经 过 支 链 迁
移 ， 无 异 构 化 作用

3 和 2 产

TREE 十 ER
1]-> yx 2 <

3 和 4 产 屋 | aaz

4 生 切 口

图 6-18 对称 和 不 对 称 中 间 体 变换 产生 不 同 产物
三 、8 字形 分 子 的 解 离

图 6-19 表示 两 个 环 状 分 子 由 于 交叉 形成 的 8 字形 分 子 可 以 通过 三 种 方式 切 有
割 。 如 果 将 8 字 分 子 的 上 边 环 转 180" 则 形成 一 个 开 环 结构 ， 首 先 假设 这 个 结构 易 ，
发 生 断 裂 ， 上 且 断 裂 只 发 生 在 一 个 单 链 区 域 ， 如 图 中 箭头 所 示 的 四 个 位 点 ， 断 裂 后
将 产生 三 种 类 型 的 分 子 ， 这 三 种 形式 在 不 同 的 系统 中 将 起 很 不 同 的 作用 。 例 如
如 果 参 与 重组 的 是 细菌 或 真菌 的 DNA 分 子 ， 不 管 是 二 聚 体 或 滚 环 式 复制 都 必须
加 工 成 单个 基因 组 长 度 的 分 子 ， 但 如 果 是 在 入 噬菌体 系统 中 ， 产 生 单 体 分 子 将 会
导致 死亡 ， 因 为 入 叭 菌 体 在 包装 时 必须 存在 两 个 COS 位 点 ， 只 有 二 聚 体 或 滚 环
(继续 复制 ) 复制 才能 产生 重组 叹 菌 体 。 关 于 滚 环形 式 介 导 重 组 还 无 任何 证 据 ;
但 RecA- 的 细菌 中 的 小 质粒 常 发 生 二 聚 化 。

多

,=~、 一 个 环 相对 于 另 上 人 志 生 。

5- 、\\、 一 个 环 旋转 180” AR

人 1 ve 1

ER |
一 一 仇 和 二

按 2、4 箭头 切 开 按 1、3 箭头 切 开 按 1、2 或 3、4 箭头 切 开
图 6-19 8 字形 分 子 的 变换

第 五 节 RecA 和 RecBCD 和 旦 昌 在 重组 中 的 作用
一 、RecA 重 白
在 体外 RecA 蛋白 能 使 Holliday 结构 产生 ，RecA 蛋白 启动 单 链 转移 到 双 链

DNA 分子 中 ， 紧 接着 发 生 交 换 。 图 饼 20 表示 在 体外 RecA 蛋白 使 两 个 双 螺 旋
(其 中 之 一 在 一 端 产生 一 个 切口 ) 完整 的 重组 接合 ， 当 退火 时 由 RecA 蛋白 驱使 到

RecA

图 6-20 RecA 和 蛋白 在 体外 介 导 的 重组 反应 模型
可 183 e

gap 处 [图 6-20 (c)]， 当 上 边 分 子 gap (切口 ) 的 左边 松 旋 时 ， 结 合 处 将 扩散 到
整个 双 螺 旋 区 ， 同 时 在 交换 的 右边 形成 第 二 个 杂交 双 螺 旋 [图 6-20 (d)]。 这 就
说 明 RecA 蛋白 可 能 引导 交换 位 点 的 左边 区 域 形 成 四 链 螺旋 区 ， 促 进 整 个 双 螺 旋
区 的 链 的 交换 (图 6-21)。

双 链 DNA 配对 (四 链 DNA 螺旋 ) 杂 合 双 链 DNA
支 链 迁 移 方向

图 6-21 重组 中 的 DNA 四 链 螺 旋

图 6-22 是 一 个 精细 的 反应 模型 ， 可 用 来 解释 当 RecA 蛋白 结合 到 DNA 上 一 ，
远离 末端 的 切口 时 ， 在 细胞 内 如 何 启动 重组 。RecA 蛋白 作用 的 靶 DNA 双 螺 旋
中 必须 产生 一 个 切口 ， 提 供 一 个 自由 未 端 并 由 此 链 互相 缠绕 形成 双 螺 旋 。 现 已 发
现 一 些 参与 重组 的 蛋白 质 的 内 切 核酸 酶 活性 。
DNA 损伤

5 全
中 证 下
记 结合 在 交 口 的 RecA 蛋白 。
沈

DNA 同 源 区 对
损害 的 片段 发 生
部 分 的 特异 性 退火

自由 末端 互相 缠绕 以 扩大 退火

S
太

进一步 退火 和 支 链 迁 移

|
损伤 可 以 从 切除 途径 修复

窒 口 转移 到 第 二 条 链 中
DNA 聚合 酶 可 以 填补

图 6-22 ”从 一 个 欠 口 处 起 始 重组 的 类 似 途 径

.184 ，

二 、RecBCD 酶

大 肠 杆菌 RecBCD 酶 具有 多 种 活性 : 解 旋 酶 活性 、 外 切 核酸 酶 活性 和 ATP
酶 活性 。RecBCD 酶 复合 物 由 刁 .coli recB、7yecC、 yecD 基因 编码 的 蛋白 组 成 ，
专 一 地 识别 DNA 上 的 断裂 处 ， 这 种 断裂 可 由 细菌 接合 转移 、 鸣 菌 体 的 转 导 以 及
射线 照射 和 某 些 化 学 物质 处 理 后 产生 。 在 体外 系统 中 ， 纯 化 的 RecBCD 酶 可 识别
并 结合 于 DNA 的 平 齐 末端 〈 等 于 双 链 DNA 的 断裂 处 ) 后 沿 DNA 移动 ， 在 移动
的 同时 依赖 其 解 旋 酶 活性 解 开 双 螺 旋 (图 6-23)， 它 的 3 一 $ 外 切 核 酸 酶 活性 和
5 一 3 外 切 核酸 酶 活性 降解 两 个 单 链 ， 当 到 达 CHI 位 点 时 ，3 一 $ 外 切 核酸 酶 活
性 降低 ， 解 旋 继 续 进行 并 且 S$ 一 ~3 “外 切 核 酸 酶 活性 增强 而 产生 单 链 3 末端， 此 时
RecD 解 离 出 来 ，RecBC 继续 前 进 ， 产 生 的 单 链 3 末端 由 RecA 蛋 日 结合 覆盖 形
成 重组 末端 (recombinogenic end)。

SG GGTGG RecBCD

5 3，
3/ 9

Rec BCD 的 解 旋 酶 活性
使 DNA 松 旋 , 其 外 切 核 酸 酶
活性 降解 两 个 单 链

在 CHI 位 点 ,3 一 5' 外 切 核酸 酶 活
性 降低 ，5' 一 3' 外 切 核酸 酶 活性 增
人

名 全

RecA 蛋白

图 6-23 -由 .coi Rec BCD 酶 介 导 的 重组 的 起 始

在 研究 入 叹 菌 体 突变 株 时 发 现 和 DNA 上 只 改变 一 个 碱 基 对 就 可 以 创造 出 一

个 激发 重组 的 位 点 ， 这 个 位 点 称 为 CHI 位 点 。CHI 位 点 的 一 致 序列 为 不 对 称 的

8bp 序列 ;35'GCTGGTGG3”。 在 大 肠 杆 菌 染 色 体 上 约 每 5 一 10kb 就 有 一 个 CHI
3'CGAGQCACCS'

序列 ， 这 为 RecBCD 酶 提供 了 许多 机 会 。 在 正常 细胞 里 这 种 序列 对 RecBCD 酶 通

二 驻 “

负 是 不 合用 的 ， 因 为 这 些 DNA 没有 上 自由 末端 ， 但 对 于 细菌 接合 转移 ， 鸣 菌 体 转
导 中 的 重组 特别 重要 。 事 实 上 ， 正 是 RecBCD 酶 在 入 鸣 菌 体重 组 中 的 功能 才 导 致
了 CHI 位 点 的 发 现 。

三 、 参 与 同 产 重组 的 其 他 委 白 质

1. Ruv 蛋白

Ruv 蛋白 参与 同 源 重 组 中 支 链 迁 移 和 Holliday 结构 的 解 离 。 虽 然 Holliday 结

构 的 形成 依赖 于 RecA 蛋白 ， 但 结构 的 维持 却 不 需要 RecA 蛋白 。 除 去 RecA 蛋白

后 留 下 的 稳定 Holliday 结构 可 用 于 支 链 迁移 和 解 离 的 研究 。Holliday 结构 中 交叉

点 的 迁移 可 由 大 肠 杆 菌 Ruv A 和 RuvB 和 昌 白 有 效 地 催化 〈 图 6-24)。 进 一 步 的 研

究 显示 ，Ruv A 专 一 地 识别 Holliday 交 义 点 ，Ruv B 的 解 旋 酶 活性 对 支 链 迁 移 的

近期 的 研究 已 经 清楚 地 了 解 了 这 两 种 蛋白 的 作用 。 有 活性 的 Ruv A 以 四 聚
体形 式 与 Holliday 交叉 点 结合 ，

Ga) 合成 的 交叉 链 5 ----- 圭 -------- 和 -3 使 交叉 点 形成 非 折 友 状 态 的 四
En 5 方形 平面 构象 并 保持 4 条 DNA
人 )，，” 单 链 片段 处 于 分 离 态 。Ruv A

5 蛋白 的 结合 诱导 两 个 环 状

RuvAandRuvBAE (ring-like)- 六 聚 体 Ruv B 蛋 自

-- 二- 与 Ruv A 复合 物 周 围 的 双 链
人 DNA 上 对 应 的 两 个 位 点 结合
ER 到 [图 6-25 (a)]， 水 解 ATP 供
RuvA and RuvB,ATP 能 ，Ruv B 六 聚 体 环 〈ring )

起 分 子 泵 作用 ， 推 动 两 个 双 链

(c) 松 旋 9 DNA 分 子 进 入 Ruv A 复合 物 ，
RE 分 开 4 条 DNA 链 ， 然 后 将 两

0 SS 个 异 源 双 螺旋 区 从 Ruv A 复合

物 中 挤 压 出 去 ， 接 着 就 是 支 链

人 b) 支 链 迁 移

由 局 | : 迁移 。 两 个 Ruv C 内 切 核 酸 酶
和 结合 到 Ruv A /Ruv B 复合 物 上
“ 信 、 并 在 相对 180* 的 两 个 位 点 切 开

DNA, 经 连接 酶 连接 后 产生 重组
图 6-24 由 .coi 重 日 RuvA 和 RuvB 催化 的 文 链 迁 移 (或 非 重 组 ) 的 伟 异 源 双 链 区 的

DNA 分 子 [图 6-25 (b)]。
。，186 。

S

支 链 迁移

(7 下
四 ss RARRRRRRRRRRNRRRNRRRRRRRPRRARRAAPRSR
人 @ D e
全 四 中
xsSSSSREGRSRSAARRRRR
忆
一 一

图 6225 开 .col 蛋白 在 支 链 迁移 和 Holliday 连接 处 解 离 中 的 作用

2. 真 核 同 源 重 组 酶

所 有 真 核 细 胞 包括 人 类 细胞 产生 的 重组 相关 蛋白 在 结构 和 功能 上 都 与 大 肠 杆

苗 中 的 RecA、RecBCD、Rauv A、Ruv B、Ruv C 类 似 ， 例 如 在 人 和 酵母 中 的

RAD51 蛋白 ， 它 在 催化 同 源 DNA 片段 配对 、 介 导 单 链 插 入 以 及 顺序 的 同 源 方 面
187 ，

都 与 RecA 类 似 ， 而 且 已 在 细菌 和 真 核 细 胞 中 发 现 有 同 源 蛋 白 。 由 此 可 见 在 所 有
类 型 的 细胞 里 参与 同 源 重 组 的 分 子 及 同 源 重 组 机 制 几乎 是 类 似 的 。

3. Cre 蛋白 和 其 他 重组 酶

Cre 蛋白 和 其 他 重组 酶 催化 位 点 专 一 性 重组 。 重 组 酶 识别 位 点 专 一 性 重组 申
的 两 个 DNA 分 子 中 相对 短 的 独特 顺序 并 催化 两 个 分 子 的 连接 。 在 原核 和 真 核 细
胞 中 已 经 发 现 了 几 种 位 点 专 一 性 重组 。

专 一 位 点 重组 研究 得 最 为 充分 的 例子 是 入 鸣 菌 体 在 宿主 染色 体 特 殊 位 点 的 整
合 。 整 合 可 在 体外 进行 ， 只 需要 整合 酶 和 宿主 编码 的 整合 因子 。 整 合 酶 也 催化 原
鸣 菌 体 的 割 离 。

对 P1 鸣 菌 体 编 码 的 Cre 蛋白 催化 位 点 专 一 性 重组 的 机 制 了 解 得 最 为 清楚
当 P1 复制 时 ， 产 生 很 长 的 多 聚 体 DNA， 通 过 多 聚 分 子 上 loxP 位 点 的 重组 产生
P1 羊 体 分 于 习 图 :6-26)。

loxP 位 点

PIDNA
单 体

P1 单 体

图 6-26 Cre 和 蛋白， 由 叭 菌 PI 编码 ， 催 化 多 聚 体 环 状 P1 DNA 上 loxP 位
点 之 间 的 位 点 专 一 性 重组

Cre 蛋白 与 入 的 整合 酶 在 结构 与 功能 上 都 非常 类 似 ， 甚 至 连 P1 单 体 分 子 央
多 聚 体 割 离 的 机 制 也 与 和 原 喉 菌 体 的 割 离 类 似 。

Cre 蛋白 催化 的 重组 见 图 6-27， 这 个 机 制 中 涉及 连续 的 两 个 中 间 体 ， 在 中 间
体 中 Cre 和 DNA 通过 磷酸 酷 氨 酸 键 共 价 连接 ， 类 似 于 Topo II 与 DNA 之 间 的 连
接 (图 6-28)， 第 一 个 Cre- DNA 中 间 体 反应 产生 类 似 Holliday 结构 ， 第 三 个 反
应 产生 重组 体 双 链 DNA 产物 。 通 过 研究 突变 的 DNA 分 子 或 是 在 loxP 位 点 断裂
的 分 子 ， 研 究 者 已 能 阻 断 Cre 蛋白 在 中 间 体 中 的 几 步 催化 反应 〈 图 6-29)。

，188 ，

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重组 DNAs Cre-DNA 中 间 体 I
图 6-27 ”CreloxP 位 点 专 一 性 重组 的 机 制
双 - 链 螺旋
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3 负 超 螺旋 DNA- 酶 介 导 下

拓扑 异 构 酶

图 6-28 .coli 拓扑 异 构 酶 I 的 活性

.189 ，

图 6-29 根据 位 点 专 一 性 重组 中 CreDNA 中 间 体 I 的 X 射 线 结 晶 学 的 Ribbon 模型

LoxP 鼠 Cre 鼠
尺
指 插 虽 双 呈 腹 持 持 搬 虽 加 类 拓 拓
Exon 1 Exon 2 Exon3 细胞 - 类 型 -特异 性 cre
LoxP LoxP 启动 子
所 有 细胞 携带 具有 外 显 子 2 携带 Cre 转 基因 鼠 的 所 有 细胞 是
侧 旁 loxP 的 内 源 基因 X 为 了 逆 除 基因 X 的 杂 合 子
|

LoxP-Cre 鼠 : 所 有 细胞 都 携带 一 拷贝 的 loxP- 修饰 的
无 基因 和 Cre 基因 ， 一 拷贝 的 也 基因 被 敲 除

细胞 不 表达 Cre 细胞 表达 Cre

] 2

基因 功能 正常

| 2 |

] 3
基因 功能 被 终 断
6-30 利用 loxP-Cre 重组 系统 进行 细胞 -类 型 -特异 性 基因 吻 除

7

P1 喉 菌 体 的 重组 酶 系统 为 发 育 生 物 学 研究 中 的 基因 剔除 提供 了 有 用 工具 。
经 典 的 基因 吻 除 老鼠 是 通过 图 6-30 中 的 程序 建立 的 。P1-loxP 重组 酶 系统 已 能 使
研究 者 建立 仅 在 某 一 特别 组 织 中 缺失 特殊 目的 基因 的 动物 ， 这 样 的 组 织 特异 性 基
因 吻 除 老 鼠 使 研究 者 能 对 成 年 动物 某 一 组 织 中 任 一 基因 的 功能 进行 研究 。

4 和 发。

第 七 量 将 了 录

基因 表达 的 完成 必须 通过 遗传 信息 从 DNA 到 RNA， 然 后 从 RNA 到 蛋白 质
这 样 的 过 程 。RNA 分 子 以 DNA 分 子 的 一 条 链 为 模板 ， 在 依赖 于 DNA 的 RNA
聚合 酶 (DNA-dependent RNApolymerase) 催化 下 合成 (图 7-1)。 依 赖 于 DNA
的 RNA 聚合 酶 也 简称 为 RNA 聚合 酶 (RNA polymerase)。RNA 分 子 合成 的 起
始 、 延 长 、 终 止 的 过 程 叫 转录 。

图 7-1 RNA 只 从 DNA 分 子 的 一 条 链 拷贝

转录 必须 从 两 个 方面 进行 讨论 ， 第 一 是 转录 的 酶 学 ， 第 二 是 决定 转录 在
DNA 分 子 上 的 什么 位 点 开始 和 停止 的 信号。

第 一 节 “RNA 的 酶 促 合 成
一 、RNA 酶 促 合成 的 基本 特征

1) RNA 合 成 的 底 物 是 $ -三 磷酸 核 苷 酸 (NTP)， 包 括 ATP、GTP、CTP 和
UTP， 每 个 NTP 的 3 位 和 2 位 碳 原子 上 各 有 一 个 一 OH。

2) 在 聚合 酶 作用 下 ， 一 个 NTP 的 3-OH 和 另 一 个 NTP 的 5-P 反 应 ， 去掉

3) RNA 的 碱 基 顺 序 由 其 模板 DNA 的 顺序 决定 ，NTP 依靠 与 DNA 上 的 碱
基 配 对 的 亲和力 被 选择 ， 这 一 点 与 DNA 复制 相同 ， 只 是 dTTP 由 UTP 代替 。

4) 在 开始 转录 的 双 链 DNA 分 子 的 任何 一 个 特定 区 域 都 是 以 单 链 为 模板 ， 如
图 7-1。

$) RNA 合 成 的 方向 是 从 $ 一 3"， 单 核 苷 酸 只 加 到 3-OH 上 上， 新生 RNA 链
与 其 模板 DNA 链 呈 反 向 平行 。

6) RNA 的 合成 中 不 需要 引物 〈 这 一 点 与 DNA 的 合成 不 同 )。

”2

7) 只 有 5 -三 磷酸 核 苷 酸 挫 入 到 RNA 的 合成 中 ， 所 以 起 始 转录 处 的 第 一 个
核 苷 酸 5$ 未 端 具有 三 磷酸 结构 ， 其 3-OH 是 下 一 个 核 苷 酸 的 接触 点 ， 因 而 这 样
从 成 的 RNA 分 子 的 5 末端 具有 三 磷酸 。

二 、 大 肠 杆菌 RNA 聚合 栈

大 肠 杆 菌 RNA 聚合 酶 (下 .coii RNApolymerase) 由 多 亚 基 组 成 ， 全 酶 分 子
质量 为 465 000Da (图 7-2)。 通 过 对 大 肠 杆菌 突变 株 的 研究 ， 已 经 证 明 组 成 全 酶
的 五 种 亚 基 由 四 个 基因 编码 。RzpoAa 编码 w 亚 基 ，rzoB 编码 B 亚 基 ，rzocC 编码
忆 亚 基 ，rzopD 编码 c 亚 基 。

基因 功能
酶 的 装配
1po4d “2o 亚 基 启动 子 识别
(各 40kDay) 结合 一 些 激 活 因子
7PoB 亚 基
(155kDa)
催化 中 心

1PoC 及 亚 基
(160kDa)

D G 亚 基

(32~90kDa) 启动 子 特异 性

已 coi 酶 =465 kD

图 7-2 真 细 菌 RNA 聚 合 酶 具有 4 类 亚 基
a B 和 的 大 小 在 不 同 的 细菌 中 相当 恒定 ，c 亚 基 的 大 小 在 不 同 的 细菌 中 变化 较 大 。

5 亚 基 很 容易 从 全 酶 上 掉 下 来 ，c 亚 基 在 酶 作用 的 某 个 阶段 掉 下 来 之 后 ， 笨
下 的 oB， 称 为 核心 酶 (core enzyme)， 而 BB'c 称 为 全 酶 。c 是 识别 因子 。 在

下 .colii 中 ，rRNA、tRNA 和 mRNA 均 由 同一 种 酶 即 RNA 聚合 酶 (opBp'c) 催化
合成 。

在 RNA 聚合 酶 的 各 亚 基 中 ，a、B 和 B 亚 基 对 酶 活性 的 重组 是 必需 的 ， 核 心

493 。

酶 具 众 化 活性 ， 其 作用 是 识别 DNA 分 子 上 RNA 合成 的 起 始 信号 。 但 c 亚 基 不
能 单独 与 DNA 结合 ， 它 结合 到 核心 酶 后 可 能 引起 酶 构 型 的 变化 ， 因 而 改变 核心

酶 与 DNA 结合 的 特性 。 根 据 单个 亚 基 或 单个 亚 基 聚集 体 的 功能 特征 研究 以 及 亚

基 的 特异 探 针 和 变异 体 混 合 重 组 的 研究 ，B 亚 基 是 仅 有 的 可 以 单独 与 DNA 结合
的 亚 基 ， 它 参与 RNA 聚合 酶 与 模板 的 反应 ， 同 时 B 亚 基 也 参与 核心 酶 和 亚 基
的 结合 以 及 转录 的 终止 。B 亚 基 具 有 利 福 霉 素 和 链 霉 素 的 结合 点 ， 也 与 c 和 a 亚
基 的 结合 有 关 ， 它 参与 RNA 链 的 引发 和 延伸 ， 催化 底 物 形成 磅 酸 二 酯 键 。B
(或 B) 亚 基 也 可 与 终止 因子 o 发 生 直接 反应 。a 亚 基 具有 与 B 亚 基 的 结合 位 点 ，
参与 特定 的 基因 表达 ， 可 能 与 酶 和 DNA 上 的 启动 区 域 的 反应 有 关 。
除了 四 个 多 肽 亚 基 外 ， 大 肠 杆菌 RNA 聚合 酶 还 含有 2 个 Zn 原子 与 B 亚 基 相
连接 。 无 论 在 体外 或 体内 ，RNA 聚合 酶 通过 下 列 几 步 反应 聚集 而 成 :
o 十 有 一 oz 有 B
o2B+B 一 ozBB-
o2B8 +co 一 azBB
细菌 RNA 聚合 酶 在 体外 低 离子 强度 下 会 发 生 一 种 可 逆 的 凝聚 。 例 如 大 肠 杆
菌 全 酶 在 0.1moVL 以 上 离子 强度 时 以 单 体 存在 ， 在 较 低 的 离子 强度 下 则 形成 二
聚 体 ， 核 心 酶 在 较 低 离子 强度 下 则 是 以 六 聚 体 以 上 的 多 聚 体 形式 存在 。
所 有 RNA 聚合 酶 除了 都 具有 相同 的 功能 ， 即 合成 RNA 以 外 ， 还 可 能 与 转

录 调 节 有 关 。 如 枯草 杆菌 芽 移 化 是 与 因子 的 失去 和 有 B 亚 基 的 修饰 联系 在 一 起

的 ， 因 而 枯草 杆菌 的 RNA 聚合 酶 突变 株 可 阻止 该 菌 的 芽孢 化 过 程 。

原核 生物 RNA 聚合 酶 能 催化 所 有 类 别 RNA 的 生物 合成 ， 但 其 活性 能 被 利
福 平 等 药物 抑制 。

RNA 聚 合 酶 很 大 ， 它 与 DNA 结合 时 覆盖 DNA 的 范围 大 约 是 40bp (base
pair)， 这 个 范围 是 通过 RNA 聚合 酶 与 DNA 结合 后 再 用 核酸 酶 降解 DNA 的 方法
确定 的 。 当 用 DNA 酶 对 DNA 进行 降解 处 理 时 ， 由 于 RNA 聚合 酶 的 保护 ， 结 合
有 聚合 酶 的 那 段 DNA 就 不 被 降解 ， 对 这 部 分 不 被 降解 的 DNA 进行 估计 ， 得 出
大 约 是 40bp。 这 个 方法 就 是 大 家 所 知 的 DNA 酶 保护 法 (dnase protection
method) 。 另 外 一 个 测定 RNA 聚合 酶 覆盖 范围 的 方法 是 硫酸 二 甲 酯 保护 法
sulfate protection method)， 这 个 方法 主要 是 利用 DNA 被 RNA 聚合 酶
结合 后 受到 保护 而 不 再 被 甲 基 化 。

三 、RNA 聚合 酶 在 DNA 上 的 识别 结合 位 点

三 ED

转录 的 第 一 步 就 是 RNA 聚合 酶 结合 到 DNA 分 子 上 ， 与 RNA 聚合 酶 结合 并
: 194 ，

在 此 起 始 转录 的 特殊 位 置 叫 启 动 子 (promoter)。 启 动 子 是 20 一 200bp 的 专 一 序
列 ， 在 这 段 序 列 中 ， 发 生 一 系列 的 相互 作用 。 局 动 子 是 在 Lac -突变 株 中 首次 发
现 的 ， 这 个 突变 不 仅 破坏 了 ac 基因 的 活性 ， 阻 止 Lac RNA 的 转录 ， 而 且 不 能
互补 ， 叫 做 启动 子 突变 (prometer mutation ) 。

在 启动 子 处 发 生 一 系列 的 相互 作用 。RNA 聚合 酶 必须 识别 一 个 特殊 的 DNA
序列 ， 结 合 到 一 个 合适 的 构 型 中 ， 打 开 DNA 双 螺 旋 从 而 进入 其 中 对 其 碱 基 进 行
拷贝 ， 接 着 启动 RNA 的 合成 。 这 些 事件 的 发 生 由 DNA 的 碱 基 序 列 、RNA 聚合
酶 的 5 亚 基 (没有 亚 基 ， 局 动 子 不 被 识别 ) 共同 引导 ， 有 些 启 动 子 还 需 辅 助 蛋
自 (auxiliary protein) 引导 。 已 知 这 个 过 程 可 归纳 为 三 步 : DRNA 聚合 酶 结合
三 个 识别 位 点 。@ 聚 合 酶 移动 到 起 始 位 点 。 图 形成 一 个 开放 启动 子 复 合
物 《open-promoter complex)。 分 离 不 同 基 因 的 启动 子 并 测定 它们 的 碱 基 序 列 ， 发
现 不 同 启动 子 的 启动 区 非 编码 链 有 7 个 碱 基 是 很 一 致 的 (TATAATG)。

2. -10 区

瓦 .co 和 天 .coil 吹 菌 体 的 几 个 基因 的 启动 子 序 列 中 ， 在 左边 距 mRNA 第 一
处 开始 转录 的 碱 基 5 一 10 个 碱 基 的 地 方 有 一 段 顺序 叫 Pribnow box 即 -10 区 ， 典
型 的 Pribnow box 序列 为 TATAATG。 在 Pribnow box 中 ， 第 六 个 碱 基 全 是 工 ，
即 Pribnow box 的 第 六 个 碱 基 是 绝对 保守 的 。 已 测 知 3$ 一 36 个 下 .coli 的 Prib-
E6w box， 其 前 两 个 碱 基 全 部 是 TA， 突 变 体 可 以 变 成 TG、CA、GA 或 TC， 但
均 保 留 了 TA 两 个 碱 基 中 的 一 个 。 目 前 认为 Pribnow box 决定 转录 的 方向 ， 所 以
转录 从 左 到 右 。 在 Pribnow box 区 ，DNA 双 螺 旋 解 开 并 与 RNA 聚合 酶 形成 open-
Promoter complex。 转 录 的 方 回 称 为 下 游 (down stream)， 所 有 上 游 (upstream) 的 碱
基 是 不 锌 转录 的 ， 不 转录 的 碱 基 以 负数 表示 。Pribnow box 在 - 13 一 -4 之 间 。

图 7-3 是 下 .coii /ac 基因 启动 子 的 六 个 突变 (箭头 下 的 是 突变 的 )， 有 两 个
突变 在 Pribnow box 中 ， 另 一 个 在 其 旁边 ，Pribnow box 中 的 突变 或 者 破坏 转录
的 局 动 或 者 改变 转录 起 始 的 必要 和 条件， 可见 Pribnow box 的 重要 。Pribnow box
的 碱 基 顺 序 基本 上 是 恒定 的 ， 测 定 了 100 个 启动 子 ， 其 结果 如 下 :

AT AL
9 -89 ao0 82- Go kh

mRNA 起 点

Y
-30 -20 -10 0

GGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTG
ke

+
大 -大 A AA

图 7-3， ec 启动 子 的 -= 10 区 和 -35 区， 下边 标 出 突变 位 点 和 替换 或 缺失 的 碱 基

人

3. -35 区

-35 区 位 于 Pribnovw box 左 侧 ， 是 启动 子 中 另 一 个 重要 的 区 域 ， 在 -35 区
也 存在 与 Pribnow box 类 似 的 一 个 碱 基 序列 ， 这 个 共同 序列 是 TITGACA。
测定 了 100 个 五 .co 的 不 同 启动 子 的 结果 如 下 :
和 CC
82 证 8-65.2354 (起
1975 年 Pribnovw 比较 了 几 种 大 肠 杆 菌 噬 菌 体 和 大 肠 杆菌 的 启动 子 序列 并 发
现 了 -10 区 存在 一 致 序列 之 后 ，Schaller 等 人 又 发 现 ， 若 把 被 全 酶 保护 的 DNA
片段 提纯 ，RNA 聚合 酶 全 酶 不 能 再 和 此 片段 结合 ， 或 者 不 能 再 选择 正确 的 起 始
位 点 ， 因 而 推测 ， 在 酶 保护 区 外 一 定 还 有 一 个 序列 对 于 酶 识别 启动 子 是 必需 的 8
对 入 鸣 菌 体 和 包括 真 核 病毒 SV40 的 研究 结果 表明 ， 启 动 子 区 域 的 DNA 序列 必
须 从 mRNA 的 合成 起 点 向 左 延 伸 到 35 个 碱 基 对 以 上 ， 而 乳糖 操纵 子 的 启动 区 域

必须 从 RNA 合成 起 点 向 左 延伸 到 60 个 碱 基 对 以 上 。 和 启动 子 和 SV40 启动 子 的

-35 区 都 有 共同 序列 ， 其 中 含有 确 zd 限制 性 内 切 核酸 酶 的 位 点 ， 用 殉 zdIII 处
理 不 同 的 启动 子 后 ， 启 动 子 便 失 去 活性 。 在 -35 区 的 同 源 序列 中 ，TTC 是 很 保
守 的 。 目 前 认为 RNA 聚合 酶 首先 识别 并 结合 于 -35 区 ， 然 后 移 同 Pribnow box

至 于 是 如 何 移动 的 目前 还 不 很 清楚 ， 普 遍 认 为 RNA 聚合 酶 结合 后 沿 着 DNA 滑
动 。 另 一 个 可 能 性 是 RNA 聚合 酶 的 亚 基 首 先 与 高 度 专 一 性 的 -35 区 左边 的 识别 ，

位 点 相 结合 ， 然 后 ， 由 于 RNA 聚合 酶 体积 巨大 而 能 进入 到 Pribnow box 区 ,如

图 7-4 所 示 。RNA 聚合 酶 一 旦 进入 到 Pribnow box， 就 从 左边 的 识别 位 点 解 离 出
来 ， 和 Pribnow box 紧密 结合 ， 形 成 一 个 open-promoter complex。
这 个 open-promoter complex 是 一 个 高 度 稳 定 的 复合 物 ， 并 且 起 着 链 启 动 的 审

间作 用 。 在 这 个 复合 物 中 ， 距 Pribnow box 左边 大 约 10 个 碱 基 对 的 位 置 DNA 解

旋 ， 并 且 延 伸 到 第 一 个 被 转录 的 碱 基 。 这 种 解 旋 是 核 苷 酸 进 入 与 DNA 进行 碱 基
配对 所 必需 的 。 由 于 Pribnow box 的 碱 基 组 成 中 富 含 A、T， 所 以 Pribnow box 处
DNA 易 变性 。 总 而 言 之 ，RNA 聚合 酶 本 身 可 诱导 Pribnow box 到 open-promoter
complex 的 结构 变化 。

我 们 把 启动 子 分 为 强 启动 子 和 弱 启 动 子 两 类 来 进行 讨论 。 弱 启动 子 被 RNA

聚合 酶 识别 的 效率 较 低 ， 启 动 合成 mRNA 的 数目 也 比 强 启动 子 要 少 得 多 ， 因 而

翻译 出 的 蛋白 质 也 少 得 多 。 强 弱 启 动 子 是 根据 测定 其 合成 蛋白 质 分 子 的 多 少 来 确 ，

定 的 。 根 据 目前 的 研究 ， 强 弱 启 动 子 之 间 的 差别 就 在 于 - 35 区 的 序列 不 同 。 上

外 ，Prihnow box 和 -35 区 之 间 的 距离 和 启动 子 的 强 弱 也 有 关系 。 在 测定 了 100

个 不 同 的 启动 子 的 序列 后 发 现 - 10 区 和 -35 区 之 间 的 距离 90% 以 上 是 16 三

18bp， 也 有 少数 是 15 一 20bp。 虽 然 这 段 序列 在 启动 子 中 可 能 并 不 重要 ， 但 RNA

聚合 酶 的 几何 学 却 可 能 严格 要 求 保 持 两 个 位 点 之 间 适 当 的 距离 ， 一 10 区 和 -=35
。 196 ，

RNA 聚合 酶

es
和 | | 1 | | DNA
535 PB 起 点

DNA

(c) 开放 启动 子 复合 物 的 建立
图 7-4 RNA 聚 合 酶 和 局 动 子 形成 开放 启动 子 复合 物

区 之 间 相 距 17bp 时 启动 子 是 最 强 的 。

如 果 突 变 发 生 在 启动 子 上 ， 那 么 使 -10 区 和 -35 区 越 远 离 标准 顺序 的 突变 ，
转录 的 mRNA 越 少 ， 这 种 突变 称 之 为 down mutation; 越 接近 标准 的 顺序 的 突
变 ， 转 录 的 mRNA 越 多 ， 这 种 突变 称 为 up mutationo

4. CAP 位 点

有 些 启 动 子 完全 缺少 - 35 区 的 同 源 序列 ， 例 如 入 pre、gal P 和 ara BAD 启动
子 ， 这 些 启动 子 只 有 在 一 些 正 效应 子 分子 存 在 时 才 有 活性 。 例 如 入 pre 只 有 在
XecII 蛋白 存在 时 才 有 活性 。,uc 启动 子 有 - 35 区 序列 ， 但 在 c<AMP 受 体 蛋 白 CAP
不 存在 时 它 不 能 和 RNA 聚合 酶 结合 。 /uc 启动 子 中 有 两 个 AMP-CAP 结合 位 点 ，
一 个 位 点 在 -70 到 - 50 (site D)， 另 一 个 在 -50 到 -40 (siteII)。 位 点 I 有 反 向
重复 序列 ， 如 图 7-5 所 示 ， 这 似乎 是 最 强 结合 位 点 的 特征 。
位 点 I 本 身 是 一 个 很 弱 的 结合 位 点 ， 但 是 当 CAP-cAMP 复合 物 结 合 于 位 点
I 时 ，CAP-cAMP 复合 物 对 位 点 II 的 结合 活性 大 大 提高 。 一 旦 位 点 开 被 占据 ，
RNA 聚 合 酶 即 与 -35 区 序列 紧 紧 结合 ， 接 着 与 - 10 区 结合 。CAP 激发 RNA 聚
合 酶 与 -35 区 的 结合 是 一 种 重要 的 调节 作用 ， 它 对 Pribnow box 的 功能 发 挥 也 具
有 重要 意义 。 当 无 CAP 时 ，RNA 聚合 酶 也 能 和 Pribnow box 结合 ， 但 是 形成 的
497 。

AAA 开放 GT CA ON 人 全 入 全 全 全
1
:
下 页 DG ANG 下 Di ARROECNGS 有 GD

图 7-5 CAP 结合 部 位 的 碱 基 顺 序 ， 表 现 出 对 称 性

是 一 个 关闭 的 启动 子 复合 物 (closed-promoter complex)， 不 能 使 起 始 区 DNA 双
链 解 开 。,uc 启动 子 的 - 10 区 序列 是 TATG TTG， 下 边 画 线 的 G 可 能 增加 了
DNA 的 热 稳 定性 ， 所 以 RNA 聚合 酶 不 能 诱导 解 链 ， 而 CAP-cAMP 的 结合 可 能
使 紧邻 位 点 工 的 富 含 G、C 区 不 稳定 ， 在 Pribnovw box 处 降低 RNA 聚合 酶 的 熔 链
温度 ， 因 而 很 容易 建立 一 个 open-promoter complex， 如 图 7-6 所 示 。

RNA 聚合 酶

0
I I[L =35 Prnbnow box

图 7-6 在 buc 启动 子 上 有 两 个 CAP 位 点 和 RNA 聚 合 酶 位 点 ，I 和 开 是 这 两 个 位 点

入 鸣 菌 体 UV5 突变 株 在 rec 启动 子 的 Pribnow box 中 有 两 个 碱 基 发 生 了 改
变 ,，G-A 和 TA, 即 由 原来 的 序列 TATGTTG 变 成 了 TATAATG， 仅 两 个 碱 基 的
改变 就 使 得 这 种 突变 株 的 启动 子 在 形成 open-promoter complex 时 不 需要 cAME:
CAP 的 辅助 。 这 是 因为 GC 碱 基 对 的 丢失 降低 了 整个 序列 的 热 稳定 性 ， 在 不 存在
CAP 的 情况 下 RNA 聚合 酶 也 能 解 开 DNA 螺旋 。 有 些 有 - 35 区 序列 的 启动 子 需
要 其 他 因子 作用 才能 与 RNA 聚合 酶 结合 ， 这 些 因 子 可 能 促进 RNA 聚合 酶 的

ww
结合 。

四 、 转 录 的 起 始

关于 原核 生物 RNA 转录 的 起 始 过 程 ， 目 前 所 了 解 的 大 致 可 概括 如 下
GORNA 聚 合 酶 核心 酶 在 c 亚 基 参与 下 与 DNA 分 子 结合 ， 形 成 非 专 一 复合 物 ， 这
样 的 复合 物 是 很 不 稳定 的 ; @ 起 始 识 别 : RNA 聚合 酶 全 酶 与 启动 子 结合 形成 封
闭 的 启动 子 复合 物 (closed-promoter conplex)， 这 时 酶 与 DNA 的 外 部 结合 ， 识 别
部 位 大 约 在 启动 子 的 -35 处 ; 图 活化 : 形成 开放 的 启动 子 复合 物 (open-promat
complex) 时 ，RNA 聚合 酶 在 - 10 区 与 启动 子 紧 密 结 合 ， 并 在 解 天 DNA 双 链 后

“198 ，

识别 有 义 链 。 由 于 -10 区 富 含 A、T， 故 有 利于 DNA 解 链 ; 由 形成 三 元 起 始 复
谷物 : 当 RNA 聚合 酶 移动 到 转录 起 始点 时 加 入 第 一 个 三 磷酸 核 苷 酸 得 到 三 元 复
侣 物 (启动 子 、 全 酶 、 三 磷酸 核 苷 酸 )， 即 开始 转录 。

RNA 链 合成 的 起 始 是 从 形成 开放 启动 子 复合 物 开 始 的 ， 一 旦 该 复合 物 形成 ，
RNA 到 合 酶 就 开始 准备 合成 RNA。RNA 聚合 酶 上 含有 两 个 核 苷 酸 结合 位 点 ，
分 别 叫做 起 始 位 点 和 延伸 位 点 (〈initiation site and elongation site)。 起 始 位 点 只 结
谷 味 叭 三 磷酸 核 背 酸 即 ATP 和 GTP， 这 两 个 味 叭 三 磷酸 核 苷 酸 之 一 (常常 是
RATP 刀 是 RNA 链 上 的 第 一 个 核 苷 酸 〈 有 时 也 见 到 有 UTP， 但 是 很 少 )， 因 此
DNRA 上 第 一 个 被 转录 的 碱 基 常 常 是 胸腺 喀 喧 。 起 始 的 三 磷酸 核 苷 酸 首先 结合 到
酶 止 ， 再 在 open-promoter complex 处 与 DNA 上 互补 的 碱 基 形 成 氨 键 (图 7-7)。
延长 位 点 与 另 一 个 三 人 酸 核 苷 酸 结合 ， 这 个 核 苷 酸 是 通过 其 对 DNA 链 上 起 始 位
点 下 一 个 碱 基 的 配对 能 力 被 严格 选择 的 。 之 后 ， 起 始 位 点 和 延长 位 点 上 结合 的 这
两 个 核 苷 酸 再 结合 到 一 起 ， 第 一 个 结合 到 DNA 上 的 碱 基 从 起 始 位 点 上 释放 出
来 ， 链 起 始 完成 。

7-7 RNA 合 成 的 起 始

当 RNA 聚合 酶 释放 碱 基 并 且 沿 DNA 移动 时 ， 链 的 延伸 即 开 始 。

如 何 选择 DNA 上 第 一 个 被 拷贝 的 碱 基 目 前 还 不 清楚 。 它 常常 是 在 保留 有 工
的 =10 区 序列 的 第 6 到 第 9 个 碱 基 之 间 ， 但 是 目前 既 没有 确切 的 位 点 ， 也 没有
明确 的 模式 〈 图 7-8)。

启动 子 序列
天 .coii galLP1 S-GTATG-3
已 coli araB4D 5-GTATG23'
啤 菌 体 XI17 基因 5-GTATG-3'
病毒 SV40 5S-GTATG-3'

图 7-8 四 种 不 同 的 启动 子 中 的 RNA 的 第 一 个 碱 基 处 的 模板 顺序

五 、RNA 链 的 延伸

核 苷 酸 不 断 加 到 RNA 链 的 3-OH 上 ，RNA 链 就 延长 。 在 起 始 到 延伸 的 转
变 过 程 中 ，DNA 分 子 和 酶 分 子 可 能 发 生 构象 的 变化 以 适应 延伸 过 程 的 需要 。 当

SR

潮

酶 从 起 始 位 点 往 下 游 移 动 时 ， 解 旋 也 随 酶 一 起 进行 ， 而 转录 完成 部 分 的 DNA 则
重新 形成 完整 的 双 螺 旋 ， 这 表明 DNA 螺旋 在 酶 作用 下 有 一 个 可 逆 的 过 程 ， 辐 时
酶 分 子 的 构象 也 发 生 了 变化 。

在 转录 起 始 阶段 ， 全 酶 与 DNA 分 子 要 形成 稳定 的 复合 物 ， 因 而 对 结合 部 位
的 一 级 结构 有 严格 的 专 一 性 要 求 ; 而 在 延伸 阶段 ， 为 了 能 沿 模板 移动 ，RNA 到
合 酶 必须 放松 对 DNA 的 结合 ， 而 且 对 拷贝 每 一 个 核 苷 酸 应 具有 同等 能 力 ， 而 不
应 有 所 偏向 。RNA 聚合 酶 与 DNA 模板 相互 作用 的 这 些 变化 ， 使 聚合 酶 在 链 延 伟
几 个 核 苷 酸 (估计 是 8 个 ) 之 后 就 将 c 亚 基 从 全 酶 上 释放 出 来 ， 这 样 链 延伸 就 由
核心 酶 催化 。c 亚 基 的 存在 与 否 ， 引 起 B 与 B 亚 基 构 象 上 的 变化 ， 即 当 c 亚 基 结
合 时 ，8B 与 B' 表 现 为 有 利于 专 一 与 DNA 结合 的 构象 ， 而 c 亚 基 释放 后 留 下 的 核
心 酶 则 与 DNA 不 专 一 结合 ， 失 去 识别 能 力 或 优先 与 任 一 核 苷 酸 序列 结合 的 能 。，
力 ， 不 能 形成 稳定 的 复合 物 ， 如 图 7-9 所 示 。

RNA 聚合 酶 上

”图 79 RNA 合 成 起 始 不 久 ，RNA 聚合 酶 核心 酶 变 构 ，v 因子 脱落 站

当 核 心 酶 沿 DNA 移动 时 ， 继 续 结合 下 一 个 能 与 DNA 配对 的 核 苷 酸 ， 并 且 。
解 开 前 面 的 DNA 螺旋 。 而 原先 解 开 的 区 域 只 有 几 个 碱 基 对 ， 恰 恰 就 在 RNA 桶 ，
合 酶 的 后 边 ， 其 DNA 螺旋 又 重新 关闭 ， 于 是 新 合成 的 RNA 就 从 重新 关闭 的
DNA 中 释放 出 来 。

用 牛 胰 RNA 酶 (这 种 酶 只 作用 于 单 股 RNA 但 不 切割 DNA-RNA 杂 人 台 分 子 )
处 理 转录 系统 ， 结 果 表 明 大 约 有 10 个 碱 基 被 保护 而 不 被 酶 切 ， 这 种 保护 作用 究
竟 是 由 于 RNA 与 DNA 形成 了 氢 键 还 是 仅仅 由 于 酶 的 大 块 空 间 的 干扰 ， 现 在 还
不 清楚 。

*。200 ，。

链 延 伸 的 速度 不 是 恒定 的 ， 在 DNA 的 某 些 区 域 ， 转 录 速 度 减 慢 或 停止 ， 这
各 速 度 的 降低 叫 pause，pause 发 生 在 富 含 GC 区 (图 7-10)， 在 图 7-10 的 这 个 序
列 里 , 由 于 GC->AT 的 变化 ， 使 得 此 突变 株 消 除了 pause， 因 为 GC 变 成 AT 后 降
低 了 和 氢 键 的 稳定 性 。

暂停 1
暂停 2
5AAUUGU

短 mRNA
3'AAUUGUGAGCGGAUAAC

TIGGAATITIGTGAGCGGGATAACAATTT..
mACCITTAACACTCGCCTATTITGTTAAA'，

< 编码 链
民 之

下
T|TT ，” 弱 或 无 暂停 |
^GAA 。 强 暂停

世

图 7-10 五 .coi ac 系统 的 一 个 片段 ， 有 两 个 pause 突变 后 可 消除 pause (GT->AT)

六 、RNA 链 合成 的 终止 和 新 合成 RNA 链 的 释放

RNA 合成 的 终止 发 生 在 DNA 特殊 的 碱 基 序列 中 ， 对 20 个 已 测 知 的 终止 序
列 的 研究 表明 ， 它 们 具有 共同 的 特征 (图 7-11)， 终 止 序列 具有 以 下 三 个 重要 的
区 域 : 四 具有 一 个 反 向 重复 序列 ， 中 间 是 不 重复 的 片段 ， 即 假设 DNA 上 一 条 链
的 序列 是 ABCDEF 一 XYZ 一 F'E'D'C' BA ， 其 中 A 与 A 人 B 与 B 等 是 互补 的
(如 色 氢 酸 操纵 子 中 前 导 区 存在 的 终止 区 : AAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTT )，
这 样 在 转录 时 ，DNA 链 中 可 以 通过 链 内 碱 基 配 对 形成 二 元 对 称 结构 ， 因 而 转录
的 RNA 在 这 部 分 可 以 形成 茎 - 环 结构 ， 这 种 结构 在 转录 终止 中 独立 起 作用 ， 并
且 使 得 新 合成 的 RNA 链 能 抗 RNaseII 的 降解 (RNaseII 是 一 种 胞 内 酶 ， 对 双 股
RNA 无 活性 )。@ 第 二 个 区 域 是 在 靠近 推测 的 茎 的 环 端 (有 时 全 部 在 荃 中 )， 是
一 个 富 含 GC 的 区 域 。@ 第 三 个 区 域 (有 时 不 存在 ) 是 一 个 AT 序列 (可 能 在 葵
的 开始 )， 所 以 在 mRNA 中 会 转录 产生 一 个 6 一 8 个 尿 喀 啶 接着 一 个 腺 味 叭 的
序列 。

RNA 聚合 酶 移动 至 终止 部 位 时 转录 产物 仍然 与 模板 链 以 氢 键 结合 (图 7-
12)， 此 时 RNA 中 荃 的 一 半 已 经 游离 出 模板 ， 并 通过 RNA 分 子 内 相互 作用 而 形
成 蕉 环 结构 。 在 DNA 链 的 这 个 区 域 中 二 元 对 称 结构 的 变异 将 对 转录 产物 葵 环 的
形成 发 生 重 要 影响 ， 而 蕉 环 的 形成 又 能 促使 该 处 DNA 链 退 火 恢复 螺旋 结构 ， 使
验 环 位 于 螺旋 之 外 ， 这 时 RNA 聚合 酶 就 从 “延伸 ”构象 转变 为 “终止 ”构象 。

证 机 E，。

全
六 TT 和 AAAGGCTCCIRNONGG 和 GCCTTTAOTOIRIY 。

了 TAATTTCCGAGG AAAACCTCGGAAAAAAAA 吕
1

1 1Iv~---r=---… ~---J-~-- 一

DNA

高 G.C 高 A.T'
本 人 被 转录 的
| ， 最 后 碱 基

mRNA 终止

Neooo oooseetenwei sseogoaeeeoop 吉 本 ? 史

图 7-11 五 .coii trp 操纵 子 终止 区 的 DNA 序 列 (a) 和 mRNA 序列 (b)

此 外 ， 由 于 茎 环 后 一 般 连 着 数 个 连续
的 U，rU-dA 配对 的 DNA=RNA 杂交

体 很 不 稳定 从 而 释放 出 转录 产物 。
转录 的 终止 有 两 种 形式 ， 一 种 是
不 依赖 于 终止 蛋白 Rho (o) 因子 而
靠 DNA 自身 的 序列 终止 转录 ， 另 一
类 是 需要 终止 蛋白 (o 因子 ) -的 作用
终止 转录 。 不 同 模板 的 终止 子 结构 或
其 生成 的 RNA 葵 环 的 大 小 及 其 稳定
性 是 不 一 样 的 ， 例 如 鸣 菌 体 入 6S 基
因 转 录 的 RNA 的 蕉 是 很 长 的 ， 且 富
含 GC 对 ; 而 依赖 于 o 因子 的 噬菌体
图 7-12 ”转录 终止 及 链 释放 模型 和 Cro 基因 转录 产物 的 未 端 葵 最短，

而 且 最 不 稳定 。

最 近 对 trp 操纵 子 终止 信号 的 研究 表明 ， 在 操纵 子 最 末 一 个 结构 基因 之 后 存
在 两 个 终止 信号 ， 第 一 个 信号 具有 典型 的 终止 子 结构 特点 ， 即 在 数 个 OU 之 前 存

2

在 葵 环 结构 ， 这 被 认为 是 一 个 体内 转录 终止 信号 。 但 如 果 体 外 加 入 o 因子 ， 则
RNA 聚 合 酶 在 第 一 个 终止 信号 下 游 250 个 核 苷 酸 处 终止 转录 ， 该 区 并 无 典型 的
莹 环 结构 特点 ， 但 AU 丰富 ， 因 此 可 能 存在 另 一 种 未 被 认识 的 终止 机 制 。

在 依赖 o 的 终止 子 处 结构 不 够 稳定 ，RNA 聚合 酶 只 是 在 此 暂停 但 不 终止 ，
因而 需要 0 的 帮助 才能 停止 转录 。p 具有 两 种 活性 : @ 终 止 转录 ; @ 依 赖 于 RNA
的 核 苷 三 磷酸 酶 (NTPase) 活性 。 同 时 许多 试验 表明 ， 这 两 种 活性 为 同一 个 蛋
白质 所 具有 ， 因 此 提出 了 一 个 转录 终止 模型 (图 7-13): 开始 o 因子 附着 在 新 生
RNA 上 ， 并 随 之 沿 5 一 3 方向 朝 RNA 聚合 酶 移动 ，ATP 或 其 他 三 棍 酸 核 苷 酸
求解 为 这 种 移动 提供 能 量 。 最 后 ，p 接触 到 在 依赖 于 p 的 终止 子 处 暂停 的 RNA
聚合 酶 ， 与 之 反应 使 新 生 的 RNA 链 释放 出 来 。 从 这 个 模型 可 以 清楚 地 看 到 ， 影
响 o 与 RNA 的 结合 或 o 沿 RNA 移动 的 因素 将 抑制 转录 的 终止 。 在 原核 生物 中 转
录 与 翻译 往往 是 偶 联 在 一 起 的 ， 翻 译 的 同时 进行 意味 着 核糖 体 将 遮盖 新 生 RNA，
并 阻止 o 的 结合 ， 从 而 抑制 转录 终止 ; 而 当 核 糖 体 与 RNA 脱离 时 出 现 裸露 的
RNA, 5 就 发 生 作用 而 使 转录 终止 ， 这 就 是 操纵 子 末端 终止 的 机 制 。

| 证 剖 心

DNSeNescsze=szsosossszmee SSNzszsesesospscNesqcsoNzsescsoszsc

RS

Rho 附 在 RNA 的 5 端

Rho 沿 着 RNA
追踪 聚合 酶 移动
QZNSSOSCSC

TARACSCNCQGCS2SCO7DcQZ7QCQ2SISoReecNr

聚合 酶 在 终止 子 处 暂停 ，
| Rho 起 作用

JADsSNISCSzSrRoscaOsoNcSNIRCNSPSCNIQONCNYSSCSSINTNINSNESFSESNSESNA

四

图 7-13 Rho 因子 跟踪 RNA 聚合 酶 沿 着 RNA 移动 到 Rho 依 赖 的 终止 子 时 终止 转录

终止 发 生

二 间 RNA 分 子 的 种 类 及 转录 后 加 下

RNA 分 子 主要 分 三 种 类 型 ， 即 mRNA (messenger RNA)、TrRNA (ribosomal
RNA) 和 tRNA (tranfer RNA)。 它 们 都 是 由 DNA 转录 而 成 的 ， 都 叫 RNA， 人 得
在 蛋白 质 合 成 中 具有 很 不 同 的 功能 。

一 、mRNA 的 结构

细胞 中 每 一 条 多 肽 链 的 氨基 酸 顺 序 其 实 是 由 DNA 分 子 中 的 碱 基 顺序 决定
的 ， 虽 然 氨基 酸 对 DNA 没有 亲 和 性 ， 但 在 DNA 到 和 蛋白质 的 转变 过 程 中 有 一 中
间 过 程 ， 在 这 中 间 过 程 中 DNA 上 的 遗传 信息 转录 到 信使 RNA (mRNA) 分 子
上 ， 再 由 mRNA 作 蛋 白质 翻 译 的 直接 模板 。

与 一 个 多 肽 链 相 对 应 的 DNA 片段 加 上 启动 子 部 位 再 加 上 终止 子 部 位 叫做 三
个 顺 反 子 ， 一 次 转录 得 到 的 mRNA 可 以 含 一 个 顺 反 子 ， 也 可 以 含 多 个 顺 反 子 , 时
分 别 叫做 单 顺 反 子 mRNA (mono-cistron mRNA) 和 多 顺 反 子 mRNA (poly
cistron mRNA)。 实 际 上 以 多 顺 反 子 的 方式 转录 是 一 种 在 调控 上 很 经 济 的 方法 。

mRNA 的 大 小 不 一 ， 小 的 可 以 是 大 约 只 编码 50 个 氨基 酸 的 mRNA， 也 就 是

只 有 150 个 碱 基 ; 大 一 点 的 可 以 是 能 编码 300 一 600 个 氨基 酸 的 由 900 一 1800 个 |

碱 基 组 成 的 mRNA。 原 核 生 物 中 的 多 顺 反 子 mRNA 比 单 顺 反 子 mRNA 更 普遍 ,
因此 原核 生物 中 一 个 典型 的 mRNA 分 子 一 般 包 含有 3000 一 8000 个 碱 基 ， 少 数 巨
大 的 分 子 ， 如 组 氨 酸 mRNA 分 子 编码 十 个 蛋白 质 ， 含 有 12 000 个 碱 基 。

一 个 顺 反 子 除 了 翻译 中 的 起 始 和 终止 序列 外 ,在 mRNA 中 还 存在 其 他 重要
的 区 域 。 有 些 mRNA 具有 领头 和 尾部 (leader and tailer)， 这 两 个 区 域 是 不 编码 ”
蛋白 质 的 ， 在 某 些 情况 中 ，leader 中 含有 一 个 调控 区 称 为 弱化 子 (attenuator)，
弱化 子 (有 的 人 称 为 衰减 子 ) 决定 蛋白 质 合成 的 速率 。 在 mRNA 的 $-P 和 3
OH 两 端 均 发 现 有 不 翻译 的 序列 ， 而 且 多 顺 反 子 mRNA 分 子 中 还 可 能 含有 几 百
个 碱 基 长 的 顺 反 子 间 序列 (intercistronic sequence) 。

mRNA 一 般 以 DNA 的 一 条 链 为 模板 来 转录 ， 但 并 非 都 是 这 样 ， 有 许多 鸣 菌
体 mRNA 可 以 同时 以 两 条 链 为 模板 从 两 个 方向 转录 ， 例 如 鸣 菌 体 入 就 是 以 两 条
链 为 模板 进行 转录 ， 分 别称 为 左 向 转录 链 (1) 和 右 回转 录 (r) 链 。

二 、mRNA 的 寿命
原核 生物 mRNA 的 一 个 重要 特点 就 是 它 的 寿命 比 tRNA 和 rRNA 的 短 ， 例

如 细菌 ， 其 mRNA 的 半衰期 只 有 几 分 钟 ，lac mRNA 终止 合成 后 9min 就 几乎 全
204 ，

| 部 消失 。mRNA 很 容易 从 $ -P 被 降解 ， 但 有 些 mRNA5S'-P 末端 被 修饰 而 得 到 保
| 护 ， 所 以 不 易 被 降解 ， 例 如 真 核 生物 中 的 血红 蛋白 .mRNA (hemoglobin mRNA)
| 和 蚕 的 蚕丝 纤维 蛋白 mRNA (silk fibroin mRNA)。

三 、 稳 定 的 RNA 一 一 核糖 体 RNA 和 转运 RNA

|

蛋白 质 从 成 除了 需要 mRNA 作 翻 译 的 模板 以 外 ， 还 需要 核糖 体 RNA
| ERNA) 作 翻 译 进行 的 场所 ， 需 要 转运 RNA (tRNAj 作为 转运 氨基 酸 的 工具 。
| TRNA 和 让 NA 在 代谢 中 比 mRNA 稳定 。

RNA 和 tRNA 的 转录 都 是 从 启动 子 起 始 到 终止 子 结束 来 完成 的 ， 从 这 一 点
讲 ， 康 NA 和 RNA 的 合成 过 程 与 mRNA 没有 什么 不 同 ， 但 rRNA 和 tRNA 有 以
| 下 三 点 特性 与 mRNA 不 同 : @ 所 有 RNA 初级 转录 产物 的 5 未 端 均 是 5 三 磷酸 ，
| 而 成 熟 了 NA 和 tRNA 分 子 的 5 未 端 是 5 - 单 磷酸 。@rRNA 和 tRNA 分 子 比 其 初
| 级 转录 产物 小 很 多 。@ 所 有 tRNA 除了 含有 A、G、C 和 U 以 外 ， 还 含有 稀有 碱
， 攻 ， 这 些 稀有 碱 基 在 初级 转录 产物 中 是 没有 的 。

RNA 和 tRNA 分 子 的 所 有 这 些 变化 都 是 通过 一 个 称 为 转录 后 修饰 或 转录 后

世 工 的 过 程 来 完成 的 。
四 、tRNA 分 子 的 加 工

tRNA 分 子 的 种 类 远 比 rRNA 分 子 种 类 要 多 ， 在 原核 生物 中 tRNA 分 子 有
30 二 40 种 ， 真 核 生 物 中 则 更 多 ， 大 约 有 60 种 以 上 。 在 原核 生物 中 ， 有 些 tRNA
基因 是 和 rRNA 基因 连接 在 一 起 的 ， 包 括 间 隔 区 中 的 tRNA 基因 和 末端 的 让 NA
基因 两 种 情况 。 例 如 大 肠 杆 菌 K12 有 七 个 rRNA 基因 答 ， 它 的 16S rRNA 和 23S
ERNA 基因 之 间 都 插 有 tRNA 基因 ， 其 中 三 个 编码 让 NAE 和 FNA 亿 ， 另 外 四 个
编码 RNAJP; 另外 有 几 个 了 NA， 如 RNA4AP、tRNAIP 和 tRNA 严 则 由 rRNA
基因 竹中 远离 启动 子 的 末端 序列 转录 。

此 外 ，RNA 基因 大 多 以 基因 簇 存 在 ， 构 成 多 顺 反 子 转录 单位 。 大 肠 杆 菌 基
因 图 上 永 NA 基因 的 已 知 位 置 已 测定 ， 约 有 60 个 tRNA 基因 ， 若 考虑 到 摆动 假
说 ， 这 约 为 翻译 61 个 密码 子 所 需要 基因 的 二 倍 。1981 年 鉴定 了 一 个 大 肠 杆菌 操
纵 子 ， 其 中 含有 七 个 tRNA 基因 : Merm-Lex-Glz1-GInI-Metm-GIz2-GLz2 (基因
图 的 1Smin 处 )， 各 认 NA 基因 间 被 二 级 结构 隔 开 ， 推 想 为 RNA 加 工 酶 的 识别
位 点 。

由 于 加 工 紧 随 着 转录 之 后 ， 转 录 还 没有 终止 或 刚 开 始 不 久 加 工 就 已 经 开始 进
行 了 ， 所 以 在 野生 型 细菌 中 很 难 分 离 出 大 的 转录 产物 。 图 7-14 表示 了 双 顺 反 子
基因 转录 与 加 工 的 过 程 ， 一 种 为 单 顺 反 子 产 物 ， 另 一 种 是 双 顺 反 子 产物 ， 后 者 常

1

1
3 1 2 StDNA

StDNA

图 7-14 tRNA 的 转录 与 加 工 关 系 示 意图

在 加 工 酶 缺陷 型 菌 中 分 离 得 到 。 两 种 产物 都 需要 进一步 加 工 才能 形成 成 熟 下 NA
全
tRNA 前 体 的 加 工 主要 包括 以 下 三 个 方面 : 四 前 切 、 修 剪 和 剪接 ，@ 如 果 需
要 ， 在 3 端 添加 CCAOH; @@ 核 苷 修饰 。
所 有 这 些 反应 都 是 在 酶 催化 下 进行 的 。 总 的 来 说 ，tRNA 加 工 所 需要 用 的 酶
比 mRNA 或 zRNA 加 工 所 需要 的 酶 都 要 多 ， 特 别 是 多 顺 反 子 tRNA 基因 转录 产
物 的 加 工 更 为 复杂 ， 往 往 需要 多 个 酶 的 协同 作用 。

1. 剪 切 、 修 剪 和 剪接

tRNA 剪 切 酶 是 一 类 主要 的 加 工 酶 ， 属 内 切 核酸 酶 性 质 ， 它 在 疏 NA 前 体 两
端的 附加 序列 处 水 解 前 体 tRNA 以 得 到 一 定 大 小 的 tRNA 分子。 大 肠 杆 菌 RNase
P 特异 地 剪 切 几 乎 所 有 大 肠 杆菌 及 其 叹 菌 体 RNA 前 体 的 $ 端 附加 序列 ， 生 成 成
熟 的 了 NA 5 末端， 因此 这 个 $ 内 切 核酸 酶 也 被 叫做 下 NA 5 成熟 酶 。 比 较 了 几
个 tRNA 前 体 的 RNase P 作用 位 点 后 发 现 ，RNase P 的 专 一 性 与 其 剪 切 位 点 周围
的 一 级 结构 以 至 二 级 结构 并 无 直接 关系 。 经 研究 发 现 RNase 了 的 专 一 性 可 能 与
tRNA 前 体 的 三 叶 草 特殊 构 型 有 关 。 另 外 ， 无 3 端 CCAOH 序列 的 让 NA 前 体 不
能 作为 RNase P 的 底 物 ， 所 以 RNase P 的 专 一 性 也 与 3`"CCAOH 有 关 。

1978 年 Altman 等 发 现 大 肠 杆菌 RNase P 是 一 种 特异 的 分 子 ， 它 由 至 多 23%
蛋白 质 和 至 少 77%RNA 组 成 ， 沉 降 密度 为 1 .71g/cm' (CsCl 中 ) 和 1.5$g/cnn
(CsSO4 中 )， 它 是 一 个 典型 的 RNA- 蛋 白质 复合 物 。 拆 开 蛋 白质 和 RNA， 两 者
不 具有 活性 ， 重 组 则 活性 恢复 。

RNaseEF 是 3 内 切 核酸 酶 ， 它 在 距 3“ 端 不 太 长 的 核 昔 酸 序 列 处 切 开 较 大 的 前
体 。 用 于 rRNA 加 工 的 RNase II 和 RNase 下 在 慌 NA 加 工 中 可 能 也 起 作用 ， 但
体内 tRNA 成 熟 并 非 绝 对 需要 RNase III， 而 且 RNase 正 剪 切 也 仅仅 限于 很 少数

"206

|
|

| 荡 NA 前 体 中 ， 这 两 种 酶 的 功能 可 能 只 是 使 大 的 新 生 转 录 产 物 变 得 小 些 ， 以 便 更
| 有 效 地 与 RNase P 作用 。

为 了 使 谎 NA 分 子 得 到 成 熟 的 3 端 ， 还 需要 另 一 个 外 切 核酸 酶 进行 修剪 ， 从
| 了 3 庙 逐 个 切 去 附加 的 序列 以 暴露 出 tRNA 3“ 端 。 这 个 修剪 酶 是 RNase D， 其 分 子
| 质量 为 38 000U， 为 单一 亚 基 蛋白 质 。RNase D 不 同 于 另 一 个 3 外 切 核 酸 酶
RNase I 它 具 更 为 严格 的 选择 活性 ， 因 此 是 体内 3'tRNA 成 熟 酶 。

所 以 ，RNA 前 体 中 插入 序列 的 除去 是 靠 一 个 非常 复杂 的 酶 系 来 完成 的 。
2. 核 苷 修饰

成 熟 的 疏 NA 分 子 中 含有 许多 修饰 成 分 ， 不 同 让 NA 所 含 修饰 成 分 的 种 类 和
数目 都 各 不 相同 。 虽 然 对 于 修饰 成 分 在 RNA 中 的 生物 功能 仍 了 解 很 少 ， 但 对 其
生物 合成 过 程 已 有 不 同 程度 的 了 解 。 核 苷 修饰 问题 是 RNA 特别 是 疏 NA 加 工 的
主要 内 容 。tRNA 的 修饰 是 在 多 核 苷 酸 链 上 进行 的 ， 由 一 类 统称 为 修饰 酶 的 酶 类

“所 催化 。

无 修饰 成 分 的 tRNA (或 前 体 ) 含 修 饰 成 分 的 tRNA (或 前 体 )。

tRNA 修饰 酶 具有 高 度 的 专 一 性 ，DNA、xrRNA (可 能 有 例外 ) 多 核 苷 酸 或
是 单 核 背 酸 、 核 苷 都 不 能 作为 此 类 修饰 酶 的 底 物 。 由 于 NA 中 修饰 成 分 繁多 ，
因而 修饰 酶 种 类 很 多 ， 一 般 来 说 ， 每 种 修饰 核 苷 都 有 催化 其 合成 的 修饰 酶 。

tRNA 甲 基 转 移 酶 (简称 tRNA 甲 基 化 酶 ) 是 研究 较 早 较 详细 的 一 种 tRNA
修饰 酶 ， 它 不 同 于 mRNA 甲 基 化 酶 和 rRNA 甲 基 化 酶 。 近 年 来 由 于 分 离 纯 化 技
术 的 提高 ， 已 经 得 到 对 碱 基 及 其 排列 顺序 高 度 专 一 的 tRNA 甲 基 化 酶 ， 如
tiRNA ( 腺 味 叭 -1) 甲 基 化 酶 催化 让 NA 中 特定 位 置 的 A->mA，tRNA ( 乌 味 叭 -7)
甲 基 化 酶 可 催化 了 RNA 中 第 $5 位 的 G>m7G， 其 他 如 催化 了 RNA 中 生成 mlG、
m2G、mC 以 及 xc 的 酶 也 已 高 度 纯 化 。tRNA 甲 基 化 酶 对 碱 基 顺 序 具 有 严格 的
要 求 ， 如 从 酵母 中 分 离 的 两 个 tRNA ( 乌 味 叭 -1) 甲 基 化 酶 ， 它 们 能 分 别 甲 基 化
tRNA 中 的 Gilo 和 G43 并 分 别 生成 mlGli9 和 mlG43; 从 枯草 杆菌 分 离 的 tRNA ( 腺
味 叭 -1) 甲 基 化 酶 能 催化 RNA 中 的 YAAGGCm3G->YAmlAGGCm3G; 而 鼠 肝
中 得 到 同一 种 酶 则 可 催化 GTYCGAAU->CTYCGAmlAU。

几乎 所 有 tRNA 甲 基 化 酶 的 甲 基 供 体 均 为 S 腺 苷 甲 硫 氢 酸 (SAM)， 但 也 有
报道 在 某 些 革 兰 氏 阳 性 菌 中 分 离 出 的 所 有 tRNA ( 尿 喀 啶 - 5) 甲 基 化 酶 ( 即 rT
甲 基 化 酶 ) 不 是 以 SAM 为 供 体 ， 而 是 从 $, 10- 甲 又 四 氧 叶酸 获得 甲 基 ， 同 时 以
FADH2 作 还 原 剂 。

三 泛 研究 的 tRNA 修饰 酶 还 有 tRNA 异 戊 烯 转移 酶 (tRNA 和 2 异 戊 烯 合成
酶 ) 及 tRNA 乌 味 叭 转 糖苷 酶 和 tRNAsw 合成 酶 。

下 面具 体 介 绍 一 个 tRNA 的 加 工 过 程 。

修饰 酶

本 0

有 200 个 核 苷 酸 的 间隔 区 ，tRNATr 本 身 是 85 个 核 苷 酸 ， 加 上 间隔 顺序 共 350 不
核 苷 酸 。
加 工 过 程 分 以 下 三 步 。
(1) 3'-OH 末端 的 形成
这 个 过 程 包括 一 个 内 切 核酸 酶 识别 一 个 发 夹 环 结构 (图 7-15) 和 一 个 外 切
核酸 酶 识别 CCA 三 碱 基 序列 这 样 两 个 过 程 。 转 录 产 物 在 位 点 @ 被 内 切 核酸 酶 降
|

大 肠 杆 菌 让 NATz 基 因 的 每 个 基因 重复 单位 有 350 个 核 音 酸 ， 两 个 基因 之 间

解 之 后 ， 其 上 游 的 7 个 碱 基 被 RNase D 逐个 去 除 (RNase D 是 一 种 核酸 外 切 核酸
酶 ， 作 用 在 图 7-15 中 @)， 然 后 RNase D 再 除去 CCA 下 游 的 两 个 碱 基 UC (图 大
15 中 国 )， 这 两 个 碱 基 的 切除 过 程 是 在 5 端 加 工 之 后 进行 的 。 在 忆 .coi 中 曾 分
离 到 这 两 个 碱 基 切除 前 的 分 子 ， 称 之 为 pre-tRNA， 开 .coli 中 pre-tRNA 分 子 有 以
下 结构 :

瑟 1
次 受 人 工 1
区 g@ RNaseD 除去 > 2
\ 这 两 个 碱 基 有
人 | 1 @ 内 切 核酸 本
了 有 人 7 大 革
1 1 已 玫
二 产 2
| < 十 十 十 十 十 十 十 十 FE 孩 近 170 茂 基 - 二 -二 -二 - 予 OH
PPPS 一 这 有 放 让 本 和 全 生 旺 ,Gu.c| CCA
， 四 RNase 逐个 除
去 这 些 核 苷 酸

加
2mG< 一 1/G

图 7-15 下 .coii tRNATt 转 录 子 的 加 工 过 程

p-$- (41bases) -tRNA- (2bases) -3 -OH， 切 除 两 个 碱 基 后 形成 CCA3 -OH
末端 。

(2) 5 -P 末 端的 形成

$“-P 末端 的 形成 在 RNase P 作用 下 完成 ，RNase P 切除 图 7-15 中 5 端 发 严

”228

”结构 处 的 41 个 碱 基 ， 形 成 5 -P 末端 。

一 -一 一 一 一

(3) 修饰 碱 基 的 产生

碱 基 修 饰 过 程 就 是 高 度 专 一 性 的 酶 分 别 在 其 专 一 位 点 改变 碱 基 ， 见 图 7-15
中 @， 大 肠 杆菌 tRNA 中 的 两 个 U 转变 成 假 尿 旷 啶 (pseudouridine， 亚 )， 两
不 可 转变 成 4- 硫 尿 喀 啶 〈4-thiouridine，4tU)， 一 个 鸟 味 叭 变 成 2 -O- 甲 基 鸟 味 叭
COmethyL-guanosine，2 mG)， 一 个 腺 味 叭 变 成 异 成 炳 腺 味 哈 (isopenteny-
ladenosine，2 ipA)。

众 图 7-15 中 可 以 看 出 ，tRNA 中 不 需要 的 碱 基 都 在 成 熟 tRNA 的 两 边 ， 而 不
在 其 中 间 ， 间 隔 区 在 两 个 tRNA 之 间 。

五 、 大 肠 杆 菌 中 rRNA 的 加 工

尼 .coi 中 的 zRNA 有 三 种 : SS rRNA、16SrRNA 和 23S rRNA， 分 别 有 120、
1541 和 2904 个 核 苷 酸 。 这 些 rRNA 和 另外 几 个 tRNA 全 部 包含 在 一 个 具有 5000
个 核 苷 酸 的 转录 子 中 ， 这 些 转录 子 的 碱 基 序 列 很 多 已 研究 清楚 了 。 图 7-16 是
下 .co 的 一 个 转录 子 ， 图 示 从 $ “末端 到 3 末端。

16S RNA
了 的 23S RNA
;1541 核 苷 酸 7
7 SN “2904 核 背 酸
志 让
1
| 1
1 斌
本
让
|
| 过
51/ ED oa 二 十 生 2 3?
RSTY 肌 所 23S 0
tRNAL- tRNA 和 tRNAAm tRNATm

图 7-16 开 .coii rRNA 转录 子 的 加 工

16S rRNA-tRNALe_tRNAAa_23S rRNA-SS rRNA-tRNA4Asp_tRNAIe 转 录 后 的
切割 位 点 见 图 中 的 箭头 。

当 此 巨大 的 转录 子 完成 转录 之 后 ， 一 系列 的 酶 就 与 之 作用 。 虽 然 与 之 作用 的
酶 系统 还 没有 全 部 鉴定 出 来 ， 但 第 一 个 酶 显然 是 RNase III， 它 是 一 种 切割 双 链
RNA 的 酶 。 首 先 RNase III 在 双 链 外 切 审 ， 其 他 的 酶 接着 完成 了 NA 的 加 工 过
程 ，RNase P 切割 其 中 的 tRNA 部 分 。

在 原核 生物 中 还 没有 发 现 mRNA 的 加 工 ， 但 有 两 个 例外 ， 一 个 是 叹 菌 体 T7
中 的 mRNA 被 RNase III 切割 成 $ 个 不 同 的 mRNA 分 子 ， 另 外 ， 鸣 菌 体 昭 0 中
一 个 mRNA 是 由 RNaseP 加 工 而 成 的 。

原核 生物 RNA 的 加 工 过 程 可 以 小 结 如 下 : 四 所 有 稳定 的 RNAL CRNA 和

rRNA) 转录 后 都 需要 加 工 ， 除 鸣 菌 体 T7 和 昭 0 中 的 例外 情况 ，mRNA 不 需要
加 工 。@ 大 约 有 10 个 酶 参与 加 工 过 程 ， 一 般 内 切 核酸 酶 切割 后 产生 $-P 和 3“
OH 基 团 。@3“-OH 未 端 一 般 由 核酸 外 切 核 酸 酶 作用 形成 ，SSrRNA 可 能 是 例外 。
田 许 多 加 工 酶 对 碱 基 不 具有 专 一 性 ， 但 要 识别 大 的 结构 特征 。@ 当 不 存在 RNase
II 时 ， 可 能 由 苹 NA 的 加 工 酶 来 代替 。@@ 和 稀有 碱 基 是 在 转录 以 后 通过 修饰 酶 作
用 产生 的 ， 不 是 原来 就 有 的 。

第 三 节 ， 真 核 生 物 中 RNA 的 转录 和 加 工
一 、 真 核 生物 中 RNA 的 转录

真 核 生 物 有 三 种 RNA 聚合 酶 ， 分 别 利 用 三 类 不 同 的 启动 子 。RNA 聚合 酶 间

转录 产生 核糖 体 RNA 和 大 多 数 snRNA，RNA 聚合 酶 II 转录 产生 mRNA 前 体 ，
RNA 聚 合 酶 III 转录 产 生 tRNA、SS RNA 和 部 分 sn RNA。

原核 细胞 中 ， 除 某 些 启动 子 需 要 辅助 因子 外 ，RNA 聚合 酶 可 以 单独 起 始 转
录 。 而 真 核 细 胞 的 RNA 聚合 酶 不 能 单独 起 作用 ， 它 需要 负责 识别 启动 子 元 件 序
列 的 辅助 因子 。RNA 聚合 酶 I 和 RNA 聚合 酶 II 所 利用 的 启动 子 位 于 转录 起 始
位 点 上 游 ， 而 RNA 聚 合 酶 III 利用 的 启动 子 位 于 转录 起 始 位 点 下 游 。

每 种 启动 子 都 含有 相应 的 一 类 辅助 因子 以 及 供 RNA 聚合 酶 识别 的 一 套 特殊
的 短 保守 顺序 。RNA 聚合 酶 I 和 III 依靠 少数 的 辅助 因子 识别 相对 有 限 的 几 套 启
有 了

RNA 聚合 酶 II 所 利用 的 启动 子 中 能 被 转录 因子 识别 的 短 序列 也 称 作 用 位 点

序列 ， 分 布 在 大 于 100bp 的 区 域内 ， 位 于 转录 起 始点 上 游 。 不 同 启动 子 中 的 短 序

列 及 识别 它们 的 因子 大 多 数 是 共同 的 ， 但 也 有 些 特别 的 因子 ， 它 们 识别 特定 的 一
类 基因 并 调节 其 局 动 。 数 目 众 多 的 效应 因子 的 作用 是 促进 转录 的 起 始 。 这 些 效应
因子 可 以 分 为 三 类 ， 前 两 类 与 RNA 聚合 酶 和 局 动 子 的 相互 作用 有 关 ， 第 三 类 则
在 转录 调控 中 起 作用 。
1) 基本 因子 〈basal factor)， 这 类 因子 在 所 有 局 动 子 起 始 的 RNA 的 合成 中 都
210 ，

是 必需 的 ， 它 们 和 RNA 聚合 酶 在 转录 起 始点 周围 形成 复合 物 ， 决 定 起 始 的 位

2) 上 游 因 子 〈upstream factor)， 是 一 些 能 够 识别 并 结合 转录 起 始点 上 游 的
一 致 性 短 序列 的 DNA 结合 蛋白 。 它 们 普遍 存在 并 且 在 任何 启动 子 的 特定 结合 位
点 上 起 作用 ， 能 增强 起 始 的 效率 ， 并 且 使 启动 子 适 度 地 发 挥 功能 。 不 同 的 启动 子
需要 不 同 的 一 套 上 游 因子 ， 它 们 对 基因 的 充分 表达 是 必需 的 。

3) 诱导 因子 (inducible factor)， 是 在 特定 的 时 间或 特定 的 组 织 被 合成 或 激活
的 ， 能 控制 转录 在 准确 的 时 间 和 地 点 进行 的 一 类 因子 。 这 些 因 子 在 DNA 上 的 结
合 序列 叫做 应 答 元 件 (response element)。

只 含有 能 被 基本 因子 和 上 游 因 子 识 别 的 元 件 的 启动 子 在 任何 类 型 的 细胞 中 都
能 起 始 转录 ， 这 样 的 基因 是 细胞 中 组 成 型 表达 的 基因 (有 时 也 称 为 持家 基因
housekeeping gene)， 或 者 是 感染 广泛 宿主 并 且 依 赖 于 宿主 转录 装置 进行 增殖 的
病毒 基因 。

RNA 聚合 酶 I 起 始 的 转录 方式 多 种 多 样 ， 但 它们 的 共同 特征 是 上 游 因子 和
诱导 因子 结合 到 转录 起 始点 上 游 的 特定 序列 上 。 这 些 因 子 与 DNA 结合 形成 复合
物 ， 其 中 蛋白 质 与 蛋白 质 的 相互 作用 是 很 重要 的 ， 通 过 基本 转录 因子 间 的 相互 作
用 而 启动 转录 。

以 上 所 述 的 启动 子 元 件 序列 都 位 于 转录 起 始点 附近 。 另 外 还 有 一 些 DNA 序
列 能 增强 转录 ， 但 这 些 序列 距 转录 起 始点 相当 远 ， 而 且 无 论 是 上 游 或 下 游 ， 也 无
论 方向 如 何 均 能 增强 转录 ， 这 一 类 元 件 叫 做 增强 子 。 增 强 子 元 件 与 启动 子 元 件 类
似 ， 也 由 多 种 多 样 的 标准 序列 组 成 ， 而 且 这 些 序列 都 是 相 邻 的 。 增 强 子 对 RNA
聚合 酶 II 和 RNA 聚合 酶 [催化 的 转录 都 有 增强 作用 。

转录 起 始 所 必需 的 ， 但 不 是 RNA 聚合 酶 的 成 分 的 任何 蛋白 质 都 定义 为 转录
因子 。 许 多 转录 因子 通过 识别 顺 式 作 用 位 点 起 作用 ， 但 这 不 是 转录 因子 作用 的 惟
三 方式 ， 一 种 因子 和 另 一 种 因子 之 间 以 及 一 种 因子 与 RNA 聚合 酶 之 间 可 以 识别
和 相互 作用 ， 也 可 以 挫 入 到 起 始 复合 物 中 。 某 一 种 因子 只 对 一 种 或 特定 的 一 套 启
动 子 的 转录 起 作用 。

真 核 与 原核 mRNA 转录 的 区 别 就 在 于 真 核 转 录 需 要 数目 巨大 的 转录 因子 。
真 核 启动 子 的 定义 是 含有 全 部 结合 位 点 的 区 域 ， 该 区 域 支 持 正 常 效率 的 并 被 适当
控制 的 转录 。 转 录 真 核 mRNA 的 启动 子 的 主要 特征 在 于 它 是 转录 因子 结合 的 位
点 ， 而 RNA 聚合 酶 只 结合 在 其 周围 ， 并 不 直接 与 启动 子 延 伸 的 上 游 区域 接 触 。

真 核 转 录 调 控 方 式 呈 正 调控 ， 在 组 织 特异 性 控制 下 ， 提 供 某 些 转录 因子 ， 激
活 某 些 启动 子 。 抑 制 启动 子 的 调控 方式 很 罕见 。

真 核 转录 单位 通常 只 包含 一 个 基因 ， 转 录 终 止 位 点 存在 编码 区 下 游 ， 但 缺少
原核 中 典型 的 终止 区 ，RNA 聚合 酶 I 和 聚合 酶 III 催化 的 转录 的 终止 发 生 在 分 散
的 序列 上 ， 而 RNA 聚合 酶 II 催化 的 转录 终止 还 不 清楚 ， 真 核 mRNA 的 3 末端

和

不 是 转录 终止 时 形成 而 是 由 转录 后 切割 加 工 产生 的 。
真 核 生物 中 的 三 种 RNA 聚合 酶 存在 于 核 内 不 同 的 位 置 ， 它 们 的 一 般 性 质 见
表 7-1。

表 7-1 真 核 细胞 中 的 三 种 RNA 聚合 酶

酶 位 置 产物 相对 活性 x- 鹅 膏 素 敏感 性
RNA 聚 合 酶 细胞 核 TRNA 50% 一 70% 不 敏感
RNA 聚合 酶 I 核 质 hnRNA 20% 一 40% 敏感
RNA 聚合 酶 II 核 质 tRNA 一 10% 种 特异 性

转录 抑制 剂 对 区 分 RNA 聚合 酶 很 有 用 ， 不 同 的 抑制 剂 作用 于 不 同 的 RNA
聚合 酶 ， 一 些 抑制 物 的 性 质 见 表 7-2。

表 7-2 ”转录 抑制 剂 及 其 作用

抑 制剂 作用 的 酶 抑制 剂 作用
利 福 霉 素 细菌 全 酶 结合 于 B 亚 基 阻 止 起 始
链 霉 素 细菌 核心 酶 结合 于 8 亚 基 阻 止 起 始
放 线 菌 素 D 真 核 RNA 聚合 酶 I 结合 于 DNA 并 阻止 延 伟
cx 忽 膏 素 真 核 RNA 聚 合 酶 I 结合 于 RNA 聚 合 酶 J

真 核 与 原核 RNA 聚合 酶 的 主要 区 别 是 对 w- 鹅 膏 素 的 敏感 性 不 同 。 所 有 真 核
RNA 聚合 酶 都 是 大 的 蛋白 质 ， 大 于 $00 000Da， 具 有 8 一 14 个 亚 基 ， 纯 化 的 酶 可
以 利用 DNA 模板 合成 RNA， 但 不 能 在 启动 子 处 选择 起 始 。

真 核 RNA 聚合 酶 开 一 般 由 十 多 个 亚 基 组 成 〈 图 7-17)。 三 个 大 的 亚 基 与 细
菌 的 RNA 聚合 酶 有 同 源 性 ， 它 们 组 成 基本 的 催化 装置 。 两 个 最 大 的 亚 基 可 能 携
带 催化 位 点 ， 其 余 三 个 亚 基 是 三 种 RNA 聚合 酶 所 共有 的 ， 绝 大 多 数 亚 基 以 单 拷
贝 形式 存在 ， 有 三 种 亚 基 以 两 个 拷贝 的 形式 存在 。

RNA 聚合 酶 II 具有 C 端 域 (carboxy-terminal domain CTD)， 由 多 个 重复 的
一 致 序列 Tyr-SerPro-Thr-SerProSer 组 成 ， 这 些 序列 是 RNA 聚合 酶 工 所 独 有
的 ， 这 些 序列 在 酵母 中 重复 26 次 而 在 哺乳 动物 中 重复 $0 次 左右 。 重 复 的 次 数 是
重要 的 ， 因 为 缺失 典型 重复 数 的 一 半 的 突变 是 致死 的 。 重 复 序 列 中 的 Ser 和 Tr
是 高 度 磷酸 化 的 ， 具 有 非 磷酸 化 亚 基 的 酶 称 为 RNA 聚合 酶 IIa， 而 具有 磷酸 化 亚
基 的 酶 称 为 RNA 聚合 酶 IIo，CTD 与 转录 起 始 反应 有 关 。

通过 缺失 突变 、 点 突变 和 足迹 法 可 以 鉴定 启动 子 元 件 。RNA 聚合 酶 工 利用
的 启动 子 可 以 分 为 两 部 分 ，- 45 一 + 20 区 位 于 转录 起 始点 周围 ， 称 为 核心 启动
子 ， 它 足以 起 始 转录 ; 另 一 序列 位 于 - 180~ - 107 区 ， 称 为 上 游 调 控 元 件 〈up-

。

av

10 个 以 上 的 亚 基 1Dp 1 与 细菌 的 B' 亚 基 相 关 结合 DNA
CTD=(Try-Ser-Pro-Ihr-Ser-Pro-Thr)，，
1 与 细菌 的 B 亚 基 相关 结合 核 苷 酶
100
5S0
2 与 细菌 的 cx 亚 基 相关 酶 装配
<1
2 三 种 酶 共有
25 1 “三 种 酶 共有
<1]
1 三 种 酶 共有
4
1

图 7-17 ” 真 核 RNA 聚合 酶 I 工 有 10 个 以 上 的 亚 基

stream control element，UCE)， 它 可 以 很 有 效 地 增强 转录 效率 (图 7-18)。

RNA 聚合 酶 I 需要 两 种 辅助 因子 ，UBF1 结合 在 核心 启动 子 和 UCE 上 ，
SLI1 不 单独 直接 与 启动 子 作 用 ， 但 是 一 旦 UBFI1 与 启动 子 结合 ，SL1 就 可 以 协同
扩展 DNA 覆盖 区 域 。 两 种 因子 同时 结合 以 后 ，RNA 聚合 酶 [就 能 与 启动 子 结合
并 起 始 转录 。 我 们 假设 在 核心 启动 子 上 结合 的 这 两 种 因子 与 RNA 聚合 酶 I 有 直
接 作 用 ， 但 我 们 不 知道 在 UCE 上 结合 的 这 两 个 同样 的 因子 如 何 刺 激 核 心 区 的 起
始 。

UBF1 是 单 链 多 肽 ， 它 特异 地 结合 于 核心 启动 子 和 UCE 中 的 GC 丰富 区 。
UBF1 可 以 识别 不 同 种 的 模板 ， 如 鼠 的 UBF1 可 识别 人 的 基因 的 核心 启动 子 和
UCE; SL1 具有 种 特异 性 ， 即 人 的 SL1 不 能 识别 鼠 的 基因 的 核心 启动 子 和 UCE，
反 过 来 也 一 样 。

SL1 (选择 因子 ) 的 行为 很 像 细菌 中 的 $ 因子 ， 它 不 能 特异 地 与 DNA 结合 ，
但 能 与 UBF-DNA 复合 物 结合 并 使 之 稳定 ， 从 而 主管 RNA 聚合 酶 T 转 录 的 起 始 。
真 核 生 物 rRNA 转录 过 程 见 图 7-19。

RNA 聚合 酶 III 利用 下 游 和 上 游 启 动 子 。 根 据 它 们 被 特定 的 一 组 转录 因子 识
别 的 方式 不 同 ， 这 些 启动 子 可 分 为 两 类 ，5SS RNA 和 tRNA 的 转录 启动 子 是 内 部
启动 子 ， 在 下 游 ， 而 snRNA 转录 的 启动 子 在 上 游 (图 7.20)。

tRNA 基因 的 转录 调控 区 位 于 转录 单元 内 的 转录 起 始点 之 后 。tRNA 基因 中
有 两 个 高 度 保守 的 启动 子 序列 ， 即 A 盒 (A box，5-TGGCNNAGTGG-37) 和 也

“95。

polI 启 动 子 由 两 部 分 组 成

es
上 游 控制 元 件 核心 启 亏

二 160- 150. 0 OO 4 三 吉 二 2 OFE 2

”ANCNANANNNORANANNNANNANNAN
EXE 了 下 2

ANONNANMANANCSCSANCNCNCSNONCNARAA

站 二 二 二 芝

秆

图 7-18 RNA 聚 合 酶 I 的 启动 子 由 一 个 核心 启动 子 组 成
距 上 游 控 制 元 件 70bp，UBF1 可 与 两 个 区 域 结 合 ， 之 后 RNA 聚合 酶 I 与 核心 启动 子 结合 。

盒 (B box，5'-GGTTCGANNCC-3 )。 这 两 个 序列 同时 也 编码 让 NA 自身 的 重要
序列 ， 即 编码 RNA 的 D 环 和 TFC 环 。 这 意味 着 了 NA 内 的 高 度 保 守 序 列 同时
也 是 高 度 保 守 的 启动 子 序列 。

RNA 聚 合 酶 III 起 始 转录 所 必需 的 两 个 复杂 的 转录 因子 TFIIIB 和 TFIIIC

已 鉴定 出 来 了 (图 7-21)。TEIIIC 可 以 与 让 NA 启动 子 的 A 盒 和 B 盒 结合 ，

TEFIIB 则 可 以 和 A 盒 S0bp 上 游 序列 结合 。TEFIIIB 由 三 个 亚 基 组 成 ， 其 中 一 个

是 TBP (TATA box binding protein)， 三 种 RNA 聚合 酶 都 需要 ; 第 二 个 亚 基 被

称 为 BRF (TFIIIB 相关 因子 ， 它 与 RNA 聚合 酶 I 起 始 因 子 TFIIB 同 源 ); 第 三

个 亚 基 是 B'。TEFIIIB 没有 序列 特异 性 ， 因 为 它 的 结合 位 点 似乎 是 由 TEFIIIC 与
“ 权 到 于

UCE

图 7-19_ rRNA 转录 起 始 的 图 解 模型

起 始点

ANONAANROARARRORNONRORORARORANNRANNORNARANONON
box A box C

ANORORORORORORORNOROARARARNANRORIARNINORNARNANORNOANON
box A box B

CONANOARNANIORNIRNONONORNANARNANARNANNANONANANONONON
OCT PSE TAITA

图 7-20 RNA 到 合 酶 III 利 用 的 启动 子 可 能 由 两 部 分 组 成
起 始点 下 游 由 分 开 的 boxA 和 boxC 或 boxA boxB 组 成 ，
上 游 可 能 由 分 开 的 顺序 (OCT PSE TATA) 组 成

二 二 上 3

RNADpolIII

RNAPpolIII

TBRIUIC

Eee

图 7-21 真 核 生 物 让 NA 启动 子 转录 的 起 始

DNA 的 结合 位 点 所 决定 的 。TEFIIIB 可 以 促进 RNA 聚合 酶 III 结合 并 起 始 转录
TFIIIB 结合 以 后 ，TEIIIC 就 相当 于 一 个 为 其 定位 的 装配 因子 。

RNA 聚 合 酶 III 利用 的 另 一 类 启动 子 是 SS rRNA 启动 子 。SS rRNA 基因 的
启动 子 上 含有 一 个 A 盒 ， 位 于 内 部 调控 区 域 ， 它 处 于 转录 起 始点 下 游 + 50 至
+65 之 间 。 另 一 个 C 盒 位 于 转录 起 点 下 族 +80 一 + 99 之 间 ， 这 两 个 序列 都 非常
重要 。

SS rRNA 启动 子 的 C 盒 是 特异 的 DNA 结合 蛋白 TFIIIA 的 结合 位 点 〈 图
7-22)。TEFIIIA 作为 装配 因子 使 得 TFIIIC 可 以 与 SS rRNA 启动 子 相 互 作 用 。A 售
可 能 也 稳定 TFIIIC 与 DNA 的 结合 ， 一 旦 TFIIIC 与 DNA 结合 形成 复合 物 ，
TFIIIB 就 能 够 与 该 复合 物 起 作用 并 使 RNA 聚合 酶 III 结合 进来 而 起 始 转录 。

RNA 聚合 酶 II 自身 不 能 启动 转录 ， 它 必须 依赖 于 辅助 的 转录 因子 ， 聚 合 酶

与 这 些 转 录 因 子 组 成 一 个 基本 转录 装置 ， 这 个 装置 对 于 任何 启动 子 都 是 必需 的 。

RNA 聚合 酶 开 结合 的 启动 子 含有 多 种 短 的 顺 式 作用 元 件 ， 每 一 种 元 件 被 一 种 反
有 6

A 盒 C 盒

|

虽 _-

IC
| 2
: TFIIIA =

全

(一 (TBP 且 azrzrrcyxT *
[ 和 上 CA 人生 也 全 全 PE 0]
\ REY 抽 和、

图 7-22 真 核 生 物 SS zRNA 启动 子 转 录 的 起 始

式 作用 因子 所 识别 。 这 些 顺 式 作 用 元 件 位 于 TATA 盒 的 上 游 ， 并 且 可 能 以 两 种
方向 和 不 同 的 距离 存在 。 靠 近 起 始 位 点 的 TATA 盒 和 直接 位 于 起 始 位 点 上 的 起
始 子 区 (initiator region) 负责 起 始 位 点 的 准确 选择 ， 远 上 游 的 元 件 决定 启动 子
的 效率 。

启动 子 可 被 增强 子 激活 而 增强 转录 ， 增 强 子 距离 它 所 作用 的 启动 子 很 还 ， 它
可 以 从 两 个 方向 在 一 个 基因 的 两 边 起 作用 。 增 强 子 由 一 套 元 件 组 成 ， 这 些 元 件 组
织 〈orgnization) 得 比较 集中 。 有 些 元 件 为 增强 子 和 启动 子 所 共有 。 增 强 子 通过

二

与 启动 子 上 装配 的 蛋白 质 复合 物 相 互 作用 而 发 挥 功能 。

外 本

已 被 鉴定 RNA 聚合 酶 II 起 始 转录 所 必需 的 一 系列 转录 因子 、 纯 化 和 克隆 。
这 些 因 子 被 命名 为 TFIIA、TRFIIB (transcription factor IIA，IIB) 等 。 它 们 以 特
定 的 次 序 组 装 到 局 动 子 上 (图 7-23)。

TATA 售 二 一 二
TAFII |
ee
TFID

图 7-23 RNA 聚 合 酶 I 转 录 起 始 复合 体 在 一 含有 TATA 盒 的 启动 子 上 的 组 装

RNA 聚 合 酶 I 起 始 复合 物 组 装 的 第 一 步 是 TFIID 识别 相应 序列 并 与 之 结
合 。TFIID 是 由 TBP 和 TAF II (TBP 相关 因子 ) 组 成 的 复合 物 。TBP 与 TATA
结合 。 研 究 表明 在 哺乳 动物 细胞 中 ，TBP 与 TATA 结合 后 ， 接 着 至 少 有 8 个
TAFII 加 入 进来 形成 TFIID。

TBP 在 真 核 生 物 的 三 种 转录 复合 物 (SLL、TFIIIB 和 TFIID) 中 都 存在 ，

5 人

在 转录 起 始 中 起 重要 作用 。 分 析 过 的 所 有 真 核 生 物 TBP 均 是 单 体 蛋 白 并 都 有 一
不 由 180 个 残 基 构成 的 非常 保守 的 C 端 结构 域 ， 这 个 保守 的 结构 域 在 体内 转录
申 所 起 的 作用 与 全 长 蛋白 质 所 起 的 作用 相同 。TBP 是 一 个 完全 二 元 对 称 结构 ，
作用 于 DNRA 的 小 沟 。TBP 内 部 结构 与 TATA 结合 ， 外 部 结构 与 其 他 蛋白 质 因子
相互 作用 。TATA 结合 区 发 生 突变 将 抑制 RNA 聚合 酶 II 的 转录 起 始 。

TEIIA 与 TFIID 的 结合 能 增强 TFIID 与 TATA 盒 的 结合 ， 并 稳定 TFIID-
DNA 复合 物 。 体 外 转录 研究 发 现 ，TEFIID 得 到 纯化 后 ， 就 不 再 需要 TFIIA。 所
以 在 完整 细胞 中 ，TEFIIA 的 作用 似乎 是 抵消 抑制 因子 诸如 与 TFIID 相关 DR1 和
DR2 的 作用 ， 很 可 能 TFIIA 与 TFIID 的 结合 阻碍 了 这 些 抑制 因子 的 结合 ， 让 组

TEIID 一 是 结合 到 DNA 上 ，TFIIB 就 会 与 TFIID 结合 ， 而 且 TFIIB 又 可 与
RNA 育 合 酶 结合 。TEFIIB 起 一 个 桥梁 作用 ， 它 允许 RNA 育 合 酶 以 及 携带 聚合 酶
的 TFIIF 加 入 到 复合 物 中 来 。TEFIIF 含有 两 个 亚 基 ， 大 亚 基 RAP74 具有 依赖
ATP 的 DNA 解 旋 酶 活性 ， 小 亚 基 RAP 38 和 RNA 聚合 酶 II 紧密 结合 。 复 合
装配 完成 后 ，RNA 聚合 酶 II 要 从 复合 物 中 释放 出 来 才能 起 始 转录 。 负 责 把 RNA
孙 侣 酶 II 释放 出 来 的 是 TFIIH， 它 的 一 个 亚 基 具 有 和 蛋白质 激酶 活性 ， 能 使 RNA
事 侣 酶 C 端 重复 序列 (CTD) YSPTSPS 中 的 S 和 工 (丝氨酸 和 苏 氨 酸 ) 磷酸 化 ，
磷酸 化 使 RNA 聚合 酶 II 发 生变 构 并 与 TFIIF 分 离 而 从 复合 物 中 释放 出 来 ， 沿 着
DNA 模板 移动 开始 转录 。

RNA 聚合 酶 工 的 转录 终止 能 力 目前 还 没有 完全 研究 清楚 ， 转 录 产 物 的 3 末
端 是 切割 产生 的 。 位 于 切割 位 点 上 游 10 一 30 个 碱 基 的 AAUAAA 序列 是 切割 和
加 多 聚 A 的 信号 。 转 录 基 本 复合 物 中 的 一 种 内 切 核酸 酶 和 poly (A) 聚合 酶 及 其
他 因子 (这 些 因子 具有 识别 AAUAAA 信和 号 的 专 一 性 ) 相 结合 。

二 、 真 核 mRNA 分 子 5 端 和 3 端的 结构

1. 真 核 mRNA 分 子 $ 端 “ 帽 子 ”

真 核 mRNA 分 子 5 端 是 由 7- 甲 基 乌 嗓 叭 核 苷 酸 与 2 -O- 甲 基 乌 味 叭 核 苷 酸 或
2 -0- 甲 基 腺 味 叭 核 背 酸 以 $ -3 焦 磷酸 连接 而 封 财 的 。5 端 “ 帽 子 ” 的 结构 单位
是 (7-MeG) -5 -ppp-$- [2 -OMe (GVA)] -3 -p-5“- 核 苷 酸 -3 -p。

图 7-24 是 真 核 mRNA 分 子 的 $ 端 结构 ， 有 三 种 结构 类 型 的 帽子 (m7G5-
pppNP，m'G5 ppp5 Nmp-Np 和 m7G5S'pppS'NmpNmp)， 在 帽子 0 中 ， 核 糖 不 被
甲 基 化 ; 在 帽子 1 中 有 一 个 核糖 被 甲 基 化 ; 在 帽子 2 中 有 两 个 核糖 被 甲 基 化 。 除
真 核 生 物 mRNA 外 ， 高 等 动 植物 病毒 也 有 3“ 帽子 结构 ， 有 的 病毒 具有 特殊 的 帽
子 结构 ， 这 些 帽 子 结构 都 是 转录 后 加 上 去 的 。

1

帽子 结构 对 于 mRNA 的 翻译 很 重
要 ， 它 可 使 mRNA 免 章 外 切 核酸 酶 的 降
解 ， 同 时 它 对 于 mRNA 与 核糖 体 的 结合
以 及 翻译 起 始 区 的 辨认 也 很 重要 。 呼 肠

mRNA 都 有 甲 基 化 的 “未 端 帽子 结构 得
带 甲 基 化 5 端的 mRNA 比 5 端 不 甲 基 化
的 mRNA 在 麦 豚 系 统 中 合成 和 蛋白质 的 速
度 快 得 多 。 如 果 用 化 学 方法 除去 mG
病毒 RNA 和 免 珠 蛋白 mRNA 就 失去 了

绝 大 部 分 模板 活性 。 中

种 大 邢 涝 5 端 帽子 结构 与 蛋白 质 翻 译 的 起 始 ，

有 关 。 无 mG 的 呼 肠 孤 病毒 不 能 与 408

了 亚 基 形 成 复合 物 。m7G 可 能 是 蛋白 质 合

9 碍 了 ! 和 ?4 全 人 成 起 始 的 辨认 信号 的 一 部 分 ， 如 小 鸡 外 上

cb 一 "、、Bas 白 蛋白 mRNA， 其 5 未 端的 帽子 结构 阴 上

| 近 区 域 能 形成 发 夹 结构 ， 这 样 的 结构 使

人 个子 ?处 中 基 化 5 端 帽子 结构 与 蛋白 质 合成 的 起 始 密码 下

& 革 才 co 子 在 空间 上 靠近 了 ， 这 种 $ 端 附近 的 发
夹 结构 在 其 他 真 核 mRNA 中 也 存在 ， 医

图 724 真 核 RNA 的 5 端 帽子 结构 ”此 帽子 结构 与 蛋白 质 合成 的 启动 有 关 。
2. 真 核 mRNA 分 子 3 末端 尾巴

绝 大 多 数 (不 是 全 部 ) 的 真 核 mRNA3“ 端 有 poly (A) 尾巴 ， 它 是 mRNA 如
录 后 早期 由 腺 昔 酸 聚合 酶 加 上 去 的 ， 其 长 度 一 般 是 20 一 200 核 苷 酸 ，poly ( 轴
不 能 加 到 初级 转录 产物 上 ， 因 为 在 正常 情况 下 转录 是 通过 poly (A) 信和 号 的 ， 芝
样 在 加 上 poly (A) 之 前 ， 内 切 核酸 酶 必须 发 生 作 用 。 据 目前 了 解 的 情况 来 看 时
poly (A) 尾巴 可 能 的 功能 有 : @ 对 稳定 mRNA 有 一 定 作用 。 实 验证 明 ， 去 队
poly (A) 以 后 珠 蛋白 mRNA 的 模板 活性 很 快 消失 ， 这 说 明 poly (A) 的 存在 与
mRNA 的 抗 降 解 有 关 ， 但 聚 腺 苷 酸 如 何 影 响 mRNA 的 降解 目前 还 不 清楚 时
@poly (A) 还 与 mRNA 顺利 通过 核 模 进入 细胞 质 的 过 程 有 关 ， 有 人 认为
poly (A) 与 病毒 的 侵 染 性 也 有 关 。Gpoly (A) 与 翻译 调控 有 关 。 有 些 mRNA 没
有 poly (A) 尾巴 ， 如 组 蛋白 mRNA， 这 种 mRNA 的 3 端 有 特殊 的 二 级 结构 于
末端 的 形成 依赖 于 此 二 级 结构 。RNA 的 合成 在 荃 环 结构 处 终止 ， 妨 碍 双 股 的 葵
形成 的 突变 阻止 RNA3 端的 形成 ， 修 复 突 变 可 以 恢复 二 级 结构 并 且 也 恢复 形成

<。 20

3 端的 能 力 。 因 此 推断 ，3 端的 二 级 结构 比 准确 的 序列 对 于 3 “ 端 形 成 更 为 重要 。
形成 葵 环 二 级 结构 的 链 是 DNA 上 的 编码 链 而 不 是 模板 链 。

体外 实验 证 明 ，3 "端的 正确 形成 需要 三 种 活性 成 分 的 作用 ， 一 种 是 热 不 稳定
因子 〈 功 能 尚 不 清楚 ); 第 二 种 是 与 3 切割 位 点 上 游 发 卡 结构 结合 的 因子 ; 第 三
种 是 一 个 56 个 核 苷 酸 的 RNA 称 为 U7 RNA， 它 与 3“ 端 切割 位 点 下 游 的 一 段 短 序
烈 互补 。U7 snRNA 与 组 蛋白 H3 mRNA 的 相互 作用 如 图 7-25。 在 几 种 不 同 物种
来 源 的 H3 mRNA 中 ， 与 U7 snRNA 互补 的 上 游 发 夹 结构 和 下 游 顺 序 是 保守 的 。
U7 snRNA 的 序列 和 结构 从 海胆 到 人 都 是 很 保守 的 。

省 朵 H3 mRNA
红 了 了
\

\ 7 U，
\UI
2 ICNG 3'ends
ID 1 |
> | = 十 |
二 -
5 0AACG 八 、CACCACACCCC CAAGAAAGAUUCUCGUUAAA 3'
3 RNREEG0G TO CO0666AAGAUCOE 1

GECi 5

CiG:

If 3As

图 7-25 组 蛋白 H3 mRNA 3 端的 产生 依赖 于 两 个 特性
3' 端 有 一 发 夹 结构 和 一 个 与 U7 snRNA 碱 基 配 对 的 顺序 。

组 蛋 自 mRNA 的 下 游 一 致 性 序列 的 突变 降低 了 它 与 U7 snRNA 配对 的 能 力 ，
并 且 抑 制 3 端的 加 工 ，U7 snRNA 相应 突变 可 以 恢复 配对 能 力 ， 也 能 恢复 3 "端的
加 工 。 因 而 推断 U7 snRNA 功能 的 发 挥 要 通过 碱 基 配 对 ， 但 还 不 知道 具体 步骤 ，
可 能 是 终止 也 可 能 是 切割 。

三 、 真 核 生物 mRNA 的 加 工
真 核 生 物 mRNA 的 初级 转录 产物 必须 经 历 几 个 加 工 步 又 才能 成 为 成 熟 的
mRNA， 包 括 三 个 过 程 : $“ 端 加 帽 、3 ” 端 切 割 及 多 腺 苷 酸化 和 RNA 拼接 。
1. S$ 端 加 由

新 生 RNA 起 始 合成 大 约 25 一 30 个 碱 基 后 ，7- 甲 基 鸟 味 叭 就 被 加 到 5 末端
RNA 加 工 过 程 中 , 这 个 步骤 的 起 始 由 二 聚 体 加 帽 酶 催化 ， 该 酶 与 RNA 聚合 酶 I
2

)pBa 的 CTD 的 磷酸 化 有 关 。CTD 在 转录 起 始 期 间 被
PPP 了 一 新 生 RNA 的 5 端 ”磷酸 化 ， 加 帽 酶 与 RNA 聚合 酶 I 和 开 并 无 相互

O 作用 ， 它 专门 针对 RNA 聚合 酶 开 转 录 产 生 的 产
si 时 物 进行 催化 反应 。
加 帽 酶 的 一 个 亚 基 催 化 RNA 聚合 酶 II 合 成
@ 人 3 的 新 生 RNA 的 5 末端 除去 7 磷 ， 另 一 亚 基 将 来
| 自 于 GTP 的 GMP 转移 到 新 生 RNA 的 5- 二 大
二 酸 上 ， 产 生 鸟 味 叭 5 5“- 三 磷酸 结构 ， 最 后 由 单
昌 | 的 CH， 独 的 酶 将 甲 基 转 移 到 鸟 味 叭 的 N-7 位 和 新 生
ER RNA 的 5 端 核糖 的 2-O 位 上 (图 7-26)。
@ 上 2. 前 体 RNA 与 含有 保守 的 RNA 结合 域 的

hnRNA 结合 蛋白 相 联系

蛋白 质 编码 基因 转录 产生 的 新 生 RNA 和
本 726 新 和 RNAD5SS mRNA 加 工 过 程 中 的 中 间 产 物体 系统 称
人 pre-mRNA (前 体 RNA)。 真 核 细胞 核 内 的 RNA
不 是 以 自由 形式 存在 的 。 从 RNA 聚合 酶 起 始 转
录 产 生 RNA 起 直到 成 熟 的 RNA 被 运输 到 细胞 质 中 ，RNA 一 直 与 一 套 丰富 的 核
蛋白 质 联系 在 一 起 ， 这 些 蛋 白 是 与 hnRNA 结合 的 主要 蛋白 质 组 分 ，hnRNA 是
pre-mRNA 和 其 他 大 小 不 等 的 核 内 RNA 的 统称 。 司

不 同 的 hnRNA 结合 蛋白 与 新 生 premRNA 分 子 的 不 同 区 域 结 合 ， 如 hnRNA
蛋白 质 Al1，C 和 D 优先 结合 在 内 含 子 3 ”端的 喀 喧 丰富 区 。

与 转录 因子 类 似 ， 几 乎 所 有 的 hnRNA 结合 蛋白 都 有 特定 的 分 子 结构 ， 它 们
含有 一 个 或 多 个 RNA 结合 域 ， 而 且 至 少 有 一 个 结构 域 用 于 与 其 他 蛋白 质 相 互 作
用 。

RNA 结合 蛋白 含有 与 DNA 结合 蛋白 相同 的 锌 指 结构 域 。

RNA 结合 蛋白 结构 域 也 称 为 RNA 结合 域 (RED)， 它 在 hiRNA 结合 蛋 邱
中 普遍 存在 ， 一 个 大 约 80 个 残 基 的 结构 域 存 在 于 任 一 RNA 结合 蛋白 中 。RNA
结合 蛋白 含 两 个 高 度 保 守 的 区 域 (RNP1 和 RNP2)。 ，

该 RNA 结合 蛋白 结构 域 由 四 个 B 折 琶 和 两 个 u 螺旋 组 成 。RNPL1 和 RNP 入
在 两 个 中 心 8 链 上 并 列 ， 而 且 其 侧 链 与 RNA 单 链 区 有 多 处 结合 。 单 链 RNA 环
穿越 B 折 驹 表面 并 恰好 进入 一 个 存在 于 久 、 义 链 结合 蛋白 质 环 与 RNA 结合 蛋白
C- 未 端 区 域 之 间 形 成 的 横 沟 中 (图 7-27)。

RGG box 是 hnRNA 结合 蛋白 中 发 现 的 另 一 个 RNA 结合 结构 域 ， 它 含有 五
个 Arg-Gly-Gly (RGG) 重复 ， 这 种 富 含 精 氨 酸 的 特性 与 和 噬菌体 N 蛋白 和 HIV ，
Tat 蛋白 的 RNA 结合 域 相 似 。

“

m'GpppNP 一

图 7-27 UIA 有 蛋白 和 RNA 复合 物 的 结构
(a) RNP 结构 域 简 图 ， 保 守 的 RNPL1 和 RNP2 位 于 两 个 中 等 g 链 中 。
(b) X 射 线 结晶 学 测定 的 UIA 蛋白 质 RNA 复合 物 。

3. Pre-mRNA3 “端的 加 工

在 动物 细胞 中 ， 除 组 蛋白 mRNA 以 外 ， 所 有 mRNA 都 有 3“-poly (A) 尾巴 。
时 期 脉冲 标记 腺 病毒 和 SV40 RNA 的 研究 表明 ， 病 毒 初级 转录 产物 可 以 延伸 到
加 ploy (A) 信号 的 下 游 ， 这 个 结果 说 明 附 加 ploy (A) 的 3-OH 末端 是 由 核酸
肉 切 酶 切割 产生 的 ， 但 是 预期 的 下 游 RNA 片段 由 于 在 体内 降解 得 太 快 以 致 无 法
检测 到 。 然 而 ， 用 Hela 细胞 核 抽 提 物 进行 的 体外 系统 加 工 反 应 中 检测 到 了 预期
的 切割 产物 ， 从 而 进一步 验证 了 这 种 内 切 核酸 酶 切割 机 制 。

动物 细胞 cDNA 克隆 的 早期 测序 结果 显示 在 所 有 含 AAUAAA 序列 的 mRNA
的 ploy (A) 尾巴 上 游 10 一 35 个 核 苷 酸 处 ， 如 果 编 码 AAUAAA 的 模板 变 成 其 他
任何 序列 时 ， 该 基因 的 转录 产物 就 失去 添加 ploy (A) 的 能 力 ， 由 该 突变 模板 转
录 的 未 加 工 产物 很 快 就 被 降解 了 。 在 动物 细胞 中 ， 切 割 位 点 下 游 的 第 二 个 信号 对
于 多 数 前 体 mRNA 的 切割 和 poly (A) 化 是 必需 的 。 该 信号 是 GU 丰富 区 或 U
丰富 区 ， 在 切割 位 点 周围 的 50 个 核 苷 酸 之 内 。

前 体 mRNA 的 切割 和 附加 多 聚 腺 苷 酸 所 需 的 蛋白 质 逐 渐 被 纯化 和 鉴定 ， 于
是 科学 家 提出 了 图 7-28 中 的 模型 。 根 据 这 个 模型 ， 一 个 由 四 条 链 组 成 的 360kDa
的 切割 和 多 腺 苷 酸化 特异 因子 (cleavage and polydenylation specificity factor
CPSF) 自 先 与 第 一 个 poly (A) 信号 上 游 AU 丰富 区 形成 不 稳定 复合 物 ， 然 后 ，
三 个 外 加 时 和 白 与 CPSF-RNA 复合 物 结 合 ， 这 三 个 外 加 蛋白 包含 一 个 称 为 切割 刺
激 因 子 (cleavage stimulatory factor CStF) 的 200kDa 异 源 三 聚 体 ， 一 个 称 为 切割
因子 〈cleavage factor I CEFI) 的 1S0KkU 异 源 三 聚 体 和 另外 一 个 切割 因子 (CF

3

poly(A) 信号 poly(A) 位 点
5 一 一 上 Oo0T 一 一 3

CPSF ]
CPSF 2

CEFICFILCStF

CStF
ATP ~| 慢 这 腺 音 酸化

PPi 重 ) P-LOU 一 一
解

PICFETRCGRI CS 让 (降解 )

ATP<J~PABII 快速 腺 苷 酸化
PPi

Ce 天

图 7-28 ”哺乳 动物 细胞 中 的 PremRNA 的 切割 和 多 腺 苷 酸化 的 模型

IID)。CStF 和 poly (A) 信号 下 游 GU 丰富 区 或 U 丰富 区 的 相互 作用 能 稳定 该 多
蛋白 复合 物 。 最 后 ，poly (A) 聚合 酶 [poly (A) polymerase PAP] 结合 到 该 复
合 物 上 ， 并 切割 产生 自由 3 末端 后 迅速 形成 poly (A)。

真 核 生 物 前 体 mRNA3 端的 切割 和 poly (A) 化 过 程 中 的 多 蛋白 装配 与 DNS
分 子 AT 丰富 区 的 TATA box 上 转录 起 始 复合 物 的 装配 过 程 类 似 。 多 蛋 白 复 合 物

.224 .

的 靶 配 过 程 中 贯穿 着 特异 性 的 蛋白 质 -核酸 、 蛋 白质 -蛋白 质 相 互 作用 网 络 的 协
同 作用 。
| 加 poly (A) 紧 接 在 poly (A) 位 点 切割 之 后 ， 加 poly (A) 分 两 个 时 期 ， 第
| 三 时 期 是 慢 速 加 上 12 个 A， 接 着 快速 加 上 200 一 250 个 以 上 A。 人 快速 期 需要 含
RNA 结合 蛋白 结构 域 的 poly (A) 结合 蛋白 的 多 拷贝 结合 ， 该 蛋白 定名 为 PAB
下 以 区 别 于 结合 在 细胞 质 mRNA poly (A) 尾巴 的 poly (A) 结合 蛋白 。PAB II
与 PAP 起 始 加 上 的 短 poly (A) 尾 结合 ， 可 以 进一步 促进 PAP 催化 的 poly (A)
化 反应 〈 图 7-28)。

4. RNA 拼接

所 有 真 核 mRNA 分 子 初 级 转录 产物 中 都 有 插入 序列 即 内 含 子 (intron)， 内
含 子 把 编码 序列 隔 开 ， 真 核 mRNA 分 子 必须 经 过 加 工 去 除 内 含 子 并 拼接 后 才能
作为 蛋白 质 翻译 的 模板 。RNA 的 拼接 (RNA splicing) 发 生 在 细胞 核 内 。5 “ 端 帆
子 和 3 “ 端 尾 巴 形成 之 后 ， 内 含 子 一 个 一 个 被 切除 ， 编 码 序 列 ( 称 为 外 显 子 exon)
| 相互 连接 形成 成 熟 的 mRNA 这 个 过 程 就 叫 RNA 的 拼接 。 拼 接 后 的 mRNA 仍 有
马 端 帽子 和 3 端 尾巴 。

采用 蜡 源 双 链 技术 ， 在 电镜 下 可 以 清楚 地 看 到 不 参与 形成 成 熟 mRNA 分 子
的 双 链 RNA 部 分 (intron) (图 7-29)。

3'- 多 聚 (A) 尾 巴

3 内 合子 3
(a) (b)
图 7-29 成 熟 mRNA 与 DNA 杂交 后 的 电镜 照片

RNA 的 拼接 具备 以 下 特点 : 切割 必须 在 特定 位 点 上 进行 ， 即 切割 时 必须 识
别 出 内 含 子 和 外 显 子 连接 处 的 特殊 碱 基 序列 ， 和 否则 即使 错 切 一 个 碱 基 ， 阅 读 框 也
会 及 生 改变 。

分 析 许多 内 含 子 的 碱 基 序列 发 现 ， 每 个 内 含 子 的 5 端 都 是 GU，3“ 端 都 是
AG (图 7-30)。
mRNA 加 帽 和 加 poly (A) 之 后 ， 在 核 内 发 生 拼 接 反 应 。 由 于 初级 转录 产物

5

肉 合 与 2 全 G
和 3'AG S' 位 点 3 位 点
A G A 人 生 浓 Il12?PyYN CA G
丽人 | 而 和 全 人 全 人 YN 全 Aioo 9 区 外 2

图 7-30 内 含 子 两 端的 序列

被 逐步 加 工 ， 所 以 核 内 RNA 分 子 的 大 小 很 不 一 致 。 故 称 为 异 质 核 内 RN
(hnRNA), 加工 完 成 以 后 的 成 熟 mRNA 才能 从 核 内 转运 到 细胞 质 中 ， 然 后 被 翻
译 。 是 什么 因素 阻止 初级 转录 产物 和 部 分 加 工 产物 被 转运 到 细胞 质 目前 还 不 清
楚 。 一 般 认 为 拼接 在 核 膜 上 发 生 ， 接 着 成 熟 mRNA 通过 核 孔 转运 到 细胞 质 内 。

所 有 内 含 子 都 具有 相同 的 末端 ， 那 么 拼接 究竟 如 何 发 生 的 呢 ? 内 含 子 的 切除 ，
是 有 明显 次 序 的 还 是 随机 的 ? 如 果 按 专 一 的 次 序 进行 ， 那 么 将 仅仅 产生 单一 的 审
间 体 ; 如 果 是 随机 进行 的 ， 那 么 将 存在 各 种 中 间 体 。 在 对 少数 基因 进行 的 研究 申
观察 到 内 含 子 不 是 以 一 个 单一 次 序 切除 的 ， 而 是 以 选择 次 序 切除 的 。 例 如 : 鸡 卵
蛋白 基因 有 7 个 内 含 子 (A 一 G)， 如 果 随 机 切除 应 产生 300 种 中 间 体 ， 但 实际 上
只 见 到 少数 几 种 中 间 体 。 失 去 一 个 内 含 子 的 中 间 体 常常 是 失去 了 下 或 下 接着 两
个 都 失去 ， 即 首先 失去 的 内 含 子 常常 是 下 或 F， 接 下 去 失去 G 或 D， 然 后 再 是 ，
B， 最 后 是 A 或 C。

核 内 RNA 拼接 所 需要 的 只 是 在 5 位 点 、3 “位 点 和 分 支 位 点 的 三 个 短 的 一 致
性 序列 。 分 支 位 点 的 一 致 性 序列 在 酵母 中 是 高 度 保守 的 ， 该 序列 为 UACUAAC
这 个 序列 在 高 等 真 核 生 物 中 是 不 太保 守 的 ， 但 是 具有 可 识别 的 一 致 性 ， 即 各 位 置
的 味 叭 、 喀 啶 是 一 致 的 ， 该 序列 为 : Py80NPy80Py87Pu75APy95。 强 套 拼接 过 程
分 三 步 进行 : @ 在 $' 位 点 切 开 ， 内 含 子 $-G 和 在 分 支 位 点 一 致 性 序列 中 的 A 中
5 -2 "磷酸 二 酯 键 结合 形 成 旨 套 。@ 在 3 端 切 开 并 且 连 结 外 显 子 ， 内 含 子 以 绳 套
形式 被 释放 。@ 绳 套 解 开 成 线 状 内 含 子 。

分 支 位 点 的 驾 序列 位 于 3 “拼接 位 点 上 游 18 一 40 个 核 苷 酸 处 ， 分 支 位 点 靶 序
列 是 用 来 鉴别 将 与 $' 拼 接 位 点 连结 的 最 靠近 3 “拼接 位 点 的 靶 点 。 在 酵母 中 ， 娟
果 UACUAAC 突变 ， 拼 接 反应 的 任何 一 步 均 不 能 发 生 。5 “拼接 位 点 突变 后 不 影
响 绳 套 的 形成 。 如 果 内 含 子 开头 的 G 变 为 A， 那 么 切割 在 左边 的 外 显 子 进 行
绳 套 可 以 形成 ， 但 到 此 为 止 。 如 果 5 -2 分支 序列 不 正确 ， 则 在 它 的 3" 端 下 游 布
发 生 切 制 ， 其 他 的 一 些 突变 也 容易 阻 断 该 切割 反应 。

根据 3' 位 点 的 作用 ， 内 含 子 分 两 类 ， 类 内 含 子 的 3/ 位 点 突变 不 影响 5 位 是 |
的 加 工 和 分 支 位 点 。 另 一 类 内 含 子 的 3' 位 点 的 变异 会 妨碍 5 拼接 位 点 的 切割 。

拼接 的 第 一 步 是 通过 $“ 拼 接 位 点 上 UACUAAC 中 的 A 的 亲 水 攻击 ， 第 二 步

“0206

是 由 第 一 步 释放 的 3' 端 再 去 攻击 3 拼接 位 点 ， 在 这 个 过 程 中 ， 磷 酸 二 酯 键 的 数
目 是 保守 的 ， 在 外 显 子 和 内 含 子 (exon 和 intron) 拼接 位 点 原来 有 两 个 磷酸 二 酯
键 ， 在 拼接 过 程 中 一 个 被 两 个 外 显 子 之 间 的 $ -3 "磷酸 二 酯 键 取 代 ， 另 一 个 被 形
成 绳 套 中 的 5$ -2 磷酸 二 酯 键 所 代替 (图 7-31)。

外 显 子 1 pU------------- 和 A---=- P 外 显 子 2
外 显 子 1 -OH 人
U G
St 人

外 显 子 1 0 一 P 一 O 外 显 子 2

7-31 在 一 个 自由 的 3 -OH 末端 通过 两 次 转 酯 反应 ， 攻 击 一 个 磷酸 双 酯 键 ， 发 生 核 剪接

真 核 生物 细 胞 核 和 细胞 质 中 含有 大 量 的 小 分 子 RNA。 在 高 等 生物 中 ， 小 分
了 于 RNA 大 小 大 约 100 一 300 个 核 苷 酸 ， 在 酵母 中 可 长 达 1000 个 核 苷 酸 左右 ， 它
们 在 细胞 中 相当 丰富 达 每 细胞 105 一 106 分 子 ， 种 类 也 很 多 ， 但 它们 的 浓度 太 低
而 不 能 直接 检测 ， 不 过 它们 与 加 工 过 程 中 有 关 的 功能 已 被 鉴定 。 核 内 的 小 分 子
RNA 叫 snaRNA (small nuclear RNA)， 细 胞 质 中 的 小 分 子 RNA 叫 sRNA (small
cytoplasmic RNA)， 在 天 然 状 态 下 ， 它 们 以 核糖 核 蛋 白 粒 子 形式 (snRNP 和
scRNP， 有 时 候 也 称 为 snurp 和 scyrp) 存在 。 一 个 snRNP 通常 只 含有 单个 RNA
分 子 和 10 种 左右 的 蛋白 质 ， 有 些 蛋 白质 是 某 一 特定 snaRNP 所 特有 的 ， 而 有 些 蛋
自 质 是 几 种 类 型 的 snRNP 所 共用 的 。 一 些 公共 蛋白 质 被 自身 免疫 抗 血 清 所 识别 ，
称 作 anti-sm; 这 些 蛋 白质 一 定 与 自身 免疫 识别 有 关系 ， 但 它们 与 自身 免疫 病 的
关系 目前 还 不 清楚 。

通过 突变 研究 发 现 一 些 较 丰 富 的 soRNA 在 酵母 的 生活 中 不 是 必 不 可 少 的 ，
而 与 拼接 有 关 的 snaRNA 是 必需 的 ， 它 们 的 基因 突变 是 致死 的 。

一 些 snRNA 与 拼接 有 关 ， 某 些 snRNA 具有 与 $ 和 3“ 拼接 位 点 以 及 分 支 靶 序
列 互 补 的 序列 ， 它 们 之 间 可 以 进行 碱 基 配 对 ， 并 在 拼接 中 起 重要 作用 。

拼接 装置 包括 几 种 saRNP， 并 有 大 量 附加 的 单个 蛋白 质 ， 常 称 作 拼 接 因子 ，

YY

四

这 些 snRNP 包括 U1、U2、US5 和 U4/U6， 它 们 是 根据 细胞 内 存在 的 snRNA 的
名 称 而 命名 的 ，Ul、 U2 和 U5 snRNP 各 含 单个 RNA 分 子 和 几 种 蛋白 质
U4/U6 snRNP 含有 U4 和 U6 两 条 RNA 分 子 。 各 种 snRNP 中 蛋白 质 的 总 和 大 纲
有 40 种 ， 其 中 的 几 种 可 能 直接 与 拼接 有 关 ， 而 有 些 仅仅 是 维持 结构 所 需要 的
或 者 是 snRNP 粒子 的 相互 作用 或 装配 所 需 。
人 的 Ul snRNP 含有 8 种 蛋白 质 ，Ul snRNP 可 能 形成 的 二 级 结构 含 几 个 域 ，
如 图 7-32 所 示 ， 在 UL RNA 中 ， 荟 环 结构 提供 蛋白 质 结 合 位 点 。 在 体外 ， 完 整 ，
的 U1 snRNP 可 以 结合 到 $ “拼接 位 点 上 并 且 只 有 完整 的 U1 snRNP 颗粒 才 具 有 结 ，
合 能 力 。 用 突变 分 析 可 以 直接 检查 U1 snRNA 与 5 拼接 位 点 配对 的 必要 性 。 图
7-33 中 ， 野 生 型 腺 病毒 12S mRNA 前 体 $ 拼接 位 点 的 序列 与 UL RNA 的 六 个 位
置 配对 后 进行 拼接 。 如 果 12S mRNA 前 体 5 端 突 变 ， 即 GG-AU， 则 拼接 不 能
进行 。 但 当 UL RNA 也 突变 ， 即 CU， 则 拼接 恢复 ， winpes

mRNA 5 "拼接 位 点 互补 对 于 拼接 是 必需 的 。

| 结构 域 Dj

(oue |

| GecG |

党 -大 如 二 测定 | 忆 |

广 结构 域 C 有 过

(AAU | 下 进

1 A 各 1: |

1 1 小 一 GG 全 |

TU 到 下

1 2G 1 : GC |

| 9IL

1 1 人

2 总 兴 注 35

1 U A 1 7
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1 全 7 WO SR

1 1 3 < 站
从 斋 > 光 )
结构 域 B GC 了 去
C 二 GOG 人 4 ;
和 A GGAUG IIGCU SS 2 间
C 的 0 蚌 :ec 1
0 5

图 7-32 ”UL RNA 有 一 些 碱 基 配 对 的 结构 形成 一 些 结构 域 ，
其 $ 端 单 链 可 与 $ 拼接 位 点 配对

2

ee 5

人 本 站 让 cv 克 责 之
:15' 外 显 子 GUG A G G 内 合子 3'

12S 腺 病毒 拼接 位 点

野生 型 UI RNA 和 12S mRNA 前 体 正 常 拼 接

TI
2 记 记 二
5' 外 显 子 GUGAA G 内 含 子 3

突变 拼接 位 点

野生 型 UL RNA 和 12S mRNA 前 体 不 拼接

UUA
15 外 显 了 QU GAAT 内 含 子 3'

突变 UL snRNA 和 突变 的 12S mRNA 拼接 恢复
图 7-33 消除 $ 拼接 位 点 功能 的 突变 可 被 U1 snRNA 中 与 其 碱 基 配 对 处 的 突变 所 抑制

。 U2 RNA 含有 与 分 支 位 点 互补 的 序列 ， 用 抗 U2snRNA 的 抗体 进行 免疫 沉淀
可 直接 鉴定 出 U2 snRNP 和 包括 分 支 位 点 在 内 的 内 含 子 形成 的 复合 物 。snRNA

5 人 2

近 5 端的 序列 与 内 含 子 中 的 分 支 序 列 互补 。
与 拼接 有 关 的 snRNP 和 拼接 因子 一 起 形成 一 个 大 的 颗粒 复合 物 ， 称 为 拼接
体 (splicesome)， 拼 接 体 为 S0 一 60S 大 小 的 核糖 核 蛋白 颗粒 。 有 些 RNA 拼接 蛋
白 与 依赖 于 ATP 的 RNA 解 链 酶 有 关 ， 它 们 在 拼接 体 中 RNA-RNA、RNA- 蛋 自
质 相互 作用 或 在 结构 的 创立 和 释放 中 起 重要 作用 。
几 种 snRNA 的 序列 已 经 测定 ， 它 们 的 共同 特点 是 可 以 形成 不 同 的 结构 域

外 显 子 内 含 子 外 显 子
UACUAAC 一 AG

左 侧 一 致 序列 旁 支 位 点 ” 右 侧 一 致 序列

一

人

Ul 结合 到 5' 拼接 点

一 一 一 cu 一 一 :cc 一 AG U2 结合 到 旁 支 位 点

普
过

US/U4/U6 三 聚 体 结合
U5 结合 到 外 显 子 $' 位 点
U6 结 到 U2

AS 过 届 )3 量
， 人 这 Ul 杰 放
0 A G U5 从 外 显 子 移 到 内 含 子

U4 释放
U6 催化 转 脂 反应
5 "位 置 切割 , 绳 套 形成

3' 位 置 切割 ,外 显 子 连接
拼接 RNA 释放
U2/US/U6 仍 和 强 套 结合

UACUAAC 一 AG 绳 套 去 旁 支

GU

图 7-34 ”拼接 通过 不 连续 步 又 进行 ， 该 过 程 中 形成 拼接 体 ，
包括 识别 一 致 性 序列 的 各 成 分 的 相互 作用

和 天

ER

(domain) (图 7-32)， 而 且 都 有 与 前 体 mRNA 5 端 位 点 、3 端 位 点 、 分 支 轰 序列
以 及 不 同 的 snaRNA 之 间 互 补 的 碱 基 序 列 。 这 些 特点 使 它们 在 拼接 中 起 作用 。 拼
接 过 程 见 图 7-34， 下 面 是 几 种 拼接 模式 :

1) 工 组 内 含 子 自 我 拼接 (图 7-35 ) ;

7 \
人 1
YY
下 可
d3 医
EE
下 1 1 Rd
d2 > 汉 时 1 Y
5 盏 5
的 隐 1 <N d4
N 有 N
7 N
Fi 过 RE ES 二
ee TITTTHFE 二 \
1 1 的
1 1
YY SS 5
人 SR
本 下 SG 三 人 网
外 显 子 1 刀 > 外 显 子 2 OBS
OO_-_---- 本 生生 和 scale ，
7 外 显 子 外 显 子 2
核 RNA II 型

第 一 次 转移 第 二 次 转移

图 7-35 所 有 类 型 的 拼接 反应 都 经 过 两 次 转 酯 反应

= 385

2) 选择 拼接 (图 7-36);
有

SV40TVt 抗 原 两 个 $ 位 点 与 共同 的 3 位 点 拼接
1 2 9 4 外 显 子

135 289 氨基 酸
下 汪汪 243 氨基 酸

95 人 55 氨基 酸

腺 病毒 E1A 多 个 5 位 点 与 共同 的 3 位 点 拼接

雄 和 峻 性
无 蛋白 质

只 有 肉 性 有 200
氨基 酸 的 蛋白 质

黑 腹 果 蝇 通过 5 “位 点 对 不 同 的 3 位 点 拼接
图 7-36 ”改变 拼接 方式 可 以 从 单个 基因 产生 多 种 蛋白 质

3) 顺 式 拼 接 和 反 式 拼接 (图 7-37) ;
4) 酵母 tRNA 拼接 (图 7-38， 图 7-39)。

"2

正常 拼接 只 发 生 在 顺 式
as 和
纹 显 才 3 内 含 玉 外 显 子 4

人

顺 式 拼接 产物 反 式 拼接 产物
如 内 含 子 中 引入 互补 序列 ， 可 反 式 拼接
图 737 拼接 一 般 以 顺 式 进 行 ， 但 当 造 成 特殊 结构 提供 内 含 子 碱 基 配 对 时 ， 可 发 生 反 式 拼接

O
|
下 一

0
明

OO 一

32OH,2，
图 7-38 酵母 的 tRNA 在 体外 的 拼接 可 通过 凝 胶 电泳 来 分 析 前 体 tRNA 和 拼接 产物

”89 ，

) 疾 胶 电泳 )

前 体

7-39_ tRNA 的 拼接 需要 核酸 酶 和 连接 酶 活性

四 、 核 酶

已 知 RNA 中 存在 几 种 类 型 的 催化 反应 ， 核 酶 (ribozyme) 已 成 为 用 来 描述
具有 催化 活性 的 RNA 的 一 个 通用 术语 。 根据 反应 的 类 型 一 些 RNA 对 非 自身
的 一 些 底 物 有 催化 活性 ， 而 另 一 些 RNA 则 在 分 子 内 发 挥 作 用 称 作 自 我 切割 (au
tocleavage) 或 者 自我 拼接 (autosplicing)。

RNA 酶 P 是 一 种 核糖 核 蛋 白 ， 由 一 条 RNA 分 子 与 其 结合 的 蛋白 质 组 成 ， 该
RNA 在 tRNA 的 加 工 中 具有 切割 能 力 ， 而 蛋白 质 成 分 起 间接 的 作用 ， 可 能 用 来
维持 这 种 具有 催化 活性 的 RNA 的 结构 。

类 病毒 类 小 RNA 具有 进行 自我 切割 反应 的 能 力 ， 该 反应 发 生 在 分 子 内 部 ，
这 种 分 子 可 分 为 “ 酶 活性 ”部 分 和 “ 底 物 ”部 分 ， 并 且 相 关 序 列 的 基因 工程 可 以
创造 出 “ 酶 ”， 这 种 酶 不 依赖 于 “ 底 物 ”。

I 类 内 含 子 具 有 自我 拼接 能 力 ， 这 种 反应 在 体外 可 以 由 RNA 单独 执行 ， 但
在 体内 需要 辅助 蛋白 帮助 ，I 类 内 含 子 的 工程 RNA 分 子 具 有 与 原始 功能 相关 的
其 他 几 种 催化 活性 。

在 体外 ， 这 些 反应 的 共同 主体 是 RNA 执行 切割 和 通过 磷酸 二 酯 键 连接 的 反
应 。

“hy

自我 拼接 是 在 四 膜 虫 细胞 核 内 、 真 菌 线粒体 和 T4 鸣 菌 体 中 发 现 的 工 类 内 含
子 的 性 质 。 反 应 需要 的 信息 存在 于 内 含 子 序列 中 ， 反 应 需要 一 个 特别 的 二 级 结构
(可 能 是 三 级 结构 )。 内 含 子 可 能 编码 负责 移动 的 内 切 核酸 酶 。I 类 和 II 类 内 含 子
均 含 有 可 读 框 。RNA 编辑 是 在 mRNA 水 平 上 改变 信息 的 过 程 ，RNA 编辑 在 转录
后 或 转录 期 间 改变 一 个 RNA 的 序列 ， 这 种 变化 可 以 创造 一 个 有 意义 的 编码 序
列 ， 编 辑 过 程 是 通过 核 酶 在 转录 后 或 转录 中 的 RNA 序列 中 增加 或 缺失 或 替换 一
不 碱 基 ， 而 改变 mRNA 的 信息 。 这 种 编辑 过 程 在 哺乳 动物 系统 中 常常 发 生 单个
碱 基 的 替换 ， 而 在 椎 虫 和 副 黏 病毒 中 常常 发 生 缺 失 (常常 缺失 U)。 在 椎 虫 中 ，
编辑 反应 非常 广泛 ， 有 一 种 mRNA 中 多 达 一 半 碱 基 被 编辑 。 编 辑 反 应 使 用 与
ERNA 互补 的 导向 RNA 作为 模板 ， 导 向 RNA 和 预 编辑 (pre-edited) RNA 配
对 忆 并 利用 其 3 端 多 聚 U 尾巴 通过 转 酯 反应 把 尿 喀 啶 插入 到 目标 RNA 中 。

2239。

第 作 章 翻译

从 20 世纪 5$0 年 代 初 期 开始 ， 经 过 了 20 多 年 的 努力 ， 已 经 逐渐 了 解 清楚 了

蛋白 质 合 成 与 DNA、RNA 及 核糖 体 的 关系 。 近 年 来 的 研究 对 象 已 从 原核 生物 转

到 真 核 生 物 及 其 细胞 器 ， 由 整体 或 复杂 体系 进入 分 子 水 平 ， 许 多 参与 蛋白 质 合 成
的 生物 大 分 子 的 一 级 结构 、 部 分 高 级 结构 已 被 阐明 ， 蛋 白质 合成 的 调控 问题 也 取
得 了 不 少 研究 成 果 。

蛋白 质 的 生物 合成 过 程 也 就 是 生物 体内 遗传 信息 的 “翻译 ”过 程 。 这 一 过 程 时
比 “ 复 制 ” 和 “转录 ”都 要 复杂 得 多 ， 它 大 约 需要 200 多 种 生物 大 分 子 ， 其 中 外

括 核糖 体 〈( 由 RNA 和 蛋白 质 组 成 )、mRNA、tRNA 以 及 同 工 受 体 让 NA、 和 氢 本 于

tRNA 合成 酶 、 可 溶性 蛋白 质 因子 (起 始 因子 、 延 伸 因 子 和 释放 因子 ) 等 ， 参 加 重
协同 作用 。 关 于 蛋白 质 的 生物 合成 需要 论述 两 方面 的 问题 ， 一 方面 是 有 关 遗 传 信和
息 的 传递 问题 ， 另 一 方面 就 是 关于 蛋白 质 合 成 的 机 制 问题 。

基因 的 遗传 信息 是 通过 mRNA 传递 到 基因 产物 一 一 多 肽 的 。DNA 及 其 转录
产物 mRNA 的 核 苷 酸 顺 序 与 蛋白 质 的 氨基 酸 顺 序 间 的 关系 通过 遗传 密码 来 体现 。
遗传 密码 是 由 核 苷 酸 组 成 的 三 联 体 。 翻 译 时 ， 从 起 始 密码 子 开始 ， 沿 着 mRNA
的 5 一 3 方向 不 重大 地 连续 阅读 氨基 酸 密码 子 ， 一 直到 终止 密码 子 停止 ， 从 K
端 到 C 端 生 成 一 条 具有 特定 顺序 的 肽 链 。

关于 遗传 信息 如 何 从 DNA 到 mRNA 在 前 几 章 里 已 论述 ， 本 章 主要 讨论 遗传
密码 的 破译 和 蛋白 质 生物 合成 的 机 制 。

第 一 节 ， 遗传 密码 的 破译

遗传 密码 (code) 是 指 DNA 上 的 核 苷 酸 与 蛋白 质 链 上 的 氨基 酸 之 间 的 对 应
关系 。

密码 子 (codon) 是 指 mRNA 上 三 个 连续 的 核 苷 酸 决 定 一 个 特定 的 氨基 酸 。
mRNA 上 特定 的 密码 子 顺 序 与 相应 蛋白 质 的 氨基 酸 顺 序 相 对 应 。

在 Watson 和 Crick 1953 年 提出 DNA 双 螺 旋 模 型 后 的 第 2 年 ， 物 理学 家
G.Gamovw 首先 提出 了 遗传 密码 的 思想 。 当 时 生化 遗传 学 中 已 有 很 多 实验 根据 证
明 “ 一 个 基因 一 个 蛋白 质 ” 的 假说 ， 因 此 遗传 密码 的 概念 易于 人 们 接受 。 但 当时
还 没有 发 现 mRNA 和 tRNA， 所 以 对 遗传 密码 的 研究 很 难 开 展 。 在 相当 长 的 一
段 时 间 内 ， 密 码 破译 工作 都 没有 成 功 。

86

一 、Crick 的 探索

1961 年 《基因 的 调控 》 一 文 发 表 ， 提 出 了 mRNA 的 存在 ， 并 能 携带 遗传 信
息 。 以 后 Crick 以 T2 鸣 菌 体 为 材料 ， 用 遗传 学 方法 证 明了 三 个 核 苷 酸 决定 一 个
氨基 酸 。 他 们 用 许 啶 类 药物 处 理 大 肠 杆 菌 T2 叹 菌 体 ， 引 起 T2 突变 ， 同 时 发 现
这 类 突变 可 分 为 两 大 类 ， 一 类 是 “+ ”"， 另 一 类 是 “- ”， 实 际 上 “+ ”就 是 插入
了 一 个 核 苷 酸 ， 使 阅读 框 前 移 一 格 ，“- ”就 是 减少 了 一 个 核 背 酸 ， 使 阅读 框 后
移 一 格 。 他 们 用 这 种 方法 得 到 了 许多 突变 体 ， 再 用 这 些 突变 体 进 行 重组 实验 ， 如
果 两 个 “+ ”突变 株 同 时 感染 细胞 则 得 不 到 野生 型 重组 子 ， 若 将 两 个 “- ”突变
株 做 重组 实验 也 得 到 同样 结果 。 但 如 将 三 个 “+ ”突变 或 三 个 “- ”突变 做 重组
实验 ， 均 可 得 到 野生 型 重组 子 。

医 巡 攻 采 表明 , 妆 半 个 “+ 突变 或 三 个 辣 二 于 汪 同仁 染色 体 上
时 ， 则 能 恢复 野生 型 ， 而 其 他 情况 如 两 “- ”或 两“ 2
两 + 一 “一 ”都 不 能 重组 产生 野生 型 。 上 as 明了 三 个 术 首 季
定 一 个 氨基 酸 。

”遗传 密码 是 每 三 个 核 苷 酸 一 读 ， 叫 做 可 读 框 (reading frame)， 上 述 突 变 实
际 上 就 是 移 框 突变 。

一 、Nirenberg 的 实验

1961 年 FF Jacob 提出 mRNA 概念 ， 并 与 SBrenner 等 作 了 实验 证 实 ， 之
后 M. 双 ，Nirenberg 等 就 开始 用 实验 的 方法 来 研究 遗传 密码 ， 所 用 的 方法 是 人
工 合成 一 定 的 RNA 作为 mRNA， 用 大 肠 杆菌 的 核糖 体 和 其 他 可 溶性 提取 物 及
ATP 做 细胞 外 蛋白 质 合 成 试验 。 最 初 他 们 用 多 核 苷 酸 磷酸 化 酶 来 合成 RNA， 这
种 酶 能 把 一 种 或 几 种 二 磷酸 核 苷 酸 聚 合成 多 核 苷 酸 ， 不 需要 模板 ， 合 成 的 多 核 苷
酸 顺 序 是 随机 的 。 例 如 用 1 种 二 磷酸 核 苷 酸 PPU 聚合 而 成 的 同 质 多 聚 体
(homopolymer) 是 多 聚 U。 以 此 多 聚 U 作为 人 工 mRNA， 进 行 细胞 外 蛋 白 质 合成
试验 。 每 次 试验 时 用 1#C 标记 20 种 氨基 酸 中 的 一 种 ， 看 哪 一 种 氨基 酸 能 挫 入 核
糖 体 〈 离 心 时 随 核糖 体 一 起 沉降 )， 结 果 发 现 只 有 苯 丙 氨 酸 能 挫 入 。 因 此 知道 葵
两 氨 酸 的 密码 是 UUU， 这 是 第 一 个 译 出 的 密码 。 以 后 又 译 出 AAA 是 赖 氨 酸 的
密码 ，CCC 是 且 氨 酸 密码 。

1964 年 M. 双 .Nirenberg 等 已 能 合成 一 定 顺序 的 二 核 苷 酸 和 三 核 苷 酸 。 这
个 方法 是 用 二 环 已 碳 二 亚 胺 〈dicyclochexyuar bodimid DCC) 把 3 磷酸 核 苷 酸 的
3 磷酸 和 另 一 核 苷 酸 的 $' - OH 结合 ;

同样 用 上 述 无 细胞 体系 ， 加 入 某 二 核 苷 酸 或 三 核 苷 酸 ， 然 后 看 标记 氮 基 酸 的

“ 23 。

OH
(Bi 、B 是 两 个 碱 基 ， 缩 合 时 B, 的 S -OH、22-OH 和 B 的 3-OH 都 要 保护 )

结合 情况 ， 实 际 上 就 等 于 在 核糖 体 上 加 一 个 只 有 两 个 或 三 个 核 背 酸 的 微型
mRNA。 结果 发 现 二 核 苷 酸 完 全 不 能 结合 氨基 酸 而 三 核 苷 酸 可 以 ， 但 UAAX
UAG、UGA 3 种 三 核 苷 酸 不 能 结合 氨基 酸 为 “无 字义 密码 子 ”( 终 止 密码 子 )。

三 、Khorana 的 实验

用 磷酸 核 苷 酸 合 成 多 核 苷 酸 比较 困难 ， 但 用 磷酸 脱氧 核糖 核 苷 酸 合成 DNA
时 由 于 2 位 上 没有 一 OH 需要 保护 ， 因 而 在 技术 上 容易 得 到 。Khorana 等 先 合成
各 种 二 、 三 或 四 核 苷 酸 ， 再 用 DCC 把 同一 种 窒 核 苷 酸 缩合 成 周期 性 的 多 核 背 酸 ，
例如 把 两 个 AAC 缩合 。

CR, 和 R, 为 保护 基 团 )

如 此 可 以 合成 (AAC),， 再 合成 其 互补 链 (GTT),， 组 成 双 链 DNA， 然 后
用 RNA 聚 合 酶 作 细胞 外 转录 。 可 得 (AAC), 和 (GUU ) , 两 种 RNA， 用 此 人 工
合成 的 RNA 作 mRNA 进行 细胞 外 蛋白 质 合成 实验 时 就 不 仅 是 一 个 tRNA 分子 带
一 个 氨基 酸 结合 到 核糖 体 上 ， 而 是 在 有 GTP 的 条 件 下 可 以 合成 多 肽 链 了 。 其 实时
验 结果 如 表 8-1。

由 同 种 核 苷 酸 聚 合 而 成 的 周期 性 多 核 苷 酸 所 合成 的 多 肽 都 是 只 由 一 种 氨基 酸
所 组 成 的 同 质 多 聚 体 ， 其 中 前 面 6 种 都 合成 3 种 同 质 多 肽 ， 如 (AAC)，, 合成 多
苏 氨 酸 或 多 谷 酰胺 ， 此 现象 说 明 密码 子 由 3 个 核 苷 酸 组 成 。 它 之 所 以 合成 3 种 不
同 的 同 质 氨基 酸 多 聚 体 是 由 于 阅读 框 不 同 而 有 3 种 翻译 方法 :

“8

表 8-1 人 工 合成 的 mRNA 及 细胞 外 合成 的 多 肽

人 工 合成 mRNA 细胞 外 合成 的 多 肽
CUG 汽 (SerLeu)，
(CUG)， (Val-Cys)，
KAC 太 (ThrHis)，
(AG) ， (Arg-Glu)，
(UUC)， (Ser-Ser),，(Leu-Leu),，(Phe-Phe)，
(CUUG)， (Leu-Leu),，(Val-Val),，(Cys-Cys)，
(AAG)， (Arg-Arg),，(Lys-Lys),，(Glu-Glu)，
(CAA)， 《Thr-Thr),，(Asn),，(Gln-Gln)，
(UAC)， (ThrThr),，(Leu-Leu),，(Tyr-Tyr)，
(AUC)， (llelle),，(SerSer),，(His-His)，
(GUA) ， (Ser-Ser),，(Val-Val) ，
(GAU 和 (Asp-Asp),，(Met-Met)，
(UAUC) ， (Tyr-Leu-Ser-lle)，
(UUAC)， (Leu-Leu-Thr-Thr)，
(GAUA)， 不 合成 多 肽
(GUAA)， 不 合成 多 肽

ICAA， LAA，…….

AAC， AAAG AAC，.………

CA ACA

这 三 种 密码 子 必 定 分 别 代表 苏 氨 酸 (Thr)、 天 门 冬 酰 腕 (Asn)、 谷 氨 酰 胺
(Gln)， 但 是 还 不 能 确定 哪 一 个 密码 子 代 表 哪 种 氨基 酸 。

由 三 核 苷 酸 聚 合 而 成 的 多 核 苷 酸 共 四 种 ， 每 种 都 合成 一 种 多 肽 ， 而 且 都 由 两
种 氨基 酸 周 期 性 交替 而 成 ， 例 如 (AC), 所 合成 的 多 肽 是 ThrHisThrHis……， 这
是 因为 (AC),， 只 有 一 种 读 法 ， 即 : ACA，CAC，ACA，CAC……。

因此 ACA 和 CAC 必定 分 别 代 表 Thr 和 His， 但 也 不 能 确定 哪 一 个 密码 代表
哪 一 个 氨基 酸 。

如 果 把 以 上 两 个 结果 合 起 来 看 ， 就 知道 ACA 一 定 是 编码 Thr， 因 此 CAC 一
定编 码 His。

需要 注意 的 是 ， 这 是 在 特定 条 件 下 的 细胞 外 翻译 ， 不 需要 AUG 起 始 密码
子 ， 因 此 阅读 框 不 固定 ， 所 以 才 可 能 有 这 个 结果 。

综合 以 上 3 个 小 组 的 实验 结果 和 其 他 实验 室 用 比较 间接 的 方法 所 得 的 结果 ，

。 了 239

到 1966 年 遗传 密码 全 部 破译 ， 得 出 密码 表 ( 表 8-2)。

表 8-2 遗传 密码 表
第 二 个 字母

。

} Cys

UGA Stop
UGG Trp

第
个
字
母

U
党
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G

后 来 许多 研究 结果 都 证 明 这 个 密码 表 是 正确 的 ， 特 别 是 在 测定 天 然 DNA 和 了
RNA 中 核酸 顺序 时 ， 同 时 测定 其 所 确定 的 氨基 酸 顺 序 ， 如 GX174 及 MS2 等 ，
结果 都 与 密码 表 完 全 相符 。

随 着 对 遗传 密码 的 进一步 研究 ， 发 现 它们 具有 一 些 重要 性 质 。

1. 简 并 与 兼职

一 共有 64 个 密码 子 ， 除 3 个 终止 密码 子 外 ， 余 下 61 个 为 氨基 酸 密码 子 ， 而
氨基 酸 有 20 种 ， 所 以 许多 氨基 酸 的 对 应 密码 子 不 止 1 种 ， 这 种 现象 叫做 密码 的 性
简 并 〈degenerate)。 对 应 于 同一 氨基 酸 的 不 同 密码 子 称 为 同 义 密 码 子 (synonym
codon)。

在 已 知 的 61 个 氨基 酸 密码 子 中 ， 有 两 个 是 兼职 的 ， 它 们 除了 代表 特定 的 氢
基 酸 外 ， 还 兼作 起 始 密码 子 ， 作 为 肽 链 合成 的 起 始 信号 ， 这 两 个 密码 子 是 AUG
(Met) 和 GUG (Val)。AUG 使 用 得 最 为 普遍 。

2. 密码 子 中 不 同位 置 碱 基 的 特异 性

虽然 密码 子 的 简 并 程度 各 有 不 同 ， 但 同 义 密码 子 在 密码 子 字典 中 不 是 杂乱 分
.240 ，

布 的 。64 个 密码 子 被 分 配 在 16 个 方 格 内 ， 凡 属 同一 氨基 酸 的 密码 子 ， 都 位 于 同
一 方 格 内 ， 这 些 密码 子 的 前 两 个 碱 基 相 同 ， 区 别 只 在 于 第 3 个 碱 基 : 或 为 任 一 碱
基 (如 Pro、Thr、Ala、Gly 等 密码 子 ); 或 同 是 呀 哈 (如 Gln、Glu、Lys 密码
子 ); 或 都 是 喀 啶 (如 Phe、Tyr、Cys，His、Asn 和 Asp 密码 子 )。 这 表明 密码 表
申 前 两 个 碱 基 的 特异 性 很 强 ， 有 6 个 密码 子 的 氨基 酸 (Leu、Arg 和 Ser) 也 是 以
方 格 区 分 的 。

Met 和 Trp 都 只 有 1 个 密码 子 ，Ile 有 3 个 密码 子 ， 似 乎 与 其 他 氨基 酸 密码
子 有 所 不 同 。 但 是 ， 近 年 来 研究 哺乳 动物 线粒体 密码 子 使 用 情况 时 发 现 ， 这 3 个
有 奇数 密码 子 的 氨基 酸 均 变 为 含 偶数 密码 子 的 氨基 酸 ， 而 且 也 符合 密码 子 中 前 两
企 碱 基 特 异性 强 的 规律 。

在 密码 子 的 3 个 碱 基 中 ， 有 人 认为 第 2 个 〈 中 间 的 ) 碱 基 与 氨基 酸 的 极 性 有
关 : 若 氨 基 酸 具 极 性 侧 链 ， 密 码 子 的 第 2 个 碱 基 是 味 吟 ; 若 侧 链 为 非 极 性 ， 则 第
2 个 碱 基 是 喀 啶 (也 有 个 别 例外 )， 见 表 8-3。

表 8-3 ”密码 子 中 第 2 个 碱 基 与 氨基 酸 侧 链 的 关系

U 也 A 可
> 一 cH 一 信 >》 oH 一 CHSH
一 CEPOH
CH H 一 CH 本
一 CH 一 CRA 学 计 衣 N
CH 一 CH 0 H
人 一 CH 一 CH 一 CONHE2
s NH
上 本 H 一 CH 一 CONEP NE
一 CH 一 CHs CE
一 CR 一 SCH5 | NH
CH 一 CN 2
5 于 一 CEPOH
一 CH3 CHPCOOH
CH 一 CHECOOH W
CH 2 2
3. 通用 与 例外

密码 子 的 一 个 最 重要 的 性 质 是 其 通用 性 ， 无 论 体 内 、 体 外 实验 ， 从 病毒 、 原
核 到 真 核 ， 各 种 不 同 生 物 都 可 使 用 同一 密码 子 字典 。

但 是 ，1980 年 以 来 通过 对 人 、 和 牛 和 酵母 线粒体 基因 序列 和 基因 结构 的 研究
发 现 ， 密 码 子 的 通用 性 也 有 例外 ， 在 这 些 基 因 中 并 不 完全 按照 密码 子 字 典 编码 。
以 人 和 和 牛 线粒体 为 例 ， 有 以 下 改变 : DAUA 是 Met 而 不 是 lle 的 密码 子 。 这 样 ，
lle 由 原来 的 3 个 密码 子 改 为 两 个 ， 而 Met 由 原来 的 工 个 增 至 两 个 ， 变 动 后 出 现

2

两 个 新 家 族 : AUU 或 AUC (Ile) 和 AUA 或 AUG (Met)。@UGA 不 是 终止 密 则
码 子 ， 而 成 为 Trp 密码 子 。 结 果 Trp 密码 子 也 由 一 个 增 至 两 个 ， 成 为 一 个 新 家

族 ， UGA 或 UGG (Trp)。@AGA 和 AGG 不 是 Arg 密码 子 ， 而 变 为 终止 密码
子 ， 在 哺乳 动物 线粒体 中 共有 4 个 终止 密码 子 ， 分 为 两 个 家 族 : UGA 或 UGG
和 AGA 或 AGG。 上 述 有 异 于 密码 子 字典 的 规律 的 改变 ， 使 所 有 密码 子 都 成 为 偶 和
数 ， 全 部 都 可 以 按 家 族 区 分 。 这 表明 仍 有 规律 可 循 ， 其 意义 有 待 进一步 探讨 。
田 除 AUG 外 ， 尚 可 兼用 AUA 和 AUTU 作为 起 始 密码 子 。

4. 密码 子 的 阅读 方向 与 mRNA 的 编码 方向 一 致

在 蛋白 质 生物 合成 过 程 中 ，mRNA 的 编码 方向 是 5 一 3 ， 从 玉 端 向 C 端 延
伸 肽 链 ， 因 此 密码 子 阅 读 方向 也 是 从 5 端 至 3 端 。 一 条 肽 链 的 合成 起 始 之 后 ， 密 ，
码 子 按 3 个 一 框 读 下 去 ， 不 重 友 也 不 跳 格 ， 中 间 也 没有 标点 〈 即 不 停顿 ) 直到 终
让 和

5. 密码 子 的 使 用 情况

De 序列 分 析 的 飞快 发 展 ， 目 前 已 测 出 了 许多 蛋白 质 基因
的 一 级 结构 。 将 基因 或 其 mRNA 序列 与 蛋白 质 的 氨基 酸 序列 进行 比较 ， 不 仅 验
下 和 六 2 克 nk 江 寺 全 生 和
酸 密码 子 。@ 起 始 密码 子 和 终止 密码 子 的 使 用 情况 : 绝 大 部 分 使 用 AUG 为 起 始
信和 号 〈 有 报道 真 核 生 物 全 部 使 用 AUG)， 个 别 使 用 GUG; 而 UAA、UAG 都 可
作为 终止 密码 子 。 在 某 些 基因 中 有 时 连用 两 个 终止 密码 子 ， 可 能 是 为 了 更 为 有 效
地 终止 肽 链 的 合成 。@ 几 种 哺乳 动物 氨基 酸 密码 子 使 用 频率 的 比较 : 对 鸡 卵 白 蛋
白 【 密 码 子 数 为 388)、 免 B- 球 蛋白 〈 密 码 子 数 为 147)、 免 w- 球 蛋白 〈 密 码 子 数
为 142)、 免 疫 球 蛋 (密码 子 数 为 128) 和 胰岛 素 (密码 子 数 为 99) 的 密码 子 使
用 情况 的 研究 结果 表明 ， 它 们 对 同 义 密码 子 的 使 用 差异 甚大 ， 有 的 被 广泛 使 用 ，
而 另 一 些 则 使 用 得 比较 少 。@ 大 肠 杆菌 基因 密码 子 的 使 用 情况 原核 生物 的 代表
大 肠 杆 菌 基 因 的 研究 开展 最 早 ， 进 展 也 最 快 。 通 过 比较 大 肠 杆 菌 中 13 种 含量 较
多 的 蛋白 质 密 码 子 的 使 用 情况 发 现 这 些 高 表达 的 基因 中 密码 子 的 使 用 有 以 下 规
律 : 对 于 以 C 或 吉 结 尾 的 同 义 密码 子 ， 如 前 两 个 碱 基 为 A、U， 则 第 三 个 碱 基 优
先 使 用 C 而 不 是 U; 若 前 两 个 碱 基 为 C、G， 则 第 三 个 碱 基 优 先 使 用 U 而 不 是
C。 这 样 的 选择 有 利于 翻译 时 密码 子 与 反 密 码 子 的 相互 作用 ， 两 者 的 作用 能 不 太 ，
强 也 不 太 弱 ， 而 以 中 度 为 宜 ， 即 所 谓 最 适 相互 作用 能 。MS2 鸣 菌 体 密码 子 的 使
用 情况 与 大 肠 杆 菌 基因 密码 子 的 使 用 有 相似 的 规律 。@ 轩 哺乳 动物 线粒体 基因 的 密 。
码 子 使 用 情况 : 人 和 和 牛 线粒体 基因 编码 13 种 蛋白 质 ， 如 前 所 述 ， 线 粒 体 使 用 的
起 始 和 终止 密码 子 以 及 3 个 氨基 酸 (Met、Trp 和 lle) 的 密码 子 与 其 他 生物 不
同 。 线 粒 体 的 这 种 遗传 体系 既 不 同 于 原核 生物 又 区 别 于 真 核 生 物 ， 人 和 和 牛 线粒体

. 242 ，

基因 在 使 用 同族 密码 子 中 ， 较 多 使 用 的 是 以 A 或 C 结 尾 的 密码 子 。
酵母 线粒体 密码 子 中 ， 较 多 使 用 的 情况 既 不 同 于 胞 质 ， 也 不 同 于 哺乳 动物 线

工 节 ， 摇摆 假设

| “为 什么 不 同 密码 子 代 表 同 一 氨基 酸 ? 特别 是 密码 子 的 第 三 个 字母 容许 有 变
| 化 ，Gly、Pro、Thr、Val、Ala 中 ， 似 乎 只 由 密码 子 的 前 面 两 个 字母 决定 ， 第 三
| 不 字母 是 U、C、A、G 都 可 以 。 前 面 两 个 字母 决

| 定之 后 ， 第 三 个 字母 是 U 或 C 往 往 意义 相同 ， 如 RNA 密码 子 的 配对
|jCys、Asn、Asp、His、Phe; 第 三 个 字母 是 A 或 ER
1G 的 意义 往往 也 相同 ， 如 Gln，Glu、Lys 等 。 再 第 _ 碱 基

表 8-4 tRNA 反 密 码 子 与

| 加 上 忆 .co 中 并 不 存在 61 种 以 上 的 tRNA 的 事 有
实 ， 促 使 F.H.C.Crick 在 1966 年 提出 摇摆 假设 。 A 0

生根 据 分 子 模型 假设 ，tRNA 的 反 密码 子 的 第 一 或 9 <
不 字母 如 果 是 U、9p、G 或 工 的 话 ， 则 可 以 和 mR- U，G 或 A

NA 密码 子 第 三 位 上 一 种 以 上 的 碱 基 配 对 如 表
8-4。

G 在 摆动 键 角 时 ， 可 以 和 TU 形成 两 个 氨 键 ， 因 此 像 Cys、Asn 或 Gtn、Glu
等 氨基 酸 只 要 一 种 了 NA 就 够 了 ， 像 Ala、Gly、Pro 等 也 只 要 两 种 了 RNA。

摇摆 假设 后 来 为 许多 实验 证 明 ， 因 为 凡是 已 提纯 的 tRNA 都 已 测定 核 苷 酸 顺
序 ， 其 反 密 码 子 是 已 知 的 ， 可 以 用 细胞 外 实验 直接 测 知 其 识别 密码 子 的 序列 。

三 节 人 复 白 质 生 物 合成 的 机 制
一 、 与 重 白 质 生 物 合成 有 关 的 生物 大 分 子
蛋 自 质 生物 合 成 是 由 许多 种 类 的 生物 大 分 子 协 同 作用 进行 的 ， 因 此 在 讨论 合
成 机 制 之 前 有 必要 分 别论 述 这 些 分 子 的 结构 、 功 能 及 性 质 。
1. 核糖 体 及 多 核糖 休

核糖 体 是 由 几 十 种 蛋白 质 和 几 种 RNA 组 成 的 一 种 亚 细 胞 颗粒 体 ， 它 是 蛋白
质 生物 合成 的 场所 。

核糖 体 中 蛋白 质 占 其 重量 的 13，RNA 占 2/3。 经 过 20 多 年 研究 ， 对 它们
的 种 类 及 其 在 亚 基 上 的 分 布 已 经 有 了 一 个 清楚 的 轮廓 。 从 表 8-5 可 以 看 出 ， 真 核
生物 相应 的 RNA 比 原 核 的 沉降 系数 大 ， 蛋 白质 的 数目 比较 多 ; 而 线粒体 核糖 体

.243

于

的 RNA 的 沉降 系数 一 般 比 原核 生物 的 小 ， 但 蛋白 质数 目 一 般 比 原核 生物 的 多
真菌 和 动物 线粒体 的 核糖 体 中 尚 没 有 发 现 SS RNA 和 5.8S RNA; 叶绿体 的 情况
则 与 原核 生物 非常 相似 ， 但 大 亚 基 中 有 三 种 rRNA。

表 8-5 核糖 体 中 的 RNA 和 和 蛋白质

真 核 生 物

叶绿体 @ 68 一 70
33 一 55 23 列 治 入 5

@ 细 胞 质 ;@ 大 肠 杆菌 ; @@ 存 在 于 高 等 植物 叶绿体 中 。

对 大 肠 杆菌 核糖 体 的 组 分 和 化 学 结构 已 全 部 研究 清楚 : 小 亚 基 由 一 种 RNAL
(16S，1542 个 核 苷 酸 ) 和 21 种 蛋 日 质 构 成 ; 大 亚 基 则 由 两 种 RNA (23S， 2904
个 核 苷 酸 和 5SS，120 个 核 苷 酸 ) 和 34 种 蛋白 质 构 成 。

大 肠 杆菌 核糖 体 小 亚 基 共 有 21 种 蛋白 质 ， 分 别 用 S1 至 S21 表示 ; 大 亚 基 有 量
34 种 ， 表 示 为 LI 至 L34。 两 亚 基 间 有 两 个 蛋白 质 的 结构 完全 相同 ， 即 S20=
L26; 所 以 实际 上 大 肠 杆菌 核糖 体 蛋白 质 只 有 54 种 而 不 是 55 种 。 另 外 17 和 LI
的 氨基 酸 数目 完全 相同 ， 只 是 L7 N 端 为 乙酰 丝氨酸 而 L12 是 丝氨酸 。 至 于 核糖
体 中 各 种 蛋白 质 的 数目 ， 除 L7/L12 为 四 分 子 外 ， 其 他 都 是 以 单 分 子 存在 。 有
70% 以 上 的 蛋白 质 为 碱 性 蛋白 质 ， 等 电 点 在 pH 10 以 上 ， 只 有 三 种 蛋白 质 S6s
L7 和 L12 的 等 电 点 在 pH 5 左右 。 有 几 种 蛋白 质 含 有 修饰 氨基 本 如 N 端 氨基
酸 被 乙酰 化 ， 以 及 内 部 氨基 酸 的 甲 基 化 ， 个 别 蛋 白质 如 LI1 有 9 个 甲 基 。 核糖 |
体 是 一 个 高 度 复 杂 的 体系 ， 任 一 组 分 或 局 部 组 分 都 不 能 单独 起 到 整体 作用 。

用 重组 技术 、 化 学 交 联 和 化 学 修饰 技术 、 荧 光标 记 技术 、 中 子 衍 射 法 、 免 疫 晴
电镜 法 和 亲 和 层 析 法 对 核糖 体 的 空间 拓扑 学 进行 了 广泛 的 研究 。 用 上 述 方法 配合
大 量 的 实验 ， 得 到 了 大 量 关 于 rRNA 之 间 以 及 zRNA 和 核糖 体 蛋 白 之 间 关 系 的 结
果 。 用 共 价 交 联 法 分 离 出 了 RNA 与 蛋白 质 的 复合 物 ， 如 LI1、L5、 汉 站 利和 和 与
大 亚 基 中 的 RNA 有 关 ，L1 与 23S rRNA 中 一 段 通用 序列 〈56 个 核 苷 酸 ) 结合
SS rRNA 和 23S rRNA 则 通过 L5、L13 而 相互 作用 。 通 过 对 RNA 与 蛋 和 白质 结 合
的 初步 研究 表明 ， 在 30S 亚 基 中 两 者 的 分 布 是 均匀 的 ， 大 约 有 2V3 的 蛋白 质 与
RNA 直接 结合 ; 而 在 S0S 亚 基 中 ， 两 者 的 分 布 是 不 均匀 的 ， 即 蛋白 质 集中 于 一

， 244 ，

端 而 RNA 集中 于 另 一 端 ， 蛋 白质 中 心 与 RNA 中 心 距 离 约 50 一 60A 〈 中 子 衍射
结果 及 免疫 电镜 法 支持 这 一 结论 )。 两 个 亚 基 中 蛋白 质 的 分 布 差 别 这 么 大 ， 可 能
反映 它们 在 功能 上 不 同 。

随 着 电镜 技术 的 发 展 ， 获 得 多 种 角度 的 清晰 的 二 维 结构 图 像 ， 再 用 数学 推算
册 它 与 一 个 晶体 三 维 结构 的 关系 ; 根据 这 些 结果 ，Lake 提出 大 肠 杆 菌 核糖 体 模
型 ， 见 图 8-1。 小 亚 基 包 括 一 个 头 部 ， 一 个 基部 和 一 个 平台 ， 平 台 与 头 部 之 间 有
至 裂口 ; 大 亚 基 有 一 个 中 心 突出 部 分 ， 一 边 有 一 个 脊 ， 另 一 边 有 一 个 柄 。 结 合 上
述 数 据 ， 核 糖 体 组 分 特别 是 蛋白 质 在 核糖 体 中 的 拓扑 位 置 基本 上 可 以 确定 。

中 心 突出 部
吕 7 裂口 3
| ws V
基部 全
小 亚 基 (S) 大 亚 基 (IT) 70S 核糖 体

中 心
上 止 部 斑 < 突 出 部

图 8-1 核糖 体 的 三 维 结构 模型

无 论 原 核 生 物 还 是 真 核 生 物 ， 从 中 都 可 同时 分 离 出 三 种 类 型 核糖 体 : 核糖
体 、 核 糖 体 亚 基 和 多 核糖 体 ， 它 们 之 间 的 关系 见 图 8-2; 在 体内 蛋白 质 合成 正 是
通过 这 种 核糖 体循环 进行 的 。 在 细胞 中 ， 大 多 数 核糖 体 处 于 非 活性 的 稳定 状态 ，
单独 存在 ， 只 有 少数 与 mRNA 形成 多 核糖 体 。 在 多 核糖 体 中 ， 每 个 核糖 体 单独

多 核糖 体 mRNA

非 活性 核糖 体
图 8-2 ”核糖 体循环 图

. 245 .

” 国

合成 一 条 完整 的 多 肽 链 。mRNA 上 核糖 体 的 多 少 ， 视 mRNA 链 长 而 定 ， 一 般 每
隔 40 个 核 苷 酸 有 一 个 核糖 体 。 新 生 肽 链 释放 后 ， 核 糖 体 即 脱离 mRNA， 很 快 解
聚 成 核糖 体 亚 基 。 这 些 亚 基 有 两 个 去 向 ， 一 个 去 向 是 直接 参与 另 一 轮 蛋 白质 合
成 ; 另 一 个 去 向 是 两 个 亚 基 结合 成 较 稳 定 的 核糖 体 ， 稳 定 核糖 体 不 参加 蛋白 质 合
成 ， 只 有 在 解 聚 为 亚 基 后 才能 再 成 为 活性 核糖 体 亚 基 。

真 核 生物 核糖 体 ， 有 的 游离 于 细胞 质 中 ， 有 的 结合 于 内 质 网 上 。 游 离 态 与 结

合 态 的 比例 因 细胞 类 型 不 同 而 腊 。

2. ImRNA

mRNA 是 合成 蛋白 质 的 模板 ， 由 蛋白 质 基 因 转 录 、 加 工 而 得 到 。 成 熟 的 上

mRNA 中 ， 除 了 编码 区 还 有 非 编码 区 ， 非 编码 区 对 于 翻译 也 是 必要 的 。
3.tRNA

tRNA 是 蛋白 质 生 物 合成 中 的 运载 工具 ， 根 据 mRNA 序列 编码 的 需要 携带
相应 氨基 酸 进入 核糖 体 ; 合成 肽 链 后 , “ 空 的 ”tRNA 离开 核糖 体 。

关于 tRNA 的 生物 合成 、 结 构 及 功能 生物 化 学 中 已 详细 讨论 过 ， 这 里 着 重 介
绍 校正 tRNA 和 起 始 疏 NA。

(1) 校正 tRNA

我 们 在 无 义 突变 的 校正 一 节 已 经 介绍 了 校正 让 NA， 实 际 上 就 是 编码 tRNA

的 基因 的 另 一 种 突变 。 这 些 突变 使 转录 出 的 RNA 的 个 别 碱 基 发 生 改 变 ， 尤 其 是
反 密 码 子 环 上 一 个 碱 基 的 改变 ， 使 原来 与 某 一 氨基 酸 的 密码 子 对 应 的 反 密码 子 能

够 和 终止 密码 子 对 应 ; 因而 将 某 一 氨基 酸 插 到 该 密码 子 处 ， 使 肽 链 合成 得 以 延 时

伸 。

对 校正 tRNASS3 + 的 一 级 结构 研究 表明 ， 只 有 反 密 码 子 的 第 一 位 碱 基 由 G 变

为 C， 其 他 部 分 与 RNAsS- 完全 相同 。 这 个 碱 基 的 变化 完全 改变 了 tRNA 识别 密

码 子 的 能 力 。tRNASS- (其 反 密 码 子 GUA) 能 识别 酷 氨 酸 的 两 个 密码 子 UAC 和 四
UAU， 而 校正 TRNASS- (其 反 密 码 子 CUA) 就 只 能 识别 变异 产生 的 终止 密码 子 旱

LUACs 2
tRNASS+ 再 发 生 一 次 变异 ， 反 密码 子 以 外 的 一 个 碱 基 被 另 一 个 碱 基 所 取代 ，
产生 的 校正 tRNA 仍 可 以 识别 由 变异 产生 的 终止 密码 子 UAG， 但 携带 的 不 是 酷
氨 酸 而 是 谷 所 酰胺 了 。 这 种 校正 tRNAS2+ 已 发 现 有 五 种 ， 分 别 在 第 1、2、81、
82 位 变化 了 一 个 碱 基 。

在 校正 让 NA 中 ， 即 使 一 个 碱 基 的 变化 就 可 以 改变 疏 NA 识别 密码 子 的 能 力
或 者 接受 不 同 的 氨基 酸 。 研 究 这 类 校正 tRNA 的 结构 与 功能 的 关系 ， 对 于 探索 氢
酰 tRNA 合成 酶 的 专 一 性 问题 有 着 重要 的 意义 。

.246 .

(2) 起 始 tRNA
能 特异 识别 mRNA 上 起 始 密码 子 的 RNA 称 为 起 始 tRNA (initiator RNA)，

它 参 与 蛋 自 质 生物 合成 的 起 始 。 所 有 其 他 的 tRNA 在 蛋白 质 合 成 中 起 延伸 作用 ，
统称 为 延伸 让 NA。 已 知 起 始 密码 子 有 两 个 一 -AUG 与 GUG， 它 们 分 别 是 Met
和 Val 的 密码 子 。 核 酸 序列 分 析 结 果 指 出 ， 除 了 少数 生物 使 用 GUG 作为 起 始 密
码 子 外 ， 大 部 分 原核 生物 、 病 毒 及 差不多 全 部 真 核 生 物 都 使 用 AUG。 也 就 是 说
起 始 让 NA 都 携带 Met， 核 糖 体 上 合成 的 新 链 的 N 端 均 为 Met。 原 核 生 物 与 真 核
生物 又 有 所 不 同 ， 原 核 生物 合成 的 蛋白 质 前 体 中 N 端 Met 的 -氨基 被 甲 酰基 所
封闭 ， 得 到 甲 酰 甲 硫 氨 酸 (fMet)。 故 起 始 tRNA 是 一 种 特殊 功能 的 甲 硫 氢 酸
让 NA， 它 们 的 符号 见 表 8-6。

表 8-6 起 始 tRNA 及 其 符号

EEC

x tRNA 右上 角 的 Met 有 时 可 以 省 略 。 * * 符号 中 的 上 字母 可 以 省 略 。

真 核 蛋白 合成 起 始
原核 蛋白 合成 起 始
肽 链 内 部 的 Met 的 摊 入

“起 始 RNA

真 核 生 物 起 始 tRNA 与 tRNAMs 结构 上 的 明显 差异 在 于 AUCG 序列 代替 通
党 的 TYCG 序列 。 原 核 生 物 起 始 tRNA 必须 先 甲 酰 化 后 才能 行使 功能 。

(3) 氢 栈 tRNA 合成 酶

氨 酰 tRNA 合成 酶 即 氨 基 酸 -tRNA 连接 酶 ， 此 酶 催化 下 列 反应 ;

aa+ATIP+tRNA->~aa-tRENAT+ AMP+ ppi

它 使 氨基 酸 的 羧基 与 TRNA 上 3 端 CCA 中 腺 苷 的 2' 或 3 -OH 与 氨基 酸 的 羧基 形
成 酯 键 。 不 同 氨基 酸 和 tRNA 的 连接 位 置 不 同 ， 氨 基 酸 密码 子 第 二 个 字母 是
的 与 RNA 末端 2 -OH 相连 ， 中 间 字 母 是 C 的 氨基 酸 与 3 -OH 连接 ， 中 间 为 A
或 G 时 连接 规律 性 不 大 。

每 一 种 氨基 酸 至 少 有 一 种 氨 酰 tRNA 合成 酶 。 可 能 一 个 例外 是 在 枯草 杆菌 中
不 存在 Gln-tRNA 合成 酶 。Glu-tRNA 合成 酶 可 以 用 Glu 酰 化 NAGh 和 tRNAGh，
然后 通过 转 酰 氮 反 应 使 Glu-tRNAS 转 换 成 Gln-tRNASP。 一 种 氨基 酸 可 以 对 应 多
种 tRNA， 在 氨 酰 tRNA 合成 酶 催化 下 可 以 接受 同一 种 氨基 酸 的 不 同 tRNA 叫 同
工 受 体 tRNA (iso-acceptor tRNA)。

迄今 已 有 150 种 以 上 不 同 来 源 的 氨 酰 tRNA 合成 酶 被 分 离 纯 化 。 原 核 生 物 中
的 合成 酶 一 般 分 子 质量 迄 2.5 x 105Da。 而 真 核 生物 的 酶 常 以 复合 形式 存在 ， 分 子
质量 > 之 104Da。

4. 起 始 因子

起 始 因子 是 参与 蛋白 质 生 物 合成 起 始 的 可 溶性 蛋白 因子 。 蛋 和 白质 合成 的 起 始
要 生成 核糖 体 .mRNA' 起 始 了 RNA 三 元 复合 物 ， 也 叫 起 始 复合 物 。 复 合 物 必 须 在
起 始 因子 帮助 下 才能 形成 。 目 前 已 知 原核 生物 有 3 种 起 始 因 子 ， 而 真 核 生物 则 有
10 种 。 大 肠 杆 菌 起 始 因 子 的 不 同形 式 、 分 子 质量 及 所 起 作用 见 表 8-7。

表 8-7 ”大肠 杆 菌 的 起 始 因子

起 始 因子 不 同形 式 分 子 质量 (Da) 起 始 中 的 作用
IF-1 9500 无 专 一 功能 ， 增 加 IFE-2，IFE-3 活性
IF-2 IF-2a 95 000~-117 000 ”使 fMet-tRNAI{ 选择 性 与 30S 亚 基 结合 ， 需
IF-2b 82 000 一 85 000 GTP
IF-3 IF-3a 20 668 @@ 使 30S 与 mRNA 起 始 部 位 连接
IF-3B 19 997 @ 具 解 离 活性 ， 使 亚 基 保持 为 解 离 态

IF-1 为 一 小 的 碱 性 蛋白 ， 没 有 专 一 的 功能 ， 只 能 增加 其 他 两 个 起 始 因子 的
活性 。 有 的 原核 生物 并 没有 IF-1 起 始 因子 ， 看 来 蛋白 质 的 合成 起 始 可 以 只 在
IF-2 和 IF-3 参与 下 进行 。IF-2 有 两 种 形式 : IF-2a 和 IF-2b， 后 者 可 能 是 前 者 的
蛋白 酶 降解 产物 。-SH 为 IF-2 活性 所 必需 ，I-2 经 磷酸 化 后 活性 不 变 。IF-2 的
功能 是 通过 生成 IF-2.GTP.fMet-tRNAMs 三 元 复合 物 ， 使 起 始 tRNA 与 核糖 体
小 亚 基 结合 。IF-2 与 f{Met-tRNAME: 间 的 专 一 性 是 非常 严格 的 ， 用 于 延伸 的 氢 酰
tRNA 甚至 非 甲 基 化 的 Met-tRNAMes 均 不 能 与 下 -2 结合 或 结合 得 很 不 稳定 。 在 核
糖 体 存在 时 ，IF-2 具有 很 强 的 GTPase 活性 ， 在 肽 链 合成 起 始 时 催化 GTP 水 解 。

IF-3 是 个 双 功 能 蛋白 质 ， 它 至 少 有 两 种 分 子 形式 : IF-3ac 和 IF-38B8， 后 者 只
比 前 者 少 N 端 6 个 氨基 酸 残 基 。IF-3 除了 使 mRNA 与 核糖 体 小 亚 基 结 合 外 ， 还
具 解 离 因子 活性 。IF-3 与 30S 亚 基 结合 ， 位 于 核糖 体 表 面 与 核糖 体 蛋 白 S7、S12
和 16S rRNA 结合 。 可 能 是 由 于 IF-3 遮盖 了 小 亚 基 的 16S rRNA 的 部 分 序列 使 之 ，
不 能 与 大 亚 基 的 23S rRNA 互补 ， 故 大 小 亚 基 不 能 缔 合 。

真 核 生物 的 起 始 因子 对 于 生成 80S 核糖 体 .mRNA.Met-tRNA 三 元 起 始 复合
物 是 必要 的 。 真 核 生物 起 始 因子 (eIF) 确切 的 数目 仍 不 清楚 ， 它 们 是 核糖 体 或
mRNA 结合 蛋白 。 不 同 作者 发 表 不 同 来 源 eIF 的 名 称 和 符号 也 非常 混乱 ， 经 统
一 后 列 于 表 8-8。 4

eIF-2 是 真 核 生 物 中 最 重要 的 一 个 起 始 因子 ， 它 与 GTP 和 Met-tRNAIi 生成
三 元 复合 物 (elIF-2.GTP .Met-tRNAi)， 这 个 复合 物 比 大 肠 杆 菌 的 IF-2.GTP:
fMet-tRNAI 稳定 。eIF-2 由 三 个 亚 基 组 成 ， 其 中 a 亚 基 与 乌 苷 酸 结合 有 关 ，-B- 亚

.248 ，

表 8-8 真 核 生 物 mRNA 翻译 的 起 始 因子

起 始 因子 “分 子 质量 /Da 。 亚 基 (分 子 质量 )/Da 已 知 功能
eIF-1 15 000 稳定 40S.mRNA.Met-rRNAi 复合 物
122 000 wa(32 000)
elIF-2 B(35 000) 被 GTP 活化 , 使 MettRNAi 与 40S 亚 基 结合
7Y(55 000 )

生理 功能 不 详 , 天 然 mRNA 翻译 不 需要 , 用 于
AUG 指导 的 合成
由 9 一 10 种 亚 基 组 成 其 ”与 40S 核 糖 体 亚 基 结 合 , 也 与 mRNA 上 结合
eIF-3 700 000 ”中 至 少 7 种 的 分 子 质量 “起 始 因 子 eIF-4F 互相 作用 及 40S. MettRNAi-

eIF-2A 635 000

已 测 出 GTP 有 关

elIF-4A 50 000 辅助 mRNA 结合

elIF-4B 80 000 识别 mRNA, 有 ATPase 活性

elIF-4C 19 000 与 40S 结 合

eIF-4D 17 000 生理 功能 不 详 , 天 然 mRNA 翻译 不 需要

elIF-4E 240 000 帽子 结合 蛋白 , 与 eIF-4G 相互 作用
SF-5 150 000 释放 起 始 因 子 , 缔 合 核糖 体 亚 基
elIF-4 本 与 mRNA 结合

基 有 结合 Met-tRNAi 的 活性 ， 而 y 亚 基 功 能 不 详 。 已 分 离 出 w、B 两 个 亚 基 的
elIF-2， 推 测 Y 亚 基 不 是 必需 的 。eIF-2 的 B 亚 基 也 与 识别 mRNA 有 关 。

elIF-3 与 五 .coii 的 IF-3 类 似 ， 与 40S 亚 基 结 合 ， 并 通过 eIF-4G 的 介 导 使
40S 亚 基 与 mRNA 结合; 同时，eIF-3 的 作用 可 避免 60S 与 40S 核糖 体 亚 基 的 缔
谷 ， 因 而 能 逐步 生成 起 始 复合 物 。eIF-3 也 具有 稳定 40S.Met-tRNAi'GTP 的 功
能 。

参与 mRNA 与 40S 核糖 体 亚 基 结 合 的 因子 有 eIF-3、eIF-4A、eIF-4B 以 及
SF eIF-4C 等 5 个 因子 。eIF-4F 与 mRNA 结合 ， 它 含 eIF-4E 和 eIF-4G。eIF-
4G 是 一 种 十 分 重要 的 真 核 mRNA 起 始 因 子 ， 在 把 40S 亚 基 招集 到 mRNA 上 的
过 程 中 起 桥梁 作用 ; 它 的 C 端 与 eIF-3 互相 作用 ，N 端 与 mRNA 结合 蛋白 如
eIF-4E 作用 ， 还 可 能 与 polyA 结合 蛋白 互相 作用 ; 在 这 些 因子 的 共同 作用 下 ， 形
成 40S.mRNA.Met-tRNAi 复合 物 。eIF-4E 是 从 eIF-3 和 elIEF-4B 中 分 离 的 微量 成
分 ， 它 识别 mRNA 的 帽子 结构 ， 故 称 帽 子 结合 蛋白 。

eIF-5 的 功能 可 能 是 首先 与 40S 核糖 体 亚 基 上 eIF-3 和 eIF:2 的 释放 及 GTP
水 解 有 关 ， 然 后 缔 合 60S 亚 基 得 到 起 始 复合 物 80S,.mRNA.Met-tRNAi。

eIF-4D 只 用 于 人 工 信 使 的 翻译 ， 天 然 mRNA 的 翻译 是 不 需要 的 ， 其 生理 功
能 不 详 。

.249 ，

近年 来 在 真 核 生物 中 还 发 现 许多 与 起 始 反应 有 关 的 辅助 因子 (auxiliary fac
tor)。 这 些 因 子 大 多 数 与 eIF-2 有 关 ， 表 8-9 列 出 它们 的 性 质 与 已 知 功能 。Ce
eIF-2A、Co-eIF-2B 和 CoeIF-2C 与 eaIF-2.Met-tRNAi.GTP 三 元 复合 物 生成 的 调 ，
控 有 关 。eIF-2 激活 蛋白 (ESP) 稳定 eIF-2.GTP 二 元 复合 物 ， 加 入 Met-tRNAI
形成 三 元 复合 物 后 ，ESP 释放 出 来 。

表 8-9 与 蛋白 质 合 成 起 始 有 关 的 辅助 因子

辅助 因子 分 子 质量 /Da 已 知 功能
人 人 枫 作 稳定 三 元 复合 物 ， 增 加 MettIRNAi 与 40S 核糖 体 亚 基
的 结合 速率
Co sIF2B 了 让 STR 元 复合 移 的 生成
Co-eIF-2C 促进 三 元 复合 物 的 生成
eIF-2 激活 蛋白 增加 eIF-2 生成 三 元 复合 物 和 40S 起 始 复合 物 的 能 力
elIF-6 23 000 一 25 500 抗 60S 与 40S 核糖 体 亚 基 的 缔 合

S. 延伸 因子

延伸 因子 是 一 类 参与 蛋白 质 合 成 过 程 中 肽 链 延 伸 的 蛋白 因子 。 无 论 原 核 还 是
真 核 生物 ， 延 伸 因 子 都 可 分 为 两 类 : 一 类 是 帮助 氨 酰 tRNA (延伸 了 RNA) 进
核糖 体 与 mRNA 结合 ， 另 一 类 是 使 肽 基 tRNA 从 核糖 体 的 A 位 向 了 位 移动 。 痢
者 有 EF-T (包括 EF-Tu 和 EF-Ts， 细 菌 中 ) 和 EF-1 ( 真 核 生 物 ); 后 者 是 EEG
(细菌 ) 和 EF-2 ( 真 核 生 物 )。 表 8-10 列 出 蛋白 质 合成 中 的 延伸 因子 。

表 8-10 有 蛋白质 合成 的 延伸 因子

分 子 质 量 /Da
原核 生物
EF-Tu 42 000 3
EF-TSs 31 000 1 一 2
EF-G 84 000 4 一 6
真 核 生物 人 ( 免 网 织 红 细胞 )
EF-1 47 000 一 60 000 3 一 4〈 猪 肝 )
EF-1 (〈 单 体形 式 ) 18 ( 免 网 织 红 细胞 ) |
EF-18 (聚集 形式 ) 民 ( 猪 肝 ) 县
FEE7 70 000 一 95 000 22 ( 鼠 肝 )

在 原核 生物 中 ，EF-Tu 的 功能 是 依据 mRNA 上 的 密码 子 携带 aa-tRNA 进 关
50”

丽 位 。EF-Tu 在 GTP 存在 下 与 aa-tRNA 形成 稳定 的 三 元 复合 物 : EF-Tu' GTP.
aa-RNA。EF-Tu 具 高 度 专 一 性 ， 它 能 识别 和 结合 除了 fMet-tRNA 汪 : 外 的 所 有
于 - 永 NA。 这样 就 保证 起 始 了 NA 携带 的 fMet 不 能 进入 肽 链 内 部 ， 因 为 无 论 甲 酰
或 非 甲 酰 的 起 始 tRNA 都 不 能 与 EF-Tu 和 GTP 生成 复合 物 。GTP 水 解 后 ，EF-
Ti GDP 从 核糖 体 释放 出 来 。EF-Tu 是 一 个 热 不 稳定 的 蛋白 因子 。EF-Ts 则 是 热
稳定 的 ， 它 不 直接 与 核糖 体 发 生 关 系 ， 其 功能 是 使 EF-Tu.GDP 再 生 为 EF-Tu，
GTP， 然 后 再 参与 肽 链 延 伸 :

EF-TIu.GDP EF-Ts ERE=TW" ArTE

GDP EF-Tu.EF-Ts GTP

在 蛋白 质 合 成 的 延伸 机 制 中 有 一 个 移 位 过 程 ， 即 肽 基 tRNA 从 A 位 移 至 P
位 ， 核 糖 体 与 mRNA 相对 移动 3 个 核 苷 酸 (1 个 密码 子 ) 距离 ， 这 个 复杂 过 程
需要 FEF-G 和 GTP。 在 核糖 体 存 在 下 ，EF-G 使 GTP 水 解 ， 故 EF-G 是 依赖 于 核
糖 体 的 GTPase。

真 核 生 物 的 延伸 因子 是 EF-1， 与 原核 生物 的 EF-Tu 类似。EF-1 可 以 是 单 体
形式 〈EF-1li )， 也 可 以 是 各 种 聚集 态 (EF-1a); EF-1a 是 EF-1 通过 其 他 多 肽 、
,胆固醇 酯 聚合 起 来 的 。EF-1H 类 似 于 原核 生物 的 EF-Ts， 局 动 EF-1 循环 。

EF-2 类 似 于 原核 生物 的 EF-G， 为 肽 基 tRNA 从 A 位 移 位 所 必需 。EF-2 也
具有 依赖 于 核糖 体 的 GTPase 活性 ，GTP 水 解 后 ，EF-2 从 核糖 体 释 放出 来 。

6. 释放 因子 (终止 因子 )

原核 生物 中 发 现 有 三 种 释放 因子 (release factor) RF-1、RF-2 和 RF-3，
哺乳 动物 只 有 一 种 释放 因子 RF。 释 放 因 子 的 作用 是 终止 肽 链 合 成 并 使 肽 链 释 放
出 核糖 体 。 它 们 的 性 质 见 表 8-11。

表 8-11 蛋白 质 合成 中 的 释放 因子

释放 因子 分 子 质量 /Da 识别 密码 子
原核 生物
RF-1 44 000 UAA，UAG
RF-2 47 000 UAA，UGA
REF-3 本 身 无 识别 密码 子 性 质
真 核 生物

REF 150 000 一 250 000 (2 个 相同 亚 基 ) UAA，UAG，UGA

ca

RF-1 和 REF-2 各 识别 2 个 密码 子 〈 如 表 8-11 所 示 )， 其 中 UAA 相同 ; 而
REF-3 本 身 不 识别 密码 子 ， 但 可 增加 REF-1 和 RF-2 活性 。 释 放 因 子 与 核糖 体 和 终
止 密码 子 能 生成 三 元 复合 物 。 释 放 因子 行使 功能 时 可 能 需要 GTP，GTP 水 解 后
使 该 因子 从 核糖 体 释放 。 二

对 真 核 生 物 释放 因子 研究 较 少 ， 已 知 许多 性 质 与 原核 相似 ， 但 唯一 的 一 种 释
放 因子 能 识别 所 有 3 种 终止 密码 子 。

二 、 香 白质 生物 合成 的 机 制

蛋白 质 生 物 合 成 可 以 分 为 三 个 步 又: @ 起 始 。 核 糖 体 亚 基 和 起 始 tRNA 在 起
始 因子 及 其 他 因子 参与 下 结合 在 mRNA 编码 区 $ 端 ， 保 证 起 始 tRNA 识别 起 始
密码 子 。 结 果 生 成 起 始 复合 物 : 核糖 体 .mRNA:. 起 始 了 NA。@ 延 伸 。 核 糖 体 与
mRNA 相对 移动 ， 在 延伸 因子 参与 下 由 RNA 携带 氨基 酸 (通过 aa-tRNA) 进入
核糖 体 ， 合 成 由 mRNA 序列 编码 的 多 肽 链 。 所 以 延伸 是 一 个 循环 过 程 〈 见 图
8-3).@ 终 止 。 延 伸 至 mRNA 上 出 现 终止 密码 子 ， 释 放 因 子 进入 核糖 体 ， 使 新 生
肽 链 及 核糖 体 从 mRNA 上 释放 出 来 。

细胞 质

ImRNA 移动 方向 时

着
tRNA 一 一 aa-tRNA 《 一 -一 -一 一 一
核糖 体 移动 方向

图 8-3 转录、 加 工 与 翻译 的 关系

1. 蛋白 质 合成 的 起 始

无 论 原核 生物 还 是 真 核 生 物 蛋白 质 合成 的 起 始 都 需要 生成 起 始 复合 物 ， 核 糖 国
体 .mRNA: 起 始 tRNA。 两 者 的 区 别 在 于 核糖 体 及 其 亚 基 的 大 小 、 起 始 RNA、 旺
参与 反应 的 起 始 因子 和 生成 起 始 复合 物 的 顺序 不 同 ， 见 表 8-12。

”名 人

表 8-12 ”原核 和 真 核 生 物 蛋白 质 合成 起 始 的 区 别

内 容 原核 生物 真 核 生 物
完整 70S 80S
核糖 体 亚 基 50S，30S 60S，40S
起 始 了 RNA fMettRNAKME MettRNAME
起 始 因子 3 种 至 少 7 种
1.30S mRNA 1.40S Met -tRNAME
起 始 复合 物 生 成 顺序 2.30S mRNA.fMet -tRNA 2.40S mRNA.MeLtRNAMe
3.70S mRNA.fMet -tRNANMe 3.80S mRNA.MettRNAMe

30S+ 30S+ mRNA+{fMettRNA

IF-1、IF-2、IF-3
1 [70S.mRNA'.fMet-tRNA] +GDP+Pi

苹 _ 定 浓度 Mez+ 的 生理 条 件 下 ， 核 糖 休 亚 基 很 易 聚 合 ， 所 以 首先 70S 核糖 体 必
撕 在 IF-1 和 IF-3 作用 下 解 离 。

3
70S= 50S+30S +30S.IF-3

性 然后 再 形成 30S.IF-1、2、3 复合 物 。 这 3 个 因子 有 结合 的 协同 作用 ， 并 且
都 结合 在 靠近 16S rRNA 的 3“ 端 序列 ， 位 于 核糖 体 的 界面 ， 从 而 妨碍 了 50S 亚 基
的 结合 ， 形 成 30S (小 亚 基 ) 起 始 复合 物 : 30S. IF-1、30S' IF-2、30S. IF-3 +
ERNA+{fMettRNAI+ GTP-> [30S.IF-1、2.mRNA.fMettRNANGTP] + IF-3。
茧 价 交 联 实验 表明 ， 当 形成 30S 复合 物 时 ，S7、S1、S1L1、S12、S18 和 S21 等 蛋
自 质 与 核糖 体 识 别 mRNA 起 始 位 点 有 关 。70S 起 始 复合 物 〈 简 称 起 始 复合 物 )
的 生成 和 IF-2 的 再 循环 通过 以 下 步 又 进行 。50S 亚 基 的 加 入 伴随 着 GTP 被 IF-2
(依赖 于 核糖 体 的 GTPase) 水 解 ， 然 后 IF-2 (和 IF-1) 及 GDP、Pi 从 核糖 体 释
放出 来 。

真 核 生 物 蛋白 质 合成 的 起 始 机 制 近 年 来 也 取得 不 少 进展 。 真 核 生 物 起 始 的 总
过 程 见 图 8-4。

1) 生成 40S Met-tRNA; .GTP 复合 物 。 真 核 生物 首 先生 成 小 亚 基 .起 始
慌 NA， 然 后 再 加 入 mRNA， 即 40S 亚 基 与 Met-tRNA; 结合 在 mRNA 进入 之 前 ，
这 与 原核 生物 有 区 别 。Met-tRNA; 与 40S 结合 是 在 eIF-2 和 GTP 存在 下 进行 的 ，
eIF-2 与 Met-tRNA; 等 量 存在 于 40S 亚 基 中 。 实 验 表明 ， 在 MettRNA; 进入 亚 基
之 前 ，eIF-3 已 存在 于 亚 基 中 。

2) 40S Met-tRNAi"GPT 与 mRNA 结合 。 这 是 一 个 复杂 的 过 程 ， 至 少 与 3 个
起 始 因子 一 一 eIF-3、4A、4B 有 关 ， 可 能 还 与 eaIF-1、4 和 及 4E、4G 等 起 始 因子
FE，

Met-tRNA 80S

elF-2
GTP elIF-3
[MettRNA .elIF-2 .GTP] 40S .elIF-3+

[40S. Met-tRNA' elIF-2、3 .GTP]
ES NSS 人 A、 4B、4C |
ee
ADP+Pi
ImRNA

[40S.mRNA .Met-tRNA . GTP .elIF-2、3]
(40S 起 始 复合 物 )

GDP+Pi
eIF-2、3

[80S .mRNA . Met-tRNA]
(80S 起 始 复合 物 )

eIF-3

图 8-4 真 核 生 物 蛋 白质 合成 的 起 始 过 程

有 关 。 在 mRNA 与 40S 亚 基 结合 时 ，mRNA 分 子 本 身 的 结构 特征 起 着 重要 作用 几

但 在 真 核 生 物 中 ， 没 有 发 现 像 原核 生物 中 16S rRNA3 ` 端 与 mRNA5 ' 端 非 编码 区

形成 多 个 碱 基 配 对 的 情况 。 由 于 帽子 类 似 物 (m'"GMP) 能 在 体外 抑制 带 帆
mRNA 的 翻译 ， 故 真 核 mRNA 的 帽子 结构 在 形成 起 始 复合 物 中 可 能 起 促进 作用 。

3) 60S 亚 基 加 入 到 40S mRNA.MettRNAI; 复合 物 中 。 这 个 过 程 包括 elIF-2，
eIF-3 的 作用 和 GTP 的 水 解 ， 同 时 需要 eIF-5 参与 60S 亚 基 的 结合 。

2. 肽 链 的 延伸

肽 链 延 伸 过 程 由 多 个 循环 组 成 ， 每 个 循环 包括 : 四 氨 酰 tRNA (aa-tRNA)
与 核糖 体 结合 ; 思 肽 键 形成 ; 图 移 位 。 肽 链 延 伸 始 于 上 述 起 始 复合 物 的 生成 ， 除
某 些 细节 外 ， 原 核 生 物 和 真 核 生物 的 延伸 过 程 大 致 相同 。

一 一 一 一 一 一

1) aa-tRNA 与 核糖 体 结合 : 在 氨 酰 tRNA 合成 酶 催化 下 ， 氢 基 酸 被 专 一 的 |

tRNA 所 携带 ， 生 成 aatRNA; 然后 在 EF-Tu 和 GTP 作用 下 强烈 促进 aa-tRNR
与 核糖 体 结合 。 实 验 已 证 明 ，aa-tRNA 与 核糖 体 的 结合 部 位 有 3 个 ，A 位、P 位
及 民 位 aa-tRNA 首先 结合 于 民 位 ， 然 后 经 翻转 至 A 位 ， 见 图 8-5$。

25

有

2) 肽 键 形成 : aa-tRNA 结合 于 核 小 大生
糖 体 A 位 后 ， 在 肽 基 转 移 酶 催化 下 ，
将 P 位 tRNA 上 的 肽 基 通过 其 羧基 与 A
位 tRNA 上 氮 基 酸 的 -氨基 连 接 ， 形 成
肽 键 。 真 核 生 物 中 肽 链 形成 与 原核 生
物 原则 上 相同 ， 只 是 两 类 生物 的 肽 基
转移 酶 的 活性 中 心 可 能 存在 结构 差异 。

3) 移 位 :; 肽 键 形成 后 ， 核 糖 体 处
在 前 移 位 状态 (pretranslocation state ) ;
这 时 占领 P 部 位 的 是 去 酰 化 tRNA，A
位 为 肽 基 耻 NA， 然 后 进行 移 位 。 移 位 9
包括 3 个 相关 步骤 : 核糖 体 与 mRNA 部 位 二 _R A 和 P 位
相对 移动 一 个 密码 子 的 距离 ; 肽 基
让 NA 从 A 位 移 至 P 位 ; 去 酰 化 tRNA 离开 了 位。 移 位 由 EF-G (原核 生物 ) 或
EF-2 ( 真 核 生 物 ) 催化 ， 随 后 GTP 水 解 ， 导 致 EF-G 或 EF-2 释放 。

原核 生物 的 肽 链 延 伸 循环 见 图 8-6。 每 次 循环 共 需 3 个 延伸 因子 (EF-Tu、
时 、G) 和 2 分子 GTP， 在 mRNA 密码 子 指导 下 ， 肽 链 延 伸 一 个 氨基 酸 残 基 。

aa-tRNA . EF-Tu . GTP

本 什 艺

(iD 区 Sr
EF-Tu GDP

图 8-6 肽 链 延 伸 循 环
3. 肽 链 的 终止

当 mRNA 分 子 上 终止 密码 子 出 现在 核糖 体 的 A 位 时 ， 在 一 般 情 况 下 由 于 没

有 任何 氨 酰 tRNA 可 以 与 终止 密码 子 结合 ， 不 能 把 这 些 密码 子 翻译 成 氨基 酸 。 攻
放 因子 〈 终 止 因 子 ) 在 GTP 存在 下 却 能 识别 终止 密码 子 ; RF 与 A 位 结合 后

活化 肽 基 转 移 酶 ， 把 P 位 上 的 肽 基 转 移 至 水 分 子 ， 即 水 解 P 位 上 tRNA 与 肽 链 之

间 的 键 ; 然后 新 生 肽 链 与 最 后 一 个 去 酰 化 tRNA 离开 核糖 体 。RF 具有 依赖 核糖
57 人 527 。

体 的 .GTPase 活性 ， 催 化 GTP 水 解 使 RF 与 核糖 体 解 离 。 之 后 “ 空 的 ”核糖 体 进
入 核糖 体循环 ， 图 8-7 是 肽 链 终止 过 程 示意 图 。

这 > 这 0 全
= 村

图 8-7， 肽 链 合成 终止 过 程

由 mRNA 翻译 出 来 的 多 肽 链 是 没有 功能 的 ， 这 叫 新 生 蛋 白质 或 蛋白 质 前 体 ;
需要 经 过 加 工 改造 才能 成 为 有 功能 的 蛋白 质 。

全。

第 九 量 ”原核 基因 表达 调 欣

为 什么 基因 功能 要 调控 ? 我 们 知道 一 个 大 肠 杆菌 基因 组 大 约 有 3 x 10“bp， 假
如 平均 一 个 基因 为 1000bp，330 个 氨基 酸 为 一 个 蛋白 质 ， 这 样 算 起 来 ， 一 个
忆 .coi 就 有 3000 个 基因 ， 一 个 下 .coi 细胞 总 共 含 有 10" 个 蛋白 质 分 子 ， 如 果 每
处 基因 都 等 同 翻译 的 话 ， 那 么 每 个 基因 翻译 的 蛋白 质 分 子 应 有 10"/3000<*3000
外， 但 是 对 下 .coi 各 种 蛋白 质 的 相对 细胞 含量 的 详细 分 析 表 明 ， 细 胞 中 有 些 蛋
自 质 少 至 10 个 分 子 ， 而 另 一 些 蛋白 质 却 多 达 500 000 个 分 子 ， 相 差 几乎 是 5 万
人 税 。 这 样 的 差距 是 如 何 产生 的 呢 ? 这 只 能 认为 是 有 的 基因 不 停 地 “工作 ”， 而 有
些 基因 则 缓慢 地 “工作 ”。 的 确 ， 要 使 细胞 的 酶 体系 既 协 调 又 经 济 地 发 挥 作 用 ，
每 个 基因 产物 的 量 最 适宜 ， 既 不 过 多 ， 也 不 过 少 ， 那 么 基因 表达 的 调控 就 是 必需
的 。

细菌 中 所 利用 的 大 多 数 基本 调控 机 制 遵守 下 列 规则 : 一 个 体系 在 需要 时 被 打
开 ， 不 需要 时 被 关闭 。

这 种 “ 开 ”-“ 关 ”(on- off) 活性 是 通过 调节 转录 来 建立 的 ， 也 就 是 mRNA
的 合成 是 可 以 被 调节 的 。 实 际 上 ， 当 说 一 个 系统 处 于 “off” 状 态 时 ， 也 有 基础
水 平 的 基因 表达 ， 常 常 是 每 世代 每 个 细胞 只 合成 1 一 2 个 mRNA 分 子 ， 因 而 合成
少量 蛋白 质 分 子 ， 但 为 了 方便 ， 我 们 常常 使 用 “off” 这 一 术语 ， 但 必须 明白 所
谓 “ 关 ”实际 的 意思 是 很 低 (very low)。

细菌 的 某 一 代谢 途径 中 ， 几 个 酶 按 顺序 起 作用 ， 在 这 种 情况 下 ， 往 往 是 这 一
系列 的 酶 要 么 都 产生 ， 要 么 都 不 产生 ， 这 种 现象 叫 协同 调节 。 实 际 上 这 是 由 于 编
码 上 述 所 有 基因 产物 的 多 顺 反 子 mRNA 的 合成 被 调节 的 结果 。

酶 活性 通过 生物 合成 途径 中 的 产物 或 中 间 产 物 的 浓度 来 共同 调节 ， 这 个 调节
模式 叫 反馈 抑制 或 终 产 物 抑制 。 小 的 效应 物 分 子 也 反复 地 用 于 激活 或 抑制 一 个 特
定 的 酶 的 活性 。

第 一 他 ”乳糖 代谢 系统 和 操纵 子 模型

在 乳糖 的 分 解 代谢 系 统 中 ， 代 谢 调节 研究 得 最 早 最 详细 。F.，Jacob 和 丁
Monod 用 遗传 分 析 的 方法 建立 了 乳糖 操纵 子 的 负 调 控 模 型 。 这 里 主要 介绍 这 一
模型 建立 的 研究 过 程 及 其 实验 依据 。

大 肠 杆菌 的 乳糖 转录 子 (lac scription)， 一 般 也 称 为 乳糖 操纵 子 〈lac operon)
包括 三 个 结构 基因 : Z、Y、A。

*387 、

二
<
>

转录 方向

转录 时 ，RNA 聚合 酶 首先 与 启动 区 (promoter) PP 区 结合 ， 通 过 操纵 区
(operator) O 区 向 前 转录 。 转 录 从 O 区 的 中 间 开 始 加 QZ->Y->A 方向 进行 ， 每
次 转录 出 来 的 一 条 mRNA 上 都 有 这 三 个 基因 的 信息 。 转 录 的 调控 是 在 启动 区
( 卫 区 ) 和 操纵 区 〈(O 区 ) 进行 的 。

三 个 结构 基因 各 决定 一 种 酶 ;: 2 决定 8 半 乳 糖苷 酶 ; 并 决定 8- 半 乳糖 苷 透
性 酶 ;4A 决定 8- 半 乳糖 昔 转 乙酰 酶 。

有 半 乳 糖苷 酶 是 一 种 B- 半 乳糖 苷 键 的 专 一 性 酶 ， 除 能 将 乳糖 水 解 成 葡萄 糖 和
半 乳 糖 外 ， 还 能 水 解 其 他 B- 半 乳糖 苷 〈 如 葵 基 半 乳 糖苷 )。8B- 半 乳糖 苷 透 性 酶 的
作用 是 使 外 界 的 B 半 乳糖 苷 〈 如 乳糖 ) 能 透 过 大 肠 杆菌 细胞 壁 和 原生 质 膜 进入 细
胞 内 。 所 以 大 肠 杆菌 如 果 以 乳糖 为 碳 源 和 能 源 的 话 ， 以 上 两 种 酶 是 必需 的 。B 半
乳糖 苷 转 乙 酰 酶 的 作用 是 把 乙酰 辅酶 A 上 的 乙酰 基 转 到 B 半 乳糖 苷 上 ， 形 成 Z
酰 半 乳 糖 。 它 在 乳糖 的 利用 中 并 非 必 需 。

一 、 酶 的 诱导

在 19 世纪 末 ，20 世纪 初 ， 科 学 家 们 已 经 知道 微生物 的 酶 的 性 质 取决 于 微 生
物 所 生长 的 培养 基 ， 因 此 微生物 能 够 被 “训练 ”适应 于 各 种 不 同 的 环境 。

1900 年 ，F，Dienert 发 现 ， 将 酵母 放 入 以 乳糖 或 半 乳 糖 为 唯一 碳 源 的 培养
基 时 ， 酵 母 就 能 产生 乳糖 和 半 乳 糖 代谢 所 必需 的 酶 ， 而 再 把 这 些 酵母 转 到 以 葡萄
糖 为 唯一 碳 源 的 培养 基 时 ， 这 些 酶 就 消失 了 ， 因 为 在 以 葡萄 糖 为 唯一 碳 源 的 培养
基 中 这 些 酶 对 酵母 菌 的 生长 是 不 需要 的 了 。 在 20 世纪 30 年 代 ， 百 ，Karstrom 研
究 了 细菌 中 碳水 化 合 物 代谢 过 程 中 几 种 酶 的 形成 ， 并 把 它们 分 成 两 大 类 : 一 类 是
适应 酶 (adaptive enzyme)， 这 种 酶 只 在 培养 基 中 存在 它们 的 底 物 时 才能 形成 ，
另 一 类 酶 是 组 成 酶 (constitutive enzyme)， 无 论 培 养 基 中 是 否 有 它们 的 底 物 ， 这
种 酶 都 能 形成 。 适 应 现象 是 生物 进化 中 所 获得 的 ， 实 际 上 ， 这 是 一 种 节约 。

忆 .colii 的 B 半 乳糖 苷 酶 是 一 种 适应 酶 。 这 种 酶 催化 它 的 天 然 底 物 乳糖 以 及
其 他 B 半 乳糖 苷 化 合 物 的 水 解 。 当 下 .co 以 乳糖 为 唯一 碳 源 时 ， 这 种 酶 就 产
生 ， 而 当 培 养 基 中 不 存在 乳糖 时 ， 这 种 酶 就 消失 。

后 来 发 现 有 些 物质 虽 不 是 酶 的 底 物 ， 但 可 高 效 地 诱导 酶 的 产生 ， 有 些 B 半 乳
糖苷 是 酶 的 底 物 但 不 是 诱导 物 ， 不 诱导 酶 的 产生 。 所 以 后 来 把 适应 酶 改 为 诱导
酶 ， 并 把 其 存在 而 能 引起 细胞 产生 一 种 酶 的 这 些 化 合 物 定 名 为 诱导 物 。

1946 年 ，Jacques Monod 开始 了 关于 刁 .coli B- 半 乳糖 苷 酶 的 适应 形成 的 研

所 区 区

究 ，15 年 后 ， 这 个 研究 解决 了 细菌 基因 功能 的 调控 问题 。 在 这 个 研究 的 第 一 阶
段 ，Monod 和 他 的 同事 们 就 将 他 们 的 工作 集中 到 问题 的 焦点 ， 并 确定 了 酶 适应
过 程 的 真正 本 质 。1953 年 在 他 们 发 表 的 论文 中 ， 将 适应 酶 改 为 诱导 酶 。

在 对 五 .co 形成 B 半 乳糖 苷 酶 的 诱导 物 的 性 质 的 研究 中 发 现 ， 普 通 的 及 半
乳糖 苷 的 不 可 代谢 的 含 硫 类 似 物 ， 如 甲 基 硫 代 半 乳糖 苷 〈Thiomethyl galactoside，
TMG) 和 异 丙 基 硫 代 半 乳 糖苷 (isopropythiogalactoside) 是 高 效 的 诱导 物 。

图 9-1 是 王 .cooi 及 半 乳 糖苷 酶 的 两 个 不 可 代谢 的 即 不 消耗 的 诱导 物 异 丙 硫 基
半 乳 糖 背 〈IPTG)， 以 及 酶 分 析 中 所 用 的 产 颜色 的 酶 底 物 O- 硝 基 葵 半 乳 糖苷
(ONPG) 的 结构 。

这 种 高 效 诱导 物 可 以 用 来 研究 在 不 以 乳糖 为 碳 源 和 能 源 的 培养 基 中 ， 在 不 消
耗 诱导 物 的 情况 下 的 诱导 过 程 的 真正 动力 学 。 在 这 种 情况 下 细菌 的 生长 速度 与 B
半 乳 糖苷 酶 的 浓度 无 关 ， 并 且 诱 导 物 的 浓度 保持 不 变 。 通 过 这 个 研究 发 现 ， 在 回
生长 培养 基 中 加 入 饱和 量 的 诱导 物 后 的 几 分 钟 内 ， 在 不 消耗 诱导 物 的 情况 下 ， 细
胞 按 一 个 恒定 的 最 大 速度 已 合成 g 半 乳糖 苷 酶 。 从 培养 基 中 把 诱导 物 一 除去 ， 忆
立即 就 下 降 到 最 大 诱导 物 浓度 存在 时 所 达到 的 速度 的 千 分 之 一 以 下 。 因 此 显然 在
细菌 生长 期 间 ， 这 种 新 合成 的 原生 质 中 有 恒定 的 一 部 分 已 是 B 半 乳糖 苷 酶 蛋白
质 ,该 也 值 取决 于 生长 培养 基 中 的 诱导 物 浓 度 (图 9-2): 正如 图 9-2 所 示 ， 在
诱导 物 浓度 最 大 时 ，P 值 是 0.066， 这 就 是 说 ， 被 最 大 限度 诱导 的 细胞 里 ， 所 制
造 的 全 部 和 蛋白质 中 有 6.6% 是 B- 半 乳糖 苷 酶 。

CHOH 一 CH 十 汪
HO O 人 全
OH mn (PTG)
CHOH
HO O
OH (ONPG)
0 20 40 60 80

@
世
@
. 撕

半 乳 糖苷 酶 蛋白 质 /hg

OH 细菌 蛋白 质 hg
9-1 及 半 乳糖 苷 酶 的 高 效 诱导 物 9-2 ”在 不 消耗 的 情况 下 ， 下 .coli 的
B 半 乳糖 苷 酶 的 诱导 动力 学

为 了 证 明 诱导 物 的 作用 是 诱导 新 合成 酶 而 不 是 将 已 存在 于 细胞 中 的 酶 前 体 物
转化 成 有 活性 的 酶 ， 设 计 了 同位 素 示 踪 实验 。 把 下 .coii 细胞 放 在 加 有 放射 性 5S
但 没有 任何 半 乳 糖 音 诱导 物 的 培养 基 中 繁殖 几 代 ， 然 后 再 将 这 些 带 有 放射 活性 的
细菌 转移 到 不 含 ”S 的 无 放射 性 的 培养 基 中 ， 随 着 培养 基 中 诱导 物 的 加 入 ，B 半

3

列

乳糖 苷 酶 便 开 始 合成 。 分 离 纯化 B- 半 乳糖 背 酶 ， 发 现 这 种 酶 无 5S 标记 。 说 明 酶
的 合成 不 是 由 前 体 转 化 而 来 ， 而 是 加 入 诱导 物 后 新 合成 的 。

二 、 结 构 基 因 和 调节 基因 的 突变

Monod 在 下 .coi 中 开始 关于 乳糖 发 酵 作 用 的 生理 学 研究 后 不 灵 ;
本 .Lederberg 便 开 始 探讨 它 的 遗传 基础 。1948 年 Lederberg 分 离 了 一 系列 下 .coi
的 乳糖 发 酵 负 (ec) 突变 型 ， 这 些 突变 型 不 能 发 酵 乳 糖 。 对 这 些 突变 型 进一步
研究 证 明 ， 其 中 一 些 突变 型 的 rac -特征 是 由 于 不 能 产生 B 半 乳糖 苷 酶 。 在 连续
的 几 年 内 ， 越 来 越 多 的 /ac -突变 型 分 离 出 来 了 ， 了 解 了 它们 的 特性 ， 并 且 ， 通
过 细菌 结合 转移 和 转 导 实验 将 它们 的 突变 位 点 定位 在 细菌 遗传 图 上 。 其 中 一 些
lac 突变 型 的 生理 基础 显得 很 复杂 ， 而 另 一 些 则 比较 简单 。 最 简单 的 两 种 类 型 ，
一 种 是 rec Z YA 是 和 B 半 乳糖 苷 酶 基因 突变 ; 另 一 种 是 /ac Z”Y- A” 是 透 性
酶 基因 突变 (ac Z+ Y- 突变 型 称 为 隐秘 突变 型 ， 因 为 它 的 水 解 乳 糖 的 能 力 在 完
整 细胞 内 不 显示 出 来 ， 只 有 在 细胞 提取 物 中 才 表 现 出 来 )。 鉴 定 出 所 有 这 些 突变
后 ， 通 过 研究 证 明 这 三 个 基因 在 染色 体 上 是 连锁 的 ， 见 图 9-3。

1ac 已
和 有

9-3 下 .co 中 乳 糖 发 酵 基 因 的 次 序

在 Lederberg 的 突变 型 中 还 有 另 一 类 突变 型 ， 其 半 乳 糖苷 酶 的 形成 不 依赖 于
诱导 物 的 存在 ， 这 种 组 成 型 突变 体 在 没有 乳糖 或 别 的 半 乳 糖苷 存在 时 也 能 合成 尼
半 乳 糖苷 酶 。 但 野生 型 则 必须 在 存在 诱导 物 时 才能 合成 这 种 酶 。 组 成 型 突变 分 两
大 类 ; 一 类 为 I 型 组 成 型 突变 ， 另 一 类 为 O 型 组 成 型 突变 。 为 了 和 野生 型 相 区
别 ， 两 类 突变 型 分 别 以 下 列 符号 标记 ;

[型 ， 野 生 型 为 T+ ， 突 变型 为 开

O 型 : 野生 型 为 O7， 突变 型 为 O*。 |

这 样 的 突变 可 以 说 是 多 效 性 的 突变 ， 玉 一 二 或 0 一 0 后 ， 后 边 的 ZYA 结
构 基 因 均 表现 为 组 成 型 。T 基因 叫 调节 基因 (regulatory gene)。

三 、 调 节 基 因

在 没有 任何 外 源 诱 导 物 时 ，lac 三 组 成 型 突变 型 是 如 何 合成 它们 的 zac 基因
的 酶 呢 ? 一 种 最 方便 的 解释 是 从 ac 三 到 ac 三 的 突变 导致 了 一 种 内 源 诱导 物 的
形成 ， 因 而 这 种 内 源 诱 导 物 使 细胞 能 在 没有 外 加 半 乳 糖苷 时 合成 它们 的 酶 。 但 事

“2200 ，

实 上 ， 这 种 内 源 诱导 物 是 不 存在 的 ， 因 为 在 组 成 型 突变 中 从 来 就 没有 找到 过 这 样
的 内 源 诱导 物 。 这 样 看 来 ， 研 究 三 的 作用 就 十 分 重要 了 ， 如 何 证 明 工 基因 的 调
节 作 用 呢 ? 我 们 可 以 设法 组 成 一 个 部 分 二 倍 体 细胞 ， 考 查 T+ 、 三 -的 行为 ， 就 可
以 知道 调节 基因 在 细胞 中 的 作用 。

20 世纪 50 年 代 后 期 ，Wollman、Ja-
66ob 和 Hayes 的 工作 ， 已 揭示 了 在 细菌 结
合 过 程 中 ， 一 个 雄 的 Hfr 供 体 细菌 的 DNA
转 入 雌性 的 受 体 细 菌 (F- ) 后 ， 可 形成
暂时 的 部 分 合子 ,根据 这 个 道理 ，
A.B.Pardee，Jacob 和 Monod 设计 了 一 个
实验 ， 来 探讨 工 基 因 在 细胞 中 的 作用 。 他
们 将 Hfr lac I+ Z+ strT63 作 供 体 菌 ，
FlacI Z strT6" 作 受 体 菌 ， 分 别 在 无 任
何 诱导 物 的 培养 基 上 培养 后 ， 再 混合 在 一 图 94 由 uac 六 2Z+So，TsmHF 供 体
起 做 杂交 实验 ， 图 9-4 是 实验 结果 。 玉 .coi 与 racT- QZ，srr，Tszr， 开 - 受 体

由 实验 结果 可 以 看 出 ， 当 供 体 的 ec 结合 转移 后 B 半 乳糖 苷 酶 合成 情况
厂 2Z 基因 进入 受 体 之 前 ， 由 于 供 体 没 有
接触 诱导 物 ， 受 体 是 /ac Z- ， 所 以 二 者 都 不 合成 有 8- 半 乳糖 苷 酶 ， 结 合 进行 1h 后
加 入 T6、str 杀 死 供 体 菌 ， 从 1h 到 2h 之 间 ， 有 B- 半 乳糖 苷 酶 活性 逐渐 上 升 ， 但 2h
后 ， 不 加 诱导 物 则 酶 的 合成 就 停止 ， 在 这 个 实验 的 对 照 组 ， 结 合 2h 加 入 诱导 物 ，
则 酶 的 合成 继续 进行 。 对 照 结 果 说 明 ， 部 分 合子 在 主要 实验 组 中 最 后 停止 合成 酶
不 是 因为 它 没有 合成 酶 的 能 力 ， 而 是 成 了 诱导 型 了 。

为 什么 结合 进行 到 1h 时 ，/uc 的 酶 组 成 型 合成 ， 而 到 2h 时 却 又 诱导 型 合成
呢 ? 可 以 认为 结合 需要 1h，zac T” 2Z+ 才 转移 到 受 体 菌 中 ， 由 于 受 体 菌 中 原来 并
无 到 ceTI 产 物 ， 因 此 供 体 菌 转移 进来 的 rec 2Z 基因 可 以 组 成 型 表达 ， 但 在 /ac Z 基
因 表 达 的 同时 ， cec 工 基因 也 在 表达 。 随 着 时 间 的 延长 (2h 后 )， 斑 产物 积累 达
到 足以 阻止 ac 2 基因 的 转录 时 ， 部 分 合子 就 从 组 成 型 变 为 诱导 型 了 。 从 对 照 组
的 结果 还 可 以 看 出 诱导 物 是 使 ac 工 产物 失 活 ， 因 而 加 入 诱导 物 后 ，ac 2Z 基因 继
续 表 达 。

在 提出 有 jac 工 抑 制 物 这 一 假设 以 后 的 许多 年 内 ， 对 于 进一步 确定 它 的 性 质
取得 的 进展 很 小 ， 后 来 选 到 了 ecx 的 温度 敏感 突变 株 和 无 义 突变 株 ， 这 就 说 明
1ec 工 基因 产物 是 一 种 蛋白 质 。 后 来 ， 还 发 现 了 /ac I 的 超 阻 遇 突变 株 (ac 全 )，
它 的 酶 的 合成 诱导 需要 的 诱导 物 的 浓度 比 野 生 型 要 高 得 多 (或 者 完全 不 被 诱导 ，
表现 为 /ac -)。

由 上 述 实验 及 结果 分 析 ， 可 以 建立 下 述 模型 : OF 合成 一 种 特异 性 的 阻 过
物 ， 在 没有 诱导 物 时 ， 它 阻止 Z 基因 的 表达 。@ 诱 导 物 作为 阻 遇 物 的 持 抗 物 起

”26 有 。

B- 半 乳 糖苷 酶 /ml

到

作用 ， 因 而 加 入 诱导 物 以 后 阻 遏 物 失 活 ，2Z 基因 得 以 表达 。 图 三 不 产生 阻 遏 物 ，
因而 无 需 诱 导 物 Z 基因 即 可 表达 ， 阻 遏 物 起 负 调 控 作 用 。

四 、Jacob-Monod 的 负 控 制 模型 及 实验 依据

Jacob 和 Monod 在 1961 年 发 现 了 负 控 制 系统 ， 在 生物 学 发 展 史 上 有 划时代
的 意义 。 发 表 时 生物 界 反应 之 强烈 ， 较 之 Watson 和 Crick 在 1953 年 发 表 DNR
双 螺 旋 模 型 时 有 过 之 而 无 不 及 。 他 们 这 篇 经 典 论文 中 还 预言 了 mRNA 的 存在 ，
从 而 导致 了 mRNA 的 证 实 ， 使 氨基 酸 密 码 的 实验 研究 得 以 开始 ， 结 果 使 整个 分
子 遗 传 学 体系 建立 起 来 ， 所 以 它 的 历史 意义 是 非常 重大 的 。

他 们 的 研究 目的 就 是 要 了 解 基因 功能 的 调控 ， 这 是 整个 生物 界 最 根本 性 的 问
题 。 但 几 十 年 来 没有 丝毫 突破 ， 他 们 看 出 了 细菌 中 的 适应 酶 现象 是 个 基因 调控 间
题 ， 而 且 可 以 用 实验 方法 进行 分 析 ， 因 此 他 们 选 它 作为 突破 口 ， 终 于 通过 大 量 实
验 及 分 析 ， 建 立 了 乳糖 操纵 子 的 负 控制 模型 (图 9-5)。

操纵 区

启动 子
抑制 物 | 结构 基因

人
TREE 一 丰
国人

一 一 一 ~ 抑制 物 结合 于 O 区 阻止

人 让 Z 7Y4 基因 的 转录

抑制 物
N 二
NA lac mRNA
| |
人 B- 半 乳 糖苷 酶
Kit 让 | 转 乙 酰 酶

诱导 物 有 可

诱导 物 - 乳糖 复合 物 不 能 与 O 区 结合
图 9-5 乳糖 操纵 子 负 调控 模型

图 9-5 说 明 @T 基因 产生 一 种 抑制 物 ， 这 种 抑制 物 是 一 种 可 以 变 构 的 蛋 自 】
质 ， 它 有 两 个 结合 位 点 ， 当 没有 诱导 物 时 ， 可 与 DNA 上 O 区 结合 ， 因 而 关闭
Z、Y、A 基因 的 转录 。@ 当 有 诱导 物 时 ， 诱 导 物 与 抑制 物 结合 ， 改 变 了 抑制 物
的 构 型 ， 使 它 不 能 与 O 区 结合 ， 因 而 打开 Z、Y、A 基因 的 转录 。

262 ，

当 工 基因 突变 时 ， 因 不 能 合成 抑制 物 而 使 Z、Y、A 基因 能 转录 ，O -一 O
时 ， 是 由 于 O 区 结构 发 生变 化 而 使 抑制 物 不 能 与 之 结合 ， 也 使 得 Z、Y、A 基
因 能 转录 。

这 个 模型 非常 合理 地 解释 了 达 .co 乳糖 发 酵 中 的 酶 的 诱导 现象 的 本 质 。

Jacob 和 Monod 分 离 了 一 些 组 成 型 突变 株 ， 用 细菌 结合 转移 方法 制 成 部 分 合
子 ， 观 察 B 半 乳糖 苷 酶 的 合成 情况 ， 为 他 们 的 负 控 制 模型 提出 了 令 人 信服 的 实验
依据 。

和 B- 半 乳糖 苷 酶 不 合成

B 半 乳糖 苷 酶

组 成 型 合成 @
OF CRM (免疫 交叉 反应 物 ) 产生

部 分 二 倍 体 ; 人 (0+Z+ 为 及 半 乳 糖苷 酶 诱导 型 ，OeZ- 为 CRM 组 成 型 );

攻 - (0+Z- 为 及 半 乳 糖苷 酶 组 成 型 ，O*Z+ 为 CRM 诱导 型 ); 二 罗
于 为 8 半 乳糖 苷 酶 诱导 型 ，T 2Z -为 CRM 诱导 型 )。 以 上 部 分 合子 的 不 同行 为
充分 说 明了 O 型 组 成 型 突变 是 顺 位 显 性 反 位 隐 性 ， 而 六 基因 对 于 三 来 说 是 顺
位 反 位 都 是 显 性 。

以 上 结果 分 析 完 全 符合 负 调 控 模 型 ， 负 调控 就 是 由 于 某 基 因 或 基因 产物 的 存
在 导致 转录 不 进行 ， 酶 的 合成 受 抑制 ， 就 叫 负 调控 。

五 、 工 基因 产物 及 功能

前 面部 分 二 倍 体 实 验 已 证 明 工 基因 能 产生 一 种 在 细胞 质 中 扩散 的 物质 ， 后
来 分 离 到 了 工 基因 的 ts 和 am 突变 型 ， 这 就 表明 了 工 基因 产物 是 一 种 蛋白 质 ， 后
来 又 分 离 到 了 了 突变 型 ， 表 型 为 Lac- ， 同 时 另 一 些 Lac 工 基因 突变 型 ， 它 们 的
抑制 物 在 有 诱导 物 时 对 热 的 稳定 性 升 高 ， 这 就 预示 了 工 基因 产物 可 能 是 与 诱导
物 相 互 作 用 的 。

1967 年 W.Gilbert 和 B.Miller.Hill 终于 鉴定 出 uac 工 基因 的 产物 。 他 们 检验
于 下 .coli 的 浓缩 提取 物 中 能 够 与 放射 性 标记 的 异 丙 基 硫 代 半 乳糖 苷 (IPTG) 结
合 的 一 种 蛋白 质 。 结 果 发 现 这 种 蛋白 质 很 少 ， 相 当 于 每 个 细胞 只 结合 约 20 一 40
个 IPTG 分 子 ， 这 种 蛋白 质 能 提纯 到 比 它 的 初始 浓度 高 100 倍 左 右 ， 同 时 通过 测
定 这 种 旦 白 质 在 离心 场 内 的 沉降 速度 ， 发 现 这 种 蛋白 质 分 子 大 约 含 有 1000 个 所
基 酸 ， 并 且 能 与 IPTG 结合 。 因 此 在 每 个 下 .coii 细胞 中 大 约 有 5 一 10
自 质 分子 。 在 ac 三 组 成 突变 型 中 不 能 检 出 这 种 蛋白 质 ， 说 明 这 种 结合 IPTG 的
恒 自 质 确 实 是 /ec 斑 基 因 所 产生 的 抑制 物 。 将 这 种 能 与 IPTG 结合 的 基因 产

.263 ，

组 成 型 突变 :

“有

物 在 离心 场 中 测 沉 降 常 数 ， 测 得 其 为 7.8S 的 物质 ， 用 核酸 酶 与 之 作用 数 小 时 后 ，
其 活性 不 失去 ， 而 用 链 霉 蛋白 酶 SO0YC 作用 可 失去 活性 ， 这 就 确定 地 说 明 工 基因
产物 是 蛋白 质 。 攻 3

为 了 能 够 对 Jacob 和 Monod 的 关于 /ac O 基因 是 抑制 物 的 作用 目标 进行 鉴定
实验 。W.Gilbert 和 B.Miller-Hill 从 25S 标记 了 的 细菌 中 提取 ac 工 基 因 的 产
物 一 一 抑制 物 ， 并 且 在 离 体 的 反应 混合 液 中 有 或 没有 IPTG 的 2 种 情况 下 ， 把 放
射 性 标记 的 抑制 物 蛋 白质 与 不 同 的 DNA 分 子 相 互 作 用 ， 然 后 ， 将 这 些 混合 物 进
行 蔗糖 密度 梯度 沉降 以 确定 是 否 有 任何 放射 性 抑制 物 蛋白 质 (这 种 蛋白 质 在 游离
状态 下 ， 沉 降 速 度 仅 为 实验 中 用 的 DNA 分 子 的 五 分 之 一 ) 已 结合 到 DNA 分 隆
上 以 同样 速度 与 DNA 一 起 沉降 。 这 个 实验 结果 如 下 : @ 抑 制 物 不 与 失去 了 鹏
操纵 子 全 部 基因 的 DNA 分 子 结合 ，@ 抑 制 物 结合 于 带 有 1ac 操纵 子 基 因 的 DNR
分 子 上 。 但 必须 先 除 去 IPTG 诱导 物 ， 有 IPTG 便 会 阻碍 抑制 物 与 DNA 结合 ，
@@ 如 果 操 纵 子 是 操纵 区 组 成 型 lac Of 突变 体 ， 则 抑制 物 不 与 此 DNA 分 子 结合
因此 ， 这 些 结果 直接 地 肯定 了 最 初 关 于 抑制 物 作用 机 制 的 假设 。

由 于 后 来 选 到 了 /ac 工 的 另 一 种 突变 株 ， 能 产生 大 量 的 工 抑制 物 ， 用 这 种 突 二
变 株 可 以 制备 大 量 的 ec 工 抑 制 物 ， 测 定 其 分 子 质 量 为 130 000Da， 有 四 个 亚 基 ，
每 个 亚 基 37 000Da， 只 有 四 聚 体 才 有 功能 ， 每 个 亚 基 由 347 个 所 基 酸 组 成 , 每
个 亚 基 都 有 与 诱导 物 和 O 区 的 结合 位 点 。

用 胰 蛋 白 酶 、 胰 凝 乳 酶 处 理 此 亚 基 ， 它 丧失 了 与 O 区 结合 的 能 力 而 不 失去
与 诱导 物 结合 的 能 力 。 分 析 此 亚 基 的 结构 ， 发 现 1 一 5$9，328 一 347 氨基 酸 失去 时
了 ， 说 明 1 一 5$9，328 一 347 是 与 O 区 结合 的 部 位 。

六 、 操 纵 区 和 局 动 区

怎样 知道 结构 基因 Y 和 2 都 控制 着 乳糖 发 酵 特 性 呢 ? 这 是 因为 不 但 立 突变
后 ， 细 菌 由 乳糖 发 酵 变 为 不 发 酵 乳 糖 ， 而 且 发 现 Y 不 变 而 2 突变 后 ， 细 菌 同样
由 发 酵 乳 糖 变 为 不 发 酵 乳糖 。

i 基因 突变 后 ， 细 菌 从 诱导 型 变 为 组 成 型 。 在 ; 基因 不 变 时 ， 也 曾 发 现 细菌
从 诱导 型 变 为 组 成 型 。 这 说 明 有 另 一 基因 参与 细胞 中 诱导 酶 合成 的 调节 控制 。 这
便 是 操纵 区 ， 它 的 组 成 型 写作 OF， 通过 杂交 ， 可 以 看 到 O 和 ; 在 染色 体 上 有 不
同 的 位 置 ， 而 O 和 2 则 是 邻接 的 。

转录 以 RNA 聚合 酶 和 DNA 特定 位 置 结合 开始 ， 在 乳糖 操纵 子 中 ， 这 一 结
合 位 置 在 哪里 ?

如 果 RNA 聚合 酶 和 阻 遇 物 的 结合 位 点 是 一 个 ， 那 么 这 一 部 位 的 缺失 使 聚 谷
酶 不 能 发 生 作用 ， 因 此 缺失 应 是 导致 超 阻 遇 型 ， 阻 遏 物 结合 部 位 的 缺失 则 导致 组
成 型 。 缺 失 突 变型 的 研究 结果 说 明确 实 存在 这 两 种 突变 型 。 从 而 在 阻 遏 物 结合 音

。， 264 ，

SEE

位 《操纵 区 O) 以 外 ， 还 鉴定 出 了 RNA 聚合 酶 结合 部 位 〈 启 动 区 已 )。

1975 年 以 前 ， 局 动 子 的 碱 基 顺 序 的 性 质 还 不 完全 清楚 ， 而 现在 ， 许 多 启动
隆 的 顺序 已 经 测定 。 通 过 比较 ， 发 现在 已 区 有 些 共 同 的 序列 ， 就 是 在 转录 一 章
牛 所 讲 的 =10 区 (pribnow box) 和 =-35 区 (=-35S sequence)， 有 些 启动 子 上 还 有
辅助 因子 结合 位 点 ， 如 cAMP-CAP 结合 位 点 ， 乳 糖 操纵 子 的 已 区 就 包括 以 上 三
共 结 合 部 位 。 其 中 cAMP-CAP 与 DNA 结合 起 正 调控 作用 。

七 、 正 控制 系统

cAMP 是 Sutherland 等 在 20 世纪 50 年 代 发 现 的 ， 多 年 来 不 知道 它 的 生物 学
意义 ， 未 受到 重视 ， 直 到 1965 年 发 现 兰 椎 动物 的 几 种 肽 激素 作用 于 靶 组 织 时 ，
首先 使 靶 组 织 的 cAMP 的 含量 增高 ， 这 才 引 起 人 们 的 重视 ， 现 在 已 经 清楚 <AMP
在 激素 调节 中 起 第 二 信使 作用 ，Sutherland 由 于 这 个 发 现 而 获得 诺 贝 尔 奖 。

1965 年 Sutherland 发 现 了 大 肠 杆菌 的 培养 液 中 葡萄 糖 的 含量 总 是 与 <AMP
的 含量 成 反比 。 当 时 还 没有 立即 想到 cAMEP 与 “分 解 代 谢 物 抑 制 ” 的 关系 ， 直
到 1968 年 ， 发 现 培养 液 中 加 入 cAMP 后 可 以 克服 葡萄 糖 对 及 半 乳 糖苷 酶 的 抑制
帮 用 ， 也 就 是 说 在 培养 液 中 加 入 cAMP 可 以 增加 及 半 乳糖 苷 酶 的 产量 ， 而 把 生物
学 中 表面 上 看 来 无 关 的 两 个 重大 问题 联系 起 来 ， 从 而 导致 正 控制 系统 的 发 现 。

在 正 调控 系统 中 ， 在 有 诱导 物 (抑制 解除 物 ) 存在 的 条 件 下 ， 细 胞 内 3” 35”
环 式 AMP (简写 <AMP) 的 合成 量 就 多 ，cAMP 量 多 则 /ac 操纵 子 转录 就 愈 盛 。
CEAMP 的 调控 作用 是 通过 “cAMP 受 体 蛋白 ”CAP (CAP 或 称 CRP 是 正 控制 中
的 一 个 必需 的 蛋白 质 因 子 ) 和 cAMP 结合 成 复合 物 (cAMP-CAP 复合 物 )， 此 复
合 物 和 ac 操纵 子 P 区 的 CAP 位 点 结合 ， 转 录 才 能 开始 。cAMP-CAP 与 P 区 结
合 ， 改 变 DNA 的 次 级 结构 ， 使 RNA 聚合 酶 能 与 - 10 区 形成 open-promoter com-
plex， 这 一 机 制 称 为 正 控制 。

正 控 制 系统 的 要 点 是 <AMP-CAP 对 转录 的 诱导 作用 (induction)， 未 和
EAMP 结 合 的 CAP 是 “无 活性 的 ”诱导 物 ， 它 不 能 和 CAP 位 点 结合 ， 已 和
CAMP 结合 的 CAP 是 有 活性 的 诱导 物 (inducer); cAMP 称 为 “ 辅 诱导 物 ” (co-
inducer) 。

细胞 内 csAMP 的 含量 受 许多 条 件 的 控制 ，cAMP 是 由 ATP 经 腺 苷 酸 环 化 酶

(adenylcyclase) 环 化 而 成 : ATP AMP + 焦 磷酸

各 种 因素 都 可 以 影响 腺 味 叭 核 苷 酸 环 化 酶 的 活性 ， 因 而 影响 cAMP 的 含量 ，
从 而 影响 转录 。 例 如 ， 培 养 液 中 如 果 存 在 葡萄 糖 就 可 以 影响 环 化 酶 的 活力 ， 使 细
胞 内 cAMP 含量 降低 ， 从 而 抑制 zac 操纵 子 的 转录 。 正 控制 系统 中 葡萄 糖 这 样 的
抑制 物 称 辅 抑 制 物 ， 这 是 为 了 和 负 调 控 系 统 中 的 蛋白 质 抑 制 物 相 区 别 。 正 控制 和

BBS,”

负 控 制 的 比较 见 表 9-1。

表 9-1 正 控 制 和 负 控 制 的 比较

正 控制 体系 负 控 制 体系

主要 作用 物 〈 蛋 白质 性 质 ) cAMP-CAP 复合 物 抑制 物 蛋 白
主要 作用 物 的 作用 诱导 ”抑制
作用 位 置 P 区 O 区

起 相反 作用 的 辅助 因子 辅 抑 制 物 抑制 解除 物

( 非 蛋 白质 性 质 ) (葡萄 糖 ) ( 半 乳 糖 )

并 不 是 葡萄 糖 本 身 直 接 起 抑制 作用 ， 而 是 它 的 分 解 代 谢 物 起 作用 。 在 大 肠 杆
菌 中 ， 和 葡萄 糖 可 以 抑制 B 半 乳糖 苷 酶 的 产生 。 这 个 现象 很 早 就 知道 ， 传 统 中 称 为
“分 解 代 谢 物 抑制 "， 很 多 微生物 都 专 一 地 利用 一 种 糖 ， 但 下 .co 可 以 利用 葡萄
糖 也 可 以 利用 乳糖 ， 在 培养 基 上 同时 存在 葡萄 糖 和 乳糖 时 ， 下 .coil 只 利用 葡 区
糖 ， 而 不 利用 乳糖 。

这 可 能 是 长 期 自然 选择 的 结果 ， 因 为 自然 界 中 葡萄 糖 比 其 他 糖 存 在 广泛 。 画
外 ， 这 显然 也 有 适应 意义 。 如 果 环 境 中 有 和 葡萄糖 ， 细 菌 就 可 以 利用 葡萄 糖 作 能 源
和 碳 源 。 因 此 细菌 不 产生 B- 半 乳糖 背 酶 是 合理 的 节约 ， 这 也 是 通过 自然 选择 而 形
成 的 极其 合理 和 巧妙 的 调控 机 制 。

八 、P-O 区 的 结构

lac 操纵 子 早已 有 人 分 离 得 到 ， 其 已 O 区 的 核 苷 酸 顺 序 已 全 部 分 析 清 楚 ，
Lac 操纵 子 的 PO 区 结构 如 图 9-6 所 示 。
启动 子

cAMP-CRP 位 点 RNA 聚合 酶 作用 位 点

CAMP-CRP RNA 聚合 酶 保护 区

从 保护 区 入 着 起
上 点
CAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTIAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTITACACTITATGCTTCCGGCTCGTATGTITGTGTGCGAATTGTGAGCGGAIAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACC
GTCACTCGCGTTGCGTTAATTACACTCAATCGAGTGAGTAATCCGTGGGGTCCGAAA TGTCAAATACGAAGGCCGAGCATACAACACACCIT4ACACTCGCCT ATTGTT4AAGTGTGTCCTTTGTCGATACTGG
1 10 避 30 40 50 60 | 70 | 80 90 100 110 120
A AAA
和 ， Tree
下 降

图 9-6 .coi 乳糖 操纵 子 调控 区 的 碱 基 顺 序

也 区 是 从 ; 基因 结束 到 mRNA 转录 开始 点 为 止 ， 而 O 区 的 范围 是 抑制 物 结
， ,26

侣 区 。 从 ; 基因 结束 到 Z 基因 起 点 之 间 共 122 个 碱 基 对 ，mRNA 是 从 第 85 对 碱
基 开 始 的 ， 所 以 PP 区 共 84 个 碱 基 对 ， 抑 制 物 结合 区 从 78 一 112， 共 35 对 碱 基 ，
和 已 区 有 7 对 重 和 至 ， 抑 制 物 保护 区 之 后 还 隔 10 对 才 是 Z 基因 的 始点 ， 现 在 一 般
把 mRNA 开始 到 结构 基因 起 始 密码 子 之 间 这 一 段 称 为 前 导 区 (leader)。

PO 区 碱 基 对 的 命名 顺序 是 从 mRNA 起 始 的 第 一 个 核 苷 酸 为 +1 与 转录 方
向 一 致 的 为 正 ， 与 转录 方向 相反 的 为 负 。 所 以 P 区 从 -84 一 -1， 抑 制 物 保 护 区
是 -7 一 28。

O 区 (=-7~28) 的 碱 基 顺 序 有 对 称 性 ， 其 对 称 轴 在 + 11 碱 基 对 (图 9-7)。
尼 区 中 的 <AMP-CAP 复合 物 结 合 区 也 是 一 个 对 称 区 (67 一 52)， 其 对 称 轴 在
60 一 59 之 间 ， 此 对 称 序列 如 图 9-7: 对 称 区 在 蛋白 质 与 DNA 的 识别 结合 中 有 重
要 意义 。

AGEGITTEDGY AGE
AAS 下
丰 训 定 太 成 ER
工 ACAA (mi 中 全

下

区 TITGTGTGGAAIITGTGAGCGGAIAACAATIITITCACACA 开
32 ACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGT 这

-一 一 抑制 物 保护 区 一 -|
图 9-7 /uc 操纵 区 的 碱 基 顺 序

二 节 ，” 半 乳糖 操纵 子

大 肠 杆 菌 半 乳糖 操纵 子 (gal operon) 在 大 肠 杆 菌 遗 传 图 上 位 于 17min 处 ，
包括 三 个 结构 基因 : ga 此 ( 异 构 酶 UDP-galactose-4-epimerase)， galT ( 半 乳 糖
工 磷酸 尿 旷 啶 核 苷 转移 酶 ，galactose transferase)， gaLK ( 半 乳 糖 激酶 ，galactose
Kinase)。 这 三 个 酶 的 作用 是 使 半 乳 糖 变 成 1- 棍 酸 和 葡萄 糖 。 半 乳糖 操纵 子 的 调节
基因 是 gao 及， 位 于 遗传 图 上 55min 处 〈 图 9-8)。

激酶
Gal Gal-1-P 苇 移 芝 UDP-Gal +Glu-1-P
异 构 酶
UDP
-Glu
Sa 有 SalT ea 屿 FI Co
和
Sal mRNA

图 9-8 半 乳 糖 操纵 子 ， 调 节 基 因 距 结构 基因 很 远
2

gal operon 与 1ac operon 所 不 同 的 是 gajR 与 gog ETK 基因 族 离 得 很 远 ，

galR 基因 产生 阻 遏 物 蛋 白 ， 而 gazR 基因 与 ga; 的 结构 基因 和 gazO 都 不 相 邻 ，
但 gaiR 产物 和 galO 的 作用 与 ac 操纵 子 中 的 jaci 产物 和 zacO 作用 相同 ， 因 为
ga/R 和 gaLO*: 突变 表 型 分 别 是 可 以 组 成 型 地 合成 焉 、T、 开 基因 产物 。g 导 操 ，
纵 子 的 诱导 物 常 党 是 半 乳 糖 。 半 乳糖 操纵 子 还 有 两 点 与 乳糖 操纵 子 不 同 : @ 半 乳
糖 操纵 子 有 两 个 启动 子 ，mRNA 从 两 个 不 同 的 起 始点 开始 转录 ; @ 半 乳糖 操纵
子 有 两 个 O 区 ， 一 个 O 区 不 在 P 区 与 结构 基因 之 间 ， 而 是 在 P 区 士 游 在 号
-67 一 -53 的 地 方 ; 另 一 个 O 区 在 结构 基因 内 部 ， 在 go 基因 内 。 现 已 知 的

所 有 操纵 子 中 仅 此 一 例 。

一 、cAMP-CAP 对 两 个 gal 启动 子 的 不 同 作用

半 乳 糖 的 利用 效率 比 葡萄 糖 要 低 。 人 们 料想 可 能 是 葡萄 糖 存在 时 半 乳 糖 操纵
子 不 被 诱导 ， 但 实际 上 在 葡萄 糖 存在 时 ， 半 乳糖 操纵 子 是 可 以 被 诱导 的 。 分 离 到 一
些 突变 株 ， 奇 怪 的 是 ， 这 些 突变 株 可 被 分 为 两 类 ， 一 类 突变 是 能 高 水 平地 合成 半 乳 ，
糖 代谢 的 酶 ， 但 当 葡萄 糖 存在 时 不 合成 ; 另 一 类 突变 是 当 葡 萄 糖 不 存在 时 不 能 合成 时
半 乳 糖 代谢 的 酶 ， 这 些 现象 只 能 用 半 乳 糖 操 纵 子 上 存在 两 个 启动 子 来 解释 。 对 半 乳
糖 操纵 子 的 已 O 区 进行 碱 基 顺 序 分 析 ， 发 现 有 两 个 启动 子 ， 相 距 5 个 bp， 半 乳糖 局
操纵 子 可 以 从 两 个 启动 子 启动 转录 ， 有 两 个 转录 起 始点 S 和 S， 两 个 不 同 的 启动 于
子 是 PG1 和 PG2。cAMP-CAP 对 从 S 和 的 起 始 转录 的 作用 不 同 。

1) 从 S 起 始 的 转录 只 有 当 不 存在 葡萄 糖 时 才能 进行 ， 当 腺 苷 酸 环 化 酶 突变 季
(cyae ) 或 c<AMP 受 体 蛋 白 〈crp ) 突变 时 ， 半 乳糖 操纵 子 不 能 从 Si 转录 ， 袜
体外 系统 中 加 入 cAMP-CAP 时 ， 才 能 从 Si 能 转录 。

2) 从 S 的 转录 是 在 葡萄 糖 存 在 的 情况 下 起 始 的 ,从 S 的 转录 不 需
cAMP-CAP， 事 实 上 ，cAMP-CAP 抑制 从 S 的 转录 。

在 半 乳 糖 操纵 子 内 的 <AMP-CAP 所 起 的 调节 作用 比 在 乳糖 操纵 子 中 更 为 复
杂 ， 大 肠 杆菌 的 cye -或 cm- 突变 型 不 能 利用 乳糖 ， 但 可 以 利用 半 乳 糖 作 唯一 碳 旺
源 。 那 么 是 不 是 <AMP-CAP 对 半 乳 糖 操纵 子 完 全 没有 作用 呢 ? 用 体外 转录 的 手
段 证 明 <AMP-CAP 是 能 够 刺激 半 乳 糖 操纵 子 增强 转录 的 ， 用 含有 半 乳 糖 操纵 子
调节 区 的 限制 酶 片段 作 模板 进行 体外 转录 时 ， 发 现 转录 可 以 从 S 或 S 两 个 不 同
的 起 始 位 点 开始 ， 当 有 cAMP-CAP 时 转录 从 Si 开始 ， 当 无 <AMP-CAP 时 ， 转 录
从 S 开始 ， 说 明 <AMP-CAP 抑制 从 人 的 转录 而 刺激 从 Si 的 转录 。 顺 序 分 析 表 。
明 有 两 个 相互 重 春 的 Pribnow box 顺序 ， 它 们 分 别 对 应 于 两 个 不 同 的 起 始 位 点 有
和 S (图 9-9)。

活体 实验 结果 支持 <AMP-CAP 对 半 乳 糖 操纵 子 中 的 两 个 启动 子 的 作用 不 同
这 一 观点 。 发 现 有 一 个 半 乳 糖 启动 子 突变 型 不 能 利用 半 乳 糖 ， 但 如 果 将 这 一 突变

。 268 。

| OFE
| NA+(cCAMP-CAP

5 于 47 生生 这 让

员 。”cAMP-CAPsite

1 _24~ 45 ImRNA(CAMP-CAP) gal 异 构 酶 起 点

二 30 -20 -10 +1 +10 +20

GT TTTICATACCATAAGCEITAATGGAGECGAATIATGAGRA
| 1

中 区 AAGCGTAGAAACAATACGATACCAATAAAGTATGGTATTCGGATTACCTCGCTTAATACTCT
| S S

2
图 9.9 半 乳 糖 操纵 子 转录 起 始点 上 游 的 碱 基 顺 序 ，
有 两 个 Pibnow box 和 两 个 转录 起 始 位 点 S 和 S

| 菌株 再 行 突 变 为 cya -或 cr -时 则 又 能 够 利用 半 乳 糖 了 。 原 来 的 突变 型 在 体外 条
| 符 下 不 能 从 Si 开始 转录 ， 但 能 从 S 开始 转录 。 说 明 这 一 突变 型 之 所 以 不 能 利用
| 半 乳 糖 是 由 于 突变 损坏 了 在 Si 处 开始 的 转录 (可 能 是 PG1- )， 而 细胞 内 又 存在
| EAMP-CAP， 对 S 开始 的 转录 有 抑制 作用 。 所 以 这 种 突变 在 活体 内 gal 操纵 子 既
环 能 从 Si 转录 也 不 能 从 S 转录 。 因 而 不 能 利用 半 乳 糖 。 这 一 突变 再 行 突变 后 ，
不 论 是 cyae “还 是 cr 突变 ， 都 可 以 恢复 对 半 乳 糖 的 利用 。

对 这 一 突变 型 启动 子 核 苷 酸 顺 序 分 析 结 果 支 持 上 述 观 点 ， 这 一 突变 发 生 在
=11 碱 基 对 ， 使 原来 的 A/T 变 为 T/A。 这 对 碱 基 恰 好 在 PG1 的 Pribnow box 的
第 二 对 碱 基 上 ， 已 知 许多 启动 子 中 这 对 碱 基 保 守 性 极 强 ， 碱 基 改 变 必 然 会 带 来 功
能 改变 ， 因 此 不 能 从 S 处 转录 。 此 外 ， 这 对 碱 基 也 正好 是 PG2 的 Pribnow box
申 的 第 7 个 碱 基 ， 在 其 他 启动 子 上 ， 这 对 碱 基 变 化 程度 也 比较 大 ， 同 样 ， 这 里 也
没有 影响 PG2 的 功能 。

cAMP-CAP 是 如 何 促进 从 Si 的 转录 并 同时 抑制 S 的 转录 呢 ? 这 一 点 还 不 十
分 清楚 ， 一 般 认 为 ， 促 进 Si 的 方式 和 乳糖 操纵 子 中 的 方式 相似 〈 即 促进 形成
Gpen-Dromoter complex)， 并 且 在 PG1 启动 子 上 形成 的 这 个 复合 物 在 空间 位 置 上
于 扰 了 从 呆 的 起 始 (因为 该 复合 物 和 S 的 Pribnow box 有 两 个 碱 基 重 和 至 )。

二 、 双 启动 子 的 生理 功能

对 于 具有 单 启 动 子 的 基因 来 讲 ， 启 动 子 的 生理 功能 容易 理解 。 可 是 某 些 基因
具有 不 止 一 个 启动 子 ， 例 如 半 乳 糖 操纵 子 上 有 两 个 启动 子 ， 这 些 启 动 子 究竟 具有
什么 生理 功能 呢 ?

半 乳 糖 对 细菌 有 双重 作用 ， 半 乳糖 一 方面 可 以 作为 碳 源 ， 另 一 方面 它 又 是 细
胞 壁 的 成 分 。 细 胞 壁 物质 的 直接 前 体 是 UDP- 半 乳糖 ， 当 细菌 在 不 含 半 乳糖 的 培
养 基 上 生长 时 ， 可 以 通过 差 向 异 构 酶 将 UDP- 葡 萄 糖 转化 为 UDP- 半 乳糖 ， 从 而

”269 。

合成 细胞 壁 物质 。 因 此 细胞 中 必须 有 一 定量 的 差 向 异 构 酶 才能 维持 细菌 的 生长 和
繁殖 。 这 也 说 明 为 什么 在 不 加 诱导 物 时 也 有 一 定量 的 酶 形成 的 必要 性 。 事 实 上 乳
糖 操纵 子 在 诱导 和 不 诱导 时 表达 相差 1000 倍 ， 而 半 乳 糖 操纵 子 则 只 相差 10 一 和 5
音 。 当 细菌 以 葡萄 糖 作为 唯一 碳 源 和 能 源 时 ， 细 胞 内 缺少 cAMP， 于 是 PG1 不
能 启动 转录 ， 但 有 利于 PG2 启动 转录 ， 因 为 PG2 的 启动 不 但 不 需要 cAMP:
CAP， 而 且 还 避免 受 c<AMP-CAP 对 PG2 的 抑制 作用 。 由 于 PG2 的 启动 ， 于 是
细胞 内 有 一 定 水 平 的 有 关 半 乳糖 利用 的 三 种 酶 的 生成 ， 其 中 的 差 向 异 构 酶 可 以 催
化 UDP- 葡 萄 糖 转化 为 UDP- 半 乳糖 。 当 细胞 中 以 半 乳 糖 作 碳 源 时 ， 细 胞 中 cAME
流 度 升 高 ， 抑 制 PG2 启动 子 ， 促 进 PG1 启动 子 的 启动 ， 从 而 保证 细菌 能 在 两 种
不 同 的 环境 中 都 可 以 形成 细胞 壁 物质 的 前 体 一 UDP- 半 乳 糖 。

三 、 双 操纵 区

半 乳 糖 操纵 子 与 乳糖 操纵 子 不 同 ， 前 者 的 operator 不 在 P 区 与 结构 基因 之
间 ， 而 是 在 P 区 的 上 游 。 考 察 半 乳糖 操纵 子 中 -70~- - 50 之 间 包 含 的 一 段 回 文
对 称 顺序 和 乳糖 操纵 子 上 相对 应 位 置 的 CAP 位 点 非常 相似 ， 但 又 不 是 真正 的
CAP 位 点 。 因 为 半 乳 糖 操纵 子 上 -- 66 处 发 生 GV/C->AVT 突变 后 ， 操 纵 子 上 几 合
基因 不 经 诱导 就 可 以 高 水 平 表达 ， 说 明 这 一 位 点 是 操纵 区 而 不 是 CAP 位 点 。 而
目 这 一 突变 型 体外 转录 仍 需 要 cAMP 和 CAP 蛋白 ， 这 就 使 我 们 确信 半 乳 糖 操纵
子 内 这 一 序列 虽然 位 置 和 结构 都 和 乳糖 操纵 子 的 CAP 位 点 相似 但 并 不 是 CAP 位
置 ， 实 际 上 CAP 位 置 在 -24~- - 50 之 间 ， 在 操纵 基因 下 游 ， 近 年 来 发 现在 半 腊
糖 操纵 子 的 CAP 位 点 下 游 还 有 另 一 个 操纵 区 ， 在 半 乳 糖 操纵 子 的 ga 刁 基因 内 找
到 一 株 0O* 突变 ， 顺 序 分 析 表 明 ga 内 +46~- +60 的 一 段 顺 序 与 -53 一 -67 有
同 源 关系 ， 体 外 结合 实验 表明 可 以 结合 抑制 物 。 上 游 的 O 区 称 为 外 操纵 区
(OE)，sga 丰 内 的 O 区 称 为 内 操纵 区 (OT)， 两 个 操纵 区 顺序 如 图 9-10 所 示 ，
目前 对 于 两 个 O 区 的 功能 还 没有 很 完美 的 解释 。

A CTGGT AT
T GACCA TA

oc 个
=70 ANAL 人 潭 | ao
了 5-ATTCTTGIFTGTAAACGATTCCACITAATTTA-3，
3'-TAAGAACIACATTTGCTAAGGTG|ATTAAAT-5'

口 >

人 1 1 1 1 1
区 5-CTTCCAA[TGTAACCGCTACCAC|CGGTAAC-3'
! 3-GAAGGTTIAGATTGGCGATGGTGj|GCCATTG-5，
+50 os +40
C
G

图 9-10 ga 操纵 子 的 两 个 操纵 区 顺 订

”2

三 节 ” 色 氮 酸 操纵 于

色 氢 酸 操 纵 子 (trp operon) 是 色 氢 酸 合成 的 一 个 操纵 子 ， 操 纵 子 的 调控 仅
仅 根 据 生 长 培养 基 中 有 无 色 氨 酸 ， 当 培养 基 中 有 色 氨 酸 时 ， 不 需要 色 氢 酸 操纵 子
处 于 活性 状态 ， 而 当 培 养 基 中 无 色 氨 酸 时 ， 色 氢 酸 操纵 子 被 打开 ， 这 里 就 存在 一
个 调控 系统 。

色 氨 酸 的 合成 分 五 步 完 成 。 每 一 步 需要 一 种 酶 ， 这 五 种 酶 的 基因 彼此 相 邻 ，
是 连锁 在 一 起 的 ， 这 五 个 基因 被 转录 在 一 条 多 顺 反 子 mRNA 分 子 上 ， 五 个 基因
分 别 是 za、zrpD、trpC、trpoB 和 ztrpA， 分 别 编码 邻 氨 基 葵 甲酸 合成 酶 、 邻
氨基 葵 甲 酸 焦 磷 酸 转移 酶 、 邻 氨基 葵 甲 酸 异 构 酶 、 色 氢 酸 合成 酶 和 吗 味 甘油 -3-
磷酸 合成 酶 。zraiE 基因 是 第 一 个 被 翻译 的 基因 ， 和 zraiE 紧邻 的 是 promoter、
6perator 和 两 个 区 [一 个 叫做 前 导 区 〈leader) 另 一 个 叫做 弱化 子 (attenuator )，
分 别 定 名 为 trtL 和 ztrzia (不 是 zrp4A )]。 色 氢 酸 操纵 子 中 产生 阻 遏 物 的 基因 是
下 5R，zrpoR 距 zrp 基因 簇 很 远 ，zrbp 基因 得 在 瓦 .coi 染色 体 图 上 2Smin 处 而 六 -
证 则 位 于 90min 处 。 在 位 于 6Smin 处 还 有 一 个 trpS ( 色 氢 酸 tRNA 合成 酶 )，
节 5S 和 携带 有 色 氨 酸 的 了 NAI 这 两 个 因素 也 参与 色 氢 酸 操纵 子 的 调控 作用
(图 9-11)。 色 氢 酸 操纵 子 的 转录 调控 的 特点 是 ， 除 了 阻 遏 操纵 系统 外 ， 还 有 弱
化 系统 。

60 162 1550 1503 1350 1104 804 ”40
怠 基 对 数 只 1 | 17D 兢 1DO 1rDC 1DB 1rD4 人
弱化 子 序列 ”间隔 区 间隔 区
(Pa)
F------- 调节 -------- 酶 产生 |

图 9-11 色 氢 酸 操 纵 子

一 、 色 氢 酸 操纵 子 的 阻 遏 -操纵 系统

tirpR 基因 突变 型 引起 trpmRNA 的 组 成 型 起 始 合成 ， 这 和 在 zac 操纵 子 中 一
样 ，zrpR 基因 的 蛋白 产物 常常 称 为 aporepressor， 当 没有 色 氮 酸 存在 时 ， 不 能 和
t 疙 的 操纵 区 结合 ， 当 trz 的 aporepressor 与 色 氨 酸 结合 在 一 起 时 ， 成 为 有 活性
的 阻 遇 物 (repressor) 才能 与 trp 的 操纵 区 结合 。
aporepressor + operator 一 ~ 有 活性 的 启动 子 (active operator) “转录 发 生
aporepressor + tryptophan 一 > 无 活性 的 启动 子 (active repressor+ inactive operator) ”转录 不 发 生
2

上 两 式 表 明 ， 当 色 氨 酸 存在 时 ， 有 活力 的 抑制 物 能 抑制 转录 ， 当 色 所 酸 的 外
部 供应 耗 尽 时 ， 上 面 方程 式 中 的 平衡 向 左 移动 ， 操 纵 区 不 被 抑制 物 占 据 ， 转 录 开
台 ， 这 是 最 基本 的 开关 (on-off) 机 制 。

阻 遇 -操纵 机 制 对 色 氢 酸 来 说 必须 是 一 个 充分 的 开关 ， 主 管 转录 是 否 启动 ，
相当 于 色 氢 酸 操 纵 子 的 一 个 粗 调 。 而 在 色 氢 酸 操 纵 子 中 对 应 于 色 氢 酸 生 物 合成 还
有 另 一 个 系统 进行 细 调 控 ， 这 种 细 调 控 主 管 已 经 启动 的 转录 是 否 继 续 下 去 。 在 这
个 系统 中 ， 酶 的 浓度 根据 氨基 酸 的 变化 而 变化 。 这 个 有 效 的 调控 是 通过 转录 在 达
到 第 一 个 结构 基因 之 前 过 早 终止 来 实现 的 。 由 氨基 酸 的 浓度 来 调节 这 种 过 早 终止
的 频率 。 这 些 过程 是 如 何 完 成 的 将 在 下 面 讨论 。

二 、 和 能 化 子 和 前 导 区

在 trpmRNA5S 端的 开头 ， 在 trt 刀 基因 的 起 始 密码 前 有 162 个 碱 基 。 这 上 段
mRNA 片段 叫 前 导 区 。 在 前 导 区 有 一 段 碱 基 顺 序 (123 一 150)， 如 果 这 一 段 缺失

了 ，3 引 起 trp 的 酶 的 合成 提高 6 倍 ， 无 论 是 在 一 个 阻 遏 的 细胞 里 还 是 在 一 个 组 成

型 突变 的 细胞 里 都 是 这 样 (无 论 zrpR -或 zrpR )。 这 样 说 来 ， 这 段 顺序 (123 一 ，
150) 一 定 起 调控 作用 。 另 外 ， 当 mRNA 的 合成 起 始 以 后 ， 除 非 培养 基 中 完全 没
有 色 氢 酸 ， 否 则 ， 转 录 总 是 在 这 个 区 域 终止 ， 产 生 一 个 仅 有 140 核 苷 酸 的 RNA
分 子 ， 使 编码 trp 酶 基因 的 转录 短暂 停止 ， 这 就 是 为 什么 这 段 缺 失 会 导致 trp 酶

的 基因 的 表达 提高 。 在 这 个 区 转录 终止 发 生 ， 并 且 这 种 发 生 是 被 调节 的 。 这 个 区 下

域 就 叫 弱 化 子 (attenuator)。 引 起 终止 的 这 一 段 mRNA 的 碱 基 顺 序 见 图 9-12，
此 区 有 典型 的 终止 区 的 特点 ， 在 mRNA 中 通过 配对 可 以 形成 苓 - 环 结构 (stem-
and-loop)。

110 120 130 140 3 站
AUACCCAGCCCGCCUAAUGAGCGGGCUUUUUUUUU

| 人 终止 mRNA 中 的
入 AT 最 后 碱 基

已
=oke 证 e
Q

>Qooaoaa

本 110 140
ANSRGIC UUUUUUUU

图 9-12 xzrb 弱化 子 mRNA 的 终止 区

许多 不 同 的 实验 指出 ， 弱 化 需要 负荷 tp 的 让 NA (tRNAI) 存在 ， 由 这 一

”2

走 推 测 前 导 区 的 某 一 部 分 是 被 翻译 的 。 对 前 导 区 的 序列 分 析 表 明 有 起 始 密码
AUG， 在 后 边 还 有 一 个 终止 密码 子 UGA， 如 果 翻 译 从 AUG 密码 子 开始 ， 一 个
奇 环 氨基 酸 的 多 肽 应 该 被 合成 〈 图 9-13)。 不 过 在 大 肠 杆菌 细胞 中 至 今 还 没有 找
到 这 作 多 肽 ， 有 可 能 这 个 多 肽 形成 ， 但 很 容易 分 解 ， 因 此 不 易 检 测 到 。 这 个 假想
的 肽 称 为 前 导 肽 〈leader peptide)。 有 些 证 据 表 明 这 个 14 肽 可 能 是 被 合成 的 ， 前
导 区 内 有 SD 顺序 〈1972 年 Shine-Dalgason 发 现 的 在 mRNA 起 始 密码 子 上 游 3 一
页 碱 基 处 的 一 个 稳定 顺序 ， 与 核糖 体 16S RNA 的 3“ 端 互补 ， 是 核糖 体 结合 言
位 ，GAGG 由 于 是 Shine-Dalgason 发 现 的 所 以 叫 SD 顺序 )， 这 个 SD 顺序 正好 位
于 AUG 的 5 端 。 另 外 ， 前 导 肽 编码 区 与 trpE 端 融合 ， 产 生 了 一 个 N 端 与 前 导
肽 完全 相同 的 融合 蛋白 。

| 假设 的 前 导 肽 -一 蛋白 质
etLys Ala le Phe Val Leu Lys Gy Trp Trm Arg Thr Ser Stop 瑞 = RS

pppAAG(23) AUGAAAGCAAUUUUCGUACUGAAAGGU UGG UGG CGC ACUUCCUGA-(91)…AUG CAAACA CAA
图 9-13 “zrzb 前 导 区 mRNA 的 碱 基 顺 序
假设 的 前 导 肽 中 有 两 个 并 邻 的 色 氨 酸 密码 子
前 导 肽 有 一 个 很 有 意义 的 特点 ， 就 是 在 第 10 和 第 11 位 上 有 相 邻 的 两 个 色 氮
酸 密码 子 ， 这 一 点 很 重要 ， 因 为 组 氨 酸 操纵 子 中 ， 也 具有 弱化 子 ， 也 具有 一 个 类
似 的 能 编码 前 导 肽 的 碱 基 序 列 ， 此 序列 中 含有 7 个 相 邻 的 his 密码 子 。

三 、mRNA 的 前 导 区 全 序 列 分 析

TRNA 的 前 导 区 已 做 了 全 序列 分 析 ， 发 现 前 导 区 的 结构 特点 是 4 个 部 分 可
在 不 同 条 件 下 互相 配对 (图 9-14)，1 区 和 2 区 ，3 区 和 4 区 形成 发 夹 结构 (或 葵

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图 9-14 trp 前 导 区 mRNA 二 级 结构 的 几 种 形式
“273 .

环 结构 )，3 区 和 4 区 茎 环 后 边 紧 接着 8 个 U。 用 TI RNase 处 理 〈 此 酶 不 降解 双
链 RNA) 表明 ， 在 提纯 的 色 氨 酸 操纵 子 的 转录 产物 中 存在 1-2 和 3-4 苓 环 结构 ，
而 3-4 荃 环 结构 在 终止 识别 区 ， 这 个 区 对 于 终止 是 必需 的 ， 在 此 区 的 几 种 突变 都
能 在 体内 防止 终止 。 在 1、2、3、4 区 中 ， 除 了 1-2 和 3-4 配 对 外 ， 在 某 种 情况 下
2-3 也 可 以 配对 ， 当 2-3 配对 时 ，1-2，3-4 则 不 能 配对 形成 蕉 环 结构 ， 这 些 因 素
共同 构成 了 导致 在 trp 操纵 子 的 前 导 区 中 形成 过 早 终 止 机 制 的 理论 。

、 蚊 化 的 机 制

这 个 机 制 认 为 mRNA 转录 的 终止 是 通过 前 导 肽 基因 的 翻译 来 调节 的 ， 因 为
在 前 导 肽 基因 中 有 两 个 相 邻 的 色 氢 酸 密码 子 ， 所 以 翻译 这 个 前 导 肽 的 能 力 必 定 对
于 tRNAI (携带 有 色 氢 酸 ) 的 浓度 是 敏感 的 。 在 前 导 序列 中 ， 除 1 区 与 2 区 互
补 ，2 区 与 3 区 互补 外 ，3 区 又 和 4 区 互补 ， 这 四 个 区 在 不 同和 条件 下 配对 情况 不
同 ， 当 培养 基 中 色 氨 酸 的 浓度 很 低 时 ， 负 载 有 色 氢 酸 的 下 NAZ 也 就 少 ， 这 样 翻
译 通过 两 个 并 邻 的 色 氨 酸 密 码 子 的 速度 就 会 很 慢 。 由 于 在 原核 生物 中 ， 转 录 和 翻
译 是 偶 联 的 ， 即 mRNA 一 边 转 录 ， 核 糖 体 一 边 结 合 上 去 翻译 出 多 肽 ， 在 这 种 情
况 下 ， 在 4 区 被 转录 完成 时 ， 核 糖 体 才 进 行 到 1 区 (或 停留 在 两 个 相 邻 的 trp 密
码 子 处 )， 这 时 的 前 导 区 结构 是 2-3 配对 ，3-4 不 形成 终止 结构 ， 所 以 转录 可 继续
进行 直到 将 色 氨 酸 操 纵 子 中 的 结构 基因 全 部 转录 完 。 而 当 培 养 基 中 色 氨 酸 浓度 高
时 ， 核 糖 体 可 顺利 通过 两 个 相 邻 的 色 氢 酸 密码 子 ， 在 4 区 被 转录 之 前 ， 核 糖 体 就
到 达 2 区 ， 这 样 使 2-3 不 能 配对 ， 那 3-4 则 可 以 配对 形成 茎 环 结构 (终止 子 结构 )
使 转录 暂时 停止 ， 色 氨 酸 操纵 子 中 的 结构 基因 不 被 转录 ， 因 而 不 再 合成 色 氨 酸
(图 9-15)。 实 际 上 RNA 聚合 酶 在 弱化 子 处 的 活性 依赖 于 前 导 肽 翻译 中 核糖 体 所
处 的 位 置 (图 9-16)。

核 糠 体

现下 区

LD
上

(0

图 9-15 trp 操纵 子 中 弱化 机 制 模型

.274 .

*- ro

:的 呢 ? 下 面 我 们 将 举 几 个 具体 的 实验 来 说

大 肠 杆 菌 和 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 中 已 陆续
发 现 不 少 操纵 子 都 具有 弱化 现象 。 从 前 导
区 内 密码 顺序 可 以 看 出 它们 都 具有 假想 的
前 导 肽 ， 并 且 在 前 导 肽 中 都 富 含 该 操纵 子
合成 的 那 种 氨基 酸 ， 例 如 葵 丙 氨 酸 操纵 子
的 前 导 肽 中 有 六 个 葵 丙 所 酸 (Phe)， 组
氨 酸 操纵 子 的 前 导 肽 中 有 七 个 组 所 本
(His) 等 。 聚合 酶 解 离 和 才

色 氮 酸 操 纵 子 的 一 个 重要 特点 是 它 具
上 论 的 有 关 色 气 酸 | ea ro
操纵 子 的 基因 表达 的 调节 的 理论 是 如 何 得

明 。

五 、 色 氢 酸 操纵 子 弱 化 机 制 的

1. 弱化 作用 的 发 现

早已 知道 ， 在 大 肠 杆 菌 乳 糖 操纵 子 中
的 几 个 结构 基因 的 表达 是 通过 阻 巡 物 作用
在 转录 水 平 上 进行 调控 的 ， 在 不 同 环境 条 ”图 9-16_ 屯 .coii trp 操纵 子 前 导 区 的
件 下 ， 基 因 产 物 的 浓度 可 以 相差 数 干 倍 。 ”转录 与 前 导 肽 的 翻译 以 及 翻译 中 不 同
在 细菌 的 合成 代谢 中 也 发 现 过 这 种 方式 。 情况 对 结构 基因 转录 的 调控
例如 色 氮 酸 操 纵 子 受阻 遏 蛋 白 的 负 控 制作 用 的 基因 表达 可 下 降 为 原来 的 1/70。
以 后 又 发 现在 色 氮 酸 操纵 子 中 还 有 另 一 种 在 转录 水 平 上 的 调控 方式 ， 它 仅 使 基因
表达 下 降 为 原 来 的 10% 一 12.$%， 这 一 种 在 转录 水 平 上 的 调控 称 为 弱化 。 弱 化
作用 最 早 是 在 色 氮 酸 操 纵 子 中 发 现 的 ， 发 现 了 有 些 现象 与 以 阻 过 蛋白 的 阻 遇 作用
为 唯一 调节 机 制 的 观点 是 不 一 致 的 。 例 如 ， 一 株 色 氢 酰 -tRNA 合成 酶 缺陷 的 大
肠 杆菌 突变 株 trpS5， 不 能 完全 阻 遏 色 氢 酸 操 纵 子 上 编码 邻 氨基 葵 甲 酸 合成 酶
(ASase) 的 下 基因 的 表达 ， 即 trpS5 突变 株 在 含有 较 高 浓度 色 氨 酸 的 培养 基 中 ，
仍 能 使 色 氨 酸 操纵 子 的 结构 基因 表达 。

trpS5 是 一 个 温度 敏感 突变 株 ， 它 所 编码 的 trp-tRNA 合成 酶 只 在 30C 时 有
活力 ， 而 在 42Y 时 便 没 有 活力 ， 也 就 是 说 在 30T 时 才能 使 色 氨 酸 转 化 为 trp-
tRNA。 比 较 野 生 型 和 突变 型 在 42C 和 30YC 中 ， 当 供应 给 色 氮 酸 时 的 ASase 比 活
的 大 小 ， 结 果 表 明 色 氢 酸 -tRNA 具有 调节 功能 (图 9-17)。

. 275 ，

己

蛋白 质 mg/ml) =

60 120
时 间 /min

ASase/ml

100 200 300 400 S00
时 间 /min

图 9-17 trpS- 和 trpS+ 在 30C 和 42 人 时 其 ASase 的 活力 比较 结果

从 图 上 可 以 看 出 trpS5 在 42Y 时 ，trp 操纵 子 中 基因 表达 增加 〈ASase 的 比
活 高 )， 在 30 时 ， 由 于 色 氨 酸 乙 酰 化 酶 有 活性 ， 可 以 形成 trp-tRNA， 因 而
ASase 比 活 低 〈trp 操纵 子 结构 基因 表达 低 )， 而 野生 型 的 在 两 种 温度 下 表达 都 差
不 多 ， 这 就 说 明了 trp-tRNA 对 色 氨 酸 操纵 子 结构 基因 的 表达 有 调控 作用 。

另 一 突变 株 的 获得 及 其 特性 的 研究 更 充分 说 明了 这 种 转录 调控 机 制 弱 化 现象
的 存在 。 在 色 氮 酸 操 纵 子 突 变 株 的 筛选 中 ， 选 到 一 株 前 导 区 直到 D 基因 缺失 的
突变 株 trpALD102)，trpALD102 在 补充 了 过 量 的 色 氨 酸 的 培养 基 上 ， 色 氮 酸
合成 酶 〈B-2) 的 活力 比 非 缺 失 株 大 8 一 10 倍 。 这 种 消 阻 遇 作 用 不 论 是 在 trpR+
或 trpR -菌株 中 都 存在 。

5

人

从 表 9-2 中 数据 可 以 清楚 地 看 出
表 9-2 ”大 肠 杆菌 两 菌株 色 氢 酸 合成 酶 活力 比较 前 导 区 的 调节 作用 。trpAED53 中 的 工
品 - 二 系 tpRY* trpR- 不 缺失 〈 弱 化 子 存在 )，trpALD1I02 中
人 17 11.8 EL 缺失 (弱化 子 缺失 )， 缺 失 前 导 区 后
APEDp (nba 二 1.82 100 的 表达 比 有 前 导 区 的 表达 要 高 8 一 10

倍 多 ， 说 明 色 氢 酸 操纵 子 中 的 酶 合成
的 调节 除 阻 遇 作 用 外 ， 还 受到 前 导 区 某 种 调节 因素 的 影响 ， 失 去 了 这 一 因素 就 失
去 了 调节 作用 ， 有 关 的 酶 便 大 量 合成 。
2. 思 化 模型 的 遗传 学 证 气
曾经 发 现 过 前 导 区 发 生 突变 的 突变 型 ， 从 表 型 变化 上 可 以 把 它们 分 为 两 类 :
276 ，

至 类 突变 使 色 氨 酸 操 纵 子 表达 下 降 ， 也 就 是 有 利于 终止 ; 另 一 类 则 使 表达 增加 。
也 就 是 解除 终止 。trpL29 是 增强 终止 的 突变 型 ， 它 的 前 导 区 内 第 29 位 核 苷 酸 由
原来 的 G 变 为 A，…… AUG…… 一 ……AUA……，AUG 是 前 导 肽 的 起 始 密码 ，

过 为 AUA 后 便 不 能 起 始 翻译 ， 于 是 总 是 形成 2、3.4 稳定 的 三 级 结构 ， 从 而 终
止 增强 。 这 二 突变 型 的 邻 氨基 茶 甲 酸 合成 酶 (ASase) 活力 低 。 并 且 对 色 氨 酸 不
和 获 感 ， 即 对 色 氨 酸 饥 俄 不 能 做 出 解除 终止 的 反应 ， 这 是 由 于 前 导 肽 根本 不 能 翻译
下 去 的 缘故 。

另 一 个 增强 终止 的 突变 型 是 trpL75， 它 的 第 75 位 上 的 G 变 成 了 A。 野 生 型
75 位 上 的 G 在 RNA 链 的 2 区 内 ， 它 与 RNA 链 的 3 区 内 118 位 上 的 C 可 以 形成

几 气 键 ， 当 G 变 为 A 后 便 可 减弱 2 区 和 3 区 成 蕉 环 能 力 ， 于 是 导致 终止 增强 ，tr-

av

5

5L75 对 色 氢 酸 饥 饿 同样 不 能 作出 反应 。

trpL29 和 trpL75 经 再 次 突变 可 以 得 到 回复 子 ， 回 复 子 有 两 种 类 型 : 一 类 是

目 真正 的 回复 突变 。 例 如 trpL29 中 的 A 重新 变 为 野生 型 中 的 G; 另 一 类 则 是 在 另

外 位 置 上 的 核 苷 酸 又 发 生 了 一 次 改变 ， 这 类 突变 都 是 发 生 在 3 区 和 4 区 ， 或 者 3-
端的 一 串 U 上 ， 例 如 双 突 变型 tpLG-~>C trpL117AC 和 trpL29G->A trpL131G-~~>

同 记 等， 前 者 是 117 位 上 缺失 了 C， 后 者 是 131 位 上 G->C， 这 两 种 变化 都 不 利于 3
时 区 和 4 区 形成 稳定 的 二 级 结构 ， 从 而 使 终止 解除 。 这 两 株 回 复 型 的 ASase 活力 都

比 trpL29 为 高 ， 此 外 还 找到 一 株 AtrpLC1419， 它 缺失 了 3“ 端 的 四 个 U， 也 导致

月 动 记 暂停 弱化 子
在 启动 子 处 ~< 王 >
聚合 酶 起 始 |
聚合 酶 在 Asseea =GeercocSRTecmocCDDRCCeECSmDee
90bp 处 暂停

图 9-18 色 氨 酸 操纵 子 转录 调控 (包括 阻 遇 -操纵 和 弱化 子 )
， 277 ，

终止 解除 ， 说 明 3 端 U 对 转录 终止 起 一 定 作 用 。 细 菌 通过 弱化 作用 辅助 阻 遏 作用
的 不 足 ， 阻 遇 作 用 只 能 使 转录 不 起 始 ， 对 于 已 经 起 始 的 转录 ; 则 只 能 通过 弱化 作用
而 使 之 中 途 停顿 下 来 。 阻 过 作用 的 讯号 是 细胞 内 色 氨 酸 的 多 少 ; 弱化 作用 的 讯号 则
是 细胞 内 载 有 色 氮 酸 的 tRNA 的 多 少 。 它 通过 前 导 肽 的 翻译 来 控制 转录 的 进行 ， 在
细菌 细胞 内 这 两 种 作用 相辅相成 ， 体 现 着 生物 体内 精细 的 调控 作用 (图 9-18)。

第 四 节 入 噬菌体 基因 表达 的 调节

前 面 讨论 的 启动 子 和 终止 子 转录 的 控制 可 以 说 是 一 种 固定 的 控制 装置 ， 即 转
录 的 起 始 和 终止 要 求 DNA 上 有 某 种 特定 的 结构 ， 而 这 种 结构 的 功能 不 受 环境 条
件 的 影响 。 弱 化 子 则 既 有 像 终 止 子 那样 固定 的 结构 ， 又 由 于 生理 条 件 的 变化 而 改
变 结构 ， 从 而 行使 它 的 转录 调节 功能 。 乳 糖 操纵 子 受 阻 遏 物 的 调节 是 环境 因素 在
转录 水 平 上 调节 的 典型 例子 。 和 只 菌 体 的 转录 则 是 更 为 复杂 的 调控 体系 ， 因 为 它
和 入 叹 菌 体 的 裂解 途径 和 溶 源 化 途径 的 选择 密切 相关 ， 而 涉及 更 多 基因 的 转录 ，
它 也 是 到 现在 为 止 从 基因 转录 的 调控 角度 研究 得 最 为 深入 的 体系 。 它 与 其 他 调控
体系 最 大 的 区 别 是 : @ 抗 终止 ， 在 入 只 菌 体 中 发 现 N 基因 的 产物 N 蛋 白 能 解除
终止 子 的 终止 作用 ， 这 一 作用 称 为 抗 终止 作用 ， 入 叹 菌 体 基因 向 左 和 疝 右 转录 的
两 个 操纵 子 上 各 有 一 些 能 与 PN 作用 的 顺序 ， 即 PN 作用 部 位 〈(N-utilization site，
Nut)， 在 右 操纵 子 上 称 为 NutR， 在 左 操纵 子 上 的 称 NutL， 这 两 个 Nut 突变 后 ，
PN 不 能 抗 终止 。 另 外 ，Q 基因 产物 Q 蛋 日 也 起 抗 终止 作用 ; GO 叭 菌 体 处 于 浴
源 循环 时 ， 主 要 是 有 CI 基因 产生 入 阻 遏 物 ， 这 种 阻 遏 物 结合 于 左 、 右 操纵 区 ，
阻止 和 其 他 基因 的 转录 ， 同 时 根据 CI 蛋白 的 浓度 不 同 ， 它 除了 阻 遏 入 其 他 基因
转录 外 ， 还 阻止 CT 基因 本 身 的 转录 ， 这 称 为 目 调节 。

一 、 入 吃 菌 体 简 介

和 喉 菌 体 是 以 大 肠 杆菌 为 宿主 的 一 种 温和 噬菌体 ， 感 染 大 肠 杆 菌 以 后 ， 将 其
基因 组 整合 到 细菌 染色 体 上 成 为 细菌 染色 体 的 一 部 分 ， 随 着 染色 体 的 复制 而 复
制 。 这 种 整合 有 鸣 菌 体 基 因 组 的 细菌 称 为 溶 源 菌 ， 这 一 过 程 称 为 溶 源 化 途径 ， 六
源 化 细菌 一 般 不 被 同 种 鸣 菌 体 再 行 感染 ， 这 一 现象 称 为 免疫 性 。 和 鸣 菌 体感 染 往
主 后 也 可 以 不 进行 溶 源 化 途径 而 利用 细菌 细胞 内 的 养料 进行 繁殖 ， 最 终 使 宿主 裂
解 而 死亡 ， 这 一 过 程 称 为 裂解 循环 。 溶 源 化 的 细菌 受 某 些 外 界 物理 或 化 学 因素
(如 紫外 线 、 丝 裂 霉 素 C 等 ) 的 作用 原 鸣 菌 体 便 脱 离 细 菌 染 色 体 而 进行 自主 复
制 ， 于 是 细菌 有 裂解， 游离 出 大 量 的 喉 菌 体 ， 这 一 过 程 称 为 诱导 。

和 鸣 菌 体 是 一 种 中 等 大 小 的 噬菌体 ， 它 的 基因 组 是 由 双 链 线 状 DNA 分 子 组
成 。 分 子 质量 为 32.3 x 105 Da， 由 48 502bp 组 成 ， 排 列 顺序 已 全 部 定 出 。 两 条

。278 。

单 链 的 $ 端 有 突出 的 12 个 碱 基 ， 具 有 回 文 对 称 特点 ，12 个 碱 基 中 有 10 个 是 G
或 C， 可 以 牢固 地 配对 形成 环 状 (图 9-19)， 因 此 这 12 个 碱 基 称 为 黏 性 末端 ， 这
“配对 的 12bp 部 分 称 为 黏 性 位 点 。 从 入 鸣 菌 体 提取 DNA， 用 限制 性 酶 EcoRI 消化
可 得 六 个 片段 ， 如 若 先 经 退火 后 再 行 酶 切 则 只 得 五 个 片段 。 可 见 入 DNA 在 鸣 菌
体内 是 以 线形 存在 的 ， 感 染 细 菌 后 便 行 环 化 ， 然 后 再 进行 各 种 生理 活动 。 和 叭 菌
体 的 黏 性 未 端 对 于 吹 菌 体 的 感染 活性 很 重要 ， 当 把 它 切 平 后 ， 就 失去 感染 性 。

黏 性 末端

CCCGCCGCTGGA
了 55<P

7

5 了 GGCCGGCGACCT

<- 吓 一 一 -一 一 一 -一 一 一 一-

人)

图 9-19 入 叭 菌 体 DNA 的 环 化

二 、 入 噬菌体 基因 组

入 鸣 菌 体 基 因 组 上 大 约 有 35 一 40 个 为 蛋白 质 编码 的 基因 ， 另 外 还 有 一 些 识
别 位 点 。 大 多 数 蛋 白 已 被 纯化 ， 有 些 已 被 测 出 顺序 ， 和 基因 调控 通过 转录 进行 ，
与 调控 有 关 的 基因 在 基因 组 上 比较 集中 。 在 大 肠 杆菌 中 一 个 操纵 子 便 成 为 一 个 转
录 单 位 ， 每 一 个 操纵 子 中 包括 功能 上 密切 相关 的 几 个 基因 ; 入 的 一 个 转录 单位 则
包括 功能 上 并 不 直接 相关 的 更 多 基因 。 和 的 转录 调控 不 但 包括 起 始 和 终止 ， 而 且
还 包括 和 裂解 途径 或 溶 源 途 径 有 关 的 两 种 途径 的 选择 (图 9-20)。

从 图 9-20 中 可 以 看 到 入 基因 组 分 四 大 基因 簇 ， 与 调节 控制 有 关 的 调节 区
(regulation); 与 重组 有 关 的 区 域 (recombination); 与 复制 有 关 的 复制 区 (repli-
cation) 和 结构 基因 区 (包括 : 头 、 尾 、 装 配 和 裂解 有 关 的 基因 )。

入 基因 组 上 有 三 个 调节 基因 ，N\、Cro 和 Q，N 蛋白 抗 终止 子 tL1、tR1 和
tR2; Q 蛋白 抗 终止 子 慌 4; Cro 蛋白 对 CI 和 Cro 基因 的 转录 起 负 调 控 作 用 。

与 溶 源 化 有 关 的 有 三 个 基因 ，CI、CI 和 CIT，CIII 蛋白 使 CII 蛋白 稳定 ，

5 区，

9-20 入 鸣 菌 体 基 因 组

CIICIII 蛋白 能 使 CT 基因 启 始 转录 ，CI 蛋白 是 入 阻 过 物 能 使 入 的 复制 成 熟 和 裂
解 等 有 关 基 因 都 不 转录 ， 使 入 鸣 菌 体 处 于 溶 源 状态 。

重组 区 基因 主管 和 的 整合 和 割 离 ，zis 编码 割 离 酶 ，;inz 编码 整合 酶 ， 整 合
酶 作用 位 点 在 a 刀 ， 作 用 是 打 断 此 处 的 DNA 链 。

入 鸣 菌 体 基因 组 有 六 个 启动 子 ，Pr 、PRI 分 别 负责 启动 向 左 向 右 的 转录 ,
PFE、Pw 是 转录 CT 基因 的 两 个 启动 子 ，Pr 主管 建立 溶 源 ，Pw 主管 维持 溶 源 ，
Pr 的 启动 需要 CII、CIII 蛋白 ， 疡 启动 转录 int 基因 ，P 的 起 始 也 需要 CII/
CIII 蛋白 , PR2 (或 PR ) 是 入 最 强 的 启动 子 ， 负 责 后 期 一 切 基因 的 转录 。 疡 、
PrF、Py、P/ 是 启动 左 向 转录 ， 而 PRI1、PR2 则 启动 右 向 转录 (图 9-21)。

If XI1S

tLL nutL PL oOL OoR PR nueRtRIl tR2 银 3 PR2 人 让 4
L1 R1 (qub)
-号 ~-~~-- 一 ~-~~---------- 一 -一 一 一 一 一 > 一 一 一 一------ 一 -一 一
本 2
L2 R2
R3 R4
一 一 > 一 -一 -一 ---- 人
一人 一 一-

图 9-21 入 鸣 菌 体 调 控 区
三 、 和 喉 菌 体感 染 宿 主 后 的 转录 次 序

入 吹 菌 体 没 有 编码 RNA 聚合 酶 的 基因 ， 它 借用 宿主 的 酶 合成 RNA。 在 入 噬
280 ，

| 菌 体 的 转录 中 ， 宿 主 的 RNA 聚合 酶 也 被 修饰 了 ， 这 种 修饰 不 是 为 了 去 识别 噬 菌
， 体 的 启动 子 ， 而 是 修饰 后 使 RNA 聚合 酶 能 抗 终止 ， 事 实 上 入 鸣 菌 体 晚期 mRNA

的 合成 被 延迟 的 主要 原因 就 是 转录 翻译 一 种 抗 终止 蛋白 需要 时 间 ( 鸣 菌 体 裂 解
循环 需要 4Smin， 而 T7 只 需要 22 一 2Smin， 和 这样 长 的 生活 周期 反映 了 入 鸣 菌 体
更 换 生 活 周期 所 需要 的 复杂 的 调节 途径 )， 和 基因 转录 从 两 条 链 向 不 同 的 方向 进
行 ， 向 左 转录 的 一 条 链 为 工 链 ， 向 右 转录 的 一 条 链 称 为 R 链 。 和 基因 组 由 若干 个
操纵 子 所 组 成 ， 根 据 各 个 操纵 子 转录 的 先后 可 把 转录 分 为 三 个 期 。L1 和 R1 为
早期 转录 产物 ， 它 们 分 别 由 左右 两 个 操纵 子 上 的 左 启动 子 (Pi ) 和 右 启 动 子
(PR) 所 启动 ，RI1 和 LI 的 mRNA 主要 分 别 译 出 调节 蛋白 Cro 和 由 N 基因 编码
的 N 蛋 白 (PN)。RI 和 LI1 分 别 在 终止 子 tR1 和 tLI1 上 停止 转录 ， 但 由 于 有 PN
的 出 现 ， 它 的 抗 终止 功能 可 以 使 R1 和 LI1 继续 转录 ， 形 成 R2 和 L2 的 mRNA，
翻译 后 分 别 产 生 功 能 上 与 CI 蛋白 密切 相关 的 CII 和 CIII 蛋白 以 及 DNA 复制 必
需 的 O 及 了 蛋白 ， 转 录 继 续 进 行 达到 终止 子 tR2 时 也 并 不 终止 。 因 为 PN 蛋白 对
良 2 也 有 抗 终止 作用 ， 转 录 最 后 进行 到 R3， 翻 译 出 Q 蛋白 ，R2、L2 和 .Ra3 便 是

这 一 阶段 一 一 晚 早 期 转录 的 转录 产物 。 第 三 阶段 即 晚期 转录 ， 从 启动 子 PR2 开

始 转录 首先 到 达 终 止 子 疏 4， 由 于 Q 蛋白 对 它 的 抗 终止 作用 ， 转 录 继 续 进 行 。 使
基因 组 上 头 部 蛋白 ， 尾 部 蛋白 ， 与 装配 、 有 解 有 关 的 基因 全 部 表达 。

四 、 入 噬菌体 的 调控 区

和 叭 菌 体 基 因 组 内 与 调控 有 关 的 基因 或 位 点 集中 在 CIII 和 CII 之 间 范 围 内 ，
这 一 区 域 也 称 为 调控 区 。 调 控 区 内 共有 四 个 启动 子 : 右 启动 子 PR 、 左 启动 子 忆
和 另外 两 个 启动 向 左 转录 的 启动 子 PE 和 Pw。

从 PR 转录 并 经 翻译 得 到 Cro 蛋白 和 CII 蛋白 是 决定 溶 源 化 和 裂解 的 关键 。
从 已 转录 并 经 翻译 得 到 PN 和 CIII 蛋白 ，PN 起 抗 终止 作用 ，CII 和 CIII 蛋白 起
着 激活 启动 子 Pr 的 起 始 转录 作用 。 和 感染 细菌 之 后 所 形成 的 CII 和 CIII 激活 从
Pr 开始 的 向 左 转录 (包括 CT 基因 的 转录 )，CT 基因 的 产物 是 阻 遇 物 和 蛋白 ， 它
阻止 入 的 复制 。 和 整合 到 宿主 细胞 的 染色 体 上 之 后 ， 仍 然 合成 少量 的 阻 遇 物 ， 这
一 转录 由 启动 子 Pw 所 启动 ， 事 实 上 这 是 原 鸣 菌 体 的 唯一 转录 产物 。PE 即 建 立
溶 源 化 的 意思 。Pw 即 维持 溶 源 化 的 意思 。 由 产 启动 的 转录 得 到 的 CI 蛋白 量 要
比 由 Pw 启动 得 到 的 大 $ 一 10 倍 。 这 可 能 是 由 于 Pw 中 的 Pribnovw 顺序 与 起 始 密
码 相 距 很 近 (这 种 情况 在 一 般 的 mRNA 中 很 少见 )， 因 为 缺少 了 SD 顺序 ， 从 而
翻译 的 效率 下 降 。 由 疡 起 始 转录 的 mRNA 较 长 ， 含 有 SD 顺序 ， 所 以 能 翻译 出
更 多 的 CI 产物。 这 种 调节 是 在 翻译 水 平 上 进行 的 。

72

五 、 溶 产 化 的 遗传 控制 及 入 阻 遏 物 的 发 现

我 们 已 经 知道 入 叭 菌 体 是 温和 性 噬菌体 ， 能 使 宿主 形成 溶 源 菌 ， 深 源 菌 有 免
疫 性 ， 即 溶 源 菌 有 防止 同 种 唆 菌 体 超 感染 的 能 力 ， 当 溶 源 菌 失 去 了 原 噬菌体 后 。

naenvu -dotwuhdpiwyivassv

是 由 原 噬 菌 体 引起 的 。 为 了 证 明 这 一 点 ，Jacob 和 Wollman 用 Hfr (X) 和 Fa

证 和 看 有 无 入 叭 菌 体 释放 。

OHfr (CA) xF- 释 放 100~200 个 入 噬菌体 颗粒 ， 这 一 现象 称 为 结合 子 诱导
(zygotic induction)。@OHfr (入 ) xF-” (和 ) 不 释放 吻 菌 体 ; HfrxF (入 ) 不 释放

唆 菌 体 。 从 以 上 两 种 情况 中 可 以 看 出 ， 只 要 受 体 菌 是 溶 源 菌 ， 不 管 供 体 菌 是 否 是

溶 源 菌 都 不 产生 结合 子 诱 导 ， 而 只 有 当 受 体 菌 是 非 溶 源 菌 而 供 体 菌 是 浴 源 菌 时 才

产生 结合 子 诱导 。 这 说 明 受 体 菌 中 的 原 噬菌体 不 仅 对 游离 的 和 的 超 感 染 有 免疫

性 ， 而 且 对 Htfr 供 体 菌 转移 过 来 的 原 噬 菌 体 也 有 免疫 性 。 因 此 推测 溶 源 菌 的 免疫 ，

性 是 由 于 原 噬菌体 产生 了 一 种 免疫 抑制 物 。 此 抑制 物 可 抑制 入 鸣 菌 体 的 复制 和 六

其 他 基因 的 转录 ， 因 此 认为 温和 性 只 菌 体 的 本 质 在 于 它 本 身 合成 自我 抑制 物 , 而

原 鸣 菌 体 的 诱导 是 细胞 内 的 抑制 物 降低 到 一 定 水 平 的 结果 。 因 此 那些 能 妨碍 抑制
物 合成 或 破坏 抑制 物 功能 的 因素 即 能 够 起 诱导 作用 。 以 上 实验 证 明 免疫 抑制 物 是
细胞 质 因子 ， 那 么 这 个 免疫 抑制 物 是 由 什么 基因 控制 呢 ? 要 证 明 这 个 问题 ， 需 要
选 到 不 产生 抑制 物 的 突变 株 。

早期 对 和 叭 菌 体 的 研究 主要 是 关于 叭 菌 斑 类 型 的 突变 (pladue type muta

tion)。 野 生 型 和 鸣 菌 体感 染 宿 主 细菌 后 形成 的 噬 菌 斑 是 混浊 的 ， 发 现 有 一 种 入 鸣
菌 体 的 突变 株 形成 的 鸣 菌 斑 是 清晰 的 ， 以 后 又 发 现 几 种 清晰 程度 不 同 的 入 唉 菌 体
突变 型 ， 便 分 别 用 CI、CII、CIII 来 表示 ， 经 测定 ， 它 们 的 溶 源 化 频率 和 野生 型
不 相同 :

菌 种 溶 源 化 频率
十 约 4X10-1
CI RHO
扎 开 1 了 过 10 计

CIII 1054 1071

CT 基因 突变 的 分 子 基 础 是 什么 ? 以 下 几 方 面 的 事实 说 明 CT 基因 编码 一 种 阻
过 蛋白 ， 它 的 作用 正 像 乳糖 操纵 子 的 /ac 工 基因 产物 的 作用 。

1) CT 基因 突变 后 使 宿主 细菌 不 被 溶 源 化 而 发 生 裂解 ， 说 明 CI 的 作用 是 阻
过 入 鸣 菌 体 的 活动 。CT 基因 和 大 肠 杆菌 的 zec 工 相似 。

2) CI 的 作用 不 但 阻止 已 溶 源 化 的 入 原 鸣 菌 体 的 活动 ， 也 使 超 感染 的 入 叹 菌
体 不 能 复制 (这 就 是 免疫 性 的 基础 )。 这 也 和 ec 工 产物 相似 ， 即 顺 位 反 位 都 是 显

282

性 ， 因 此 也 可 以 设想 CI 基因 也 编码 一 种 蛋白 质 。 温 度 敏 感 突变 型 的 存在 也 同样
说 明 CT 基因 产物 是 一 种 蛋白 质 。

3) 也 像 ac 基因 产物 一 样 ，CT 基因 产物 作用 在 入 鸣 菌 体 的 特定 位 置 上 。
下 列 事实 可 以 说 明 这 一 点 : 溶 源 化 细菌 对 入 鸣 菌 体 具 有 免疫 性 ， 但 是 入 imm434、
Ximm21 等 杂种 喉 菌 体感 染 时 ， 这 些 鸣 菌 体能 在 和 的 溶 源 菌 中 复制 繁殖 。 这 是 因
为 和 imnm434 和 入 imm21 的 免疫 区 已 被 434 和 21 的 免疫 区 所 代替 ， 所 以 CT 的 产
物 不 能 对 它们 发 生 阻 遏 效 应 而 得 以 复制 繁殖 ， 可 见 免疫 区 便 是 CI 蛋白 作用 的 特
定位 置 。

六、 入 哗 菌 体 的 操纵 区 和 局 动 子 结构

入 喉 菌 体 的 基因 组 上 的 左右 操纵 子 也 像 大 肠 杆 菌 的 ac 操纵 子 一 样 ， 在 结构
基因 之 前 有 启动 子 P 和 操纵 区 O， 并 且 忆 与 O 之 间 也 有 重 和 至 。 和 操纵 区 结构 与
1c 操纵 区 有 不 同 之 处 ， 入 操纵 区 有 三 个 能 和 阻 遏 物 结合 的 位 点 。 即 右 操纵 区 中
的 OR3、OR2、ORI 以 及 它们 相对 应 的 左 操纵 区 中 的 013、Or2 、O1， 如 图
9-22 所 示 。

10 1=10-20-30 一 40-5S0 -60 -70 -90 -80 -70 -60-S0 一 40-30-20-10 1 10 28
从 R, 起 始点 的 核 苷 酸 对 从 己 起 始点 的 核 苷 酸 对

图 9-22 入 鸣 菌 体 左 右 操纵 区 的 结构

每 个 结合 位 点 都 由 17bp 组 成 ， 每 个 位 点 之 间 相隔 6 一 7bp， 大 多 数 是 A/T，
两 个 操纵 区 共 六 个 结合 位 点 ， 这 六 个 结合 位 点 都 表现 有 一 定 程度 的 回 文 对 称 性 。
曾经 筛选 到 一 些 的 烈性 突变 型 ， 能 在 和 的 溶 源 菌 中 生长 繁殖 ， 这 些 点 突变 大 多
减弱 了 结合 位 点 的 回 文 对 称 性 。 看 来 操纵 区 的 回 文 对 称 性 与 阻 过 物 的 结合 是 有 关
的 。 乳 糖 操纵 子 操纵 区 也 有 一 定 程度 的 回 文 对 称 性 ;乳糖 操纵 子 或 半 乳 糖 操纵 子
上 CAP 结合 位 点 等 也 有 一 定 程度 的 对 称 性 。 下 列 是 一 个 17bp 低 聚 物 ， 是 参照 六

285 。

人 下

个 结合 位 点 人 工 合成 的 ， 它 的 特点 是 和 任何 一 个 位 点 都 不 一 样 ， 但 又 呈 绝 对 的 回 量
文 对 称 性 ， 它 和 入 阻 遏 蛋白 亲和力 最 大 。
TEATCACCSCCGGTEGATRER
ATAGTGGOGGGGAGTAT
可 见 对 称 程 度 越 大 则 亲和力 越 大 。 但 是 天 然 的 结构 不 是 绝对 的 对 称 形式 ， 可
能 是 因为 亲和力 过 大 ， 不 利于 解 离 ， 不 能 起 到 良好 的 调节 功能 。
从 入 鸣 菌 体 的 DNA 顺序 上 看 ， 它 的 启动 子 和 操纵 区 有 重 春 (图 9-22)， 有
的 Pribnovw 顺序 和 - 35 顺序 与 OR1、OR2 重 至 ，P; 的 也 一 样 ，CI 基因 的 启动
子 Pv 的 Pribnovw 顺序 和 -=- 35 顺序 则 和 OR3 、OR2 有 重 肆 ， 这 些 特点 就 构成 了 六
喉 菌 体 对 其 发 育 过 程 调 节 的 分 子 基础 。

七 、CI 蛋白 和 Cro 蛋白

CI 蛋白 也 称 阻 遇 蛋白 ， 是 一 种 酸性 蛋白 ， 由 236 个 氨基 酸 组 成 ，CI 阻 过 和 蛋 ，
白 由 两 个 相同 的 亚 基 组 成 。 它 的 碱 性 氨基 酸 只 占 10%， 大 部 分 集中 在 N 端 ，N
端 26 个 氨基 酸 中 就 有 9 个 是 赖 氨 酸 或 精 氨 酸 ， 占 N 端 氨基 酸 的 33%。 这 样 的 结 _
构 究 竟 有 什么 生物 学 意义 呢 ? 遗传 学 分 析 和 生物 化 学 分 析 都 说 明 每 个 亚 基 由 两 个
功能 不 同 的 区 (domain) 组 成 ，N 端 具 有 与 DNA 上 操纵 基因 结合 的 功能 ，C 端
具有 自身 聚合 为 二 聚 体 的 功能 。C 端的 聚合 功能 解释 了 CI 蛋白 与 三 个 结合 位 点
之 间 结 合 的 协同 作用 ， 即 当 CI 蛋白 与 一 个 位 点 结合 后 使 它 与 相 邻 位 点 的 结合 更
为 容易 。 用 足迹 法 可 以 测定 各 个 操纵 基因 结合 位 点 与 CI 蛋白 结合 时 的 相对 浓度 。
实验 结果 发 现 CI 蛋白 与 ORI 结合 能 力 最 大 ， 与 OR2 次 之 ， 与 OR3 结合 能 力 最
弱 。 当 CI 蛋白 浓度 较 低 时 ， 它 首先 与 OR1 结合 〈 同 样 也 与 Orl 结合 )， 占 据 了
PR (和 已) 的 Pribnow 顺序 ， 因 而 阻止 Pe 〈 和 已 ) 启动 转录 ， 当 CI 蛋白 浓度
较 高 时 除 与 ORI 〈OT) 结合 外 ， 还 与 OA2 (和 Or2) 结合 ， 此 时 能 促进 P; 记
动 的 转录 (转录 CT 基因 )， 而 当 CI 蛋白 泊 度 很 高 时 ，CI 蛋白 除 与 ORI 、OR2
结合 外 ， 还 与 OR3 结合 ， 这 时 CI 蛋白 占据 了 Pw 的 Pribnow 顺序 和 -35 区， 因
此 阻止 CT 基因 本 身 的 转录 ， 这 就 是 自 调控 (图 9-23)。

Cro 蛋白 于 1976 年 被 分 离 获得 ， 两 年 后 测定 了 它 的 一 级 结构 ， 它 由 66 个 氨
基 酸 组 成 ，Cro 蛋白 与 CI 蛋白 在 一 级 结构 上 无 明显 的 同 源 性 ， 也 不 分 为 两 个 功
能 区 ， 可 是 功能 上 与 -CI 蛋白 非常 相似 ， 也 是 以 二 聚 体形 式 与 操纵 区 结合 ，Cro
蛋白 和 三 个 结合 位 点 的 结合 能 力也 不 同 ， 它 和 三 个 结合 位 点 的 结合 能 力 与 CI 蛋
白 与 三 个 结合 位 点 的 结合 能 力 恰好 相反 ，Cro 蛋白 与 OR3 结合 能 力 最 强 导 与
OR2 次 之 ， 与 OR1 结合 能 力 最 小 。Cro 蛋白 浓度 低 时 它 首 先 同 OR3 结合 阻止 CT
基因 转录 ， 浓 度 较 高 时 与 OR2 结合 除 阻 止 CI 基因 转录 外 ， 对 PR 也 有 阻 过 作用 ，
浓度 高 时 ， 与 OR1 也 能 结合 ， 阻 止 Pw 和 PR 启动 转录 。

， 284 ，

Pi 有 活性 : P, 无 活性
总

忆
PDB
到 尖 国 以 有 区 有 r 让 2
和 抑制 物
P, 有 活性 : 已, 无 活性

3
了 人 一

RNA 聚合 酶 全 酶
已 、P， 无 活性

|
CLAN

图 9-23 入 抑制 物 与 右 操纵 区 结合 对 PR、Pw 的 活性 的 正 负 调控

应 用 融合 操纵 子 的 技术 证 明了 CI 和 蛋白 对 PR (产生 Cro 蛋白 ) 起 负 控 制作
用 ; 对 CI 本 身 有 正 控制 作用 也 有 负 控 制作 用 。Cro 蛋 白 对 CT (Puw) 和 PR
(Cro) 都 起 负 控 制作 用 。

和 噬菌体 行 溶 源 循环 时 ，XDNA 整合 到 和 宿主 染色 体 上 ， 随 染色 体 复制 而 复制 ，
当 溶 源 菌 受 紫 外 线 或 丝 裂 霉 素 C 处 理 后 ， 激 活 recA 蛋白 ，recA 蛋白 具有 蛋白 水
解 酶 活性 ， 分 解 CI 和 蛋白。 将 CI 蛋白 在 第 111 和 112 氨基 酸 之 间 打 断 ，C 末端 先
从 DNA 上 掉 下 来 ， 从 而 N 端 也 掉 下 来 ， 于 是 RNA 聚合 酶 便 有 机 会 与 Cro 基因
的 启动 子 结合 ， 使 转录 向 裂解 方向 进行 。

和 鸣 菌 体感 染 大 肠 杆菌 后 ， 转 录 首 先 从 PP 和 PR 启动 ， 产 生 N 蛋白 和 Cro 蛋
自 ，N 蛋白 可 抗 从 Pr 和 PR 起 始 的 终止 [图 9-24 (a)]。N 蛋白 的 浓度 足够 时 ，
可 以 进行 合成 更 长 的 RNA [图 9-24 (b)]。
突变 研究 表明 ，N 蛋白 抗 终止 的 作用 专 一 序列 (被 称 为 nut N-utilization )，

位 于 启动 子 和 终止 子 之 间 。
分 离 到 一 些 下 .coli 突变 株 ， 不 能 提供 由 N 蛋 上 引 起 的 抗 终止 ， 进 而 限制 入
.285 ，

(a) 位 Hz 位 点

12S

一 一 一 一 一 -一 一 一 一 ~
(1000 碱 基 ) (500 碱 基 )
全 蛋白 质 蛋白 质
N 蛋白 诱导
(b) 解除 忆 处 的 抗 终止 解除 胡 处 的
终止 终止

和 碱 基 8 碱 基
图 9-24 从 入 鸣 菌 体 基因 组 的 P; 和 PR 的 转录

鸣 菌 体 的 感染 ， 从 中 鉴定 出 几 种 细胞 蛋白 质 ， 或 者 叫 N 利用 底 物 (Nus)， 是 N
功能 所 必需 的 。

这 些 蛋 白质 定名 为 Nus A、Nus B、Nus 下 和 Nus G， 这 些 蛋 白 在 被 感染 的 细
胞 中 具有 其 他 一 些 功能 。Nus A 是 一 种 延伸 因子 ， 而 Nus 下 (也 称 为 SI10) 是
已 .colii 核糖 体 小 亚 基 的 一 个 蛋白 质 ， 这 些 细胞 内 蛋 日 质 的 功能 共同 作用 防止 核
糖 体 RNA 基因 转录 的 终止 。

广 NusB,NusG,S10

闻

RNA ~ 。

图 9-25 由 入 叭 菌 体 N 蛋白 和 瓦 .co 细胞 蛋白 的 抗 终止

蛋 自 质 结 合 研 究 表明 ，N 蛋白 的 功能 是 结合 在 新 生 RNA Nut 位 点 上 ，
Nut 位 点 含 两 个 N 结合 oraigpeioe
“ 基 的 线性 顺序 叫 box A， 它 与 细胞 内 蛋白 NusB 和 S10 相互 作用 。N 介 导 的 终止
模型 见 图 9-25。N 蛋白 结合 到 新 生 RNA 上 nut 的 box B， 然 后 与 和 RNA 聚合 酶
复合 在 一 起 的 Nus A 相互 作用 。 一 旦 N 和 Nus A 相互 作用 ，Nus B、Nus G 和
S10 迅速 结合 ， 产 生 一 个 稳定 的 抗 终止 复合 物 。 该 复合 物 可 沿 DNA 移动 数 千
bp， 抗 依赖 于 e 和 不 依赖 于 o 的 终止 ， 使 转录 继续 进行 。

精致 的 抗 终止 机 制 ， 雇 用 一 个 多 蛋白 复合 物 ， 人 允许 入 鸣 菌 体 调 节 从 P 和 PR
转录 的 基因 的 暂时 表达 。 这 种 调控 机 制 和 其 他 一 些 机 制 一 起 允许 入 经 历 裂解 或 溶
源 感 染 (图 9-26)。 这 个 例子 也 阐明 基因 表达 可 通过 控制 转录 单位 的 过 早 终 止 来
调节 。

共和

裂解 复制 已 coi 染色 体

ET
7 入 原 噬菌体
吓 ( 赵 早期 基因 转录 上 Se
o 和 翻译

汉
0L 斩 )
AAA 达

etc.
子 人 噬菌体 装配 并 从
及 外 裂解 的 细胞 中 释放

图 9-26 入 噬 菌 感染 下 .col 后 经 历 裂解 复制 或 溶 源 化

Cro 蛋白 可 和 左右 操纵 区 结合 〈 由 于 浓度 低 只 结合 于 OR3) 对 P 和 PR 有 弱

.287 ，

的 阻 遏 作用 ， 由 N 蛋白 的 作用 使 转录 继续 前 进 产生 CII、CIIIL O、P、Q 蛋白 ，
CIICIII 能 激活 PE 和 也 启动 子 ， 转 录 后 产生 CI 蛋白 和 整合 酶 ， 而 Q 和 蛋白 量 还
很 少 ， 不 足以 启动 PR2 完成 晚期 转录 ，O、P 蛋白 的 量 也 只 能 供 NDNA 复制 三
次 。 由 于 Pz 转录 产生 CI 蛋白 结合 于 左右 操纵 区 阻止 入 其 他 基因 转录 ， 疡 ; 转录

产生 的 整合 酶 使 和 基因 组 整合 到 宿主 染色 体 上 而 建立 溶 源 。 溶 源 建 立 之 后 ， CI ，
基因 从 Pw 开始 转录 ， 通 过 CI 蛋 日 对 它 自 身 的 自 调 控 作 用 ， 从 而 保持 细胞 内 的 |

CI 蛋白 浓度 在 10 一 20 个 分 子 ， 使 其 维持 溶 源 状态 。

当 环 境 因素 及 和 宿主 的 遗传 背景 或 目前 尚 不 清楚 的 因素 使 CII 蛋白 比 Cro 蛋 自
相对 浓度 低 时 ，Cro 蛋白 阻止 CI 转录 ， 不 产生 入 阻 遇 物 ， 使 入 的 其 他 基因 可 以
转录 ， 当 产生 的 Q 蛋白 的 量 达 到 使 PR2 转录 完成 时 ， 进 行 裂解 循环 途径 。

第 五 六 _DNA 重 排 对 基因 表达 的 调节

鼠 伤寒 沙门 氏 菌 〈Saznpzorella ty 加 zxriu7 ) 有 两 种 葛 毛 抗原 〈 即 两 种 血清

型 )， 这 是 由 两 个 基因 编码 的 。 这 两 个 基因 叫做 责 和 了 ， 最 早 发 现 〈1922 年 )
由 单一 菌落 来 的 鼠 伤寒 沙门 氏 菌 的 群体 常 能 被 两 种 葛 毛 抗 血清 所 凝集 。 从 中 分 离
的 单个 菌落 能 被 一 种 抗 血 清 所 凝集 ， 可 是 在 培养 过 程 中 又 出 现 少数 能 被 另 一 种 抗
血清 所 凝集 的 菌落 。 后 者 在 培养 过 程 中 又 出 现 少数 前 者 。 这 种 现象 叫做 鞭毛 相 转

变 ， 它 不 能 用 基因 突变 来 解释 ， 主 要 因为 每 一 种 沙门 氏 菌 只 在 某 两 种 鞭毛 抗原 类

型 中 发 生来 回 变化 〈 而 阔 门 氏 菌 的 葛 毛 抗原 类 型 有 十 几 种 )， 而 这 种 变化 的 发 生
频率 又 很 高 (10 一 10 ， 自 然 突变 率 在 10 左右 )， 遗 传 学 研究 告诉 我 们 ， 凌
毛 基 因 有 两 个 ， 鞭 毛 抗原 类 型 就 是 由 这 两 个 鞭毛 抗原 决定 的 。 所 以 这 些 现象 可 以

(b) 克 2 转录 ， 万 1 不 转录
(a) 玫 0 不 转录 娓 ] 启动 子 抑制 物

栋
2
WA

7

SS 无 万 mRNA

图 9-27 两 种 鞭毛 抗原 基因 的 调节

2

明 纳 为 这 样 两 个 问题 : @ 一 个 细胞 中 的 两 个 基因 任何 时 候 只 有 一 个 表达 ; @ 是 什
芯 因 素 使 一 个 基因 表达 ， 又 使 另 一 个 基因 不 表达 呢 ?
下 瓦 I 基因 和 Z2 基因 在 染色 体 上 相距 很 远 ， 这 就 意味 着 必定 有 一 种 可 扩散 的
产物 在 基因 开关 中 起 作用 ， 瑟 1 基因 与 其 他 正常 基因 一 样 ， 但 到 基因 有 两 种 形
式 ， 五 2 基因 的 一 端 有 一 段 970bp 顺序 ， 这 段 970bp 有 三 个 特点 : 可 以 倒 位 ; 可
以 产生 抑制 瓦 ! 转录 的 产物 ; 带 有 三 的 启动 子 (图 9-27)。

从 图 9-27 中 可 以 看 到 ， 当 E2 一 端的 970bp 以 一 种 方向 存在 时 ， 2 转录 ，
王 2 的 mRNA 不 但 编码 2 的 抗原 而 且 编 码 互 ] 的 抑制 物 ， 因 此 当 FE2 转录 时 ，
百 ! 就 不 被 转录 。 如 果 970bp 倒 位 ， 则 2 不 转录 ，HI 可 以 被 转录 。 如 何 证 明
开动 HL1 还 是 B2 是 由 于 倒 位 引起 的 ? 提取 HIl 鞭毛 菌 DNA 和 H2 鞭毛 菌 的
DNA 一 酶 切 一 变性 一 复 性 一 电镜 观察 可 以 证 明 。

第 六 节 ， 西 格 马 因子 对 基因 表达 的 调控

通过 替换 西 格 马 (sigma) 因子 (c) 可 以 控制 转录 的 起 始 。 大 肠 杆 菌 的
RNA 聚合 酶 只 有 一 种 ， 同 一 种 酶 可 以 转录 所 有 的 基因 。 这 些 基因 是 在 不 同 场合
以 不 同 水 平 表 达 的 ， 所 以 大 肠 杆 菌 RNA 聚合 酶 必须 具有 广泛 的 识别 范围 。RNA
聚合 酶 在 特定 启动 子 上 的 转录 活性 似乎 由 一 系列 的 辅助 因子 的 循环 来 调控 ， 而 酶
未 身 的 亚 基 并 不 发 生 任何 变化 。 这 种 假设 并 不 被 所 有 的 人 接受 ， 因 为 允许 RNA
聚 谷 酶 识别 某 专 一 启动 子 的 变化 将 可 以 防止 它 识别 其 他 启动 子 ， 这 将 降低 RNA
聚合 酶 的 灵活 性 。
RNA 聚合 酶 全 酶 中 的 核心 酶 主管 链 延伸 ， 而 e 因子 主管 位 点 选择 。 那 么 是
天 存在 一 种 以 上 的 e 因子 ， 每 一 种 特异 性 地 识别 不 同类 型 启动 子 中 的 一 种 ?在 正
常生 长 的 大 肠 杆 菌 中 只 有 一 种 因子。 枯草 杆菌 中 含有 多 种 特性 稍微 不 同 的 c 因
子 。 在 一 定 的 环境 中 ， 当 细胞 的 生活 方式 发 生 强烈 变化 时 ， 大 量 基因 表达 的 开关
被 打开 ， 在 这 种 情况 下 ， 枯 草 杆菌 RNA 聚合 酶 上 原 有 的 e 因子 被 具有 识别 不 同
特性 启动 子 的 e 因子 全 盘 替 换 。

枯草 杆菌 在 正常 的 营养 生长 时 ， 其 RNA 聚合 酶 的 结构 与 大 肠 杆 菌 的 相同 即
8BB'。 其 ec 因子 的 分 子 质量 为 Ss 000U， 称 为 o"， 像 大 肠 杆 菌 中 一 样 ， 以 同样
的 标准 识别 启动 子 。 酶 的 区 别 在 于 它 含 不 同 的 因子 ， 其 数目 很 少 ， 这 些 e 因子
用 om 表示 ，“00” 指 示 这 种 e 因子 的 分 子 质量 ， 这 些 改变 了 的 酶 识别 与 主要 酶
wm 有 'o5 不 同 的 启动 子 。

在 某 种 状态 如 鸣 菌 体感 染 期 间 ，c 因子 的 替换 可 以 引起 从 一 套 基因 的 表达 转
换 成 另 一 套 基因 的 表达 。 裂 解 感染 是 噬菌体 接管 一 个 细菌 并 摧毁 它 ， 最 后 产生 更
多 的 叭 菌 体 的 过 程 。 在 这 种 情况 下 ， 只 菌 体 的 发 育 包括 转录 途径 的 转变 。 在 大 肠
杆菌 中 ， 通 过 合成 由 噬菌体 编码 的 RNA 聚合 酶 或 者 合成 由 叭 菌 体 编码 的 辅助 因

5 治国 全 有 ，

子 控制 大 肠 杆 菌 的 RNA 聚合 酶 来 完成 这 种 转变 。 在 枯草 杆菌 被 噬菌体 SPOL 感
染 期 间 ， 产 生 两 种 新 的 c 因子 。SPOI1 的 感染 史 经 过 3 个 阶段 的 基因 表达 。 刚 感
染 时 ， 鸣 菌 体 的 早期 基因 被 转录 ; 感染 4 一 Smin 后 ， 早 期 基因 停止 转录 而 中 期 基
因 开始 转录 ; 当 感 染 8 一 12min 时 ， 中 期 基因 的 转录 被 晚期 基因 的 转录 所 代 蔡 ;

早期 基因 的 转录 由 宿主 的 全 酶 来 进行 ， 这 些 基 因 的 启动 区 与 宿主 的 基本 无 区
别 ， 它 们 的 启动 子 都 具有 被 RNA 聚合 酶 vBpB'c5 识 别 的 固有 能 力 。

早期 基因 的 转录 转变 到 中 期 、 晚 期 基因 的 转录 需要 喉 菌 体 基 因 的 表达 ， 三 个
调节 基因 分 别 定 为 28、33 和 34， 它 们 控制 转录 的 进程 ， 如 图 9-28 所 示 。 调 节
的 途径 造成 一 个 级 联 ， 在 这 个 过 程 中 ， 宿 主 的 酶 转录 早期 基因 ， 早 期 基因 产物 对
中 期 转录 是 必需 的 ， 而 两 个 中 期 基因 编码 的 产物 对 于 晚期 基因 转录 又 是 需要 的 。

只 菌 体 的 早期 基因
具有 与 枯草 杆菌 基
因 相 同 的 启动 子

-二 -一 一 一 -一 -- 一 ---

早期 基因 28 编码
f 7 好 一 种 调节 蛋白
5p2# 替换 核心 酶
上 的 as

gps 核心 酶 复合 物 只
"YYY | 转录 噬菌体 中 期 基因
，

中 期 基因 33 和 34 编

本 oOQ
gp2” 和 gp 蔡 换
核心 酶 上 的 gpzs

图 9-28 两 种 不 同 的 c 因子 控制 PSO1L 的 转录

早期 基因 28 的 突变 株 中 的 中 期 基因 不 被 转录 。 基 因 28 的 产物 是 一 种 分 子
”质量 为 26 000Da 的 蛋白 质 〈( 称 为 gp 罗 )， 它 蔡 换 核心 酶 上 的 ec 因子 ， 这 种 替换 使
得 早期 基因 的 表达 转换 到 中 期 基因 的 表达 。 蔡 换 后 的 新 的 全 酶 不 再 转录 和 宿主 的 基
因 ， 而 特异 地 转录 鸣 菌 体 的 中 期 基因 。gp” 如 何 替 换 c 而且 宿 主 的 e 因子 发 生 了
什么 变化 目前 还 不 清楚 ， 也 许 gp% 对 核心 酶 有 更 大 的 亲和力 。

两 个 中 期 基因 与 下 一 步 的 转录 相关 联 ， 无 论 是 基因 33 或 者 是 基因 34 发 生
突变 ， 都 能 关闭 晚期 基因 的 转录 。 这 两 个 基因 产物 分 别 是 分 子 质 量 为 13 000Da
和 24 000Da 的 蛋白 质 。 这 些 蛋 白质 再 次 替换 核心 酶 上 的 gp8。 目 前 还 不 知道
5p23 和 gp?4 是 如 何 替 换 gp2& (或 残存 的 宿主 o5) 的 ， 但 它们 一 旦 和 核心 酶 结合 ，
就 能 只 在 晚期 基因 的 启动 子 处 启 始 转录 。

6 因子 的 替换 有 双重 重要 意义 ， 亚 基 的 每 次 改变 ，RNA 聚合 酶 能 识别 新 一
类 基因 而 不 再 识别 原先 的 一 类 基因 ; 这 些 开 关 构 成 RNA 聚合 酶 活性 的 改变 。 也
许 ， 实 际 上 所 有 的 核心 酶 只 和 某 一 时 刻 的 ec 因子 形成 聚合 体形 式 ， 而 且 这 一 改变
是 不 可 逆 的 。

有 些 细菌 在 孢子 形成 期 间 利 用 新 的 c 因子 。 在 营养 生长 期 末期 ， 由 于 培养 基
中 的 营养 被 耗 尽 而 对 数 生长 停止 ， 这 样 就 激发 钨 子 形成 。

抱 子 形成 包含 细菌 生物 合成 活性 的 剧烈 改变 ， 与 许多 基因 相关 联 。 基 础 水 平
的 调控 是 在 转录 中 进行 。 一 些 营养 生长 期 有 功能 的 基因 在 孢子 形成 期 间 被 关闭 ，
但 大 部 分 继续 表达 。 在 驳 子 形成 期 末期 ， 大 约 40% 的 细菌 mRNA 是 孢子 形成 特
有 的 。

孢子 形成 需要 的 特有 基因 ， 可 通过 SPO 突变 被 鉴别 。 这 种 突变 允许 正常 的
营养 生长 ， 但 不 形成 孢子 。 这 些 不 产生 苞 子 的 突变 型 根据 其 封闭 孢子 形成 的 不 同
阶段 可 被 分 为 SPO0 (sporulation 不 能 开始 )、SPOI、SPOII 等 。 一 些 是 酶 或 和 抱 子
形成 所 必需 的 结构 蛋白 组 成 型 突变 ， 但 另 一 些 突变 则 被 证 明 是 调节 转换 生活 方式
有 关 的 基因 。 长 期 以 来 ， 人 们 一 直 想 弄 清楚 在 孢子 形成 期 间 的 这 些 变化 以 及 这 些
变化 的 机 制 ， 但 目前 只 知道 这 些 改变 发 生 在 早期 ， 且 是 酶 的 专 一 性 改变 的 结果 。

新 形式 的 RNA 聚合 酶 在 孢子 形成 期 变 得 有 活性 ， 它 们 含有 营养 期 细胞 同样
的 核心 酶 但 含有 与 o 5 不同 的 ec 因子 。 这 些 变化 如 图 9-29 所 示 。

在 移 子 形成 开始 ，o 代替 o5， 在 "的 指引 下 ，RNA 聚合 酶 转录 孢子 形成
的 第 一 套 基因 而 停止 转录 营养 期 早期 已 开始 转录 的 基因 。

另 一 个 5 因子 咏 存 在 于 营养 细胞 里 ， 在 孢子 形成 早期 变 得 有 活性 ， 它 再 次
指导 RNA 聚合 酶 从 特定 的 启动 子 转录 。

在 移 子 形成 开始 后 大 约 4h 左右 在 细胞 中 出 现 另 一 种 含 喧 的 新 的 RNA 聚合
酶 ， 它 允许 转录 另 一 套 基 因 。o2? 存 在 于 营养 细胞 中 ， 它 可 能 是 在 o 指导 下 形成
的 移 子 形成 基因 产物 之 一 ， 然 而 o9 如 何 能 替换 o? "或 o 仍 不 可 思议 。

吃 是 和 营养 细胞 中 的 核心 酶 联系 在 一 起 的 一 个 因子 ， 它 与 核心 酶 组 成 RNA

5 外，

枯草 杆菌 营养 生长
其 所 有 基因 被 结合
as 的 全 酶 转录

孢子 化 前

a? 代替 核心 酶 上 的 as

ca? 核心 酶 复
合 物 能 转录 早
期 孢子 化 基因

一 个 早期 SPO 基因
产物 是 c2?， 它 代替
核心 酶 上 的 cy

孢子 化 4h 后 ca2- 核心 酶 复合 物 能

转录 中 期 孢子 化 基因

图 9-29 通过 改变 e 因子 控制 RNA 聚合 酶 的 启 始 专 一 性

聚合 酶 ， 这 种 形式 只 占 全 部 酶 活性 的 很 少 部 分 ， 当 移 子 形成 开始 时 ， 这 种 形式 的
酶 的 活动 就 停止 了 。 在 某 些 SPOI0 突变 株 的 营养 细胞 中 ， 这 种 因子 不 被 转录 。o
可 能 是 某 些 信号 系统 的 一 部 分 。 有 的 基因 产物 能 对 环境 中 的 营养 缺乏 作出 反应 并
引起 孢子 形成 过 程 开 始 ， 思 与 上 述 的 基因 表达 有 关 。 因 此 ， 和 孢子 形 成 过 程 可 能
受 一 种 模式 的 控制 ， 在 这 种 模式 中 ，c 因子 相继 被 激活 ， 每 种 c 因子 指导 一 套 基
因 产 物 的 合成 。 当 一 种 e 因子 变 成 有 活性 的 时 候 ， 老 的 e 因子 就 被 它 所 代替 ， 这
样 ，c 因子 的 转换 可 以 使 基因 开启 和 关闭 。 每 种 5 因子 安排 在 何 时 出 现 ， 取 决 手
这 种 因子 作用 的 那 套间 基 因 何 时 表达 。 这 种 5 因子 的 数量 多 少 也 与 它 的 靶 基因
292 ，

的 表达 水 平 有 关 。

什么 因素 使 得 不 同 的 ec 因子 识别 不 同类 型 的 启动 子 呢 ? 具有 咏 的 酶 识别 像
吾 .coli 中 那样 的 具有 同样 的 -35 区 和 - 10 区 的 启动 子 ， 而 这 种 一 致 性 序列 在 其
他 的 c 因子 识别 的 启动 子 中 没有 发 现 。 也 许 每 套 启动 子 有 它 自己 特征 的 一 致 性 。
目前 还 没有 充分 地 研究 每 个 ec 因子 的 靶 启 动 子 的 特征 来 归纳 出 所 有 的 一 致 序列 。
一 些 可 能 的 保守 顺序 列 入 表 9-3。

表 9-3 ”枯草 杆菌 中 每 个 c 因子 可 能 作用 的 位 点

Sigma 因子 -35 区 =-10 区
呈 营养 体 TTGACA TATAAT
7 孢子 形成 中 利用 AGGNTTT GGNATTGNT
孢子 形成 中 利用 AAATC TANTGTTNTA
a29 孢子 形成 中 合成 TINAAA CATATT
028 抱 子 形成 中 不 利用 CTNAAA CCGATAT
gp28 SPO 工 中 期 表达 AGGAGA TITNTTT
33 一 34 SPO 工 晚期 表达 CGTTAGA GATATT

1

每 一 种 酶 识别 的 启动 子 都 有 一 个 明显 特征 : 它们 的 大 小 和 上 距离 转录 起 始 位 点
的 相对 位 置 是 相同 的 。 可 以 看 出 它们 保守 顺序 只 围绕 -35 和 -10 区 这 个 中 心 。
=10 区 的 一 致 顺序 通常 富 含 AT，-35 区 的 一 致 顺序 也 表现 出 这 种 倾向 。 目 前
还 不 知道 不 同 的 c 因子 指导 识别 不 同 启 动 子 的 能 力 到 底 有 多 大 普遍 性 ， 这 一 点 在
大 肠 杆 菌 中 是 罕见 的 ， 但 在 枯草 芽孢 杆菌 中 则 具有 这 种 特征 。 关 于 通过 c 因子 替
换 改 变 转录 专 一 性 在 一 些 情况 中 已 被 证 明 ， 但 在 有 些 情 况 下 又 显得 较 复杂 。 所 以
目前 还 不 能 下 结论 说 ec 因子 可 单独 起 选择 启动 子 的 作用 。

第 七 他” 转录 后 的 调控
一 、 翻 译 水 平 上 的 调控

翻译 水 平 上 的 调控 机 制 大 致 可 分 两 种 类 型 。 一 种 为 固定 装置 式 调 控 (不 受 环
境 影 响 )， 即 这 种 调控 机 制 早已 包含 在 DNA 顺序 内 ， 如 稀有 密码 子 的 调控 和 重
登基 因 的 调控 ; 另 一 种 称 为 非 固 定 装置 式 的 调控 〈( 受 环境 影响 )， 这 种 调控 并 不
直接 与 DNA 顺序 有 关 ， 如 ， 真 核 mRNA 的 poly (A) 长 短 对 翻译 的 调控 ， 血 红
素 对 球 蛋 日 合成 的 调控 等 。

1. 稀有 密码 子 和 翻译 调控

大 肠 杆菌 DNA 复制 时 冈 崎 片段 之 前 的 引物 RNA 是 由 dmna G 基因 编码 的 引
293 ，

物 酶 催化 合成 的 ， 这 种 酶 在 细胞 内 所 需要 的 量 不 多 ， 如 果 细 胞 内 引物 酶 太 多 还 将
导致 细胞 死亡 。 在 大 肠 杆 菌 基 因 组 上 dzaG、 rboD (编码 RNA 聚合 酶 c 亚 基 ) |
和 rzasU (编码 核糖 体 30S 上 的 S21 和 蛋白) 同属 一 个 操纵 子 ， 但 奇怪 的 是 三 个 基
因 产 物 的 量 却 大 不 相同 ，dmaG 的 产物 仅 50 拷贝 ，rzoD 为 2800 拷贝 ，rzxsU 则
达 40 000 拷贝 之 多 ， 细 胞 通过 翻译 的 调控 ， 解 决 了 这 个 问题 。

考察 dnaG 的 密码 发 现 其 中 含有 不 少 和 有 密码 子 ， 也 就 是 说 这 些 密码 子 在 其
他 基因 中 利用 频率 很 低 ， 而 在 dnaG 中 却 很 高 ， 分 别 计算 出 下 .co 中 25 种 非 调
节 和 蛋白 和 dnaG、zrpoD 的 密码 中 64 种 密码 子 的 利用 频率 ， 可 以 看 出 dna G 与 其 他
两 类 有 明显 不 同 。 例 如 三 种 He 密码 子 中 在 25 种 非 调节 蛋白 中 共有 405 个 ， 其 中
AUU 占 37%、AUC 占 62%、AUA 占 1%; 三 种 IEe 密码 子 在 dna G 中 共 22 个 ，
其 中 AUU 占 36%、AUC 占 32%、AUA 占 32%; 在 rpoD 中 则 分 别 为 26%、
74%、0%。 由 此 可 见 ， 在 25 种 非 调节 蛋白 和 rpoD 中 对 AUA 的 利用 频率 极 低 ，
但 在 dnaG 中 则 恰恰 相反 ， 对 稀有 密码 AUA 的 利用 频率 相当 高 。 此 外 ，UCG，
(Ser)、CCU (Pro)、CCC (Pro)、ACG (Thr)、CAA (Gln)、AAT (Asn) 和 上
AGG (Arg) 等 七 个 密码 子 也 有 一 定 程 度 的 显著 区 别 。

其 他 有 关 调 控 蛋 白 如 lacI、araC、trpR 等 基因 产物 在 细胞 内 的 量 也 是 很 少
的 ， 这 些 基因 中 密码 子 的 利用 频率 和 dnaG 相同 ， 而 明显 不 同 于 非 调 节 蛋 白 。

为 什么 稀有 密码 子 利用 频率 高 的 基因 中 蛋白 质 合 成 量 低 ， 可 能 是 由 于 细胞 内
与 稀有 密码 对 应 的 下 NA 少 ， 这 样 就 延长 了 核糖 体 在 mRNA 上 的 时 间 ， 从 而 降 ，
低 了 翻译 速度 ， 不 过 是 否 如 此 ， 还 有 待 进一步 的 实验 证 明 。

2. 重 又 基因 与 翻译 调控

重 释 基因 最 早 是 在 下 .coii 噬菌体 GX174 中 发 现 ， 例 如 B 基因 包含 在 A 基因
内 ， 顾 基因 包含 在 D 基因 内 ， 用 不 同 的 阅读 方式 得 到 不 同 的 蛋白 质 ， 当 时 认为
重 午 基因 的 生物 学 意义 是 它 可 以 包含 更 多 的 遗传 信息 。 后 来 发 现 丝 状 的 RNA 噬
菌 体 、 线 粒 体 DNA、 插 入 序列 ， 甚 至 在 细菌 染色 体 上 也 有 重 丢 基因 存在 ， 说 明
重大 基因 可 能 对 基因 表达 的 调节 起 着 重要 作用 。 色 氨 酸 操纵 子 中 的 ztrpzE 基因 和
trpD 基因 之 间 的 翻译 偶 联 现象 可 以 说 明 这 个 问题 。

色 氮 酸 操纵 子 由 五 个 基因 (trtE、trpD、trpC、trpB、xzrpA) 组 成 ， 在 正
常情 况 下 操纵 子 中 五 个 基因 产物 是 等 摩尔 的 ， 但 发 现 zrpE 突变 后 ， 其 邻近 的 |
xzrpD 的 产量 比 下 游 的 zrpB、trpA 的 产量 要 低 ， 这 种 差别 不 能 用 转录 水 平 的 极 性 |
来 解释 ， 遗 传 学 实验 证 明 这 种 极 性 效应 是 在 翻译 水 平 上 的 ， 当 zrp 能 翻译 时 ， |
irpD 也 能 翻译 ， 这 种 依赖 性 便 称 为 翻译 偶 联 。

比较 traE 和 zrpD 以 及 ztrpC 和 trpB 两 对 基因 中 核 苷 酸 顺 序 为 翻译 偶 联 现象 |
提供 了 线索 ，zrpFE 基因 的 终止 密码 和 trpD 的 起 始 密码 之 间 只 相隔 一 个 核 苷 酸 ，
是 重 蚕 的 。

。，294 ，

站 有

而 在 trpC 和 zz 之 间 相 隔 11 个 核 苷 酸 ， 由 于 rpE 与 trpD 的 终止 密码 与
起 始 密码 重 和 至 ，zrpF 翻译 终止 时 的 核糖 体 立 即 处 在 起 始 环境 中 ， 这 种 重 琶 的 密
码 便 是 保证 同一 核糖 体 对 两 个 连续 基因 进行 翻译 偶 联 的 机 制 。 但 对 相隔 几 个 核 苷
酸 的 zrpC 和 zrpB 则 不 存在 这 种 翻译 偶 联 。

为 什么 说 翻译 偶 联 是 一 种 调控 机 制 呢 ? 我 们 知道 在 细菌 细胞 内 zrpE 和 trpD
的 产物 分 别 以 等 摩尔 结合 成 具有 功能 的 四 聚 体 ， 而 zrpC 和 zrpB 则 不 形成 复合
物 。z2B 和 zzp4A 的 产物 也 是 以 等 摩尔 结合 ， 虽 然 现 在 还 没有 发 现 翻译 偶 联 现
象 ， 但 这 两 个 基因 的 核 苷 酸 顺 序 也 是 重 登 的 。

色 氨 酸 操 纵 子 中 zraE 和 zrbD 之 间 的 翻译 偶 联 现象 并 不 是 独一无二 的 例子 。
尼 .coli 的 半 乳 糖 操纵 子 中 gaT 和 gazK 在 结构 上 存在 着 另 一 种 重 到 现 象 ，galT
的 终止 密码 子 并 不 与 gz 的 起 始 密码 重 丢 ， 它 们 之 间 相 隔 三 个 核 苷 酸 ， 但 在 终
止 密码 子 之 间 却 有 ga/K 基因 的 核糖 体 结合 顺序 〈SD 顺序 )。

虽然 这 一 情况 与 trpE-trpD 的 翻译 偶 联 并 不 完全 相似 ， 但 也 并 不 能 排除 翻译
偶 联 的 存在 。 因 为 核糖 体 结合 在 mRNA 上 可 覆盖 20 个 核 苷 酸 ， 包 括 了 SD 顺序
和 后 面 gaZ 开 基因 的 起 始 密码 ， 所 以 当 galT 终止 时 ， 核 糖 体 还 没有 脱落 就 直接
与 SD 结合 开始 saz 开 的 翻译 。 应 用 基因 操作 技术 的 实验 证 明 galTsalK 的 确 存
在 翻译 偶 联 。

3. 翻译 的 阻 遏

蛋白 质 作 为 阻 遏 物 或 激活 物 对 转录 进行 调控 的 例子 已 经 屡见不鲜 ， 那 么 蛋白
质 是 否 也 能 对 翻译 起 类 似 的 调控 作用 呢 ? 在 大 肠 杆菌 的 RNA 鸣 菌 体 QB 中 确实 发
现 这 种 现象 。Q8B 鸣 菌 体 的 基因 组 包含 有 三 个 基因 ， 从 $' 到 3 方向 依次 是 与 鸣 菌
体 组 装 和 吸附 有 关 的 成 熟 蛋白 基因 A， 外 壳 蛋 白 基 因 和 RNA 复制 酶 基因 。 当 鸣
菌 体感 染 细菌 RNA 进入 细胞 后 ， 这 条 称 为 (+ ) 链 的 亲本 RNA 立即 作为 信使
侣 成 复制 酶 ， 它 与 宿主 中 的 几 个 亚 基 结合 后 便 能 起 复制 功能 ， 但 是 这 里 发 生 了 矛
盾 ， 因 为 在 进行 翻译 时 ，Q8B (+ ) RNA 链 上 已 经 占据 了 不 少 核糖 体 ， 它 们 从
向 3 人 福 向 进行 翻译 ， 这 些 阻 得 了 复制 酶 催化 的 从 3' 向 5 方向 进行 的 〈- ) 链 合
成 ， 克 服 这 个 矛盾 的 办 法 便 是 由 Q8B 复制 酶 作为 翻译 阻 遇 物 进行 调节 。

离 体 实验 证 明 纯 化 的 复制 酶 可 以 和 外 壳 蛋 白 的 翻译 起 始 区 结合 ， 抑 制 蛋白 质
的 合成 。 因 此 设想 核糖 体 不 能 与 起 始 区 结合 ， 但 已 经 起 始 的 翻译 仍 能 继续 下 去 ，
直到 翻译 完毕 ， 核 糖 体 脱 下 ， 于 是 复制 酶 便 可 以 和 (+ ) RNA 的 3 结合 而 进行
复制 。

这 里 复制 酶 既 能 和 外 过 蛋白 的 翻译 起 始 区 结合 又 能 和 (+ ) RNA 的 3“ 端 结
合 ， 那 么 这 两 个 部 位 是 否 有 同 源 性 呢 ? 通过 计算 机 算出 这 两 个 区 的 最 稳定 的 二 级
结构 ， 表 明 它 们 的 二 级 结构 中 荃 环 结构 相似 ， 而 且 环 上 都 有 CUUU 和 UAAA 顺
序 ， 这 种 相似 可 能 和 复制 酶 作为 翻译 阻 歇 物 有 关 。

“0

另 一 类 RNA 噬菌体 R17 和 MS2 中 也 存在 类 似 于 Q8 的 翻译 阻 过 现象 。 离 体
实验 证 明 外 壳 蛋 白 可 以 和 鸣 菌 体 的 RNA 合成 酶 翻译 起 始 区 结合 从 而 阻 遏 RNA
合成 酶 的 翻译 。

4. mRNA 的 高 级 结构 对 翻译 的 调控

以 RNA 鸣 菌 体 刀 的 纯化 的 RNA 作为 信使 在 大 肠 杆菌 的 无 细胞 系统 中 进行
蛋白 质 合成 时 ， 大 部 分 合成 外 壳 蛋 白 ， 合 成 的 RNA 合成 酶 只 占 外 壳 蛋 白 的 1/3。
其 他 RNA 喉 菌 体 如 MS2 也 有 同样 现象 ， 用 同位 素 标记 可 以 考察 RNA 叭 菌 体 拖
种 蛋白 质 的 起 译 程度 ， 结 果 表 明 外 壳 蛋 白 的 起 译 程度 比 合成 酶 要 大 三 倍 。

另外 还 发 现 RNA 叭 菌 体 刀 外 壳 蛋 白 基 因 的 琥珀 突变 ， 除 影响 外 壳 蛋 白 本 身
外 还 影响 到 合成 酶 的 起 译 。 但 如 果 焉 珀 突变 不 是 发 生 在 接近 起 始 翻译 区 内 而 是 发
生 在 第 30、 第 54 或 第 70 个 氨基 酸 处 〈 共 129 个 氨基 酸 )， 那 么 就 不 影响 RNA
合成 酶 的 合成 ， 这 一 现象 说 明 合成 酶 的 起 译 只 与 外 壳 蛋 白 的 起 译 有 关 ， 与 外 壳 蛋
白 C 端的 合成 无 关 。 也 就 是 说 在 大 肠 杆 菌 的 无 细胞 系统 中 ， 在 完整 的 PRNA 分
子 上 核糖 体 可 以 直接 起 译 外 壳 蛋 白 ， 但 不 能 立即 起 译 合成 酶 ， 一 定 要 在 外 壳 蛋 白
合成 到 一 定 程度 时 才 开 始 合成 合成 酶 。 我 们 知道 在 组 装 鸣 菌 体 时 需要 很 多 外 壳 蛋
和 白 ， 这 和 离 体 系统 中 观察 到 的 现象 是 一 致 的 。 它 通过 什么 机 制 达 到 这 种 调控 呢 ?
有 一 种 假设 是 比较 合理 的 ， 认 为 合成 酶 的 起 译 部 位 被 RNA 的 高 级 结构 所 掩盖 ，
当 外 壳 蛋 白 翻译 出 前 面部 分 时 RNA 的 立体 结构 解 开 ， 合 成 酶 才 有 可 能 起 译 。 用
甲醛 处 理 RNA 可 以 增加 合成 酶 的 起 译 ， 说 明 高 级 结构 对 基因 调控 的 可 能 性 。

S. MIC-RNA 和 翻译 调控 (mRNA- 干 扰 互补 RNA)

大 肠 杆 菌 中 通过 转录 水 平 上 的 基因 调控 往往 是 由 蛋 日 质 与 DNA 的 相互 作用
从 而 达到 阻 遏 或 激活 转录 作用 ， 近 年 来 发 现 与 渗透 性 有 关 的 蛋白 质 以 及 一 种 转 座
酶 是 通过 RNA-RNA 相互 作用 对 翻译 进行 调控 的 。 大 肠 杆 菌 中 与 渗透 性 有 关 的
外 膜 孔 蛋白 的 调节 子 是 由 oxzzpB 、oxzpC 和 omzpF 三 个 相互 不 连锁 的 座位 所 组 成 。
其 中 ompC 和 ozpF 是 结构 基因 ， 编 码 两 种 结构 蛋白 ，oxmpM 座位 对 omzpC 和
opF 起 调控 作用 。oxzpB 座位 实际 上 是 由 omzzpR 和 env2 两 基因 组 成 。enz2 编
码 的 蛋白 设想 是 外 膜 上 的 一 种 受 体 蛋白 ， 能 感受 培养 基 中 渗透 压 的 变化 ， 并 将 此
信息 传递 给 细胞 质 内 的 ompR 和 蛋白， 通过 ompR 蛋白 对 o7225C 和 ozzz 民 基因 进行
正 控制 。 这 里 要 介绍 的 是 当 培养 基 中 渗透 压 变化 时 ompF 蛋白 产量 下 降 ， 同 时
ompC 蛋白 的 量 上 升 ， 从 而 保持 ompC 和 ompF 两 种 蛋白 总 量 恒定 ， 即 ozC 基
因 上 游 DNA 顺序 转录 一 段 RNA 与 ompF 基因 的 mRNA 互补 ， 从 而 降低 了
opF 的 翻译 。

通过 对 omzzpC 和 ozpF 基因 的 核 苷 酸 顺 序 分 析 ， 发 现在 离 omzC 基因 不 远 的
上 游 存 在 另外 一 个 转录 单位 〈 存 在 反方 向 的 -10 和 -35 区 )。 当 培养 基 中 渗透 压

2

高 时 ，omz 加 C 可 双向 转录 ， 除 转录 ozC 基因 外 ， 还 可 以 相反 于 omzC 基因 的 转
录 方 向 转录 174 个 核 苷 酸 的 RNA。 这 段 转录 物 与 omzpF 的 mRNA 5 端 有 较 强 的
同 源 性 ， 设 想 在 细胞 内 通过 分 子 杂 交 而 抑制 ozzpF 的 mRNA 的 翻译 ， 这 段 174
次 核 苷 酸 顺 序 称 为 mic RNA (mRNA-interfering complementary RNA)， 由 于 它 干
扰 的 是 opF 基因 的 mRNA 的 翻译 ， 所 以 编码 mic RNA 的 基因 称 为 zzicF， 类
似 于 RNA-RNA 相互 作用 进行 调控 的 另 一 个 例子 是 转 座 子 Tnl10 中 IS10 的 表达 ，
遗传 学 实验 表明 载 有 IS10R (右边 的 IS10) 的 向 外 180bp 的 多 拷贝 质粒 可 以 抑制
细菌 染色 体 上 Tal0 的 转 座 ， 这 种 抑制 作用 是 由 于 转录 出 的 RNA 与 转 座 酶 基因
的 mRNA 互补 ， 从 而 干扰 了 翻译 的 进行 。

6. 魔 斑 核 苷 酸 的 调控 作用

核糖 体 蛋 白 (r- 和 蛋白) 的 反馈 阻 歇 保证 了 几 种 = 蛋白 合成 的 协同 进行 ， 这 里
主要 讲 如 何 通过 魔 斑 核 苷 酸 的 调节 使 细胞 内 蛋白 合成 的 总 速率 和 蛋白 合成 机 器 中
的 成 分 rRNA 的 合成 速率 之 间 达 到 协调 (就 是 当 不 进行 蛋白 合成 时 ， 也 就 没有
必要 合成 =RNA)。 发 生 这 种 调节 作用 的 最 早 信号 是 不 载 有 氨基 酸 的 术 NA， 因
此 这 种 调节 也 可 以 归纳 为 翻译 水 平 上 的 调节 。

早 在 1952 年 Sands 等 报道 大 肠 杆 菌 缺 陷 型 (trp his ) 在 缺少 任何 一 种 所
需要 的 氨基 酸 的 培养 基 上 培养 时 ， 不 但 蛋白 质 合成 速率 立即 下 降 ， 而 且 RNA 合
成 速率 也 下 降 ， 因 为 色 氨 酸 和 组 氨 酸 不 是 RNA 的 前 体 ， 所 以 说 RNA 合成 速率

时 下 降 是 由 于 蛋白 质 合成 受阻 后 的 次 级 反应 。 几 年 以 后 又 发 现 大 肠 杆菌 的 另 一 个 突

变型 ， 和 上 土 述 情况 恰恰 相反 ， 在 缺少 氨基 酸 供应 时 蛋白 质 合 成 虽然 停止 ， 但
RNA 合成 速率 并 不 下 降 ， 于 是 把 前 一 种 称 为 严 紧 控制 ， 基 因 型 为 yxe!”; 后 一 种
现象 称 为 松弛 控制 ， 基 因 型 为 ze/ 。

10 多 年 后 发 现 rel* 和 rel - 菌株 除 上 述 生 理 现 象 不 同 外 ， 当 缺乏 氨基 酸 时
rel 菌株 能 合成 乌 苷 四 磷酸 (ppGpp) 和 乌 苷 五 磷酸 (pppGpp)，rel 菌株 则 不 合
成 。 因 为 这 两 种 化 合 物 是 在 层 析 谱 上 检 出 的 斑点 ， 所 以 当时 称 为 魔 斑 (magic
spot)。 在 旺盛 生长 的 细胞 中 约 有 65% 一 90% tRNA 是 载 有 氨基 酸 的 。 当 氢 基 栈
缺乏 时 ， 不 负载 氨基 酸 的 tRNA 增多 ， 这 种 不 负载 氨基 酸 的 攻 NA 仍 能 和 核糖 体
的 和 位 结合 ， 核 糖 体 上 不 载 氨 基 酸 的 tRNA 是 细胞 产生 严 紧 控 制 的 讯号 。 在 正
常 的 蛋白 质 合成 过 程 中 ，aa-tRNA 转移 到 正在 延伸 的 多 肽 上 时 需要 GTP， 也 许
是 由 于 这 一 反应 不 进行 了 ，GTP 便 可 用 作 合 成 魔 斑 的 前 体 ;

GTIP->~pppCpp 一 ppPGOpP

参与 这 个 反应 的 除 reLA 基因 所 编码 的 ATP: GTP 3-“ 焦 磷酸 转移 酶 外 ， 还 需
要 翻译 起 始 因子 EF-Tu 和 EF-G 等 。

ppGpp 的 效应 是 多 种 多 样 的 : 如 对 许多 酶 (如 腺 苷 酸 琥珀 酸 合成 酶 、 味 叭 磷
酸 核糖 转移 酶 等 ) 和 翻译 起 始 因子 的 抑制 或 激活 ; 对 RNA、tRNA 转录 的 抑制

.297 、

对 /ac、j1is、tzrp 等 操纵 子 mRNA 的 激活 。 虽 然 ppGpp 是 多 效 性 的 ， 但 有 人 让 ，
为 ppGpp 对 RNA 聚合 酶 启动 子 专 一 性 的 影响 可 能 是 严 紧 控制 的 关键 。
真 核 生物 细胞 培养 时 从 高 营养 培养 基 转 入 低 营养 培养 基 后 也 观察 到 与 原核 生
物 中 相似 的 多 种 效应 ， 如 稳定 的 RNA 合成 受到 抑制 ， 葡 萄 糖 运输 、 核 酸 前 体 的
吸取 都 受到 抑制 ， 同 时 和 昌 昌 质 分 解 被 激活 ， 但 真 核 生 物 中 尚未 发 现 ppGpps
有 人 将 ppGpp 和 cAMP 这 类 物质 称 为 警报 素 (alarmnone)， 当 细胞 缺乏 氨基 ，
酸 时 产生 ppGpp， 于 是 细胞 对 它 可 以 做 出 种 种 反应 以 求 缓和 紧急 的 情况 : 抑制 核
糖 体 或 其 他 大 分 子 的 合成 ; 活化 某 些 氨基 酸 操纵 子 的 转录 ; 活化 蛋白 水 解 酶 ; 抑
制 与 氨基 酸 无 关 的 转运 系统 等 ， 从 而 节约 能 量 和 原料 或 开发 能 量 或 原料 的 来 源 。
除了 上 述 几 种 方式 的 翻译 水 平 调控 外 ， 还 值得 一 提 的 是 茶 些 多 顺 反 子 mRNA
几 个 基因 的 差别 性 翻译 。 例 如 /ac 操纵 子 转录 出 一 条 多 顺 反 子 mRNA 在 充分 诱
导 的 细胞 里 B- 半 乳糖 苷 酶 、 透 性 酶 和 转 乙 酰 酶 活力 的 比例 是 1:0.5:0.2， 这 很 可 ，

能 是 细胞 对 这 三 种 酶 需要 量 的 反映 ， 在 翻译 过 程 中 /ac mRNA 会 经 常 脱离 核糖 ，

体 ， 对 于 下 游 的 一 个 起 始 密码 子 (AUG) 需要 重新 起 始 ， 于 是 从 5' 端 到 3' 端 的
几 种 蛋白 质 的 全 成 形成 了 梯度 ， 还 可 能 由 于 另外 的 原因 ， 即 lac mRNA 的 4 基
因 部 分 更 容易 受到 内 切 核酸 酶 的 降解 ， 因 此 Z 基因 蛋白 的 合成 就 比 a 为 多 。 这
种 榜 度 现象 是 亿 万 年 进化 的 结果 。

二 、 翻 译 后 填 控

翻译 后 调控 主要 指 两 方面 的 内 容 ， 一 方面 是 指 无 论 是 原核 生物 还 是 真 核 生物
的 蛋白 质 在 细胞 内 都 有 一 定 的 分 布 部 位 ， 大 部 分 存在 于 细胞 质 内 ， 其 余 则 分 布 在
细胞 的 其 他 组 分 上 ， 像 大 肠 杆菌 这 样 简单 的 细胞 ， 蛋 白质 分 布 在 细胞 质 、 内 膜 、
外 膜 和 周 质 等 四 个 区 域内 。 细 胞 质 内 约 占 753%; 内 膜 上 的 蛋白 总 量 虽 少 但 种 类
颇 多 ， 包 括 与 物质 运输 、 电 子 传递 以 及 与 脂 质 合成 有 关 的 蛋白 ; 外 膜 上 蛋白质 种
类 不 多 ， 但 总 量 比 内 膜 多 ， 不 少 是 作为 受 体 的 蛋白 。 对 于 真 核 细胞 来 说 蛋白 分 布
区 域 还 包括 一 些 细胞 器 或 亚 细 胞 结构 的 膜 ， 如 线粒体 、 叶 绿 体 以 及 粗糙 内 质 网
等 。

可 是 我 们 知道 蛋白 质 的 合成 机 器 在 细胞 质 内 ， 这 些 蛋 白质 是 怎样 进入 到 膜 或
周 质 中 去 呢 ? 20 世纪 70 年 代 提 出 信号 假设 对 这 个 问题 做 出 了 解答 ， 认 为 分 泌 性
蛋白 质 N 闯 的 一 段 称 为 信号 肽 的 几 十 个 氨基 酸 具有 导航 的 功能 ， 它 能 引导 细胞
质 内 正在 合成 中 的 竺 白 质 进入 膜 或 周 质 中 ， 这 段 信号 肽 则 在 蛋白 质 合成 过 程 中 途
被 水 解 去 除 。

通过 对 癌 细 胞 的 免疫 球 蛋 白 IgG 的 研究 发 现 ，IgG 轻 链 的 mRNA 全 部 存在
于 和 膜 结合 的 核糖 体 上 ， 并 且 证 明 离 体系 统 中 转录 时 的 翻译 产物 比 真 正 轻 链 大
些 ， 提 出 了 信号 肽 假设 ， 要 点 是 : @ 只 有 那些 为 着 膜 蛋白 编码 的 mRNA5 端 有 额

298 ，

外 的 一 段 密码 子 顺 序 ;， GO 当 这 段 顺序 被 译 出 来 以 后 ， 核 糖 体 就 会 附着 到 膜 上 ， 在
赔 上 形成 通道 的 小 孔 ， 从 而 使 新 生 肽 通过 膜 ， 如 果 没 有 这 段 及 ， 核 糖 体 不 会 附着
到 膜 上 ， 这 段 肽 称 为 信号 肽 ; @ 信 和 号 肽 长 度 约 为 15 一 30 个 氨基 酸 。 其 中 以 踢 水
性 氨基 酸 占 多 数 ; 田 当 信和 号 肽 进入 膜 后 肽 链 继续 延伸 ， 在 尚未 完成 之 前 信和 号 肽 先
被 水 解 去 ， 膜 上 可 能 存在 着 这 种 具有 专 一 性 的 蛋白 水 解 酶 ; @ 当 多 肽 全 部 合成 以
后 便 从 核糖 体 释 放 到 膜 上 或 周 质 中 ， 于 是 核糖 体 又 从 膜 上 游离 出 来 。

目前 对 信号 肽 的 结构 和 功能 已 研究 得 比较 清楚 ， 并 且 已 将 信号 顺序 用 于 获得
更 多 分 记性 产物 的 基因 工程 中 。

翻译 调控 的 另 一 方面 主要 是 指 翻译 后 的 蛋白 质 修饰 及 构象 形成 。 如 从 mRNA
直接 翻译 出 的 多 肽 往往 无 生物 学 活性 ， 经 切除 一 部 分 后 具有 活性 ; 有 些 恒 白质 翻
译 后 需 经 甲 基 化 、 糖 基 化 之 后 才 具 活性 ， 这 种 修饰 作用 能 使 20 种 氨基 酸 变 得 多
种 多 样 ， 修 饰 后 可 达 100 多 种 ; 有些 酶 〈 如 激酶 ) 需要 磷酸 化 后 才 有 活性 等 。 翻
译 产 生 的 多 肽 链 还 必须 正确 折 肢 形 成 正确 的 构象 才 具 有 生物 学 功能 。 最 初 人 们 由
于 被 核酸 酶 热 变性 失 活 冷 却 后 又 可 恢复 正确 构象 而 重新 具有 活性 所 误导 ， 认 为 蛋
自 质 可 自动 形成 正确 构象 。 近 年 来 的 研究 发 现 表 明 ， 人 时 白质 的 构象 形成 至 少 与 环
境 及 一 类 负责 帮助 恒 白质 形成 正确 构象 的 被 称 为 “蛋白 质 伴娘 ”的 和 量 白 有 关 。 蛋
自 质 的 氨基 酸 排列 顺序 完全 相同 但 可 形成 完全 不 同 的 构象 而 具 不 同 的 性 质 与 功
能 ， 肝 病毒 (prion) 蛋白 就 是 一 个 例子 ， 因 目前 关于 和 时 白 质 形 成 构象 的 机 制 和
相关 因子 认识 太 少 ， 所 以 不 能 在 此 介绍 和 讨论 。

99”

第 十 音 ” 真 核 生 物 基因 组 及 其 基因 表达 调控

我 们 目前 了 解 的 关于 遗传 信息 的 储存 、 复 制 与 表达 的 知识 大 部 分 仍 是 来 源 手
对 原核 细胞 和 病毒 的 研究 。 但 近年 来 越 来 越 多 的 人 从 事 于 真 核 生物 的 基因 组 、 基
因 结构 及 表达 调控 方面 的 研究 。 这 方面 的 某 些 研究 虽然 不 像 对 原核 生物 的 研究 那
样 深入 ， 那 样 明确 。 但 是 在 真 核 基 因 组 的 特点 和 真 核 基因 的 结构 方面 的 研究 都 取
得 了 重大 成 果 ， 同 时 对 真 核 基因 表 达 调 控 方 面 的 研究 也 取得 了 一 些 重要 的 进展 s

第 一 他 ” 真 核 生物 基 因 组

和 原核 生物 相 比 ， 真 核 生 物 基因 组 有 以 下 特点 ，@ 基 因 组 大 ， 具 有 多 个 复制

sr se ee ea

起 点 ;，@ 一 个 基因 组 包括 若干 个 染色 体 ， 一 般 不 呈 环 状 ; @ 整 个 染色 体 DNA 分 。
子 都 和 蛋白 质 稳定 地 结合 ，@@ 有 大 的 重复 序列 ;加 功能 上 密切 相关 的 基因 的 集中

程度 不 如 原核 生物 ， 还 没有 发 现 像 原核 生物 中 那样 的 操纵 子 存在 。

一 、 重 复 序 列

对 真 核 生 物 基 因 组 的 最 早 研究 是 从 复 性 动力 学 和 密度 梯度 离心 开始 的 。 在 最
早 的 对 真 核 生 物 DNA 和 原核 生物 DNA 复 性 动力 学 研究 中 发 现 ， 真 核 DNA 复 性

与 原核 DNA 很 不 相同 ， 在 真 核 生物 中 DNA 复 性 时 ， 其 复 性 曲线 除了 与 原核 上

DNA 部 分 相似 外 ， 还 有 一 部 分 是 复 性 很 快 的 部 分 ， 复 性 最 快 的 这 部 分 就 是 重复
序列 。 通 过 DNA 的 复 性 动力 学 曲线 可 粗略 地 佑 计 基因 组 的 大 小 以 及 这 个 基因 组

中 单 拷贝 基因 和 重复 DNA 的 量 ， 因 为 在 复 性 过 程 中 ， 基 因 组 越 大 复 性 越 慢 。 另 时
外 重复 DNA 比 单 拷贝 基因 复 性 也 要 快 。 所 以 根据 复 性 动力 学 实验 及 结果 可 以 粗 时

略 估计 基因 组 的 大 小 和 重复 程度 。
从 重复 的 程度 来 说 ， 真 核 生物 的 DNA 序列 大 致 上 可 以 分 为 : 单 拷贝 序列 、
少量 重复 序列 、 中 度 重复 序列 和 高 度 重 复 序列 。

(1) 单 找 贝 序列
这 部 分 是 复 性 曲线 中 最 后 复 性 的 部 分 ， 占 基因 组 的 40% 一 70%。
(2) 少量 重复 序列

每 一 种 的 重复 次 数 大 约 1 一 10 次 ， 例 如 编码 组 蛋白 和 疏 NA 的 基因 。 某 些 少

量 重复 基因 的 核 苷 酸 顺 序 并 不 完全 相同 。 这 里 包括 两 种 情况 : @ 几 个 基因 都 是 有

功能 的 ， 例 如 血红 蛋白 B 链 有 胚胎 型 的 (2 一 8 周 前 的 胚胎 )、 胎 儿 型 ( 指 8 一 41
。 300 。

周 的 胎儿 ) 和 成 人 型 的 ， 这 些 蛋 白质 都 只 有 几 个 氨基 酸 的 差别 ; @ 有 些 基 因 有 功
能 ， 有 些 则 没有 功能 ， 如 假 基因 。

(3) 中 度 重复 序列
这 些 序列 一 般 是 分 散 的 ， 每 一 种 序列 的 重复 次 数 不 等 ， 大 约 在 10 到 几 百 个
拷贝 。 它 们 的 排列 有 方向 一 致 的 ， 也 有 方向 相反 的 ， 许 多 中 度 重 复 序列 和 单 拷贝
序列 相间 排列 ， 也 有 中 间 没 有 单 拷贝 序列 的 。

中 度 重复 序列 大 致 可 分 为 两 类 : 短 周 期 散 置 重 复 序列 和 长 周期 散 置 重复 序
列 。 人 、 不 昌 、 海 胆 的 中 度 重 复 序列 以 前 者 为 主 ， 果 蝇 的 中 度 重 复 序列 以 后 者 为
主 。

得 周期 序列 每 序列 长 约 100 一 300bp， 长 周期 序列 的 每 序列 大 约 S000bp。 长
旺 周期 序列 均 有 若干 种 ， 但 它们 往往 有 共同 的 结构 特征 。 例 如 5$000bp 的 重复 序
列 的 两 端 各 有 长 度 约 255$ 一 400bp 的 顺 向 重复 序列 。 这 种 排列 方式 在 酵母 中 也 有
发 现 。 这 种 现象 和 下 面 要 讲 到 的 乌 类 和 哺乳 动物 染色 体 上 整合 的 反 转 病毒 十 分 相
和 似 ， 也 和 细菌 的 转 座 因 子 两 侧 的 顺 向 重复 序列 相似 ， 这 些 重复 序列 可 能 类 似 于 转
座 因子 的 成 分 。

在 果 蝇 中 曾 发 现 某 些 中 度 重 复 序列 在 黑 腹 果 蝇 和 它 的 近 缘 种 间 在 数目 和 位 置
止 都 有 不 同 ， 而 且 在 黑 腹 果 蝇 的 一 些 品系 间 也 有 不 同 。 这 些 情况 也 说 明 这 些 中 度
重复 序列 中 间 可 能 包括 转 座 子 。

(4) 高 度 重 复 序列

这 些 序列 一 般 不 分 散 ， 大 部 分 集中 在 异 染 色 质 中 ， 特 别 是 在 中 心 粒 和 端 粒 的
附近 。 高 度 重 复 序列 中 常 有 一 些 和 大 部 分 DNA 具有 不 同 的 G+C 含量 的 所 谓 卫
星 DNA。 许 多 真 核 生 物 都 有 卫星 DNA (satellite DNA)， 它 约 占 总 DNA 的 1% 一
30%， 一 些 卫星 DNA 的 核 苷 酸 顺 序 已 经 测定 。 例 如 牛 的 卫星 DNA 的 绝 大 部 分
是 ATATAT.……。 一 种 果 蝇 (drosophila virils) 有 三 个 卫星 DNA 区 带 ， 它 们 的
核 背 酸 顺 序 分 别 是 : 5-ACAAATT-3; 5- 大 肠 杆 菌
ACAAACT-3'; $-ATAAACT-3'。 这 些 顺 序 重复
约 10" 次 。

许多 真 核 生物 的 核 内 DNA 在 CsCl 或 CSO， 沁
中 密度 梯度 离心 时 ， 除 了 形成 一 个 主 带 外 ， 往 往
在 主 带 的 轻 侧 或 重 侧 还 有 一 个 或 几 个 小 带 ， 这 就
是 卫星 带 。 对 这 部 分 DNA 进行 分 析 发 现 是 重复 起
顺序 ， 这 部 分 DNA 称 为 卫星 DNA。 图 10-1 是 大 as
肠 杆菌 和 鱼 类 核 内 DNA 在 CsCl 密度 梯度 离心 时
出 现 的 密度 峰 ， 大 肠 杆菌 中 只 有 一 个 峰 ， 而 艇 类 ”图 10-1 竺 类 核 内 DNA 和
则 除了 密度 为 1 .705 的 一 个 峰 外 ， 还 有 一 个 密度 E.coii DNA 在 CsCl 梯度 离
为 1.683 的 峰 。 心中 的 密度 峰

wd

| 汪

用 复 性 实验 证 明 卫 星 DNA 全 部 是 高 度 重 复 顺 序 ， 而 高 度 重 复 顺 序 则 有 大 部
分 (不 是 全 部 ) 包含 在 卫星 DNA 中 。 把 小 鼠 卫 星 DNA 通过 RNA 聚合 酶 在 体外
转录 成 有 放射 性 标记 的 互补 RNA， 以 此 RNA 与 体外 培养 的 小 鼠 细 胞 做 原 位 厅
交 ， 放 射 自 显影 后 证 明 卫 星 DNA 分 布 在 20 对 染色 体 中 所 有 19 对 常 染 色 体 和 习
染色 体 的 着 丝 点 (centromere) 附近 ， 即 细胞 学 中 称 为 异 染 色 质 (haterochras
matin) 部 分 。Y 染色 体 上 没有 卫星 DNA， 但 YY 染色 体 上 很 多 部 分 是 异 染 色 质
这 说 明 ， 卫 星 DNA 在 异 染 色 质 部 分 ， 但 异 染 色 质 上 的 DNA 并 非 全 部 是 卫星
DNA， 异 染色 质 上 还 有 非 卫 星 DNA 和 单一 顺序 。

二 4 基因: 家 族

真 核 生物 中 虽然 很 少 有 真正 的 操纵 子 ， 可 是 结构 和 功能 上 相关 的 基因 和 常 聚集
在 一 起 形成 所 谓 基因 家 族 〈gene familie)， 虽 然 同 一 家 族 的 成 员 也 可 以 分 居 各 处 时
属于 一 个 基因 家 族 的 各 种 基因 可 能 都 是 单 拷贝 的 ， 也 可 能 是 多 拷贝 的 。
根据 基因 家 族 的 复杂 程度 ， 可 以 把 它们 分 为 下 列 几 种 类 型 : 简单 的 多 基因 家
族 、 复 杂 的 多 基因 家 族 、 不 同 场合 表达 的 复杂 的 多 基因 家 族 (图 10-2)。

单 链 SS TRNA_ 基因 基因 基因
基因
(3)
组 绰 自 革 生 二 着 ! H4 H2B H3，_-H2A 允 E
(海胆 ) 和
重复 单位
组 彼 自 .和
〈 果 蝇 )
重复 单位
tRNA Ans Lys Lys Lys Asn Asn Asn
( 果 蝇 ) - -一 一 < 一 一 ---- 所 一 下 一 -- -一 --- -一 一 > 一 -< 一 一 所 一 一 一 一
(b)
5 球 攻 月 -一下 全 二 Be
一 一 一 /
胚胎 胎儿 成 人

图 10-2 ” 真 核 生物 基因 组 中 不 同 的 多 基因 家 族
(a) 简单 的 多 基因 家 族 ; (b) 复杂 的 多 基因 家 族 ; (ce) 发 育 控制 的 复杂 多 基因 家 族 。

一 些 生物 的 SS RNA 基因 构成 简单 的 基因 家 族 。 它 们 的 结构 相同 ， 基 因 与 基
因 之 间 是 中 度 重 复 顺序 。
复杂 的 多 基因 家 族 的 各 个 成 员 并 不 都 相同 。 海 胆 和 采 蝇 的 组 蛋白 基因 以 及 果
. 302 ，

蝇 的 tRNA 基因 就 属于 这 类 基因 家 族 。 五 个 组 蛋白 基因 作为 一 个 单位 重复 达 千
有 欢 ， 每 组 基因 单独 地 按 一 定 方向 转录 。 某 些 tRNA 基因 集中 在 一 起 ， 另 一 些 则 集
申 在 其 他 位 置 。 遗 传 学 分 析 证 明 玉 米 有 三 类 醇 溶 性 蛋白 ， 其 基因 数目 分 别 是 24、
52 和 2， 它 们 分 别处 在 三 个 染色 体 上 。 一 些 基 因 是 分 散 的 ， 而 另 一 些 则 是 集中 在
一 起 的 。

上 ”人 的 珠 蛋白 基因 家 族 是 属于 不 同 场合 表达 的 复杂 多 基因 家 族 ， 包 括 胚胎 时 期
表达 的 珠 蛋白 基因 ， 胎 儿 时 期 表达 的 y 珠 蛋 白 基 因 和 成 体 中 表达 的 $ 和 B 珠 蛋白
基因 。

以 上 这 些 基因 家 族 中 的 成 员 都 是 有 功能 的 ， 尽 管 有 些 基因 可 能 只 在 某 个 发 育
阶段 表达 。 而 在 有 一 些 基因 家 族 中 则 包括 一 些 没 有 功能 的 成 员 ， 这 些 便 是 假 基
因 。 假 基因 是 和 一 般 编码 的 基因 在 结构 上 相似 ， 可 是 并 不 表达 的 基因 。 这 些 基 因
可 以 认为 和 表达 基因 属于 同一 个 家 族 。

大 们 早 就 设想 新 的 基因 来 源 于 已 有 基因 的 重复 ， 重 复 基 因 的 命运 可 以 是 以 下

3 种 : DO 具 有 和 原 有 基因 几乎 完全 相同 的 结构 和 功能 ， 如 珠 和 蛋白 基因 -adl 和 -
522。@ 重 复 基 因 发 生 较 多 的 结构 上 的 变化 ， 可 是 仍然 执行 几乎 相同 的 功能 。 例
如 血红 蛋白 的 " 链 和 有 B 链 基因 。@@ 重 复 基 因 的 结构 和 功能 都 发 生 了 较 大 的 变化 ，
如 编码 肌 红 蛋白 和 编码 血红 蛋白 的 基因 。
，， 假 基因 虽然 也 可 以 认为 是 原 有 基因 的 重复 ， 可 是 和 其 他 重复 基因 有 显著 的 区
别 ， 它 们 和 有 功能 的 基因 相 比 除了 一 些 一 般 性 的 变化 以 外 往往 还 有 一 些 特殊 变
化 : @ 缺 少 内 含 子 ;@ 在 假 基因 的 末端 连接 着 许多 d4AMP; @@ 两 端 有 顺 向 重复 序
列 。

根据 这 些 结构 上 的 特点 ， 一 般 认 为 假 基因 似乎 不 是 正常 基因 的 直接 重复 ， 而
是 正常 基因 的 mRNA 经 剪接 以 后 再 经 过 反 转 录 酶 的 作用 合成 相应 的 DNA， 然 后
再 整合 到 染色 体 上 的 结果 。 而 且 整 合 方式 也 不 同 于 一 般 的 同 源 重 组 ， 因 为 在 它 的
两 侧 出 现 顺 向 重复 序列 。 在 这 一 点 上 假 基 因 和 下 面 要 讨论 的 反 转 病毒 相 类 似 。

对 人 的 DNA 进行 琼脂 糖 电 泳 分 析 的 结果 说 明 中 度 重 复 序列 中 除了 一 些 长 短
不 等 的 重复 序列 以 外 ， 总 的 DNA 中 大 约 有 3% 的 重复 序列 长 度 相 等 ， 都 是 大 约
300bp。 一 个 基因 组 中 拷贝 数 大 约 是 3x105 一 5x 105。 在 这 部 分 重复 序列 中 60%
可 以 为 限制 酶 Aix 所 识别 ， 说 明 这 是 一 类 长 度 、 性 质 相 似 的 重复 序列 ， 因 此 称
之 为 Alu 家 族 。

随机 取 人 的 DNA 克隆 100 个 ， 每 个 克隆 中 的 DNA 长 度 是 1.$X104 一 2X
10'bp， 用 Alu 家 族 成 员 DNA 作为 探 针 去 检测 ， 发 现 95% 的 克隆 能 和 它 进 行 杂
交 。 说 明 这 些 片段 中 部 包含 着 Alu 家 族 成 员 。 同 样 也 说 明了 Alu 家 族 的 普遍 性 ，
它 是 中 度 重 复 序列 中 最 普遍 的 一 种 。

Alu 家族 不 只 在 人 基因 中 发 现 ， 非 洲 绿 猴 、 小 鼠 、 中 国人 仓鼠 等 哺乳 动物 中 都
有 。 比 较 这 些 动物 的 Alu 家 族 成 员 的 核 苷 酸 顺 序 ， 可 以 看 到 它们 的 大 部 分 顺序 是

EBD08 ”~

相同 的 ， 特 别 是 3 端 都 有 富 含 4AMP 的 序列 。
这 些 Alu 成 员 在 它们 的 两 端 都 具有 7 一 20bp 的 顺 向 重复 序列 ， 各 个 Alu 成 员
的 两 端的 顺 向 重复 序列 都 不 相同 。 以 下 列 出 两 个 属于 人 Alu 成 员 的 核 苷 酸 顺 序 :
GTTTAGATAAG……Alu……AzGTTTAGATAAA
AAAGAAATG……Alu……Al4GA3GA4GA5GA5GAs 3
AAATAAATGGAlu 序列 两 端的 顺 向 重复 顺序 和 大 肠 杆 菌 中 已 发 现 的 转 座 子 两 侧
的 顺序 相 类 似 。 有 报道 说 同一 个 体 的 不 同 组 织 中 Alu 序列 数 不 相 等 ， 这 一 现象 和
酵母 菌 中 的 转 座 因 子 Ty-] 的 情况 相似 。
除了 Alu 家 族 以 外 哺乳 动物 染色 体 上 还 有 其 他 较 小 的 家 族 。

三 、 反 转 病毒 和 癌 基 因

反 转 病毒 是 一 类 单 链 线 状 RNA 病毒 ， 它 们 通过 反 转 录 酶 的 作用 合成 DNA
中 间 体 ，DNA 中 间 体 经 细胞 质 进 入 细胞 核 ， 然 后 整合 到 染色 体 DNA 上 而 成 为 原
病毒 (provirus)。

反 转 病毒 的 基因 组 包括 两 个 相同 的 线 状 单 链 RNA， 各 长 5 一 10kb (图 10-
3)， 感 染 宿 主 后 通过 反 转 录 酶 的 作用 合成 一 个 双 链 DNA (图 10-4)， 它 的 两 端 出
现 两 个 较 长 的 重复 序列 (LTR)， 每 个 重复 序列 包括 原来 属于 病毒 基因 组 亚 单位
的 两 个 不 同 的 部 分 U3、U5 和 相同 部 分 R (图 10-4)。

人
poly(A)200 氨 键 区 poly(A)200

图 10-3”Rous 肉瘤 病毒 核酸 的 结构

T-U5$ U3-T
病毒 RNA 链
| 5
DNA 4,U3-R-U5 U3-R-U5 ,，
起 4 $
LITR ER

图 10-4 38S 病毒 RNA 链 上 的 末端 序列 及 其 DNA 拷贝 上 的 长 末端 序列 (LTR)
反 转 病毒 RNA 经 反 转 录 后 形成 的 DNA 两 端 存 在 重复 序列 暗示 反 转 病毒 和

.304 ，

， 转 座 子 有 类 似 性 质 。 为 了 进一步 研究 病毒 的 整合 过 程 ， 采 用 了 基因 克隆 手段 来 分

析 原 病毒 和 宿主 染色 体 DNA 交接 处 的 核 苷 酸 顺 序 ， 结 果 发 现在 小 鼠 乳房 瘤 病毒
(mouse mammary tumour virus，MMTV) 每 个 LTR 序列 的 两 端 都 有 Sbp 的 反 向
重复 序列 。 病 毒 DNA 与 宿主 DNA 交接 位 置 处 宿主 DNA 上 有 6bp 顺 向 重复 。

ITrR 的 两 端的 反 向 重复 序列 的 存在 令 人 想到 大 肠 杆菌 的 ISI 两 端的 反 向 重复 序

列 ， 顺 向 重复 序列 的 存在 令 人 想到 转 座 子 两 侧 的 重复 序列 。 大 肠 杆菌 的 Tn 插入
染色 体 两 侧 出 现 顺 向 重复 序列 ， 其 中 一 个 序列 是 染色 体 上 原 有 的 序列 。 除 了
MMTV 外 ， 其 他 反 转 病毒 插入 染色 体 后 也 有 这 些 结构 上 的 特点 ， 如 莫 氏 路 齿 类

。 自在 病 病毒 和 脾脏 坏 血 病 病 毒 。

为 了 进一步 说 明 末 端 重复 顺序 的 功能 ， 在 SNV 中 进行 了 末端 缺失 所 带 来 的
对 于 DNA 复制 或 整合 的 影响 的 研究 ， 发 现 U3 末端 12bp 和 US 末端 8bp 中 一 些
核 苷 酸 的 缺失 使 病毒 不 能 整合 ， 但 是 仍然 能 复制 ， 说 明 它 们 对 整合 是 必要 的 ， 可
对 于 DNA 复制 并 不 必要 。 这 一 实验 结果 与 转 座 子 转 座 所 必需 的 结构 特征 相同 ，

两 端的 重复 顺序 为 转 座 子 转 座 所 必需 ， 反 转 病 毒 的 LTR 则 为 其 整合 所 必需 ， 这
就 给 我 们 提出 了 一 个 问题 ， 反 转 病 毒 除了 通过 染色 体外 复制 并 整合 到 染色 体 上 这

一 过 程 以 外 ， 是 否 还 可 以 像 转 座 子 一 样 直 接 在 基因 组 内 转移 位 置 呢 ? 一 种 内 源 病
毒 〈 原 病毒 ) 在 一 个 染色 体 上 可 以 有 若干 个 ， 这 一 事实 说 明 病毒 可 能 通过 不 止 一

性 种 方式 出 现在 染色 体 的 不 同位 置 上 。 前 面 已 经 指出 许多 长 周期 散 置 重复 序列 的 结

5 人

构 和 整合 的 反 转 病毒 的 结构 相似 ， 所 以 两 者 之 间 的 关系 是 一 个 耐人寻味 的 问题 。
反 转 病毒 有 许多 种 类 。 从 马 、 小 鼠 、 大 鼠 到 疏 行 动物 、 猫 、 人 仓鼠 、 猴 、 猪 、

U 牛 、 鼠 和 人 都 分 离 到 这 类 病毒 。 尤 其 以 乌 类 和 小 鼠 为 最 多 。 有 些 反 转 病毒 具有 复

制 和 繁殖 所 必需 的 全 部 基因 ， 因 此 能 独立 复制 和 繁殖 。 另 一 些 则 缺失 了 某 些 基
因 ， 因 此 只 有 在 野生 型 作为 辅助 病毒 存在 于 同一 细胞 时 才能 复制 和 繁殖 。

通常 反 转 病毒 含有 反 转 酶 基因 (zol )、 衣 壳 蛋 白 基 因 (ero) 和 启动 区
(c)。 除 了 与 病毒 的 复制 和 繁殖 有 关 的 基因 外 ， 许 多 反 转 病毒 的 基因 组 中 还 有 癌
基因 sc (肉瘤 病毒 癌 基 因 ) 和 来 源 于 宿主 细胞 的 瘤 基 因 ozc。

反 转 病毒 感染 宿主 后 能 使 宿主 产生 肿瘤 ， 也 能 使 培养 中 的 成 纤维 细胞 发 生 恶
性 转化 。 将 这 些 转化 细胞 接种 到 动物 身上 能 引起 肿瘤 生长 ， 这 是 因为 许多 反 转 病
毒 的 基因 组 中 有 sxc 或 omc 基因 的 缘故 。

鸟 造 白细胞 组 织 增生 病毒 (ALV) 基因 组 中 虽然 既 无 swrc 基因 又 无 orxc 基
因 ， 可 是 经 过 很 长 潜伏 期 后 也 能 引起 肿瘤 ， 这 是 由 于 它 整 合 在 染色 体 上 的 一 个 瘤
基因 的 近 劳 而 使 它 被 激活 的 缘故 。 人 和 动物 的 癌 基 因 便 是 从 反 转 病毒 的 研究 开始
的 。

癌 基 因 的 发 现 是 反 转 病毒 研究 和 分 子 生 物 学 技术 相 结 合 的 结果 。 应 用 基因 克
隆 、Southern blot 和 分 子 杂 交 方 法 首先 于 1976 年 发 现 鸟 类 的 基因 组 DNA 中 具有
与 劳 氏 和 肉瘤 病毒 的 src 基因 核 苷 酸 顺 序 相 近似 的 序列 ， 接 着 又 发 现在 哺乳 动物 的
05 ”。

DNA 中 也 有 这 些 序列 。 随 着 反 转 病毒 中 更 多 癌 基 因 的 发 现 ， 同 时 也 证 实 了 这 些
癌 基 因 的 同 源 序列 都 可 以 在 动物 的 基因 组 中 找到 ， 为 了 便于 区 别 ，Cofffin 等 于
1981 年 提出 了 一 个 统一 命名 规则 。 把 属于 病毒 的 癌 基 因 称 为 病毒 瘤 基 因 (viral
oncogene， V-oxc)， 把 属于 动物 细胞 的 癌 基 因 称 为 细胞 癌 基 因 (cellular onco-
gene，C-oxc )， 把 来 自 某 种 病毒 的 癌 基 因 用 病毒 名 称 的 缩写 表示 。 例 如 把 来 自 成
扩 细 胞 性 白血病 病毒 (myeloblastoma virus) 的 癌 基 因 称 为 加 光 ， 把 来 自 成 髓 细
胞 瘤 病 毒 (myelocytomatosis virus) 的 瘤 基 因 称 为 xye， 把 来 自 肉 瘤 病 毒 (sarco-
ma virus) 的 瘤 基 因 称 为 yc， 把 来 自 大 鼠 瘤 病毒 (rat sarcoma virus) 的 癌 基 因 称
为 ras， 有 时 两 种 癌 基 因 来 自 同一 种 病毒 ， 那 么 它们 分 别 用 A、B 表 示 。 例 如 来
自 红细胞 增殖 病毒 (erythroblastosis virus) 的 两 种 癌 基 因 称 为 erpA、erp-B。 原
癌 基 因 (proto-oncogene) 指 具 有 致癌 活性 基因 的 无 活性 原型 。 将 近 20 年 来 的 研
究 结 果 表 明正 常 细胞 中 具有 无 活性 的 原 瘤 基因。 它们 可 以 通过 种 种 方式 被 活化 而
成 为 癌 基 因 。

到 现在 为 止 已 经 发 现 反 转 病毒 的 癌 基 因 (V-oxzc) 有 十 几 种 ， 每 一 种 都 有 它
的 相应 的 Coxc， 许 多 C-onc 具有 近似 的 核 苷 酸 顺 序 。 此 外 还 发 现 几 个 不 同 的 瘤
基因 编码 同一 种 酶 一 一 酷 氨 酸 专 一 的 蛋 上 质 激酶 。 这 些 事实 都 说 明正 常 动物 基因
组 中 存在 着 瘤 基 因 家 族 ， 其 中 可 能 包括 50 一 100 个 癌 基 因 ， 这 些 基 因 分 布 在 几 条
染色 体 上 。

除了 在 兰 椎 动物 以 外 还 在 果 蝇 和 线虫 中 也 发 现 有 瘤 基 因 ， 这 些 交 基 因 不 但 和
高 等 动物 中 的 癌 基 因 在 核 苷 酸 顺 序 方 面 显示 出 同 源 性 ， 而 且 可 能 也 在 功能 上 相
似 ， 例 如 在 果 晶 一 些 组 织 中 发 现 酷 氨 酸 专 一 的 蛋白 激酶 ， 这 酶 也 被 劳 氏 肉瘤 病毒
的 乙 sc 基因 和 乌 类 及 哺乳 类 的 C-wc 基因 所 编码 。

由 于 反 转 病毒 和 许多 动物 的 基因 组 有 相同 或 相似 的 瘤 基因， 必然 会 发 生 这 样
的 问题 : 这 些 基 因 来 源 于 病毒 还 是 来 源 于 动物 基因 组 ? 以 下 几 方面 的 事实 说 明 瘤
基因 来 源 于 动物 基因 组 : @ 在 各 种 动物 中 瘤 基 因 的 数目 和 位 置 比较 固定 ， 可 是 在
反 转 病毒 中 的 数目 和 位 置 则 不 固定 ;@ 线 虫 和 果 蝇 等 生物 中 发 现 与 高 等 动物 瘤 基
因 同 源 的 基因 ， 可 反 转 病毒 不 能 感染 这 些 生物 ; @ 在 许多 高 等 动物 癌 基 因 中 发 现
有 内 含 子 ， 反 转 病毒 的 癌 基 因 中 则 没有 内 含 子 ; 由 动物 的 瘤 基 因 可 以 被 反 转 病毒
所 转 导 。

瘤 基 因 是 有 害 基因 ， 为 什么 真 核 生物 基因 组 中 包含 这 么 多 瘤 基 因 呢 ? 一 种 解
释 是 癌 基 因 是 正常 生长 和 发 育 所 必需 的 ， 在 正常 组 织 中 瘤 基 因 常 有 不 同 程度 的 表
达 ， 一 些 实验 指出 这 些 基 因 的 表达 有 组 织 专 一 性 ， 如 茶 一 种 反 转 病毒 只 能 使 某 一
些 器 官 生 长 肿瘤 ， 而 且 只 能 使 某 些 细胞 发 生 转 化 。 癌 的 遗传 倾向 性 也 是 组 织 专 一
的 ， 许 多 瘤 基 因 在 各 种 组 织 中 或 者 在 不 同 的 发 育 阶 段 的 表达 往往 不 同 ， 这 些 事实
暗示 我 们 原 瘤 基 因 可 能 是 一 些 正 常 发 育 所 必需 的 基因 ， 是 基因 组 的 正常 成 分 。

病毒 引起 癌变 ， 这 一 事实 首先 在 1911 年 由 Ross 所 发 现 。 他 发 现 由 鸡 的 肉瘤

*。 306 。

只

中 所 提取 的 病毒 能 诱发 肿瘤 ， 因 此 这 一 病毒 称 Ross virus。 这 一 发 现 当 时 并 没有
受到 注意 。

肿瘤 可 以 由 许多 因素 引起 ， 这 使 得 肿瘤 起 因 的 研究 发 生 困难 。 自 从 发 现 了 病
毒 的 致癌 作用 是 由 于 带 有 瘤 基 因 ， 并 且 由 于 以 后 证 实 动物 细胞 中 存在 为 数 不 少 的

原 瘤 基因 ， 而 这 些 原 瘤 基因 整合 到 病毒 中 以 后 转变 为 瘤 基因 ， 于 是 瘤 变 的 真正 原

因 的 探索 便 出 现 了 新 的 希望 。 既 然 正常 细胞 中 存在 着 原 瘤 基因 ， 既 然 这 些 基 因 整
合 到 病毒 中 以 后 会 被 激活 ， 那 么 这 些 基因 在 不 脱离 正常 的 基因 组 时 会 不 会 也 被 激

是 活 呢 ? 因此 原 瘤 基因 被 激活 的 问题 是 一 个 受到 十 分 重视 的 课题 。

最 简单 的 情况 是 原 癌 基 因 整 合 在 反 转 病毒 的 下 游 ， 在 这 种 情况 下 不 被 转录 的
原 瘤 基 因 便 被 转录 ， 也 就 是 说 原 瘤 基 因 被 激活 成 瘤 基因， 这 些 反 转 病毒 感染 动物
以 后 整合 到 动物 基因 组 上 ， 被 激活 的 癌 基 因 便 通过 促使 染色 体 复 制 和 细胞 分 裂 而

。 井 成 癌变 。

了 人

鸟 类 白血病 病毒 (ALV) 的 基因 组 中 并 没有 瘤 基因 ， 可 是 它 能 够 引起 肿瘤

时 生长 ， 这 是 因为 它 整合 在 细胞 瘤 基因 〈C-yc) 的 近 旁 的 缘故 。 转 录 产 物 测定 结

， 果 说 明 Cayc 的 转录 在 其 旁 整合 有 ALV 的 情况 下 增加 100 倍 ， 类 似 的 现象 也 在

二 些 其 他 病毒 感染 中 发 现 。

没有 病毒 感染 的 情况 下 原 癌 基 因 怎 样 被 激活 是 一 个 更 有 实际 意义 的 问题 。 人
的 膀胱 肉瘤 组 织 原 癌 基因 C-ras 的 激活 是 由 于 发 生 了 一 个 碱 基 对 的 置换 (G-~
T)， 它 使 编码 的 蛋白 质 中 发 生 了 一 个 氨基 酸 的 取代 (甘氨酸 变 为 绑 氢 酸 )。

染色 体 畸 变 可 能 是 另 一 个 原因 。Burkitt 氏 淋 巴 瘤 (一 种 B 细胞 肿瘤 ) 的 细
胞 中 有 一 个 基因 易 位 ， 它 把 第 八 染色 体 上 的 一 个 原 癌 基 因 转 移 到 第 十 四 染色 体 的
免疫 球 蛋 白 基因 的 旁边 ， 类 似 现象 也 在 小 鼠 的 浆 细 胞 中 发 现 ， 它 的 十 五 染色 体 上
的 C-zyc 易 位 到 第 十 二 染色 体 上 。

基因 激活 的 结果 或 是 导致 基因 产物 的 量 的 增加 ， 或 是 导致 产物 的 质 的 变化
《如 酶 的 活性 及 底 物 专 一 性 改变 )。 癌 细胞 的 一 个 最 主要 的 特性 是 无 控制 的 细胞 分
裂 ， 细 胞 分 裂 以 前 先 要 进行 DNA 复制 ， 细 胞 的 表面 结构 也 随 着 癌变 而 发 生变
化 ， 癌 基因 产物 怎样 发 生 影 响 ， 这 些 问 题 还 有 待 于 进一步 研究 解决 。

、 真 核 细胞 中 的 转 座 因子

酵母 菌 是 低 等 真 核 生 物 ， 它 的 基因 组 虽然 在 许多 方面 与 原核 不 同 ， 但 其 转 座
子 却 在 许多 方面 与 细菌 的 转 座 子 相似 ， 包 括 它 的 遗传 学 效应 。 它 能 导致 染色 体 畸
变 ， 它 的 两 端 有 重复 等 。 转 座 子 Ty-1 (transposion yeast) 的 大 小 为 6.Skb， 有 两
个 8 的 顺 向 重复 序列 ， 其 长 度 为 0.25Skb。 酵 母 菌 基因 组 上 的 8 序列 大 约 有 100
个 ， 暗 示 8$ 也 是 转 座 子 。

在 不 同 品系 中 Ty-l 片段 数目 不 同 。Ty-l 所 在 的 位 置 也 不 同 ， 这 些 都 说 明

. 307

Ty-l 是 可 以 转移 位 置 的 DNA 序列 。Ty-l 插入 基因 球 s4 造成 自发 突变 ， 择 入 位
置 出 现 克 s4 基因 两 侧 有 五 个 核 苷 酸 对 的 重复 。

1. 果 蝇 的 转 座 因子

果 蝇 的 转 座 因子 P 因子 的 存在 可 以 为 宿主 带 来 一 系列 的 异常 现象 ， 这 些 现
象 常 出 现在 品系 间 杂 交 子 代 中 ， 所 以 称 为 杂交 退化 综合 征 〈hybrid dysgenesis
syndrom)， 如 卵 梨 发育 不 全 ， 以 及 雄性 个 体 中 的 重组 ， 高 突变 率 等 。

2. 玉米 中 的 解 离 因子 、 活 化 因子

20 世纪 40 年 代 发 现 玉米 中 有 解 离 因子 (DS) 和 活化 因子 (AC)， 这 些 因子
与 转 座 子 一 样 引起 插入 突变 。

五 、 真 核 细胞 中 的 线粒体 基因 组 和 叶绿体 基因 组

真 核 细胞 中 除了 核 基因 外 ， 还 有 线粒体 DNA 和 叶绿体 DNA， 它 们 是 生命 活
动 所 必需 的 ， 这 一 点 与 原核 生物 不 同 ， 原 核 生 物 的 染色 体外 DNA“〔 质 粒 ) 不 是
细胞 生活 所 必需 的 。

线粒体 和 叶绿体 基因 组 除了 一 部 分 基因 编码 它 本 身 的 核糖 体 蛋 上 折 质 和 tRNA
以 外 ， 还 有 一 部 分 基因 编码 某 些 蛋 白质 的 一 些 亚 基 。 它 们 和 核 基 因 编 码 的 亚 基 共
同 组 成 有 功能 的 蛋白 质 。 如 玉米 等 植物 的 二 磷酸 核 酮 糖 转化 酶 的 大 亚 基 由 叶绿体
基因 所 编码 ， 它 的 小 亚 基 由 核 基因 所 编码 。

一 些 事实 暗示 我 们 核 基因 组 、 线 粒 体 基 因 组 和 叶绿体 基因 组 之 间 可 以 发 生 基
因 交 流 ， 酵 母 菌 的 ATPase 的 基因 属于 线粒体 基因 组 ， 脉 孢 菌 的 编码 ATPase 的
基因 却 属于 核 基 因 组 。 玉 米线 粒 体 基 因 组 和 叶绿体 基因 组 有 12kb 的 同 源 序列 。

酵母 菌 的 基因 Vas! 是 一 个 线粒体 基因 组 中 与 线粒体 核糖 体 装 配 有 关 的 基
因 。 用 .coii 质粒 pPBR322 克隆 这 一 基因 ， 制 备 这 一 基因 的 探 针 ， 用 它 与 干 酵
母 核 DNA 进行 Southern 吸 印 杂 交 ， 发 现在 核 DNA 中 有 同 源 序列 。

根据 以 上 事实 可 以 认为 核 基因 组 和 线粒体 或 叶绿体 基因 组 间 可 以 发 生 基因 交
流 。 这 些 事实 也 支持 共生 进化 学 说 ， 认 为 真 核 生 物 的 线粒体 和 叶绿体 来 源 于 远古
时 代 的 共生 生物 。 从 共生 开始 以 后 可 能 便 不 断 地 发 生 着 共生 生物 和 宿主 细胞 之 间
的 基因 交流 。

二 节 ， 真 核 基因 的 结构

真 核 细 胞 的 重要 特点 是 细胞 分 化 为 细胞 核 和 细胞 质 ， 整 个 基因 组 几乎 全 部 包
括 在 细胞 核 内 ， 基 因 在 核 内 以 染色 体 的 形式 存在 ， 核 膜 把 细胞 核 和 细胞 质 隔 开 。
308 ，

本

对 真 核 基因 的 早期 研究 是 搞 清 染 色 体 的 组 成 、DNA 分 子 在 染色 体 中 的 存在 状态
和 数目 等 。 对 染色 体 的 化 学 分 析 的 结果 是 : 大 约 1/5 是 DNA，2/3 是 蛋 日 质 ，
还 有 少量 的 RNA。20 世纪 70 年 代 改 进 了 DNA 的 提取 方法 。 在 提取 过 程 中 尽量
避免 了 扯 断 ， 测 得 DNA 的 分 子 质量 大 小 刚好 等 于 一 条 染色 体 中 的 DNA 含量 。
通过 大 量 实验 以 后 ，1974 年 以 后 一 臻 公认， 每 条 复制 前 的 真 核 染 色 体 只 有 一 个
连续 不 断 的 DNA 双 螺 旋 分 子 。 即 使 在 着 丝 点 处 也 不 中 断 ， 复 制 后 的 染色 体 则 有
两 个 DNA 分 子 ， 即 每 条 染色 单 体 有 一 个 DNA 双 链 分 子 。 之 后 便 开 始 了 对 真 核
细胞 特定 基因 的 结构 及 表达 的 研究 。

一 、FrRNA 基因

rRNA 是 细胞 中 主要 的 转录 产物 之 一 ， 在 高 等 真 核 生 物 中 要 求 有 众多 为
rRNA 编码 的 基因 拷贝 。 这 些 基因 都 位 于 细胞 核
内 。 在 许多 高 等 真 核 生 物 中 ， 这 些 基 因 一 前 一 后 ….， SN 和 汐
地 串联 排列 ， 并 且 在 电子 显微镜 下 可 以 看 到 在 转 .ARRAY
录 中 的 各 重复 单位 的 情况 。 图 10-5 是 rDNA 被 转 0
录 的 电镜 照片 。

每 个 转录 单位 被 不 转录 的 间隔 区 分 开 。 被 转
录 的 区 域 被 RNA 聚合 酶 和 新 生 的 RNA 链 包 围
着 。 新 生 RNA 链 和 有 蛋白质 联系 在 一 起 产生 前 核
糖 体 粒 子 。 这 些 粒子 中 含有 成 熟 核 糖 体 中 的 蛋白
质 以 及 还 有 一 些 非 核糖 体 核 蛋白 ， 这 些 蛋白 具有
内 切 核酸 酶 活性 ， 参 与 rDNA 初级 转录 产物 的 加
“本

人 肿瘤 细胞 系 Hela 细胞 的 rDNA 的 初级 转录
产物 是 4$SS。 经 加 工 后 产生 18S 和 28S (图 10-6)。

目前 对 几 种 生物 的 rRNA 基因 的 结构 及 转录
加 工 过 程 都 研究 得 比较 清楚 。

1. 非洲 爪 蛙 的 rRNA 基因

用 原 位 分 子 杂 交 法 也 可 证 明 rRNA 基因 在 随
体 染 色 体 的 核 仁 组 织 区 上 。 而 SS RNA 基因 则 分
布 在 几乎 所 有 染色 体 的 端 部 。
rRNA 基因 和 SS RNA 基因 是 最 早 分 离 成 功 ,时
的 真 核 基因 。 这 是 由 于 它们 在 染色 体 上 多 次 重复 ，“ 图 10.5 爪 蛙 细胞 核 IDNA
并 且 它 们 的 G+C 含 量 比 其 他 DNA 高 ， 所 以 很 容 基因 转录 的 电镜 照片
*。309 ，

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ESSSSSSSSSSSSSSSSSSSSL
28 $ 18 $
SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS SSsSSSSSSI

10-6 ”Hela 细胞 rRNA 的 结构 图

易 通 过 CsCl 密度 梯度 离心 将 其 分 离 。

1966 年 M.Birnstie 等 将 DNA 分 离 成 功 并 进行 研究 后 很 快 得 出 以 下 结论 ;
rRNA 基因 在 染色 体 上 重复 多 次 ， 每 个 核 仁 组 织 区 有 约 450 个 拷贝 首尾 相 接 ，
因此 每 个 二 倍 体 细 胞 内 约 900 个 拷贝 。@ 基 因 和 基因 之 间 有 间隔 区 (spacer)， 即
不 转录 部 分 。 转 录 子 与 间隔 区 相间 排列 ，rDNA 应 包括 IRNA 基因 和 间隔 区 。

他 们 用 放射 性 标记 的 18S RNA 和 28S RNA 分 别 与 非洲 爪 蛙 体 细胞 DNA 分
子 杂 交 ， 发 现 体 细胞 DNA 中 有 0.04% 一 0.07% 和 28S RNA 杂交 。 有 0.025% 一
0.04% 的 DNA 与 18S RNA 杂交 。 已 知 28S RNA 的 分 子 质 量 是 1.4 X 10'Dae
18S RNA 的 分 子 质量 是 0.7 x 105Da， 后 者 是 前 者 的 一 半 ， 分 子 杂 交 的 量 也 是
18S 约 为 28S 的 一 半 ， 因 此 认为 28S DNA 和 .18S DNA 的 拷贝 数 相等 。

D.D.Brown 等 1968 年 用 3H 标记 的 18S RNA 和 28S RNA 一 起 和 DNA 做 分
子 杂 交 ， 结 果 杂 交 的 总 量 为 总 DNA 的 0.057%。

已 知 非洲 爪 蛙 的 单个 基因 组 的 DNA 重量 约 为 3pg (lpg=10 -2g)， 假 定 和
RNA 杂交 的 DNA 单 链 的 重量 和 杂交 的 RNA 量 大 致 相等 ， 则 可 计算 其 拷贝 数 。

考虑 到 DNA 扯 断 的 长 度 不 会 刚好 相当 于 18S RNA 和 28S RNA 的 长 度 ， 因
此 杂交 的 DNA 单 链 比 RNA 链 略 长 一 些 ， 大 致 估计 每 单 倍 体 基 因 组 内 rRNA 基
因 拷 贝 数 在 450 左右 。

将 rDNA 用 弱 碱 溶液 处 理 ， 部 分 变性 后 在 电镜 下 可 以 看 到 其 部 分 变性 图 。
rRNA 基因 拷贝 首尾 相 接 ， 变 性 部 分 是 DNA 双 链 中 A、 工 含量 高 的 区 域 拆 开 成
的 单 链 ， 而 G、C 含量 高 的 区 域 仍 保持 不 变性 的 双 链 (图 10-7)。 从 图 '10-7 上 看
出 每 一 重复 单位 平均 长 6um， 不 变性 段 为 lm， 变 性 段 为 Sum。 已 知 28S RNA
和 18S RNA 中 G+C 含量 特别 高 ， 因 此 推测 不 变性 区 是 编码 rRNA 基因 部 分 ，

"310i 。

变性 区 是 间隔 区 。 从 转录 初级 产物 为 40S

(pre RNA) 的 分 子 质 量 大 约 是 2.6 x 104Da
来 看 ，DNA 中 每 一 转录 区 段 应 是 3.Spm， 变性 区
间隔 区 约 为 2.Sum。 非 变性 区

非洲 爪 蛙 rDNA 的 初级 转录 产物 为 40S。
经 加 工 后 产生 三 种 rRNA: 18S RNA、5.8S
RNA 和 28S RNA。 一 个 rRNA 基因 重复 单
位 和 它 在 染色 体 上 的 排列 如 图 10-8 所 示 。

图 中 不 转录 的 部 分 为 外 部 间隔 区 (SP-
ej， 也 称 为 不 转录 的 间隔 区 (NTS)， 初 级
转录 产物 中 在 加 工时 切除 的 部 分 为 内 部 间隔
区 (SP-i， 图 中 斜 线 部 分 )。

2. SS RNA 基因

个 重复 单位
10-7 Triturus Viridisen 游离 核 仁 的
爪 蛙 的 SS RNA 基因 研究 得 最 为 清楚 ， 部 分 变性 图
5S RNA 的 碱 基 顺 序 已 全 部 测定 ，5S RNA 上 的 启动 区 顺序 已 测定 ， 间 隔 区 顺序
也 已 知道 。

0 不 转录 的 间隔 区
18S 28S |

重复 单位
02X00 碱 基 对 ) 一 一 一 |
转录 单位 一 一 |

图 10-8 和 爪 蛙 40S 前 体 rRNA 基因

SS DNA 占 基因 组 总 DNA 的 0.7%， 每 单 倍 体 基 因 组 中 有 24 000 拷贝 ， 分
布 在 几乎 所 有 染色 体 的 端 部 ， 每 条 染色 体 端 部 有 1000 一 2000 拷贝 。

用 弱 碱 溢 液 处 理 SS DNA 可 得 到 变性 和 不 变性 部 分 交替 出 现 的 部 分 变性 图
(图 10-9)， 间 隔 区 与 转录 区 比例 是 6:1。5SS RNA 基因 在 染色 体 上 的 排列 也 是 首
尾 相 接 。5SS RNA 基因 每 个 重复 单位 为 720bp， 非 转录 部 分 除了 间隔 区 外 还 有 一
个 假 基 因 (图 10-10)。

爪 蛙 SS 基因 却 有 两 种 ， 卵 母 细 胞 一 种 ， 体 细胞 一 种 ， 相 差 6 个 bb，5S
RNA 121bp， 假 基因 101bp。 假 基因 101bp 中 与 SS RNA 有 10 个 bp 不 同 ， 并 且
缺失 了 SS RNA3 端的 19 个 bp， 启 动 区 有 9 个 bp 不同 。 图 10-11 是 不 同 SS RNA
基因 的 不 同 结构 。 有 些 有 假 基 因 ， 有 些 则 没有 假 基 因 。

图 10-9 非洲 爪 蛙 SS DNA 部 分 变性 图

5S$
属 上 大 等 录 一 一 >|

FF 一 一 一 一 重复 单位 一 一 >|
(720 碱 基 对 )

图 10-10 不 蛙 .SS RNA 基因

AT- 丰富 间隔 区 基因 假 基因

Fe 一 360~-570bp 一 -一 120bp >i<73bpz<106bp~1

(3)
基因
(b)
基因 1 基因 2 基因 3

He 一 一 199bp 一 一 >~|< 一 120bp>>i<79bpzl< 一 120bp >>H<78bp->he120bp -kk52bpz，
(9)

GC- 丰富 间隔 区 基因

人
FF- 750bp 一 > 一 120bpz|

(d)

基因
一

he 一 一 一 230+Sbp 二
15Sbp

(e)

图 10-11 不 同 的 SS RNA 基因 的 结构
(a) 爪 蛙 大 卵 母 细 胞 ; (b) 爪 蛙 微 卵 母 细胞 ;
(c) 爪 蛙 卵 母 细 胞 ; (d) 爪 蛙 组 织 细胞 ; (e) 黑 腹 果 晶 。

2

二 、tRNA 基因

tRNA 虽 小 但 也 是 细胞 核酸 重要 的 组 成 成 分 。tRNA 是 一 组 具有 广泛 作用 的
RNA， 除 了 作为 合成 多 肽 链 过 程 中 氨基 酸 的 运载 工具 外 ， 还 起 其 他 方面 的 重要
作用 。 例 如 大 肠 杆菌 色 所 酸 操 纵 子 中 的 弱化 依赖 于 携带 有 色 氢 酸 的 疏 NAI 的 水
平 ， 而 葡萄 球菌 的 细胞 壁 的 合成 与 新 的 了 NASY 种 类 相关 联 ， 在 逆转 录 病 毒 基因
组 的 3 末端 存在 连 有 tRNA 的 结构 ， 某 种 特定 的 tRNA 可 以 具有 反 向 转录 的 引物
作用 。 这 表明 在 高 等 生物 中 tRNA 的 功能 也 有 类 似 的 差异 ， 出 于 不 同 的 需要 ， 可
以 估计 在 正常 发 育 和 瘤 形成 期 间 大量 不 同类 型 的 tRNA 发 生 改 变 。 因 此 对 tRNA
基因 的 研究 具有 广泛 的 意义 。

1. tRNA 基因 的 数目

对 真 核 生 物 tRNA 基因 的 研究 也 是 从 非洲 爪 蛙 开始 的 。 用 分 子 杂 交 的 方法 研
， 究 tRNA 基因 的 结果 说 明 爪 蛙 tRNA 基因 有 以 下 特点 : QDIIRNA 基因 重复 多 次 且
各 自 成 从 。@ 基 因 拷 贝 很 多 且 基 因 之 间 有 间隔 区 。 现 在 已 对 许多 种 生物 的 不 同
谎 NA 基因 进行 研究 ， 发 现 不 同 生物 中 ， 其 细胞 中 tRNA 基因 总 数 各 不 相同 ， 从
几 百 到 几 千 ; 某 一 种 RNA 的 基因 数 在 不 同 生 物 中 也 不 相同 ， 从 几 个 到 几 百 个 。

2. tRNA 基因 的 排列

在 真 核 生 物 中 ， 已 知 tRNA 基因 拷贝 数 很 多 ， 那 么 这 些 tRNA 基因 在 基因 组
上 是 如 何 组 织 的 便 成 了 一 个 有 趣 的 问题 。 它 们 是 分 散 存 在 还 是 成 丛 存 在 ? 是 每 种
tRNA 基因 各 自 成 从 还 是 和 其 他 tRNA 基因 一 起 ? 是 否 存在 一 个 按 功能 的 逻辑 进
行 排列 ? 很 多 实验 表明 真 核 生 物 中 的 RNA 基因 的 组 织 最 显著 的 特点 是 多 样 性 。

三 、 为 蛋白 质 编码 的 基因

真 核 生 物 中 为 蛋白 质 编码 的 基因 ， 研 究 得 最 快 的 是 海胆 的 组 蛋白 基因 。 所 有
动 、 植 物 细胞 染色 体 中 都 含有 一 类 叫 组 蛋白 的 碱 性 蛋白 ， 组 蛋白 与 DNA 形成 染
色 体 的 核 小 体 (nucleosome)。 海 胆 染 色 体 上 的 组 蛋白 有 $ 种 : HI、H2A、H2B、
H3 和 H4， 由 5 个 基因 编码 ， 这 五 个 基因 组 成 一 个 重复 单位 。 基 因 之 间 有 间隔
区 ， 一 个 重复 单位 全 长 约 6500bp。 在 染色 体 上 首尾 相 接地 重复 数 百 次 。

海胆 卵 母 细 胞 受精 后 几 小 时 分 裂 9 一 10 次 ， 组 蛋白 也 增加 2? 一 28 倍 ， 所 以

此 时 的 mRNA 很 容易 提取 。 提 取 到 其 mRNA 后 ， 可 以 与 其 DNA 进行 分 子 杂 交 ，

从 而 提取 组 蛋白 DNA。 用 限制 性 内 切 核酸 酶 束 z"d III 处 理 ， 切 口 在 HI 和 H4 基

因 之 间 ， 因 此 一 个 不 xdIII 片段 正好 是 一 个 重复 单位 。 图 10-12 是 一 个 重复 单位
“和 上 胸 。

图 10-12 海胆 组 蛋白 DNA 一 个 重复 单位 的 部 分 变性 电镜 照片

的 部 分 变性 图 。

在 人 类 细胞 中 ， 也 有 5 个 组 蛋 日 基因 组 成 一 个 重复 单位 ， 基 因 位 于 第 七 对 染
色 体 短 辟 上， 接近 于 着 丝 点 。 重 复数 十 次 ， 人 类 体外 培养 的 Hela 细胞 也 是 5 个
组 蛋白 基因 组 成 一 个 重复 单位 。 组 蛋白 基因 的 数目 及 排列 变化 很 大 ， 甚 至 是 关系
很 近 的 生物 之 间 都 有 显著 的 差别 。 表 10-1 是 几 种 生物 的 DNA 含量 复制 速率 及 组
蛋白 基因 拷贝 数 的 比较 。 从 表 中 可 以 看 出 组 蛋白 基因 的 数目 与 基因 组 的 大 小 ， 特
别 是 与 其 复制 速度 有 关 。

表 10-1 组 蛋白 基因 数目 和 DNA 最 大 速率 合成 比较

中 DNA 已 知 最 短 复 制 时 间 DNA 合 成 的 最 大 速率 ”组 蛋白 基因 拷贝 数
/(pg/ 细 胞 单 倍 体 ) /h /(pg/b) ( 单 倍数 )
人 3 14 0.21 10 一 40
也 3 2 0 这 5 10 一 40
鸡 1.26 0.35 3.6 10
爪 峙 2 0.25 16.8 20 一 50
海 胆 (077 0.75 1 300 一 600
果 蝇 0.17 0.17 1.0 100
酵 母 0.025 1.0 0.025

以 上 我 们 介绍 的 都 是 重复 多 次 的 基因 ， 从 方法 上 讲 ， 只 有 重复 次 数 多 的 基
因 ， 才 容易 从 细胞 中 直接 得 到 ， 而 要 得 到 单 拷贝 基因 则 很 不 容易 。 一 般 是 采用 先
获得 基因 的 转录 产物 mRNA， 再 把 mRNA 反 转 录 成 cDNA。 但 由 于 基因 工程 技
术 的 发 展 ， 可 以 将 任何 一 目的 基因 在 细菌 中 扩 增 ， 得 到 大 量 的 克隆 化 基因 ， 对 真
核 单 拷贝 基因 的 研究 就 方便 多 了 。

四 、 内 部 间隔 区 和 隔 月 基因

真 核 基 因 的 结构 ， 在 1977 年 有 重大 发 现 ， 即 发 现 了 “内 部 间隔 区 ”。 所 谓 内
' 314 ，

部 间隔 区 是 : 某 些 基因 的 转录 产物 mRNA 分 子 是 一 个 连续 不 断 的 核 苷 酸 共 价 结
侣 的 分 子 ， 但 它 却 是 从 DNA 上 不 相连 续 的 片段 上 转录 下 来 的 。

1977 年 7 月 ， 美 国 冷泉 港 定量 生物 学 论文 报告 会 上 几 个 实验 室 同 时 报告 了
这 一 现象 。 当 时 只 限于 两 种 真 核 动物 病毒 ， 即 猴 病 毒 SV40 和 腺 病毒 ， 但 会 后 很
快 又 陆续 报道 真 核 生 物 本 身 的 各 种 基因 也 具有 内 部 间隔 区 ， 如 兔 和 小 鼠 血 红 蛋 白
8B 链 基因 、 鸡 卵 白 蛋白 基因 、 小 鼠 免 疫 球 蛋白 基因 、 酵 母 tRNA 基因 、 果 蝇
TRNA 基因 以 及 鸡 劳 氏 肉瘤 病毒 和 鼠 白血病 病毒 基因 等 。 在 为 蛋白 质 编码 的 基因
中 ， 内 部 间隔 区 甚至 可 以 位 于 编码 部 分 内 部 。

以 SV40 病毒 和 鸡 卵 白 蛋白 基因 为 例 ， 介 绍 其 转录 加 工 情 况 。

1. 猴 病 毒 SV40

SV40 是 环 状 双 链 DNA 病毒 ，DNA 长 $S224bp， 其 物理 图 谱 以 EcoR I 的 切
点 为 零 , 将 全 长 分 为 100 等 份 ， 名
以 百分数 表示 ， 或 全 环 为 1， 等
分 为 100 等 份 后 以 小 数 表 示 。
SV40 的 环 状 DNA 上 ， 限 制 酶
EcoR 工 有 一 个 切 点 为 零 ， Hpa II
和 ij&o 工 共有 三 个 切 点 .0.17、
0.67 和 10.735 (图 10-13)。

SV40 感染 和 宿主 后 ， 在 其
DNA 复制 之 前 就 转录 出 mRNA，
称 为 早期 转录 。 早 期 转录 经 翻译
产生 工 和 + 抗原， 图 中 SV40 基
因 组 环 外 带 箭 头 的 线 代 表 早期 mRNA
mRNA， 环 内 带 箭头 的 线 表 示 这
几 种 蛋白 质 的 基因 在 基因 组 上 的
位 置 ， 病 毒 DNA 开始 复制 后 除
早期 转录 外 ， 在 相反 方向 增加 了
晚期 转录 ， 晚 期 转录 经 翻译 后 产生 三 种 蛋白 质 VP1、VP2 和 VP3。

SV40 DNA 的 转录 是 一 个 包括 按时 间 调 控 (早期 王 晚 期 ) 和 广泛 的 mRNA
加 工 的 复杂 过 程 ， 这 个 过 程 中 选择 性 地 除去 起 始 和 终止 密码 ， 早 期 和 晚期 转录 是
在 DNA 的 不 同 链 以 不 同 的 方向 进行 ， 转 录 的 启动 区 靠近 DNA 复制 原点
(图 10-13)。 图 10-14 (〈a) 表示 单个 早期 mRNA 分 子 编码 工 和 tt 两 种 抗原 ， 在 物
理 图 上 0.66 处 开始 转录 ， 一 个 AUG 密码 子 是 两 种 抗原 蛋白 的 起 始 密码 ， 这 个
早期 mRNA 以 两 种 不 同 的 方式 被 加 工 产生 单 顺 反 子 mRNA 分 子 ， 一 种 产生 工 抗
原 ， 另 一 种 产生 t 抗原 。 加 工 的 模式 : 四 切除 内 含 子 1 (intron 1) 产生 mRNA

人 S“

图 10-13 SV40 的 物理 图 谱
( 采 自 J.D.Watson，1987)

1， 此 mRNA 从 AUG 起 始 到 Stop 1 终止 翻译 产生 t 抗原 ; @ 切 除 内 含 子 2 ( 远
tron 2)，intron 2 和 intron 1 有 相同 的 3 末端， 切除 后 产生 的 mRNA 从 同样 的

AUG 起 译 到 Stop 2 终止 产生 工 抗原 。 工 抗原 比 t+ 抗原 大 得 多 ， 这 两 种 抗原 的 N
端 片段 是 相同 的 。

|
ee 终止 子 1 终止 子 2

AUG, AUG， AUG 终 止 子 4.5 终 士 子 3
二

， 切 队
LF---- AUG,Y 终 止 子 5 终止 子 3
1 一 一 (一 人 一 一

| 内 含 子 3 -二
AUG Y 终止 子 4.5

| 人

图 10-14 _SV40 mRNA 的 加 工
(a) 早期 mRNA; (b) 晚期 mRNA。

图 10-14 (b) 表明 产生 三 种 病毒 蛋白 质 晚期 mRNA 需 三 种 模式 的 加 工 ， 没
有 加 工 的 RNA 不 产生 和 蛋白质 ，vp3 和 vp2 以 同样 的 阅读 框 被 翻译 ， 而 且 二 者 有
相同 的 C 端 ， 这 样 实际 上 vp3 是 vp2 的 一 个 片段 ; 它 是 加 工 酶 除去 翻译 vp2 的 起
始 密码 后 的 mRNA 的 翻译 产物 。vpl 的 阅读 框 与 vp2 和 vp3 的 不 同 。 它 的 阅读 框
是 通过 加 工 切 除 包 括 vp2 和 vp3 的 起 始 密码 在 内 的 很 大 一 段 RNA 以 后 建立 的 ，
仅仅 保留 起 始 信号 建立 vpl 的 阅读 框 。

值得 注意 的 是 ，SV40 的 基因 产物 不 是 从 大 的 多 肽 切割 而 来 。

多 瘤 病 毒 (polyoma virus) DNA 的 复制 和 SV40 相同 ， 其 转录 与 SV40 也 基
本 相同 。

2. 鸡 卵 蛋白 基因

前 述 真 核 基 因 均 为 多 拷贝 基因 。 多 拷贝 基因 很 难 研 究 其 前 后 的 DNA 顺序 ，
因此 无 从 研究 其 基因 的 调节 控制 。 卵 蛋白 基因 是 单 拷贝 基因 ， 在 鸡 的 各 种 细胞 中
. 316 ，

都 存在 卵 蛋 白 基 因 ， 但 是 只 有 当 母 鸡 下 蛋 时 输卵管 高 度 分 化 的 管状 腺 细胞 中 的 卵
蛋白 基因 才 表 达 。 此 基因 受 峻 激素 的 控制 ， 没 有 峻 激素 此 基因 不 能 转录 RNA，
为 了 从 分 子 水 平 上 了 解 这 一 调控 过 程 ， 有 必要 比较 管状 细胞 和 其 他 不 表达 的 细胞
中 的 卵 蛋 白 基 因 的 结构 。 法 国 巴 斯 德 大 学 真 核 分子 遗 传 学 实验 室 的 Pierre
Chambon 等 从 上 述 目的 出 发 ， 利 用 当时 已 经 逐渐 完善 了 的 DNA 重组 技术 ， 开 始
克隆 鸡 卵 蛋白 基因 。

首先 ， 他 们 纯化 卵 清 蛋白 mRNA， 这 种 mRNA 在 产 卵 母 鸡 的 输卵管 细胞 的
RNA 中 占 S0%， 因 此 易于 纯化 。 卵 蛋白 mRNA 有 1872 个 核 苷 酸 ， 其 中 1158 个
核 苷 酸 编码 卵 蛋 白 的 386 个 氨基 酸 。

第 二 步 是 以 反 转 录 酶 转录 成 一 条 cDNA 链 ， 然 后 以 DNA 聚合 酶 复制 成 双 链
DNA。

第 三 步 是 以 质粒 为 载体 ， 转 化 大 肠 杆菌 获得 cDNA 克隆 。

第 四 步 是 以 限制 性 内 切 核酸 酶 分 析 cDNA 建立 物理 图 谱 ， 他 们 注意 到 卵 蛋 白
mRNA 的 EDNA 中 没有 EcoR IT 和 殉 zd III 两 种 限制 酶 的 识别 位 点 。

第 五 步 是 用 EcoR 工 和 下 xd III 切割 输卵管 细胞 和 红细胞 中 分 离 出 来 的
DNA。 在 琼脂 糖 凝 胶 中 电泳 ， 使 DNA 片段 按 大 小 分 布 在 凝 胶 板 上 。

第 六 步 是 用 Southern-blot 技术 先 使 凝 胶 中 的 DNA 片段 变性 ， 然 后 把 它 吸 印
到 硝酸 纤维 滤纸 上 固定 。

第 七 步 是 将 cDNA 用 nick translation 法 制备 高 放射 活性 的 cDNA 探 针 ， 将 标
记 的 cDNA 变性 ， 然 后 与 硝酸 纤维 滤纸 上 的 DNA 进行 分 子 杂 交 ， 洗 去 未 杂交 的
探 针 ， 放 射 自 显影 后 即 可 确定 含 卵 蛋白 基因 的 DNA 片段 在 硝酸 纤维 滤纸 上 的 位
置 。

因为 卵 蛋 白 cDNA 不 被 EcoR TI 和 严 md III 切 开 ， 用 这 两 种 酶 中 任何 一 种 切
割 的 染色 体 DNA 片段 进行 吸 印 分 析 ， 都 只 应 该 产生 一 条 放射 性 带 。 如 果 染 色 体
DNA 上 的 卵 蛋 白 基 因 与 cDNA 的 碱 基 顺 序 是 完全 对 应 的 话 ， 卵 蛋白 基因 中 应 当
没有 EcoR I 和 于 xd III 的 识别 位 点 。 因 此 ， 杂 交 只 能 产生 一 条 放射 性 带 ， 但 是
出 乎 意料 ， 不 论 用 EcoR I 还 是 克 mxd III 切割 的 染色 体 DNA 都 出 现 数 条 放射 性
带 ， 不 论 来 自 和 输卵管 还 是 红细胞 的 染色 体 DNA 结果 都 一 样 ， 这 些 结果 反映 了 鸡
卵 蛋 自 基 因 结 构 中 未 预料 到 的 异常 现象 ， 实 验 过 程 如 图 10-15。

图 10-15 中 鸡 卵 蛋白 mRNA 的 cDNA 与 其 基因 组 的 EcoR I 片 段 杂交 产生 四
条 带 a、b、c、ds

为 了 解释 上 述 现象 ， 必 须 弄 清楚 卵 蛋 白 mRNA 和 染色 体 上 卵 蛋白 基因 DNA
的 差别 。 为 此 进一步 制作 cDNA 和 染色 体 上 卵 蛋 白 基因 的 限制 图 谱 ， 结 果 证 实 了
染色 体 有 cDNA 所 不 具有 的 EcoR TI 和 殉 md III 识别 位 点 ， EcoR I 不 切割 cDNA
而 染色 体 DNA 被 它 切 成 a、b、c 三 段 。b 段 含 有 编码 mRNA 的 起 始 端 500 个 核
苷 酸 顺 序 ， 而 a 段 含有 编码 mRNA 最 后 部 分 的 顺序 ， 从 cDNA 和 染色 体 DNA 的

”317 。

卵 重 自 mRNA 口 鸡 输卵管 或

红细胞 DNA
scDNA | 反 转 录 酶 。。 | 限制 酶 切 | EcoR I 切
TRNA DNA 片段
1
dscDNA | DNA 聚合 酶 于
0 | 径 苑 | 电泳 分 离

提纯 并 参
标记

标记 的
cDNA

a

be
1.250
9.220 0.3S0 1750

碱 基 对 数目

10-15 ” 鸡 卵 重 白 基 因 的 研究

限制 图 的 比较 ， 可 以 明显 看 出 为 mRNA 编码 的 DNA 是 不 连续 的 ， 这 种 mRNA
最 后 将 转译 为 蛋白 质 ， 也 就 是 说 为 蛋白 质 编码 的 基因 内 是 间隔 的 。

吸 印 和 杂交 所 作 的 限制 图 谱 分 辩 率 太 低 ， 为 了 更 详细 地 分 析 隔 裂 基 因 的 结
构 ， 他 们 用 卵 蛋白 cDNA 为 探 针 ， 从 鸡 染 色 体 的 基因 文库 中 分 离 出 卵 蛋白 基因 重
组 分 子 克 隆 ， 变 性 后 与 卵 蛋 白 mRNA 杂交 。 所 形成 的 杂种 分 子 的 电子 显微镜 照
片 (图 10-16) 进一步 显示 出 隔 裂 基 因 的 结构 。

从 图 10-16 中 可 以 看 出 鸡 卵 蛋白 基因 被 7 个 内 含 子 (A 一 G) 隔 裂 为 8 个 外
显 子 (1~-7)， 以 Maxam 和 Gilbert 方法 测定 cDNA 的 全 部 序列 与 已 知 的 蛋白 的
氨基 酸 顺 序 完 全 相对 应 。 图 10-17 中 所 示 卵 蛋白 基因 结构 ， 总 长 约 7700bp， 外 显
子 总 长 为 1872bp， 为 基因 总 长 的 1/4， 为 蛋白 质 编码 的 仅 11$8bp， 为 基因 总 长
的 1/7。

由 于 在 输卵管 细胞 核 中 从 未 找到 过 卵 白 和 蛋白 mRNA 的 前 体 RNA
(pre-mRNA)， 因 此 有 人 倾向 于 认为 卵 蛋 日 mRNA 是 几 个 RNA 分 子 连接 而 成 的 ，
那么 “内 部 间隔 区 ”这 个 名 字 就 不 适用 了 。 因 此 用 隔 裂 基因 这 个 术语 来 表示 这 类
情况 。

3。

图 10-16 ” 鸡 卵 蛋白 基因 的 intron、exon

7.700bp

; 人 SO
| 记 曙 和 上 人
1 1855lidl29118 4143,156 943

图 10-17 鸡 卵 蛋白 基因 示意 图

内 部 间隔 区 和 隔 裂 基因 的 发 现 出 人 意料 ，Pierre Chambon 等 最 初 的 设想 是 研
究 卵 蛋白 基因 转录 起 始点 上 游 发 动 区 ， 以 便 进 一 步 研究 峻 激素 及 其 受 体 蛋 白 对 这
个 基因 的 调控 机 制 ， 可 研究 结果 出 乎 预料 ， 它 为 真 核 基 因 的 研究 提出 了 许多 新 问
题 。

三 节 ， 真 核 基因 表达 的 调控
、 真 核 基 因 表 达 控 制 的 特点 和 复杂 性

真 核 生 物 在 进化 上 比 原核 生物 高 级 ， 具 有 更 加 复杂 的 细胞 结构 ， 庞 大 的 基因
组 和 复杂 的 染色 体 结 构 。 在 多 细胞 尤其 是 高 等 动物 中 ， 随 着 发 育 和 分 化 ， 出 现 不
同 的 组 织 器 官 、 不 同类 型 的 细胞 ， 尽 管 这 些 不 同类 型 的 细胞 的 染色 体 具 有 相同 的
DNA， 但 它们 合成 不 同 的 蛋白 质 。 对 不 同 序列 的 mRNA 研究 表明 ， 较 高 等 的 真
核 细 胞 中 合成 约 10 000 一 20 000 种 蛋白 质 ， 其 中 含量 丰富 的 蛋白 质 大 部 分 在 不 同
类 型 的 细胞 中 相同 ， 而 至 少 有 好 几 百 种 含量 低 的 蛋白 质 在 不 同类 型 的 细胞 中 是 不
同 的 ， 其 中 大 部 分 是 调控 蛋白 或 酶 ， 这 几 百 种 不 同 的 蛋白 虽然 占 的 比例 不 大 ， 但
已 足以 使 细胞 出 现 不 同 的 形态 和 行为 ， 行 使 不 同 的 功能 。 和 原核 生物 相 比 ， 真 核

“3

生物 的 基因 表达 调控 更 加 复杂 ， 更 加 精细 和 微妙 。

真 核 基 因 表 达 调 控 ， 可 以 在 从 DNA 到 RNA 到 有 功能 的 蛋白 质 的 途径 中 的
许多 步骤 上 进行 ，@ODNA 和 染色 体 水 平 上 的 调控 : 基因 的 拷贝 数 的 扩 增 或 丢失
和 基因 重 排 ，DNA 修饰 ， 在 染色 体 上 的 位 置 、 染 色 体 结构 (包括 染色 质 、 异 染
色 质 、 核 小 体 ) 都 可 影响 基因 表达 ; @ 转 录 水 平 上 : 转录 起 始 的 控制 和 延伸 的 弱
化 对 mRNA 前 体 的 水 平 都 会 产生 影响 ; @@ 转 录 后 RNA 加 工 过程 和 运送 中 的 调
控 : 原核 DNA 被 转录 时 ， 蛋 白质 合成 也 随 着 转录 起 始 而 进行 ， 即 边 转录 边 翻
译 ， 而 真 核 基因 转录 出 mRNA 前 体 ， 要 经 过 加 工 才能 成 熟 为 mRNA， 包括 切割 、
拼接 、 编 辑 、5 和 3 “末端 修饰 等 ， 成 熟 的 mRNA 再 运 出 细胞 核 ; 图 翻译 水 平 上
的 调控 ; @ 翻 译 后 的 控制 : 翻译 后 产生 的 蛋白 质 常常 需要 修饰 和 加 工 如 磷酸 化 、
糖 基 化 、 切 除 信 号 肽 及 构象 形成 等 ， 才 能 成 为 有 活性 的 和 蛋白质， 可 以 利用 这 个 过
程 有 选择 地 激活 或 灭 活 某 些 蛋白 质 ; @mRNA 降解 的 控制 : 控制 mRNA 的 寿命
就 能 控制 一 定数 目的 mRNA 分 子 产生 蛋白 质 的 数量 ， 这 种 控制 是 由 mRNA 3 端
的 序列 决定 的 。

上 述 归纳 的 几 个 方面 的 控制 ， 最 重要 的 是 转录 起 始 的 调控 和 翻译 水 平 上 的 调
控 ， 我 们 下 面 将 重点 介绍 。

二 、 真 核 基因 转录 起 始 的 控制 机 制

以 前 所 述 的 在 原核 细胞 内 转录 控制 中 ， 乳 糖 操纵 子 的 两 种 信号 调节 机 制 是 简
单 而 完美 的 ， 当 起 负 控 制作 用 的 抑制 蛋白 从 DNA 的 结合 区 脱离 后 ， 便 让 出 空间
位 置 ， 使 RNA 聚合 酶 得 以 和 DNA 结合 而 起 始 转录 ， 但 在 真 核 细胞 中 转录 起 始
情况 就 完全 不 相同 ， 真 核 基 因 转 录 激 活 和 起 始 需 要 多 种 元 件 ， 包 括 特定 的 DNA
序列 、 蛋 日 质 激活 因子 、 通 用 转录 因子 和 RNA 聚合 酶 ， 也 就 是 说 转录 激活 和 起
始 涉及 DNA 和 多 种 蛋白 质 之 间 相 互 作用 的 大 分 子 体 系 ， 要 和 弄 清真 核 细 胞 如 何 精
心 创造 出 如 此 复杂 的 基因 开关 ， 我 们 必须 对 下 面 叙 述 的 问题 逐一 了 解 。

1. 真 核 基因 控制 区 包括 启动 子 和 调控 的 DNA 序列

真 核 基 因 控 制 区 指 的 是 起 始 转录 所 需 的 DNA 序列 ， 加 上 调控 起 始 发 生 的 速
率 所 需 的 DNA 序 列 。 因 此 ， 控 制 区 包括 启动 子 (promoter) 和 调控 序列 。

启动 子 是 通用 转录 因子 和 RNA 聚合 酶 装配 成 转录 起 始 复合 物 的 一 段 DNA
序列 ， 对 它 下 游 的 一 个 转录 单位 的 转录 起 正 控制 作用 ， 这 段 序列 对 于 RNA 聚合
酶 工 的 启动 子 来 说 ， 位 于 转录 起 始点 附近 至 上 游 的 TATA 盒 之 间 ，RNA 聚合 酶
III 转录 的 基因 有 两 个 启动 子 : 一 个 在 上 游 ， 另 一 个 在 转录 序列 的 中 间 。 几 乎 所
有 的 RNA 多 聚 酶 II 利用 的 启动 子 都 有 TATA 序列 ，TATA 盒 一 般 位 于 相对 转
录 起 始 核 苷 酸 上 游 - 25 区 ， 是 启动 子 的 标志 。

” 和

|

决定 转录 起 始 速率 的 调控 序列 ， 是 一 些 调控 蛋白 ， 包 括 转录 激活 蛋白 和 抑制
。 蛋 自 的 结合 区 域 。 一 般 一 种 激活 转录 的 调控 蛋白 〈 反 式 激活 因子 ) 识别 和 结合 的
。 DNA 长 度 在 20 个 核 苷 酸 之 内 ， 虽 然 一 般 在 启动 子 上 游 200 个 核 苷 酸 之 内 存在 这

， 些 序列 ， 但 在 较 高 等 的 真 核 生 物 中 ， 调 探 序列 点 布 在 大 到 50kb 的 范围 之 内 并 非

罕见 ， 增 强 子 上 含有 激活 转录 的 调控 蛋白 结合 序列 ， 能 增强 上 下 游 远 距 离 的 基因
转录 。 在 RNA 多 聚 酶 II 转录 的 基因 控制 区 ， 常 见 的 短 序列 有 TATA 盒 、CAAT
盒 和 GC 盒 。

TATA 盒 位 于 转录 起 始点 上 游 - 25 左右 ， 是 通用 转录 因子 TFIID 识别 和 结
合 的 序列 ，TATA 盒 发 生变 异 对 转录 水 平 影响 不 大 ， 但 影响 转录 的 起 始点 ， 一 致
性 序列 为 TATAAA。

CAAT 盒 : 一 般 位 于 - 75 左右 ， 一 致 性 序列 为 GGGCCAATCT， 是 转录 激
活 因子 NF1 和 CTF 成 员 等 多 种 蛋白 识别 和 结合 序列 ， 对 基因 转录 有 较 强 的 激活
作用 ， 对 两 个 方向 都 可 激活 ， 而 且 作 用 距离 不 定 。

GC 盒 : GGGCGG， 是 转录 激活 因子 SPI 识别 与 结合 序列 ， 它 和 CAAT 盒 都
是 不 对 称 的 序列 ， 但 都 能 对 两 个 方向 行使 激活 功能 ，GC 盒 的 位 置 可 以 处 于
TATA 盒 与 CAAT 盒 之 间 ， 也 可 位 于 CAAT 盒 上 游 ， 位 置 因 不 同 基因 而 异 。

上 面 说 到 的 几 种 短 的 DNA 调控 序列 只 是 常见 的 DNA 调控 序列 的 一 部 分 ，
事实 上， 不同 基因 控制 序列 千差万别 。 这 些 短 的 DNA 调控 序列 是 基因 开关 的 基
本 成 分 。

2. 真 核 基因 转录 调控 蛋白 识别 和 结合 特异 的 DNA 序列

真 核 细胞 中 的 转录 调控 蛋 日 有 好 几 和 干 种， 种 类 繁多 ， 但 每 种 在 一 个 细胞 中 的
含量 都 非常 少 ， 种 类 依 不 同 细 胞 类 型 而 异 ， 不 同 基因 受 不 同 的 调控 蛋白 控制 ， 这
样 能 允许 细胞 启动 或 关闭 单个 特异 基因 的 转录 。

转录 调控 蛋白 ， 一 般 能 识别 和 结合 DNA 上 的 一 段 短 的 序列 。 这 段 短 的 DNA
序列 可 以 用 足迹 试验 (foot printing) 和 族 胶 迁移 率 改 变 试验 (gel-mobility shift
assay) 来 测定 。 通 常 说 的 “ 顺 式 激 活 因子 ” (cis-activative factor) 指 的 就 是 激活
转录 作用 的 调控 蛋白 识别 和 结合 的 一 段 DNA 序列 ， 它 只 对 同一 DNA 上 的 基因
具 激 活 作 用 ， 也 有 人 把 它 称 为 同 域 作 用 元 件 。 而 “ 反 式 激活 因子 ” (trans-activa-
tive factor) 就 是 能 激活 基因 转录 的 调控 蛋 日 ， 它 们 对 处 在 不 同 DNA 分 子 上 的 基
因 都 能 起 作用 ， 也 有 人 称 为 异域 作用 因子 。 事 实 上 , “ 反 式 ”二 字 并 不 合乎 英文
的 原意 ， 原 意 应 为 “转移 性 激活 因子 "。 表 10-2 中 列举 了 一 些 基 因 转 录 调 挖 蛋白
及 其 识别 的 DNA 序 列 。 也 有 的 调控 蛋白 本 身 并 不 直接 识别 和 结合 于 DNA 的 特
异 序列 ， 而 是 通过 与 结合 在 DNA 上 的 其 他 调控 蛋白 结合 ， 通 过 蛋白 质 之 间 的 互
相 作 用 而 加 强 或 抑制 转录 ， 例 如 一 些 病毒 的 最 早期 基因 产物 (IE 蛋白 ) 可 以 激
活 许 多 种 基因 的 转录 ， 这 些 基 因 的 控制 区 DNA 序列 并 不 相同 。

和

表 10-2 ”一 些 调控 蛋白 及 识别 和 结合 的 DNA 序列

调控 蛋白 识别 结合 序列 分 子 质量 或 功能

SP1 GGGCGG(GC box) 95 一 110kDa:

OCT1,2/(OTF1, 2) ATGCAAAT ATTTGCAT OCT1 90 一 100kDa:OCT2

GATA-1 TGATAG

CTF/NF1 GGCCAATCT(CAAT box) 抗原 上 与 CP-1 无 关

NEF-kB 65.50kDa ” GGGACTTTCC

ATF GTGACGT

TBP TATAAAA(TATA box)

AP1 39kDa (p8) TGACTCA

AP2 50 一 52kDa ”CCCCAGGC

TFIID 32kDa TATA 32kDa

E2F TITCGCGC

CRE 35 一 43kDa “”TGACGTCA(cAMP 应 答 因 子 ) ”cAMP 诱导 L Zip
SRF 67kDa GATGTCCATA

C/EBP 42kDa TGTGGAAAG( 增 强 子 结合 蛋白 ) L Zip
C-myc COSGCGTTTIROCGE

C-Jun TGAC/GTCA L Zip
GAL4 CGGAGGACTGTCCTCCG
CP-! CCAAT

3. 基因 转录 激活 蛋白 的 功能 区 域 和 结构 花 式

许多 基因 转录 激活 蛋白 可 分 为 明显 的 两 个 功能 区 域 ， 一 个 是 识别 和 结合
DNA 的 特异 序列 ， 另 一 个 是 激活 转录 的 功能 区 域 ， 后 者 无 基因 特异 性 ， 如 果 把
A 激 活 蛋白 的 DNA 结合 部 分 与 了 激活 蛋白 的 激活 功能 部 分 融合 在 一 起 ， 可 以 构
成 一 种 有 功能 的 基因 激活 蛋白 ， 这 种 融合 蛋白 只 能 激活 A 蛋白 所 能 激活 的 基因 。
激活 的 功能 区 域 负责 与 其 他 的 蛋白 质 互 相 作 用 ， 如 形成 二 聚 体 ， 帮 助 通用 转录 因
子 在 启动 子 上 装配 成 转录 起 始 复合 物 等 。 这 一 功能 区 域 在 结构 特点 上 常 在 表面 富
含 带 负电 和 荷 的 酸性 氨基 酸 ， 被 称 为 “酸性 的 激活 区 域 ”。

在 生物 学 上 分 子 识别 一 般 依 靠 两 种 分 子 表面 之 间 能 完全 配套 。 基 因 调 控 蛋 自
识别 双 链 DNA 上 的 特异 序列 是 因为 蛋白 质 表 面 与 DNA 双 螺 旋 的 特殊 的 表面 通
过 氢 键 、 离 子 键 和 玻 水 的 互相 作用 形成 广泛 的 互补 ， 例 如 门 冬 氨 酸 可 和 和 A 结合 ，
精 氨 酸 和 组 氨 酸 可 以 和 G 结合 ， 识 别 DNA 序列 的 蛋白 质 结构 主 要 是 螺旋， 但

ww 322。

也 有 8 折 和 到。 对 于 被 识别 的 双 链 DNA 来 说 ， 并 不 需要 解 开 螺旋 和 形成 单 链 ， 每
站 碱 基 对 的 边缘 是 暴露 在 双 螺 旋 的 表面 的 ， 能 为 蛋白 质 的 识别 呈送 不 同 的 氢 键 供
体 、 氢 键 受 体 和 朴 水 的 模式 。

基因 调控 蛋白 含有 能 阅读 DNA 序列 的 结构 花 式 (motif)。 几 种 主要 的 结构
花 式 及 其 与 DNA 的 作用 方式 见 第 二 章 。

4. 真 核 RNA 聚合 酶 需要 的 通用 转录 因子

原核 RNA 聚合 酶 可 以 单独 识别 和 结合 在 原核 基因 的 启动 子 上 而 起 始 转录 ，
变换 不 同 的 c 亚 基 就 能 转录 不 同 套 的 基因 。 真 核 RNA 聚合 酶 不 同 ， 它 在 体外 不
能 起 始 转录 ， 于 是 导致 发 现 另 一 些 称 为 “通用 转录 因子 ”的 蛋白 质 。 通 用 转录 因
子 并 非 是 真 核 RNA 聚合 酶 在 被 提纯 过 程 中 丢失 的 亚 基 ， 它 们 是 一 些 独 立 的 蛋白
质 。 每 种 RNA 聚合 酶 转录 任何 一 个 基因 使 用 的 是 同一 套 通用 转录 因子 ， 每 种 转
录 因 子 含 多 种 蛋白 质 亚 基 。 与 调控 蛋白 相 比 ， 转 录 因 子 种 类 少 ， 但 含量 丰富 。 真
核 RNA 聚合 酶 II 使 用 的 一 套 转 录 因 子 包括 TFIID、TFIIA、TEFIIB、TFIIF、
TFIIE、TFIIH 和 TFIIJ。

转录 因子 和 RNA 聚合 酶 II 必须 在 启动 子 上 装配 成 复合 物 才能 起 始 转录 ， 装
配 过 程 如 前 所 述 。

5. 增强 子 通过 多 和 悍 白 复合 物 而 增强 转录

增强 子 的 长 度 在 50 一 200bp 范围 之 内 ， 内 含 一 系列 转录 因子 的 结合 位 点 。 对
人 类 有 干扰 素 基 因 增 强 子 (大 约 70bp) 分 析 ， 为 与 增强 子 相 互 作 用 的 转录 因子
的 作用 模式 提供 了 一 个 很 好 的 例子 。 通 过 接头 扫 擅 突变 (linker scanning mnuta-
tion) 分 析 ， 已 鉴定 出 四 个 控制 元 件 和 与 每 个 控制 元 件 识别 结 合 的 和 蛋白。 这 些 蛋
自在 转录 实验 中 激活 来 自 B- 干 扰 素 增 强 子 的 转录 。 图 10-18 转录 实验 显示 这 些 转
录 因 子 对 干扰 素 增 强 子 的 结合 是 同时 发 生 的 ， 在 一 个 与 染色 质 联 系 在 一 起 的 丰
富 的 小 蛋白 质 HMG1 存在 情况 下 ， 转 录 因 子 的 结合 具 高 度 协同 性 ， 与 下 .coli 中
CAP 蛋白 和 RNA 聚合 酶 在 启动 子 上 的 结合 (图 10-19) 类 似 ， 这 种 协同 结合

增强 子 DNA 上 产生 一 个 蛋白 质 复合 物 ， 命 名 为 增强 体 (enhancesome) (图 10-
20)。

HMGI1 结合 于 DNA 小 沟 ， 使 DNA 分 子 急 剧 弯曲 ， 这 种 弯曲 使 转录 因子 可 适
当地 相互 作用 。 因 为 这 些 结合 蛋白 结合 在 相 邻 的 位 点 ， 使 蛋 白 质 的 局 部 浓度 增高 从
而 它们 之 间 的 相互 作用 增强 。 在 研究 工 细 胞 受 体 基 因 v 的 增强 子 中 ， 同 样 发 现 一 种
类 似 于 HMGI 的 功能 的 蛋白 质 也 是 与 DNA 小 沟 结合 并 诱导 DNA 弯曲 。 这 类 和 蛋白
被 命名 为 architectural protein， 因 为 它 对 构建 这 些 多 蛋白 复合 物 是 必需 的 。

“ 329

编码 X 蛋白 报告 基因
基因
X 结合 位 点

细胞 质 膜

图 10-18 ”转录 因子 活性 的 体内 分 析

芝 二 于 RNA 聚合 酶

lac 控制 区 ″ CAP 位 点 聚合 酶 位 点

图 10-19 开 .coii RNA 聚 合 酶 和 cAMP-CAP 对 /uc 启动 子 的 协同 结合

6. HIV 基因 组 的 转录 通过 抗 终止 被 调控

通过 对 RNA 聚合 酶 I 进 行 HIV 基因 组 转录 的 研究 提供 了 真 核 中 转录 终止
调控 的 例子 。HIV 基因 的 有 效 表 达 需 要 ta 基因 编码 的 病毒 小 蛋白 。xat - 突变 株

局 场 2

EmilyGSotiasweewy

二 CEAwaaese

站 图 10-20 在 干扰 素 增 强 子 上 形成 的 增强 子 体 (enhancesome) 的 模型
感染 的 细胞 只 产生 短 的 HIV 转录 子 ， 它 只 能 与 HIV DNA 上 靠近 启动 子 的 限制
以 段 杂 交 ， 而 不 能 与 远离 启动 子 的 限制 片段 杂交 。 而 在 野生 型 HIV 感染 的 细胞
证 合成 长 的 病毒 转录 子 ， 它 能 与 HIV 的 全 长 DNA 中 任 一 限制 片段 杂交 。 由 此
浅 来 ，Tat 蛋白 的 功能 是 作为 抗 终 止 因 子 ， 使 RNA 聚合 酶 II 可 通读 转录 封闭 区 ，
旺 似 于 入 唉 菌 体 的 N 蛋白 ，Tat 蛋白 对 于 HIV 复制 也 是 必需 的 。 进 一 步 了 解 这
种 基因 控制 的 机 制 ， 能 为 设计 艾滋 病 的 有 效 治 疗 药物 提供 可 能 。
时 Tat 是 顺序 专 一 性 RNA 结合 蛋白 ， 它 结合 在 HIV 转录 子 5 末端 的 一 个 称 为
TAR 的 顺序 上 ， 该 顺序 也 类 似 于 入 转录 子 的 nut 顺序 。TAR 含有 两 个 结合 位 点 ，
一 个 与 Tat 蛋白 相互 作用 ， 另 一 个 与 称 为 Cyclin 工 的 细胞 蛋白 相互 作用 。nut 和
红 NA 结合 域 也 与 N 蛋白 类 似 ， 含 有 精 氨 酸 丰富 区 。
10.21，HIV Tat 蛋白 与 Cyclin 工 对 TAR 的 结合 类 似 于 入 N 蛋白 对 下 .col
NusB 和 S10 与 nut RNA 的 相互 作用 (图 9-253)。Cyclin 工 与 蛋白 激酶 Cdk9 相互

了

RNA

pol ICTD
HIV DNA

一 ~、RNA polII

图 10-21 HIV Tat 蛋白 和 几 种 真 核 细 胞 蛋白 组 成 的 抗 终止 复合 物

3

作用 ， 激 活该 激酶 ，Cdk9 的 底 物 是 RNA 聚合 酶 II 的 CTD。 在 体外 转录 研究 中 ，
加 入 Cdk9 的 抑制 物 ， 除 了 Cdk9 高 度 磷 酸化 外 ，RNA 聚合 酶 I 江 在 HIV 启动 手
起 始 转录 大 约 50 碱 基 后 终止 。Cyclin 工 和 Tat 与 HIV 转录 子 的 S 端 的 TAR 顺
序 共 同 结合 ， 位 于 能 使 CTD 磷酸 化 的 Cdk9 处 ， 抗 终止 而 允许 RNA 聚合 酶 进行
链 延 伸 。

很 明显 ，Cyclin T-cdk9 复合 物 中 的 一 个 蛋白 质 一 -Spt $ 具有 与 Nus G 和 归 自
的 氨基 酸 顺 序 同 源 区 域 ，Nus G 蛋白 是 和 N 蛋白 抗 终止 中 的 一 个 相关 和 蛋白。 这 些
同 源 性 暗示 从 细菌 到 动物 ， 在 调节 RNA 链 延 伸 中 具有 类 似 的 机 制 。

7. 某 些 快速 诱导 基因 中 RNA 聚合 酶 开 的 近 启 动 子 处 发 生 和 暂停

果 晶 的 热 休 克基 因 (heat-shock gene， 如 hsp70) 代表 了 真 核 中 RNA 链 延 伟
调控 的 另 一 种 机 制 。

在 果 蝇 热 休 克基 因 的 转录 中 ，RNA 聚合 酶 II 起 始 转录 大 约 25 个 碱 基 后 斩
停 ， 而 不 是 终止 (如 HIV 基因 组 在 缺失 Tat 蛋白 时 )。 被 暂停 的 RNA 聚合 酶 下
仍 保持 与 新 生 RNA 和 模板 DNA 的 联系 。 直 到 热 休 克 转 录 因 子 HSTF (Cn
shock transcription factor) 的 激活 这 一 条 件 的 发 生 ， 紧 接着 被 激活 的 HSIF 结合

到 热 休 克基 因 近 启动 子 区 的 专 一 位 点 ， 促 使 被 暂停 的 RNA 聚合 酶 I 工 继续 RNA
链 的 延伸 ， 并 且 快 速 启 动 新 加 入 的 RNA 聚合 酶 I 的 重新 起 始 。

热 休 克基 因 是 由 细胞 内 蛋白 质变 性 条 件 (诸如 温度 升 高 “heat-shock”) 诱导
的 。 一 些 热 休克 基因 是 编码 较 抗 变性 条 件 和 起 防止 其 他 蛋白 变性 作用 的 蛋白 ; 马
一 些 热 休 克基 因 是 编码 帮助 变性 蛋 白 质 重新 折 肢 的 伴侣 。

这 种 包含 调控 这 些 基因 表达 的 转录 控制 机 制 允许 一 个 快速 的 应 答 ， 因 为 不 需
要 时 间 去 装配 转录 起 始 复合 物 。

转录 起 始 复合 物 在 RNA polII 启动 子 上 装配 的 过 程 ， 每 一 步 都 可 能 受 调控 蛋
白 的 影响 ， 尤 其 是 TFIID 与 TATA 的 结合 和 TFIIB 与 TFIID 的 结合 ， 即 使 在 体
外 用 提纯 的 DNA (无 组 蛋白 、 核 小 体 、 异 染色 质 和 染色 质 结构 ) 作为 转录 模板 ，
加 入 提纯 的 通用 转录 因子 和 RNA polII， 转 录 效 率 仍 是 很 低 的 。 如 果 DNA 的 启
动 子 上 游 有 激活 转录 的 调控 蛋白 结合 序列 ， 加 入 激活 转录 的 调控 蛋白 质 后 可 以 使
转录 水 平 提高 几 十 倍 至 几 百 倍 。 这 就 说 明 转 录 起 始 复合 物 装配 速度 和 频率 受 调控
蛋白 的 控制 ， 激 活 转录 的 调控 蛋白 帮助 和 加 速 转录 因子 装配 成 转录 起 始 复合 物 。
当 RNA 聚合 酶 从 复合 物 释放 后 转录 因子 复合 物 分 散 解 体 。

真 核 RNA 聚合 酶 I 和 III 也 需要 自己 独特 的 一 套 转录 因子 ，RNA polI 需要
UBFI 和 SL1，SLI1 含 TBP 和 另外 三 种 蛋白 。RNA polIII 需要 TFIIIA、TFIIIB、
TFIIIC，TRIIIB 含 TBP，TBP 在 polI 和 pol III 启动 子 上 的 结合 不 依赖 TATA 序
列 。

”326 ，

8. 真 核 基因 转录 抑制 蛋白 的 作用 模式

上 面 我 们 主要 介绍 了 激活 转录 的 因子 ， 基 因 控 制 包括 激活 和 抑制 两 个 方面 。
起 抑制 作用 的 调控 蛋白 ， 有 的 通过 和 特异 性 DNA 序列 结合 后 抑制 基因 转录 ， 有
的 在 细胞 质 中 与 激活 转录 的 调控 蛋白 结合 形成 二 聚 体 而 使 激活 转录 的 调控 蛋白 成
无 活性 状态 。 例 如 LeB 与 NF-kB 结合 成 二 聚 体 使 NF-<B 灭 活 ， 只 有 当 NEF-kB 从
三 聚 体 中 释放 出 来 后 才能 进入 核 中 与 DNA 结合 激活 转录 。 与 DNA 结合 后 抑制
转录 的 调控 蛋白 的 几 种 作用 方式 如 图 10-22 所 示 。

激活 因子 、 “一 激活 表面

激活 因子 结合 位 点 抑制 物 结合 位 点
(b) 激活 因子
有 结合 位 点
抑制 物 结合 位 点 二 一

YA
冯 玫

直接 与 通用 转录
因子 作用

志

(5)

图 10-22 ” 真 核 基因 抑制 蛋白 可 以 三 种 方式 起 作用

1) 兖 和 争 结合 : 激活 蛋白 与 抑制 蛋白 的 DNA 结合 序列 有 部 分 重 春 ， 如 抑制 蛋
自 先 结合 占领 了 空间 位 置 ， 激 活 蛋 白 就 不 能 结合 。

2) 封闭 或 修饰 激活 蛋白 的 表面 : 抑制 蛋白 结合 在 激活 蛋白 近 旁 或 通过 DNA
芍 曲 回 折 使 抑制 蛋白 与 激活 蛋白 靠拢 ， 抑 制 蛋 白 与 激活 蛋白 的 激活 转录 功能 区 域
相互 作用 而 使 后 者 失去 激活 转录 活性 。

3) 直接 与 通用 转录 因子 或 RNA 聚合 酶 相互 作用 阻止 转录 起 始 复合 物 的 装
配 。

.327 .

4) 结合 在 起 始 复合 物 装配 的 区 域 或 下 游 ， 阻 止 RNA 聚合 酶 转录 ， 例 如
HCMV IEI 蛋白 是 一 种 转录 激活 因子 ， 可 激活 多 种 基因 的 转录 ， 但 正 I 蛋 白 对 自
身 基 因 的 转录 具有 自 调 作 用 或 反馈 抑制 作用 ，IEI 蛋白 可 与 自身 基因 DNA 结合 ，
结合 位 置 在 转录 起 始 附近 。

9. 真 核 基 因 转 录 调 控 的 一 般 模 型 (DNA 和 多 种 蛋白 质 相互 作用 )

上 面 已 经 逐一 叙述 ， 真 核 基因 转录 控制 包括 三 大 要 素 : DDNA 调控 单元 ;
DNA 上 一 些 短 的 序列 ， 是 转录 因子 和 调控 蛋白 结合 的 区 域 ， 这 些 区 域 一 般 分 布
在 转录 起 始 区 上 游 ， 如 TATA 盒 、GC 盒 、CAAT 盒 、 增 强 子 及 其 他 序列 。@ 调
控 蛋 白 : 如 SP1、NF1、OCT、NF-kB 等 。@ 通 用 转录 因子 和 RNA 聚合 酶 。 这
三 大 要 素 的 大 分 子 系统 相互 作用 包括 DNA 与 蛋白 质 相 互 作用 、 调 挖 蛋白 之 间 的
相互 作用 、 调 控 蛋 白 与 通用 转录 因子 及 RNA 聚合 酶 的 相互 作用 。

在 大 分 子 体系 的 相互 作用 中 ，DNA 调控 单元 起 了 提供 相互 作用 的 场所 和 组
织 者 或 导演 的 作用 ， 图 10-23 是 RNA 聚合 酶 II 转录 的 综合 性 的 调控 模型 ， 在 这
一 模型 中 ， 第 一 步 是 调控 蛋白 与 DNA 的 互相 作用 ， 激 活 转录 的 调控 蛋 白 与 DNA
特异 序列 结合 ， 激 活 转录 的 蛋白 帮助 和 促进 TFIID 进入 和 结合 TATA 盒 ， 激 活
蛋白 与 其 他 转录 因子 和 RNA 聚合 酶 II 相互 作用 加 速 转录 起 始 复合 物 的 装配 。
TFIIF 的 大 亚 基 使 DNA 解 螺旋 ，TFIIH 的 作用 使 RNA polII 从 复合 物 中 释放 ，
转录 产生 mRNA 前 体 。

图 10-23 在 启动 子 处 各 种 调控 因子 的 相互 作用

模型 中 有 多 种 激活 转录 蛋白 与 不 同 的 DNA 序列 结合 ， 每 种 能 单独 激活 转
录 ， 但 每 种 激活 的 强度 有 差别 ， 多 种 和 蛋白 (包括 增强 子 上 结合 的 蛋白 ) 协同 作用
能 进一步 增强 转录 。 另 外 值得 注意 的 是 ， 有 的 DNA 序列 可 以 被 不 同 的 激活 因子
识别 和 结合 ， 也 有 的 调控 蛋白 可 识别 和 结合 两 种 以 上 的 DNA 序列 ， 例 如
C/EBP。 不 同 因 子 结合 同一 序列 对 转录 激活 的 强度 不 一 样 ， 例 如 OCT 序列 可 以 被

”2

旱

BCT1I、OCT2 识别 与 结合 ，CAAT 盒 可 被 NFI1、CVEDP、CTF 的 成 员 、ACF、
CDP 等 多 种 因子 识别 与 结合 。 各 种 因子 的 结合 亲和力 不 同 ， 对 转录 激活 的 作用
也 不 一 样 ， 当 CDP 结合 在 CAAT 盒 时 可 以 抑制 转录 。 不 同 的 组 织 ， 不 同类 型 细
胞 ， 不 同 发 育 时 期 出 现 不 同 的 调控 蛋白 ， 甚 至 同一 细胞 的 不 同 基因 的 相同 DNA
序列 ， 可 能 结合 的 调控 蛋白 也 有 区 别 。 但 对 多 数 DNA 序列 来 说 结合 的 调控 蛋白
是 相当 专 一 的 。

从 上 面 的 模式 图 中 我 们 看 到 ， 在 真 核 基 因 的 控制 区 有 许多 不 同 的 调控 蛋白
(激活 转录 的 和 抑制 转录 的 ) 结合 。 虽 然 在 体外 的 CAT 试验 中 ， 每 种 激活 转录 的
调控 蛋白 结合 在 DNA 上 通常 能 单独 激活 转录 ， 可 以 测 出 报告 基因 的 表达 ， 但 在
真 核 细 胞 中 ， 启 动 子 上 的 转录 是 开启 还 是 关闭 ， 转 录 是 强 还 是 弱 ， 必 须 集中 所 有
结合 的 调控 蛋白 提供 的 对 转录 的 提示 ， 启 动 子 才能 做 出 决定 。 增 强 子 是 远 距 离 控
制 单 元 的 代表 ， 它 能 使 转录 水 平 提高 几 十 倍 甚 至 几 百 倍 ， 通 过 DNA 回 折 人 靠拢 启
动 子 ， 下 面 我 们 再 介绍 几 种 具体 的 真 核 基因 转录 调控 模型 ， 以 便 加 深 对 真 核 基因
转录 调控 的 理解 。

三 、 几 种 真 核 基因 转录 调控 模型

1. 果 蝇 胚胎 eve 基因 条 纹 2 的 调控 模型

果 蝇 eve 基因 是 胚胎 发 育 早期 (单个 多 核 巨 细胞 时 期 ) 的 重要 基因 ， 如 eve
基因 灭 活 则 豚 胎 的 许多 部 分 不 能 形成 ， 胚 胎 就 在 发 育 早 期 死亡 ， 它 的 表达 控制 区
长 20kb 以 上 ， 结 合 20 多 种 调控 蛋白 。 这 一 巨大 的 复杂 的 调控 区 含 一 系列 DNA
调控 单元 ， 每 单元 排列 多 个 独特 的 短 的 DNA 序列 ， 这 些 短 序列 为 特异 的 调控 蛋
自 结 合 区 。 目 前 对 整个 调控 区 的 研究 还 不 大 深入 ， 我 们 下 面 只 介绍 和 讨论 条 纹 2
单元 的 调控 模式 。

条 纹 2 控制 单元 长 480 个 核 苷 酸 ， 已 知 排列 有 8 个 蛋白 质 结合 序列 ， 可 以 以
不 同方 式 结合 四 种 调控 蛋白 ， 其 中 bicoid 和 hunch hack 两 种 蛋白 具 正 控制 功能 ，
kriippel 和 giant 是 两 种 抑制 蛋白 ， 这 四 种 蛋白 共同 控制 eve 基因 转录 的 开关 ， 两
种 抑制 蛋白 中 任 一 种 结合 于 DNA 上 就 能 关闭 条 纹 2 控制 单元 控制 的 转录 ， 如 果
果 蝇 的 这 两 种 抑制 蛋白 缺乏 ， 受 精 的 果 蝇 卵 〈 且 胎 ) 的 组 织 化 学 染色 出 现 的 条 纹
2 变 得 很 宽 。 而 要 使 控制 的 基因 达到 最 大 的 表达 ， 两 种 正 控制 的 调控 蛋白 必须 同
时 都 结合 在 DNA 上 。

从 图 10-24 中 可 以 看 出 ， 激 活 蛋白 和 抑制 蛋白 的 结合 区 排列 有 两 个 特点 ， 一
个 是 8 个 结合 序列 中 有 4 个 激活 蛋白 和 抑制 蛋白 的 DNA 结合 序列 重 释 ; 另 一 个
是 激活 蛋 日 的 结合 序列 被 抑制 蛋白 的 结合 序列 隔 开 。 至 于 为 什么 两 种 抑制 蛋白 中
任 一 种 结合 于 DNA 序列 上 就 能 关闭 转录 还 不 清楚 ， 因 为 目前 还 不 了 解 它 们 相互

4 29

作用 的 细节 。 如 果 把 Jac2 基因 接 在 条 纹 2 调控 单元 的 下 游 ， 可 以 用 DNA 突变 技 “
术 研 究 调控 单元 中 各 个 短 序列 或 每 种 控 调 蛋白 对 基因 表达 的 影响 。 把 这 种 人 造 的
杂 合 基因 转移 到 果 蝇 早期 胚胎 的 染色 体 中 ， 组 织 化 学 染色 可 以 使 条 纹 2 变 为 蓝 色
(lac2Z 的 缘故 ， 图 b 中 箭头 所 示 )， 条 纹 的 位 置 不 改变 见 图 10-25。

条 纹 2 组件 :480bp

ae Kriippel 及 其 结合 位 点 bicoid 及 其 结合 位 点
一 -vi

卡 Rs 灶 ma 其 人 上 - 生 hunchback 及 其 结合 位 点

10-24 条 纹 2 单元 调控 序列 与 调控 蛋白 的 相互 作用

条 纹 3 组 件 “条 纹 2 组 件 ”条纹 7 组 件 c>

UVUUUUUUUUUHU LALLLLLALLLLLLLL EL FA 个 YA

TATA 基因
EEy

条 纹 2 组 件 TATA jacZ 基 因

图 10-25 “实验 阐明 的 evwe 基因 调控 区 的 标准 元 件 结构

2. 人 球 蛋 白 基 因 控 制 模型

人 昌 球 和 晶 基因 控制 是 复杂 的 真 核 基因 控制 的 典型 之 一 ， 也 是 目前 了 解 较 为
详细 的 真 核 基 因 控 制 模型 。B 球 蛋 白 基 因 只 在 红细胞 发 育 的 特定 时 间 表 达 。 因
此 ，8B 球 和 蛋 白 基因 表达 具有 细胞 类 型 和 发 育 时间 的 专 一 性 。

B 球 和 量 白 和 其 他 球 蛋白 基因 在 染色 体 上 排列 成 复 组 成 基因 座 (gene locus)，
连同 基因 座 的 控制 区 ， 跨 越 约 100kb 的 DNA 长 度 ， 基 因 座 中 每 个 球 和 蛋白 基 因 除
有 自己 的 控制 序列 外 ， 整 个 基因 座 还 有 制 控 序 列 ， 称 为 LCR (locus control re-
gion)， 基 因 座 中 各 球 和 曙 白 基因 排列 次 序 和 具有 不 同 SLCR 的 球 蛋白 基因 在 不 同

“300 ，

发 育 阶 段 和 不 同 器 官 中 表达 。

B 球 蛋白 基因 及 其 本 身 的 控制 区 如 图 10-26 所 示 。 转 录 区 域 长 近 2kb， 转 录
区 的 上 游 和 下 游 各 有 一 段 长 约 200bp 的 调控 序列 ， 两 个 控制 区 对 B 球 蛋白 基因 的
最 大 表达 都 是 必需 的 ， 但 上 游 的 控制 区 对 转录 的 开关 起 关键 作用 。

基因 调控 区

RNA 起 点 加 polyA 位 点
外 显 子
二 EEC 桶 基本 全 。
内 含 子

2 CN vcrAN
办 0 NE | = 7 人、 AN 和、 和
GATAzl A-1 TAai ATA-I GATA-1
NEFIGATA-1 CPl SCP1 GAT GATA 人 G 器
-220 3 +2200 +2400

图 10-26 ”人 8 球 和 蛋白 基因 的 调控 模型

下 游 的 控制 区 比较 简单 ， 含 四 个 GATA-I 的 结合 区 ， 但 其 中 的 两 个 结合 区
不 是 GATA-1 专 一 的 ， 也 可 以 结合 OCTA 或 CP1 (结合 序列 重 和 至， 箭头 所 示 )。
上 上游 的 控制 区 显得 较为 复杂 ， 在 TATA 盒 的 上 游 有 6 个 短 的 序列 可 以 结合 四 种
不 同 的 调控 蛋白 。 在 这 些 调控 蛋白 中 ，SP1、CP1、NFI1 在 一 般 的 细胞 类 型 中 都
存在 ， 而 GATA-1 这 种 调控 蛋白 只 在 包括 红细胞 在 内 的 很 少 几 种 细胞 中 存在 。
GATA-1 识别 和 结合 的 DNA 核心 序列 为 TGATAG， 是 B 球 蛋白 基因 激活 的 重要
蛋白 ， 可 见 在 发 育 分 化 过 程 中 ， 调 挖 蛋白 的 种 类 是 在 不 断 改变 的 。

如 果 把 人 的 B- 球 蛋白 连同 它 的 近 旁 调控 区 一 起 转移 到 转基因 老鼠 中 ， 无 论 其
插入 在 染色 体 什 么 位 置 ， 表 达 的 效果 都 是 很 差 的 ， 这 说 明 B- 球 蛋白 基因 除 受 本 身
上 下 游 的 调控 序列 调控 外 ， 还 受到 更 远 的 调控 序列 控制 。 研 究 结 果 表 明 ， 球 蛋白
基因 徐 上 游 的 染色 质 结 构 控 制 整个 基因 得 的 转录 开关 。 第 一 个 证 据 来 源 于 核酸 酶
敏感 试验 。

在 球 蛋 白 基 因 不 表达 的 细胞 中 ， 在 分 离 的 细胞 核 中 的 球 蛋 白 基 因 对 DNase [
有 抗 性 ， 但 在 红细胞 分 离 的 核 中 的 整个 球 蛋 白 基 因 簇 都 对 DNase I 超 敏感 ， 表 明
在 前 者 中 基因 被 紧密 压缩 包 庄 在 染色 质 中 ， 而 后 者 染色 质变 得 松弛 而 使 DNA 某
些 部 分 暴露 出 来 ， 这 暴露 出 来 的 DNA 序列 被 认为 是 激活 转录 的 调控 蛋白 结合
区 ， 当 调控 蛋 折 与 这 些 序 列 结合 后 进一步 引起 染色 质 核 小 体 改变 而 开启 各 个 基因
的 转录 。 在 s 球 蛋 日 基因 上 游 约 20kb， 发 现 5 个 DNaseI 超 敏感 区 ， 这 些 敏 感 区
就 是 LCR，LCR 序列 不 但 对 B 球 蛋白 转录 是 必需 的 ， 而 且 对 基因 复 中 的 其 他 球

33 有。

蛋白 基因 的 转录 也 是 必需 的 。

LCR 的 调控 作用 还 可 以 从 对 地 中 海 贫 血 病 〈 一 种 球 蛋白 生成 障碍 的 贫血 病 )
的 研究 中 看 出 ， 病 人 的 B 球 蛋 白 及 近 旁 的 调控 序列 完整 无 缺 ， 这 部 分 也 对
DNase JI 人 敏感 ， 但 LCR 部 分 或 全 部 缺失 ， 因 此 使 B 球 蛋白 基因 在 病人 的 红细胞 申
保持 休眠 状态 。

LCR 的 作用 在 对 转基因 老鼠 研究 中 进一步 证 实 ， 把 B 球 蛋白 及 其 近 旁 的 调
控 序 列 插入 鼠 红细胞 基因 组 中 不 同位 置 ， 表 达 水 平 因 揪 入 位 置 不 同 而 有 些 差异 ，
但 都 是 低 水 平 表 达 。 当 加 上 LCR 一 起 ， 无 论 在 哪里 插入 ， 都 能 获得 高 水 平 的 表
达 。

与 LCR 结合 的 几 种 调控 蛋白 已 被 鉴定 出 来 ， 但 问题 的 关键 是 LCR 的 DNA
与 调控 蛋白 的 相互 作用 怎样 改变 下 游 广大 范围 的 染色 质 结 构 ? 目前 虽然 有 几 种 假
设 ， 但 对 于 LCR 远 距 离 调控 的 机 制 和 细节 还 不 了 解 ， 还 不 能 做 出 结论 。

、DNA 修饰 和 梁 色 质 结构 控 制 基因 转录

1. DNA 上 特异 位 置 甲 基 化 可 控制 基因 表达

我 们 在 前 面 主要 讨论 DNA 的 调控 序列 、 局 动 子 、 调 控 蛋 白 、 对 真 核 基因 转
录 的 控制 ， 事 实 上 ， 真 核 基 因 转 录 水 平 的 控制 是 多 方面 的 。

在 真 核 细 胞 中 ，DNA 上 甲 基 化 的 基因 主要 集中 在 异 染 色 质 ， 有 2% 一 7% 的
C 被 甲 基 人 化。 事实 上 大 多 数 甲 基 化 在 CG 二 联 序列 ， 在 两 条 链 上 甲 基 化 产生
SmCPG 3“， 这 种 甲 基 化 可 用 限制 性 内 切 核 酸 酶 分 析 检 查 。Msz 工 能 消化 所 有 的
3 人 RE 4
CCGG 序列 ， 而 Hpa I 只 能 切割 未 甲 基 化 的 CCGG 序列 ， 两 种 酶 切割 比较 就 知
道 有 多 少 CCGG 被 甲 基 化 。 甲 基 化 图 式 检查 发 现 ， 许 多 基因 中 大 多 数 的 甲 基 化
位 置 是 比较 固定 的 ， 但 另 有 一 些 位 置 是 可 变 的 。 基 因 在 不 表达 的 组 织 中 大 多 数位
点 是 被 甲 基 化 的 ， 但 在 基因 表达 活路 的 组 织 中 是 没有 甲 基 化 的 。 把 甲 基 化 的 和 不
甲 基 化 的 基因 导入 新 的 宿主 细胞 中 ， 结 果 甲 基 化 的 基因 不 表达 ， 未 甲 基 化 的 基因
可 以 表达 。 这 表明 了 某 些 基因 的 特异 位 点 CG 甲 基 化 可 抑制 转录 ， 对 这 些 基因 转
录 必 须 经 过 去 甲 基 化 过 程 。 那 么 ， 什 么 地 方 的 CG 甲 基 化 才能 抑制 转录 ? 甲 基 化
抑制 的 机 制 是 什么 ?

Y 球 蛋白 基因 在 转录 起 始点 周围 即 - 200 一 + 90 之 间 存 在 多 点 甲 基 化 ， 无 论
去 除 起 始点 上 游 三 个 位 点 的 甲 基 化 或 去 除 起 始点 下 游 三 个 位 点 的 甲 基 化 ， 都 不 能
解除 转录 的 抑制 ， 当 除去 所 有 位 点 的 甲 基 化 后 ，Y 球 重 日 基因 才能 被 转录 ， 因 此
认为 启动 子 的 甲 基 化 是 抑制 转录 的 ， 其 余 广泛 的 地 方 甲 基 化 不 抑制 转录 。 在 一 些
甲 基 化 影响 转录 的 基因 的 $ 区 域 常 存在 CpG 丰富 咏 〈CpG-rich island)， 这 些 地

.332 ，

方 的 GC 含量 比 DNA 的 GC 平均 含量 明显 高 得 多 ， 而 CG 二 核 苷 酸 序列 出 现 的 频
率 比 基因 组 的 其 他 地 方 增加 10 倍 以 上 。

在 启动 子 的 CpG 岛 甲 基 化 防止 基因 转录 是 由 两 种 结合 蛋白 造成 的 ， 这 两 种
蛋白 是 MeCP-1 和 MeCP-2，MeCP-1 的 结合 需要 几 个 CpG 甲 基 化 ，MeCP-2 的 结
侣 只 要 一 个 CpG 甲 基 化 。 两 种 CpG 甲 基 化 结合 蛋白 的 任 一 种 结合 于 启动 子 都 能
抑制 转录 。MeCP-1 和 MeCP-2 在 启动 子 的 结合 阻止 通用 转录 因子 和 RNA 聚合
酶 在 这 一 位 置 装 配 成 转录 起 始 复合 物 。 由 此 可 见 ， 某 些 基因 的 转录 激活 还 包括
DNA 去 甲 基 化 步 又。 甲 基 化 控制 基因 表达 ， 在 受精 卵 中 选择 性 表达 父 本 还 是 母
本 的 等 位 基因 中 起 重要 作用 。

2. 染色 质 结构 对 基因 转录 激活 的 控制

真 核 细胞 DNA 是 很 长 的 分 子 ， 在 核 内 以 染色 体形 式 存 在 ，DNA 分 子 被 组 蛋
自体 包 衷 形成 核 小 体 ， 核 小 体 再 进一步 压缩 包 庄 成 30nm 丝 状 结构 ， 最 后 可 能 还
有 更 高 级 的 结构 形成 异 染 色 质 。 一 个 基因 的 转录 必须 允许 激活 转录 的 调控 蛋白 、

转录 因子 和 RNA 聚合 酶 靠近 并 接触 DNA。 染 色 质 结构 如 何 改变 才能 做 到 这 一
点 ? 当 RNA 聚合 酶 沿 着 DNA 模板 移动 延伸 转录 时 ， 核 小 体 又 将 如 何 变化 ?” 有
些 基因 ( 占 染 色 体 相 当 大 的 一 部 分 ) 在 一 些 类 型 细胞 中 总 是 休眠 的 ， 核 小 体 结构
如 何 使 它 休 了 眠 ? 目前 还 不 能 清楚 地 回答 这 些 问 题 ， 只 有 一 点 能 肯定 ， 就 是 基因 转
录 的 激活 首先 需要 染色 质 结 构 的 改变 。

在 电子 显微镜 下 观察 到 两 种 染色 质 的 丝 状 体 : 一 种 10nm， 另 一 种 30nm，
10nm 染色 质 可 见 “ 珠 - 绳 ”结构 , “ 珠 ” 是 圆柱 形 的 组 蛋白 体 ， 直 径 约 1l1nm， 高
6nm， 组 蛋 日 体 含 2 个 H2A:.H2B 二 聚 体 和 2 个 H3.H4 二 聚 体 ， 成 为 八 聚 体 结
构 。“ 绳 ”就 是 线 状 DNA， 在 每 个 组 蛋白 体 上 螺旋 绰 绕 1.8 圈 ， 每 圈 相 当 于 约
80bp 长 度 ，DNA 缠绕 在 组 蛋白 体 上 成 为 核 小 体 ， 核 小 体 是 染色 质 的 基本 结构 ，
每 个 核 小 体 上 缠绕 的 DNA (146bpb) 加 上 两 个 核 小 体 之 间 的 部 分 共 约 为 200bp
( 约 相 当 67nm 长 度 )， 核 小 体 结构 不 需要 HIl 蛋白 。10nm 的 染色 质 是 松弛 和 伸展
的 形式 。

30nm 的 丝 状 染 色 质 结构 ， 是 10nm 结构 的 进一步 紧密 压缩 成 螺旋 ， 每 圈 螺
旋 含 6 个 核 小 体 ， 形 成 这 种 结构 需要 HIl 蛋白 。30nm 结构 是 染色 质 和 蜡染 色 质
的 基本 结构 。

基因 表达 需要 染色 质 的 改变 ， 变 得 更 加 伸展 和 松弛 ， 这 方面 最 早 的 证 据 是 用
低 浓度 的 DNase I 消 化 ， 只 在 表达 的 基因 区 域 发 现 对 DNaseI 的 超 敏 感 点 ， 不 表
达 的 基因 不 存在 酶 的 敏感 点 ， 表 明 在 表达 基因 区 域 起 始 部 分 ，DNA 是 暴露 的 。
在 SV40 染色 体 后 期 转录 单位 启动 子 上 游 一 段 DNA 可 以 很 好 地 被 DNase I、 小 球
菌 核酸 酶 及 其 他 核酸 酶 (包括 限制 性 内 切 核 酸 酶 ) 切 制 ， 这 段 伸展 的 染色 质 长 约
400bp， 是 自由 的 DNA 片段 ， 用 电镜 观察 SV40 染色 体 ， 也 可 看 到 这 一 段 长 约

7 3

120nm， 相 当 于 约 360bp 长 度 ， 电 镜 对 SV40 染色 体 的 观察 直接 证 实 DNase TI 超
敏感 区 是 没有 核 小 体 的 ， 当 然 这 并 不 意味 着 在 体内 这 段 没 有 核 小 体 的 DNA 上 也
没有 其 他 蛋白 。

染色 质 的 结构 控制 基因 转录 ， 控 制 的 方式 是 在 基因 的 控制 区 改变 结构 ， 产 生
DNaseI 超 敏 感 区 ， 超 敏感 区 是 一 段 长 200 一 400bp 的 伸展 的 无 核 小 体 的 暴露 的
DNA。

关于 产生 超 敏 感 点 激活 基因 转录 的 机 制 ， 目 前 还 有 争论 。 生 化 研究 的 一 些 结
果 揭 示 出 下 面 几 个 问题 ， 比 较 转 录 的 基因 和 不 转录 的 基因 的 组 蛋白 区 表明 : @ 组 ，
蛋白 HIl 与 不 转录 区 染色 质 结 合 比 转录 的 染色 质 结 合 紧 ，HI 的 五 个 丝氨酸 磷酸
化 总 是 伴随 着 染色 质 凝 聚 和 紧密 堆积 ， 有 可 能 Hl 的 去 磷酸 化 使 超 敏感 点 的 核 小
体 堆 积 松弛 而 使 染色 质 伸展 。@ 在 转录 的 染色 质 上 组 蛋白 是 高 度 乙 酰 化 的 。
@H2B 的 磷酸 化 程度 降低 。@ 轩 从 果 蝇 到 人 类 的 许多 种 生物 ， 转 录 染 色 质 区 域 H2A
的 形式 不 同 。@HMG14 和 HMG17 两 种 蛋 昌 (high-mobility-group protein) 只 存
在 于 转录 的 染色 质 。HMG 蛋白 在 进化 上 是 高 度 保守 的 ， 它 们 与 核 小 体 结合 可 能
在 染色 质 结 构 改变 允许 基因 转录 上 有 重要 作用 。

除了 上 述 组 蛋白 改变 外 ， 转 录 激 活 蛋白 (包括 转录 因子 ) 与 超 敏 感 区 的
DNA 特异 序列 结合 进一步 改变 染色 质 的 结构 当然 是 很 重要 的 ， 这 些 蛋 和 白 的 结合
可 能 阻止 组 蛋白 与 DNA 联系 或 取而代之 。

一 旦 转录 起 始 ，RNA 聚合 酶 向 前 转录 的 移动 中 可 以 容易 地 通过 核 小 体 ， 不
需要 把 组 蛋白 从 DNA 上 驱逐 出 去 ， 转 录 通 过 一 个 核 小 体 时 ， 两 个 H2A.H2B 二
聚 体 轮流 暂时 离开 八 聚 体 ， 八 聚 体 的 暂时 改变 是 可 逆 的 。 图 10-27 是 Van Holde
等 人 1992 年 提出 的 RNA 聚合 酶 转录 通过 核 小 体 的 模型 。

3. 染色 质 的 紧密 堆积 可 防止 基因 转录

上 面 我 们 介绍 了 染色 质 松弛 和 伸展 使 基因 激活 ， 另 一 方面 ， 染 色 质 的 紧密 压
缩 堆积 ， 可 使 调控 蛋白 和 转录 因子 都 不 能 靠近 DNA， 而 使 基因 组 中 相当 大 的 一
部 分 基因 处 于 休眠 状态 ， 当 然 其 中 有 些 基 因 可 以 从 休 眼 变 成 激活 ， 另 一 些 则 不 能
转变 。 这 些 高 度 凝 聚 的 染色 质 结构 形式 包括 异 染 色 质 。

对 酵母 S. cerevisae 的 ADE2 基因 表达 的 研究 表明 ，ADE2 在 基因 组 中 的 位
置 不 同 ， 表 达 的 效果 就 不 同 ， 这 种 现象 称 为 位 置 效 应 (position effect)， 当 ADE2
蛋白 不 存在 时 ， 腺 味 叭 生物 合成 途径 被 阻 断 ; 细胞 累积 红色 色素 ， 因 而 形成 的 醇
母 集落 呈 红 色 ， 正 常 集落 呈 白 色 ， 当 ADE2 基因 处 在 正常 位 置 时 ， 所 有 的 细胞
中 都 表达 ADE2。 而 当 处 在 端 粒 附近 时 ， 在 绝 大 多 数 红 色 细 胞 中 ADE2 基因 处 在
休眠 状态 。 除 ADE2 不 表达 外 ， 在 染色 体 末 端 10kb 的 范围 的 基因 都 不 表达 。 随
着 ADE2 的 位 置 离 端 粒 越 来 越 远 ， 抑 制 的 程度 也 逐渐 减弱 ， 位 置 效应 是 可 以 遗
传 的 。 端 粒 附近 的 基因 表达 受 抑制 ， 是 由 于 核 小 体 的 堆积 压缩 十 分 紧密 所 致 。

*。， 334

和

“2 人 放 --H2A.H2B 二 聚 体
RNA 聚合 酶 获 可 RS
DNA ”进入 核 小 体 -

10-27 RNA 到 合 酶 具有 在 不 引起 组 蛋白 解体 的 情况 下 通过 核 小 体 的 能

4. 基因 重 排 对 基因 表达 的 影响

(1) 同一 个 启动 子 连 结 不 同 的 结构 基因

一 个 结构 基因 通过 移 到 其 启动 子 处 而 被 激活 ， 在 酵母 菌 的 结合 型 控制 中 研究
得 最 为 清楚 。 在 单 体 酵母 中 存在 两 种 结合 型 ，a 和 u 分 别 由 BEMa 和 Meu 基因 座
位 控制 ，a 型 细胞 可 以 有 效 地 与 w 型 细胞 接合 合并 (merge) 成 Ma 二 倍 体 细 胞 ，
而 同型 细胞 不 能 结合 ， 即 a 型 细胞 之 间 不 能 结合 ，a 型 细胞 之 间 也 不 能 结合 。
EMa 和 古 Mez 是 非 同 源 的 基因 复 ， 位 于 同一 条 染色 体 上 ， 但 彼此 靠 得 不 近 ， 这
个 位 置 是 非 等 位 的 ， 每 个 单 倍 体 细 胞 中 含有 RMaz 和 RMa 两 种 基因 簇 ， 但 一 个
单独 细胞 里 只 有 其 中 一 个 基因 是 被 表达 的 ， 例 如 ， 如 果 HBMea 表达 ， 此 细胞 为 a
型 细胞 ， 在 某 种 情况 下 ，a 型 细胞 可 以 转变 成 a 型 细胞 (反之 亦 然 )， 这 种 现象
叫做 结合 型 转变 ， 这 种 结合 型 转变 现象 只 发 生 在 含有 BO 基因 的 细胞 里 〈HO，
homothalic 的 简写 ， 即 同型 结合 )。

结合 型 的 转变 依赖 FEO 基因 ，HO 突变 后 ， 转 变频 率 下 降 到 10 。

已 有 一 些 证 据 推 导出 图 10-28 中 的 结合 型 基因 表达 模型 。

酵母 的 结合 型 暗盒 调控 模型 中 ，EEMz 和 HUMe 本 来 处 于 无 活性 位 置 。 BEMz
和 瑟 Mu 基因 可 以 移动 到 Mat 座位 ， 它 们 的 移动 需要 RHO 基因 产物 ， 当 有 Mu 移
动 结合 Mat 座位 时 ，HMa 表达 ，HMa 不 表达 ， 这 个 酵母 细胞 是 v 结合 型 。

模型 中 ，Mat 座位 邻接 的 是 启动 子 。 无 论 是 了 Ma 还 是 有 Mex 插入 到 Mat 时 ，

1 95 .。

Ma P ZNMa Ma

酵母 染色 体
Ho 产物 Ho 产物

图 10-28 酵母 结合 型 调节 的 暗盒 式 模型

就 可 以 被 启动 转录 表达 ， 要 说 明 一 个 重要 的 事实 就 是 当 发 生 插 入 时 ， 原 来 的 那个
保持 沉默 的 拷贝 仍然 留 在 原来 的 位 置 (这 一 点 与 转 座 子 的 转 座 相 像 )。

EMa 或 HMea 的 一 个 拷贝 移 到 Mat 位 并 且 原 拷贝 仍 保留 在 原来 的 位 点 ， 这
个 过 程 类 似 于 转化 ， 而 此 基因 移 到 染色 体 上 固定 的 位 置 上 《〈Mat) 以 后 一 般 不 再
引起 转 位 ， 而 当 RMa 或 了 Mu 基因 簇 移 到 Mat 时 ， 这 个 位 置 原先 已 被 EMu 或
DBMa 占据 着 (也 就 是 说 mating-type locus 从 未 空 过 )。 所 以 一 个 基因 簇 的 进入 必
须 伴随 着 另 一 个 单位 的 移 去 。 关 于 这 一 点 已 有 一 些 证 据 ， 已 经 发 现 了 这 个 移动 的
单位 被 丢失 ， 这 个 过 程 类 似 于 在 溶 源 菌 中 的 所 谓 原 鸣 菌 体 蔡 换 现象 。 例 如 当 入 鸣
菌 体 的 溶 源 菌 被 Ximm434 超 感 染 后 ， 和 原 噬 菌 体 被 割 离 而 Nimm434 被 整合 到 答
主 染色 体 上 ， 通 过 类 似 的 比较 ， 假 设 可 能 mating 座位 上 基因 的 互相 转变 是 位 点
专 一 性 的 重组 事件 ， 它 可 能 是 被 一 种 像 和 的 整合 酶 一 样 的 酶 介 导 的 。 目 前 mat-
ing-type locus 已 被 克隆 ， 在 体外 一 种 酶 的 确 能 使 这 个 位 点 的 双 链 DNA 断 开 。

(2) 免疫 系统 中 编码 顺序 的 连结

1) 免疫 球 蛋 白 基 因 。 把 两 种 稍 有 不 同 的 蛋白 质 〈 例 如 沙门 氏 菌 的 凌 毛 抗原

HIL 和 H2) 注入 到 动物 体内 ， 就 会 使 它 产 生 两 种 专 一 性 的 抗体 ， 据 粗放 的 估计 ，”
抗体 数 可 达 百 万 种 ， 蛋 白质 都 是 由 基因 编码 的 ， 那 么 怎样 可 能 由 基因 来 编码 这 许
多 免疫 球 蛋 白 分 子 呢 ?

20 世纪 40 年 代 化 学 家 .Pauling 提出 的 指令 学 说 似乎 可 以 解答 这 一 难题 ，
按照 这 一 学 说 ， 免 疫 球 量 昌 的 一 级 结构 只 有 一 种 或 少数 几 种 ， 所 以 相应 的 基因 也
只 有 少数 几 个 ， 动 物 的 淋巴 细胞 吸收 一 种 抗原 蛋白 后 细胞 中 的 抗体 分 子 便 按照 抗
原 的 构 形 而 改变 它 的 构 形 ， 使 两 者 之 间 可 以 发 生 专 一 性 反应 。 但 是 以 后 许多 生物
化 学 研究 结果 认为 蛋白 质 的 二 级 或 三 级 结构 完全 由 一 级 结构 所 决定 ， 也 就 是 说 从
某 一 种 一 级 结构 只 能 得 到 某 一 种 二 级 结构 或 三 级 结构 ， 所 以 指令 学 说 显然 不 能 成
立 。 因 此 必然 有 为 数 众 多 的 基因 来 编码 这 些 免 疫 球 蛋 白 。

哺乳 动物 的 总 的 基因 数 至 多 不 过 几 万 ， 所 以 很 难 想像 每 一 淋巴 细胞 都 能 产生
全 部 抗体 。1957 年 F.M.Burnet 提出 所 谓 克 隆 选择 学 说 〈( 即 细胞 选择 学 说 )， 认
为 每 一 种 浆 细 胞 只 能 产生 一 种 或 少数 几 种 抗体 。 抗 原 进入 体内 后 ， 刺 激 相 应 的 淋
巴 细胞 快速 分 裂 并 产生 大 量 抗体 。 按 照 这 一 学 说 ， 抗 原 只 能 起 着 选择 某 一 淋巴 细
胞 克隆 的 作用 。

。 336 。

一 些 简单 的 实验 可 以 用 来 说 明 克 隆 选择 学 说 基本 上 是 成 立 的。 实验 一 用 两 种
不 同 的 鞭毛 抗原 的 细胞 免疫 兔子 的 淋巴 组 织 ， 并 把 浆 细胞 分 散 悬 浮 ， 使 每 一 滴 液
体 中 只 有 一 个 浆 细 胞 ， 加 入 这 种 或 那 种 葛 毛 抗原 的 细菌 ， 结 果 说 明 每 种 浆 细胞 所
产生 的 抗体 只 能 使 一 种 抗原 细菌 不 活动 ， 说 明 每 一 个 细胞 只 产生 一 种 抗体 。 实 验
三 用 两 种 蛋白 质 免疫 动物 ， 同 样 取 分 散 的 浆 细胞 ， 另 外 再 把 这 两 种 蛋白 质 抗原 用
两 种 不 同 的 荧光 染料 结合 成 荧光 抗原 ， 其 中 一 种 抗原 在 紫外 线 下 呈 红 色 ， 另 一 种
呈 绿 色 ， 再 把 两 种 荧光 抗原 的 混合 物 加 到 浆 细 胞 悬 液 中 ， 在 紫外 光 下 可 以 看 到 一
， 些 细胞 呈 红 色 ， 另 一 些 呈 绿色 ， 没 有 一 个 细胞 呈 两 种 颜色 。
“克隆 选择 学 说 可 以 避免 一 个 细胞 中 有 成 百 万 个 免疫 球 蛋 白 基因 这 一 概念 上 的
困难， 可 是 又 怎么 理解 由 一 个 受精 卵 产 生 如 此 众多 的 不 同 的 免疫 球 蛋 白 基 因 呢 ?
Burnet 认为 体 细胞 突变 可 能 是 它 的 原因 。 不 过 这 样 高 的 体 细胞 突变 率 从 没有 在 其
， 他 情况 中 发 现 。 另 外 ， 免 疫 球 蛋 白 由 两 个 轻 链 和 两 个 重 链 组 成 。 每 个 链 都 有 两 个
部 分 。 一 个 称 做 可 变 区 〈V 区 )， 另 一 个 称 为 恒定 区 〈C 区 )。 以 轻 链 为 例 ， 它 的
可 变 区 有 109 个 所 基 酸 (1 一 109) (图 10-29)， 其 中 68 个 位 置 上 的 氨基 酸 多 数 发
， 现 过 三 种 以 上 的 变化 ; 恒定 区 有 105 个 氨基 酸 (110 一 214)， 其 中 只 有 三 个 位 置

、 曾 发 现 过 变化 ， 到 现在 为 止 还 没有 发 现 过 一 个 基因 可 以 截然 划分 为 突变 率 如 此 不
， 同 的 两 个 部 分 ， 因 此 体 细胞 突变 假说 很 难 成 立 。W.G.Dreyer 和 G.C.Bennett 于

， 是 在 20 世纪 60 年 代 中 提出 另 一 假说 ， 认 为 在 浆 细胞 成 熟 过 程 中 染色 体 发 生 重
| 排 。 重 排 使 原来 编码 两 个 链 的 基因 连接 在 一 起 ， 于 是 就 出 现 了 一 个 可 以 区 分 易 变
区 和 人 恒定 区 的 蛋白 质 分 子 。

1 109 446 _
重 链

10-29 ”免疫 球 蛋 昌 重 链 和 轻 链 的 可 变 区 和 恒定 区

免疫 遗传 学 的 内 容 非 常 广泛 ， 从 真 核 生物 的 基因 组 结构 角度 来 看 ， 主 要 的 问
题 是 如 果 染 色 体 重 排 假设 可 以 成 立 的 话 ， 那 么 这 些 基因 在 基因 组 中 以 怎样 的 形式
存在 着 ? 重 排 的 机 制 又 是 什么 ?

免疫 球 蛋 白 的 基本 结构 是 一 对 轻 链 、 一 对 重 链 结 合成 的 了 形 分 子 。 人 的 免
疫 球 蛋 白 的 重 链 有 五 种 类 型 即 y>、a、 八 8$ 和 s。 其 相应 的 I 类 型 为 IgG、IgA、
IgM、IgD 和 IgE。 它 们 的 恒定 区 的 氨基 酸 顺 序 彼此 间 大 约 有 60% 差别 。 轻 链 只
有 两 种 类 型 (K 和 和 )， 它 们 的 恒定 区 的 氨基 酸 顺 序 也 有 60% 以 上 的 差别 ， 属 于
同一 种 类 型 的 轻 链 或 重 链 的 恒定 区 几乎 总 是 相同 的 ， 同 一 类 型 不 同 种 的 免疫 球 蛋

”38 ，

白 的 差别 完全 取决 于 易 变 区 ， 免 疫 球 蛋 白 的 类 型 是 以 重 链 为 标准 来 区 分 的 〈 表 ，
让 匡 9)5

表 10-3 人 的 免疫 球 蛋白 种 类

免疫 球 蛋 白 IgG IgA IgM IgD IgE

重 链 过 Q 忆 》 E
轻 链 K 或 入 K 或 入 K 或 入 K 或 入 k 或 入
血清 中 的 含量 (% ) 80 13 16 1 0.002

2) 染色 体重 排 假设 的 证 实 。 为 了 证 实在 个 体 发 育 过 程 中 曾经 发 生 有 关 免 疫
球 蛋白 基因 的 染色 体重 排 ， 把 胚胎 的 DNA 和 成 体 的 DNA 进行 比较 。 成 体 DNA
用 骨髓 瘤 细 胞 MOPC321 (moure plasmacytoma321) 作为 代表 ， 它 只 产生 k 链 。
胚胎 DNA 用 小 鼠 且 胎 提取 ， 实 验 过 程 如 下 :

@ 提 取 MOPC321 的 DNA 和 小 鼠 胚胎 DNA; @ 用 限制 酶 Ba HTI 处 理 ;
@@ 电 泳 区 分 大 小 不 等 的 DNA 片段 ; 四 从 凝 胶 上 洗 下 每 一 片段 ; @@ 提 取
MOPC321 的 k 链 mRNA， 另 外 取得 它 的 3 端的 一 半 ， 两 者 都 用 碘 (〈2T) 标记 ，
制备 探 针 ; @ 把 探 针 和 洗 下 的 DNA 片段 进行 分 子 杂 交 测 定 ， 结 果 发 现 豚 胎 DNA
能 与 完整 mRNA 杂交 的 片段 有 两 个 。 它 们 的 分 子 质 量 是 3.9X105Da 和 6.0 久
10 Da。 但 是 和 3 端 一 半 进 行 分 子 杂 交 的 只 有 分 子 质量 为 6.0X 105Da 这 一 片段

这 一 事实 说 明 分 子 质量 3.9x 105Da 这 一 段 中 不 包括 相当 于 mRNA 分 子 的 3 ' 端 这
一 部 分 。

对 于 MOPC321 DNA 来 说 ， 两 者 并 无 区 别 ， 而 且 进 行 分 子 杂 交 的 片段 只 有
2.4x105Da 这 一 个 ， 说 明 在 胚胎 DNA 中 原来 不 在 一 起 的 两 个 部 分 在 成 体 中 处 在
相近 的 位 置 上 。

3) 免疫 球 蛋 白 基 因 多 样 性 的 来 源 。20 世纪 70 年 代 通过 基因 克隆 和 核 苷 酸 顺
序 分 析 ， 一 些 免疫 球 蛋白 基因 的 核 苷 酸 顺 序 已 被 分 析 清 楚 。 人 的 “ 轻 链 的 研究 结
果 说 明 : 外 编码 可 变 区 的 基因 (variable ，V) 不 是 一 个 而 是 有 大 约 150 个 ， 它
们 作为 一 个 基因 家 族 和 间隔 序列 相间 排列 在 一 起 ;，@ 每 一 个 V 基因 有 一 个 编码
引导 区 的 部 分 (L)， 它 编码 17 一 20 个 氨基 酸 ， 这 一 部 分 的 功能 是 使 免疫 球 蛋 白
分 子 通过 细胞 释放 出 来 ; @ 编 码 恒定 区 的 基因 (constant region，C) 只 有 六 个 ，
它们 组 成 另 一 家 族 ; @V 家 族 和 C 家 族 中 间 还 有 五 个 连接 序列 (J)， 丁 家 族 和 V
家 族 距 离 较 远 ，C 家 族 则 比较 近 。

在 淋巴 细胞 发 育 过 程 中 通过 某 种 染色 体重 排 过 程 LVV 和 了 丁 相 连接 ， 转 录 成
包括 L、V、J_C 几 个 部 分 的 mRNA， 再 经 过 剪接 成 为 成 熟 的 mRNA 分 子 ， 翻
译 产物 上 的 引导 区 可 能 在 穿 过 细胞 过 程 中 被 去 除 (图 10-30 )。

重 链 有 五 种 ， 它 们 的 基因 的 组 织 也 更 为 复杂 : 作为 易 变 区 和 恒定 区 的 连接
” 338-

V， V， V: Vis 本 了 由 J C
在 胚胎 细胞 中 的 基因 顺序 ee 是 < 面 面 面 面 EC2 厅 ..
前 导 区
通过 DNA 丢失 重组

这 洽 产 ， 站 六 [中
在 产生 抗体 的 细胞 中 的 基因 顺序 加 面 AAA

被 拼接 的 易 变 区

图 10-30” 轻 链 可 变 区 形成 中 的 DNA 拼接

部 分 除了 连接 序列 J 丁 以 外 还 有 多 样 性 序列 D; 恒定 区 基因 是 八 个 ; 每 个 C 基因 中
又 分 为 几 个 区 。

轻 链 的 V 基因 有 150 个 ， 丁 序列 有 5 个 ， 每 个 V 和 每 个 丁 都 不 相同 ， 所 以 V
和 丁 的 连接 有 1$0xS=750 种 。 此 外 由 于 V 和 本 的 连接 处 并 不 十 分 准确 ， 通 过 氮
基 酸 顺序 分 析 可 以 看 到 V 和 丁 的 交接 处 的 氨基 酸 有 较 多 的 变化 ， 假 设 由 于 交接
处 重组 位 置 的 细微 差别 带 来 的 变化 有 10 种 ， 那 么 轻 链 的 种 类 就 有 1$0 x 5 x 10 =
7500 种 。

对 于 重 链 来 讲 ， 估 计 人 的 V 基 因 有 80 个 ,本 序 列 有 6 个 ，D 有 50 个 ， 所 以
通过 染色 体重 排 可 以 得 80x6x50=24 000 种 组 合 ， 由 于 重组 带 来 的 变化 估计 有
100 个 ， 因 此 总 的 变化 2 400 000。 再 考虑 轻 链 和 重 链 的 随机 组 合 ， 免 疫 球 蛋白 分
子 的 种 类 将 达 18 亿 之 多 。

4) 染色 体重 排 机 制 。 为 了 研究 染色 体重 排 机 制 ， 必 须 对 胚胎 的 免疫 球 蛋 白
基因 和 成 体 的 免疫 球 蛋 白 基 因 进 行 比较 ， 在 这 项 研究 中 ， 能 产生 单一 种 类 的 免疫
球 和 蛋白 分 子 的 骨 艇 瘤 细 胞 株 仍然 为 最 合适 的 材料 。

对 小 鼠 的 < 轻 链 DNA 的 酶 切 图 谱 分 析 和 核 苷 酸 顺 序 分 析 结 果 说 明 丁 基因 有 5$
个 ， 它 们 的 排列 方式 是 :

(310) (246) (218) (299)

(38) (38) (38) (38) (36)

括 弧 中 的 数字 表示 核 苷 酸 的 数目 ，$ 个 Jx 序列 的 核 苷 酸 顺 序 中 大 约 84% 都
是 相同 的 ， 不 但 如 此 ， 丁 序列 的 两 旁 核 苷 酸 顺 序 也 是 非常 保守 的 。

丁 序列 的 这 种 核 苷 酸 排列 方式 不 限于 Jk， 也 包括 J、JH, 丁 的 3 端的 非 编 码
区 ， 其 共同 顺序 是 : 3 …………: GTTTTTGT (21 一 23base) :CACTGTG.……
V 序 列 的 核 苷 酸 顺 序 分 析 的 结果 表明 V 的 3 端的 非 编 码 区 的 共同 顺序 是 ;
3 CACAGTG- (11 一 12base) -A-CATAAAC-S$ ， 这 两 个 序列 显然 有 反 向 重
复 性 质 ， 看 来 V/J 连接 处 的 核 苷 酸 顺 序 有 下 列 通 式 :

VCACAGTG- UL 一 12base) -2ACATAAACCTIURRIRNIGI (21 二 2base) -

“。 339 ，

CACTGTGz]

基于 上 述 发 现 ， 现 在 认为 V-J 重 排 是 通过 V 和 了 丁 中 间 的 序列 的 切除 而 实现
的 。 在 这 个 过 程 中 V 的 S 端 和 丁 3? 端 反 向 重复 序列 形成 茎 环 结构 ， 使 它们 的 编码
区 靠拢 ， 然 后 通过 某 些 链 的 作用 而 切除 茎 环 结构 并 使 V 和 了 丁 连接 起 来 (图 10-31)。

这 一 连接 过 程 中 剪 切 处 稍 有 移动 便 会 带 来 前 面 所 说 的 V-J 交 接 处 的 多 种 氨基
酸 变化 ， 如 图 10-32， 如 V-J 交接 按 1 进行 ， 那 么 交接 处 的 氨基 酸 是 Trp
(TGG); 按 2 进行 ， 氨 基 酸 是 精 氨 酸 (CGG); 按 3 进行 ， 氨 基 酸 是 且 氢 酸
(CCG); 按 4 进行 ， 氨 基 酸 是 且 氨 酸 (CCC)。

SS

名

只 DOIaODaOODD

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=
AATGAGGATCCT RS TGGACGTTCGGT
Asn Glu 一 Asp 一 Pro Trmp TIhr Phe Gly
95 96

图 10-31 ”免疫 球 蛋白 基因 拼接 处 的 碱 基 顺 序

值得 注意 的 是 ， 图 10-30 中 V-J 基因 的 拼接 是 DNA 的 拼接 ， 而 不 是 RNA 的
拼接 。V、J 基 因 DNA 之 间 的 拼接 是 基因 重 排 的 一 种 方式 ， 是 免疫 球 蛋 白 基 因 重
排 的 第 一 步 。 转 录 后 mRNA 还 要 经 加 工 拼 接 最 后 翻译 出 免疫 球 蛋白 〈 图 10-33)。
从 图 中 可 以 看 出 : @OJ 与 C 基 因 之 间 的 间隔 区 仍然 存在 。@D 有 活性 的 工 链 只 来 源
于 一 个 V 和 一 个 J， 但 拼接 后 的 DNA 中 仍 有 许多 V 和 丁 基 因 。 获 得 正确 的 氨基
酸 顺 序 要 通过 RNA 的 最 后 拼接 得 到 成 熟 的 mRNA。

.340 ，

如 ，

可 能 的 交换 位 点

人 2 二 4 Vi 了 人 专 : 世
re
y Y Y Y T 和 人
V 基因 S 一 一 转录
JJ 基因 TGG ”一 一 一
| 重组 Esc 一 红 训 作 二 RN
1 TREE 全 ee 的 加 工
Trp
也 ESG 坟 WE
3 CGI |
Pro
人 (人
图 10-32 “V-J 交接 处 的 可 能 位 置 图 10-33 IgG 分 子 工 链 的 产生

五 、 转 录 后 的 控制

真 核 基 因 转 录 产 生 hnRNA， 通 过 5 和 3“ 末 端 修饰 、 剪 接 、 编 辑 等 一 系列 加
工 过 程 才 成 为 成 熟 的 mRNA， 然 后 被 运送 到 细胞 质 的 特定 区 域 才能 翻译 ， 这 些
过 程 对 基因 表达 水 平 都 会 产生 影响 。

1. 转录 延伸 的 弱化

转录 起 始 之 后 ， 每 个 基因 转录 并 不 一 定 以 相同 的 速度 转录 到 终点 ， 其 中 一 些
转录 可 由 弱化 控制 中 途 停顿 甚至 提前 终止 而 使 转录 流产 ， 转 录 弱 化 在 原核 中 资料
较 多 ， 但 在 真 核 中 同样 存在 ， 不 过 弱化 机 制 有 所 不 同 ， 在 真 核 中 转录 的 弱化 程度
(RNA 多 聚 酶 是 否 能 通过 下 游 的 特异 弱化 位 点 ) 可 能 取决 于 蛋白 质 (如 Asz 基因
的 转录 )， 即 包括 在 启动 子 上 装配 的 蛋 日 质 或 结合 在 转录 起 始点 下 游 的 蛋白 质 。
这 些 蛋 白质 在 不 同类 型 细胞 中 不 同 ， 细 胞 能 控制 不 同 基因 的 弱化 程度 。

2. RNA 的 剪接 加 工 和 编辑 使 同一 基因 转录 产生 不 同 的 蛋白

剪接 过 程 中 据 估计 有 半数 以 上 的 RNA 被 完全 降解 ， 有 半数 可 产生 不 同形 式
的 筋 接 产物 ， 使 基因 可 产生 不 同 的 蛋白 质 。 剪 接 的 改变 可 以 是 组 成 型 的 ， 这 种 情
况 下 拼接 改变 是 有 限 的 ， 每 个 转录 单位 只 产生 少数 几 种 蛋白 质 。 但 在 许多 情况
下 ， 改 变 甬 接 是 受 控制 的 而 不 是 组 成 型 的 ， 在 这 种 情况 下 ， 某 一 基因 转录 物 能 否
被 正确 甬 接 而 最 终 产 生 有 功能 的 蛋白 质 受到 细胞 类 型 的 控制 。 例 如 果 蝇 中 的 一 种
催化 P 因子 转 座 的 转 座 酶 ， 只 在 生殖 细胞 中 产生 有 功能 的 蛋白 ， 在 果 蝇 的 体 细
胞 中 均 产 生 无 功能 的 蛋白 ， 原 因 是 一 个 内 含 子 序 列 只 有 在 生殖 细胞 中 被 剪接 去
除 。

. 341 ，

剪接 加 工 对 基因 表达 也 可 有 正和 负 控 制 之 分 ， 上 述 P 因子 转 座 酶 在 果 蝇 体
细胞 中 的 加 工 是 负 控制 ， 在 生殖 细胞 中 的 加 工 是 正 控制 。 另 外 ， 根 据 细 胞 的 需
要 ， 剪 接 加 工控 制 在 不 同类 型 细胞 中 产生 不 同 的 蛋白 质 ， 例 如 Src 原 癌 基 因 编 码
的 酷 氨 酸 蛋 白质 激酶 ， 在 大 多 数 类 型 细胞 中 产生 5$33 个 氨基 酸 组 成 的 蛋白 ， 但 在
神经 细胞 中 却 产 生 539 个 氮 基 酸 的 蛋白 质 ， 这 是 因为 一 个 小 的 内 合子 A 在 神经
细胞 的 加 工 中 保留 ， 神 经 细胞 中 的 这 种 酷 氨 酸 激酶 多 了 一 个 磷酸 化 位 点 ， 具 更 高
的 特异 活性 。 又 如 果 蝇 发 育 中 有 三 个 基因 一 sz、tia、dsz 决定 性 别 ， 是 在
RNA 的 剪接 加 工 水 平 上 控制 ， 剪 接 方式 不 同 ，szl 和 tra 在 雄性 发 育 中 产生 无 功
能 的 蛋白 ， 在 峻 性 发 育 中 产生 有 功能 的 蛋白 ，dsx RNRA 剪接 不 同 ， 产 生 C 端 不
同 的 Dsx 蛋白 ， 在 雄性 个 体 发 育 中 的 Dsx 蛋白 C 端 150 个 氨基 酸 是 雄性 特异 的 ，
雌性 的 Dsx 蛋白 C 端 30 个 氨基 酸 是 雌性 特异 的 。

剪接 的 正 负 控 制 决定 剪接 的 形式 ， 控 制 的 机 制 是 在 负 控 制 中 ，RNA 的 剪接
位 点 上 有 抑制 蛋白 结合 ， 使 本 来 可 以 发 生 的 剪接 不 能 进行 ， 在 正 控 制 中 ， 剪 接 机
器 本 不 能 在 某 一 位 点 剪接 ， 但 由 于 剪接 的 激活 蛋白 在 这 位 点 附近 结合 而 使 剪接 得
以 在 这 点 上 进行 ， 不 同类 型 细胞 根据 自己 对 某 一 基因 产物 的 需要 产生 剪接 加 工 的
激活 蛋白 或 抑制 蛋白 。

在 一 些 RNA 的 加 工 中 产生 两 种 以 上 的 功能 和 蛋白， 例如 HCMV 的 正 I86 和
IEIIS5 都 是 由 同一 hnRNA 产生， 两 种 的 比例 相对 稳定 ， 如 何 控制 不 同形 式 加 工
的 比例 还 不 清楚 ， 估 计 是 由 剪接 加 工 的 抑制 或 激活 蛋白 的 量 控制 ， 也 可 能 是 由 两
者 的 比例 决定 。

RNA 编辑 在 RNA 的 多 处 增加 U， 可 造成 读 杠 改变， 出 现 终止 码 ， 改 变 氢 基
酸 等 而 产生 不 同 蛋白 。

3. RNA 的 切割 和 加 polyA 也 能 改变 基因 编码 的 蛋白 质

真 核 mRNA 的 3 端 不 是 由 RNA 多 聚 酶 I 江 的 合成 终止 决定 的 ， 而 是 在 转录
延伸 过 程 中 由 另外 的 因子 催化 切割 决定 的 。 在 一 般 情 况 下 切割 位 置 在 polyA 信和 号
序列 AAUAAA 的 下 游 约 30 个 核 苷 酸 左右 ， 然 后 再 在 末端 加 上 polyA， 但 细胞 有
能 力 控制 在 RNA 的 不 同 点 切 开 。 研 究 得 较 清 杷 的 例子 是 B 淋巴 细胞 发 育 过 程 中
合成 膜 结合 抗体 和 分 泌 性 抗体 ，B 淋巴 细胞 早期 接触 抗原 后 受 刺激 合成 的 抗体 的
C 端 是 结合 在 质 膜 上 的 ， 其 余部 分 暴露 在 细胞 表面 作为 抗原 受 体 ， 当 第 二 次 接触
这 种 抗原 ， 表 面 的 受 体 与 抗原 形成 复合 物 刺 激 B 细胞 分 裂 和 合成 分 泌 性 抗体 。
膜 结合 型 和 分 泌 型 抗体 只 是 C 端的 氨基 酸 序 列 不 同 ， 前 者 含 较 长 的 亲 脂 性 〈 邪
水 的 ) 氨基 酸 序 列 ， 而 后 者 C 端 含 短 的 亲 水 的 氨基 酸 序 列 。

4. RNA 从 核 中 运送 到 细胞 质 的 过 程 也 是 受 控制 的

在 合成 的 RNA 总 量 中 ， 约 有 1/12 的 RNA 被 运 出 核 到 细胞 质 中 ， 其 中 在 核
“3 要 一

内 被 完全 降解 的 约 50% ， 另 一 些 被 留 下 的 RNA 可 能 含 一 些 序列 ， 这 些 序列 使 它
们 决 不 会 成 为 mRNA， 另 有 一 些 代 表 潜 在 的 mRNA， 它 在 某 些 类 型 细胞 中 是 有
功能 的 ， 而 在 另 一 些 类 型 细胞 中 则 不 能 被 运 出 核 。

虽然 RNA 运 出 核 的 控制 机 制 目前 不 了 解 ， 运 出 核 的 控制 形式 的 证 据 也 很
参 ， 但 至 少 有 几 点 可 以 说 明 RNA 运 出 核 外 是 受 控制 的 : DRNA 通过 核 膜 孔 运 出
的 过 程 是 一 种 激活 过 程 ; @ 对 大 多 数 mRNA 需要 有 5 帽子 结构 和 3“polyA 结构 ;
@mRNA 必须 与 所 有 的 剪接 体 成 分 完全 脱离 后 才能 被 运 出 核 。

mRNA 通过 核 膜 孔 从 核 中 运 出 ， 它 被 送 到 细胞 质 中 的 位 置 也 有 特异 性 。 例
如 ， 如 果 mRNA 编码 的 蛋白 质 是 分 泌 到 胞 外 的 ， 它 被 直接 运 到 内 质 网 ， 连 同 与
之 结合 的 核糖 体 和 新 生 的 肽 链 一 起 被 运输 ， 即 运输 与 翻译 同时 进行 ， 在 内 质 网 膜
上 上 继续 完成 肽 链 的 合成 。 而 另 一些 mRNA 则 可 能 被 运 到 细胞 浆液 中 ， 由 细胞 浆
中 游离 的 核糖 体 进行 翻译 。 在 细胞 质 中 的 运送 和 定位 ， 前 一 种 情况 是 由 新 生 肽 链
N 未 端的 信号 序列 〈 信 和 号 肽 ) 决定 的 ， 这 段 序列 刚 被 核糖 体 合 成 ， 就 立即 被 细胞
的 一 种 “蛋白 质 截 短 成 分 ”所 识别 ， 这 种 成 分 指导 将 mRNA- 核 糖 体 -新 生 肽 复合

物 运 到 内 质 网 膜 。 在 另 一 些 情况 下 ， 运 送 和 定位 在 翻译 之 前 由 mRNA 本 身 的 核

背 酸 序列 决定 ， 这 段 信号 序列 典型 的 是 在 翻译 终止 码 和 polyA 开始 之 前 的 3 不 翻
译 区 域 。

和 六、 真 核 重 白质 合成 的 控制

在 蛋白 质 合成 水 平 上 的 控制 ， 是 基因 表达 控制 的 重要 环节 ， 同 一 细胞 中 同时
出 现 的 不 同 mRNA， 即 使 mRNA 数目 接近 相等 ， 产 生 的 蛋白 质 的 多 少 也 可 以 差
别 很 大 。 这 主要 取决 于 翻译 的 速率 和 mRNA 的 寿命 。

1. mRNAS “前 导 序 列 对 翻译 水 平 的 影响

真 核 mRNA 翻译 起 始 ， 对 绝 大 多 数 的 mRNA 来 说 ， 是 核糖 体 小 亚 基 从 S “由
子 沿 着 mRNA 移动 寻找 AUG 密码 ， 一 般 遇 到 第 一 个 AUG 就 与 核糖 体 大 亚 基 装
配 后 开始 翻译 。 但 也 有 的 漏 过 第 一 个 AUG， 从 第 二 个 或 第 三 个 AUG 开始 翻译 。
只 有 极 少 的 真 核 细胞 和 病毒 的 mRNA 翻译 时 核糖 体 小 亚 基 是 从 中 间 进 入 的 ， 这
些 mRNA 的 内 部 有 一 核糖 体 进 入 的 位 点 。 另 外 ， 在 翻译 过 程 中 如 果 核 糖 体 遇 到
弱化 序列 或 终止 信号 ， 真 核 核糖 体会 立即 拆散 ， 并 且 不 会 再 在 此 处 重新 装配 使 翻
译 重新 开始 。

在 疱疹 病毒 (HSV) 感染 的 细胞 中 ，TK (胸腺 喀 喧 激酶) 和 pol (DNA 多
聚 酶 ) 两 种 病毒 特异 的 mRNA 在 细胞 中 同时 出 现 并 且 数 量 (分 子 数 ) 接近 相等 ，
但 翻译 产生 的 pol 蛋白 还 不 到 TK 蛋白 的 1/20， 电 镜 观 察 发 现 pol mRNA 上 很 少
有 核糖 体 结 合 。HCMV 的 DNA 多 聚 酶 的 mRNA 的 $ 前 导 序 列 与 HSV 的 pol 的

和“

mRNA 十 分 相似 ， 是 一 段 长 的 富 含 GC 的 序列 ， 这 段 序 列 可 以 与 紧 接 AUG 下 游
的 序列 形成 含 多 个 GC 的 茎 环 结构 或 发 夹 结构 ，AUG 处 于 环 中 ， 这 样 核 糖 体 小
亚 基 很 难 移动 到 AUG 人 位置。 昆虫 杆 状 病毒 包含 体 蛋 白 和 一 些 植物 病毒 衣 壳 蛋 自
的 mRNA 翻译 效率 非常 高 ， 它 们 的 $ 前导 序 列 富 含 A 和 T， 如 果 用 植物 病毒
AMVR4 ( 衣 壳 蛋白 基因 ) 的 mRNA 的 前 导 序 列 代替 HCMV pol 的 mRNA 的 前
导 序 列 ，pol 的 mRNA 的 翻译 水 平 就 会 显著 提高 。 有 人 用 AMVR4 的 前 导 序列 取
代 一 种 肿瘤 抑制 蛋白 Rb mRNA 的 前 导 序 列 ， 体 外 翻译 水 平 提高 几 十 倍 ; 铁 蛋 自
mRNA 的 近 5 端 也 有 葵 环 结构 ， 一 种 翻译 抑制 蛋白 叫 顺 乌 头 酸 酶 (aconitase) 结
合 在 这 茎 环 结 构 区 域 ， 完 全 阻止 铁 蛋 白 mRNA 的 翻译 。 当 有 铁 离子 时 ，Fe 离子
与 这 抑制 蛋白 结合 使 它 与 mRNA 分 离 后 ，mRNA 才能 被 翻译 产生 铁 蛋 白 。 另 有
些 在 翻译 水 平 上 进行 反馈 抑制 的 蛋白 质 ， 当 这 种 蛋白 质 达 到 一 定 浓度 时 ， 部 分 蛋
白质 分 子 结合 在 编码 它 的 mRNA 5 端 阻 止 翻译 。

上 述 $ 前 导 序 列 形成 葵 环 结构 降低 翻译 水 平 或 抑制 蛋白 结合 5 端 阻止 mRNA
的 翻译 ， 都 是 阻止 翻译 的 起 始 ， 即 阻止 核糖 体 小 亚 基 向 AUG 移动 而 达到 降低 或
封闭 mRNA 的 翻译 。 另 有 一 种 战略 同样 能 降低 从 正确 的 AUG 开始 的 翻译 ， 就 是
在 功能 蛋白 的 编码 区 下 游 另 有 一 个 AUG， 核 糖 体 小 亚 基 必 须 漏 掉 这 个 AUG， 从
第 二 个 AUG 开始 翻译 才能 获得 有 功能 的 蛋白 ， 而 核糖 体 常 从 第 一 个 AUG 开始
翻译 ， 产 生 10 一 20 个 氨基 酸 肽 后 即 终止 。 这 样 ， 第 一 个 AUG 对 mRNA 的 正确 翻
译 起 干扰 或 弱化 作用 。 当 然 ， 有 些 mRNA 从 不 同 的 AUG 翻译 可 产生 几 种 不 同 的
功能 蛋白 ， 这 种 现象 常见 于 病毒 ， 可 使 病毒 利用 有 限 的 基因 组 编码 更 多 的 蛋白 。

2. 翻译 起 始 因 子 的 磷酸 化 可 抑制 或 选择 性 地 加 强 蛋 白质 的 合成

真 核 细胞 在 被 病毒 感染 、 热 休克 、 去 除 某 些 生 长 因子 、 进 入 细胞 周期 的 M
期 等 情况 下 都 抑制 大 部 分 蛋白 质 的 合成 ， 而 少数 蛋白 质 的 合成 反而 加 强 ; 这 种 控
制 中 ， 许 多 与 翻译 起 始 因子 eIF-2 的 变化 有 关 ，eIF-2 被 特异 性 的 蛋白 质 激 酶 磷
酸化 后 ， 降 低 大 多 数 蛋 白质 合成 的 速率 。

有 正常 功能 的 eIF-2 与 GTP 形成 复合 物 ， 介 导 甲 硫 氨 酰 tRNA 与 40S 核糖
体 亚 基 结 合 ， 然 后 这 种 复合 物 进 入 mRNA 5“ 端 并 移动 到 AUG，aJIF-2-GTP 转变
成 无 活性 的 eIF-GDP 从 复合 物 中 释放 出 来 ，60S 的 核糖 体 亚 基 这 时 和 40S 小 亚 基
装配 后 ， 蛋 白质 进行 合成 。eIF-2 与 GDP 结合 很 紧 ， 必 须 使 GDP 从 eIF-2 中 释
放出 来 ， 才 能 使 GTP 重新 与 eIF-2 结合 ，eIF-2 才能 重新 被 利用 。 这 个 GDP 和
GTP 变换 过 程 需 要 一 种 叫 eIF-2B 的 蛋白 质 。 如 果 eIF-2 磷酸 化 ， 就 能 抑制 eIF-2
重新 利用 ， 因 为 磷酸 化 的 eIF-2-GDP 和 eIF-2B 的 结合 非常 牢 ， 防 止 GDP 和 GTP
交换 ， 在 细胞 中 通常 esIF-2 的 数量 比 elIF-2B 多 ， 即 使 一 部 分 eIF-2 磷酸 化 ， 就 能
结合 几乎 全 部 的 eIF-2， 使 未 磷酸 化 的 eIF-2 也 难以 被 重新 利用 ， 这 样 就 使 蛋白
质 合 成 大 大 减少 。

.344 ，

从 上 面 所 述 中 ， 人 们 很 目 然 地 会 想到 ， 当 eIF-2 磷酸 化 时 ， 所 有 的 mRNA
的 翻译 将 会 同时 降低 ， 但 与 这 种 想法 相反 ，eIF-2 磷酸 化 只 是 选择 性 地 降低 一 些
mRNA 的 翻译 ， 对 另 一 些 mRNA 的 翻译 反而 加 强 。 酵 母 在 缺乏 氨基 酸 的 培养 基
中 ，eIF-2 磷酸 化 可 加 强 与 合成 氨基 酸 有 关 的 蛋白 质 的 合成 而 降低 其 他 所 有 蛋白
质 的 合成 ， 使 酵母 适应 无 氨基 酸 的 饥 俄 环境 。 调 节 eIF-2 的 水 平 对 哺乳 动物 细胞
进入 G0 期 是 很 重要 的 ，G0 期 蛋白 质 合成 的 速率 只 有 增殖 细胞 的 五 分 之 一 。

3. mRNA 3 端的 结构 对 翻译 速率 和 mRNA 寿命 的 影响

(1) polyA 的 影响

一 般 真 核 mRNA 的 3 末端 有 一 长 的 polyA， 这 上 段 长 的 polyA 除 影响 mRNA
的 稳定 性 外 还 影响 mRNA 的 翻译 ， 因 此 polyA 从 两 方面 影响 蛋白 质 合成 的 水 平 。
polyA 长 度 在 30 一 200 个 腺 唆 吟 核 苷 酸 范围 ， 一 些 mRNA 的 polyA 长 度 是 受 控制
的 ，polyA 对 于 mRNA 的 稳定 性 是 需要 的 。 细 胞 可 以 对 不 同 的 mRNA 的 polyA
选择 性 加 长 或 快速 截 短 、 去 除 ， 那 些 被 去 除 polyA 的 mRNA 就 很 快 被 降解 ， 那
些 被 加 长 polyA 的 mRNA 保持 稳定 ， 寿 命 长 ， 可 多 次 翻译 。

polyA 除 与 mRNA 的 稳定 即 寿 命 有 关 之 外 ， 还 可 影响 翻译 ， 在 成 熟 的 卵 中 ，
通过 加 长 特异 的 mRNA 的 polyA 的 手段 控制 基因 表达 就 是 一 个 引 人 注 目的 例子 。
在 巨大 的 卵细胞 中 ， 许 多 正常 的 降解 mRNA 的 途径 是 不 奏效 的 ， 因 此 细胞 储存
大 量 的 mRNA 以 备 受 精 ， 这 些 储存 的 mRNA 3“ 末 端的 polyA 只 有 10 一 30 核 苷 酸
长 度 ， 这 种 形式 的 mRNA 是 不 翻译 的 。 受 精 后 细胞 需要 这 些 mRNA 编码 的 蛋 昌
质 ， 就 在 需要 翻译 的 那些 mRNA 的 3“ 端 再 增加 polyA， 逐 渐 刺 激 这 些 mRNA 起
始 翻译 。

加 长 polyA 刺激 mRNA 的 翻译 的 机 制 ， 一 是 通过 eIF4G 与 PablP 作用 促进
40S 亚 基 与 mRNA 结合 ， 二 是 polyA 结合 蛋白 催化 核糖 体 大 亚 基 与 结合 在 $ 端
的 核糖 体 小 亚 基 的 装配 ， 如 图 10-34 所 示 。

(2) 3 痛 的 序列 对 mRNA 翻译 的 影响

组 蛋白 的 mRNA 的 3 末端 没有 polyA， 它 们 的 mRNA 的 稳定 性 受 3 端的 信
号 序列 控制 。 当 细胞 进入 S 期 ，DNA 合成 需要 大 量 的 组 蛋 折 ， 这 时 组 蛋白
mRNA 的 半衰期 约 1h， 在 不 合成 DNA 时 ， 半 误 期 只 数 分 钟 ， 如 果 用 药物 在 S 期
抑制 DNA 合 成， 组 蛋白 mRNA 立即 变 得 不 稳定 而 很 快 降解 。

组 蛋白 mRNA 的 3 端 存 一 段 短 的 茎 环 结构 代 替 polyA， 这 一 末端 是 在 RNA
聚合 酶 在 合成 后 通过 特异 性 切割 而 产生 的 ， 切 割 过 程 需 要 存在 于 一 种 核 蛋 白 中 的
小 RNA 与 切割 区 域 进行 碱 基 配对 ， 如 果 用 DNA 重组 技术 把 这 段 茎 环 结构 DNA
转移 到 别 的 mRNA 3“ 端 ， 别 的 mRNA 也 会 随 着 DNA 合成 停止 而 变 得 不 稳定 。
这 说 明 mRNA 的 降解 速率 受 这 3“ 信 和 号 的 影响 ， 而 且 降 解 是 从 3 末端 开始 的 。 如
果 在 组 蛋白 mRNA 编码 区 中 间 搬 入 一 个 翻译 终止 密码 ， 这 种 mRNA 是 稳定 的 ，

“ 345 。

在 起 始 密码 上 的

切割 和 加 polyA 小 核糖 体 亚 基
1 、\ 必 昌 | 。 厂 | ceaame aa === 一 aaa 7.
polyA 延长
细胞 核
下 本

大 核糖 体 亚 基

蛋白 质 与 多 聚
所 有 mRNA 的 A 尾 结合 催化
polyA 逐步 丢失 大 核糖 亚 基 进 入

(a)

图 10-34 mRNA 3 " 端 多 聚 A 尾巴 对 基因 表达 的 调控

即使 细胞 DNA 合成 停止 也 不 会 很 快 被 降解 ， 这 说 明 降 解 mRNA 的 核酸 酶 是 结合
在 核糖 体 上 的 ， 并 且 降 解 是 从 3 端 开始 的 ， 中 间 揪 入 的 翻译 终止 密码 使 核糖 体
提前 与 mRNA 分 离 而 不 能 靠近 3 末端 。 这 种 假设 能 解释 为 什么 大 多 数 不 稳定 的
mRNA 在 用 蛋白 质 合成 抑制 物 环 己 亚 胺 处 理 细胞 时 变 得 稳定 ， 这 种 与 翻译 偶 联
的 mRNA 降解 机 制 可 以 保证 mRNA 在 降解 之 前 至 少 被 翻译 一 次 。

4. 真 核 生 物 mRNA 翻译 起 始 的 控制

在 原核 生物 中 ， 翻 译 的 起 始 是 通过 核糖 体 小 亚 基 上 16S rRNA 与 mRNA 上
SD 序列 配对 ，mRNA 将 核糖 体 召 集 过 来 。

而 在 真 核 生 物 中 ， 翻 译 的 起 始 依靠 蛋白 质 -蛋白 质 、 蛋 白质 -RNA 之 间 相 互
作用 过 程 ， 这 些 过 程 是 受 控 制 的 。 以 下 为 几 种 翻译 起 始 因子 及 其 作用 。

eIF3: 40S 小 亚 基 联系 因子 ， 至 少 由 8 个 亚 基 组 成 (哺乳 动物 )， 是 与
mRNA 联系 的 起 始 因 子 ， 与 eIF4F 相互 作用 。

eIF4F: 所 有 真 核 细胞 中 的 eIF4F 都 由 帽子 结合 蛋白 eIF4E 和 大 亚 基 eIF4G
这 两 个 核心 亚 基 组 成 。

elIF4G: eIF4G 的 N 端 与 eIF4E 相互 作用 ，C 端 与 eIF3 接触 ，eIF4G 上 从 N
端 到 C 端 有 Pabl (polyA 结合 蛋白 )、eIF4E、RNAVeIF3 和 eIF4A 等 不 同 因 子 的
结合 区 ， 在 eIF4E 结合 区 和 RNAVeIF3 结合 区 之 间 有 病毒 蛋白 酶 切割 位 点 。

eIF4A: 在 高 等 真 核 生 物 中 ，eIF4A 对 mRNA 帽子 刺激 的 翻译 起 始 中 的 40S

“346 ，

j

}

东亚 基 的 召集 是 必需 的 ，eIF4A 与 eIF4G 结合 ，eIF4A 表现 出 依赖 与 ATP 的

RNA 解 旋 酶 活性 ， 这 种 活性 可 由 RNA 结合 蛋白 eIF4B 激活 ， 但 eIF4A 与 eIF4B

不 会 发 生 直接 的 相互 作用 。eIF4A 和 eIF4B 对 40S 亚 基 召集 的 作用 仍 不 十 分 清
楚 ， 可 能 是 与 40S 亚 基 装配 中 的 RNA 解 旋 有关 ， 提 纯 时 ，eIF4A 不 与 eIF4E 一
起 共 纯 化 ， 说 明 eIF4A 不 参与 eIF4F 复合 物 。

eIF4F 的 装配 : 细胞 合成 一 种 抑制 蛋白 ， 可 调控 eIF4F 的 装配 ， 被 称 为
SR4E 结合 蛋白 (4E-BPS)， 这 种 蛋白 有 一 段 与 eIF4G N 端 类 似 的 氨基 酸 序 列
(XYDRXFLXXX，eIF4G 中 的 与 eIF4E 结合 区 的 序列 : KKRYDREFLLGF)， 当
氏 EBPS 磷酸 化 时 不 能 与 eIF4E 结合 ， 但 它 去 磷酸 化 后 成 为 eIF4G 与 eIF4E 结合
的 竞争 抑制 物 。 腺 病毒 (ADV) 感染 细胞 可 诱导 4E-BPS 去 磷酸 化 ， 加 速 eaIF4E
与 4E-BPS 结 合 ， 阻 止 eaIF4E- eIF4G 的 形成 ， 从 而 抑制 细胞 mRNA 的 翻译 。4E-
BP1 是 4E-BPS 中 研究 最 充分 的 成 员 ， 生 长 因子 可 诱导 4E-BPS 磷酸 化 (Sere4 磷
酸化 ， 由 MAP- 有 丝 分 裂 激 活 蛋白 激酶 引起 )。eIF4E 本 身 的 磷酸 化 加 速 它 与
PRNA5“ 帽 子 结合 及 eIF4E 与 eIF4G 相互 作用 ，eIF4E 的 磷酸 化 〈Seroo) 在 细胞
内 是 受 调控 的 ， 但 与 eIF4E 磷酸 化 有 关 的 酶 还 没有 找到 。 当 ADYV 感染 时 ， 细 胞
内 未 磷酸 化 的 eaIF4E 积累 ， 降 低 细胞 mRNA 的 翻译 ， 而 病毒 的 mRNA 照常 高 克
翻译 ， 是 由 于 病毒 mRNA 的 分 为 三 部 分 的 前 导 序 列 (tripartite leader sequence)
在 低 浓度 的 磷酸 化 eIF4E 条 件 下 可 被 优先 选择 翻译 ， 它 是 病毒 感染 的 又 一 种 战
略 。polyA 结合 蛋白 (PABP)， 对 eIF4F 的 装配 有 促进 作用 ， 研 究 表明 ，PABIl
刺激 使 翻译 水 平 提高 2 倍 以 上 ，polyA 结合 蛋白 与 mRNA 的 polyA 结合 及 其 功能
又 受 polyA 上 游 的 37UTR 影响 ，37UTR 可 激活 或 抑制 它 与 polyA 结合 及 其 功能 ，
PABP 与 eIF4G 结合 并 互相 作用 ， 这 种 互相 作用 又 促进 4E 与 4G 之 间 的 结合 。
共同 使 mRNA 成 环 ， 促 进 40S 亚 基 与 mRNA 的 结合 及 60S 亚 基 的 装配 。

除 eIF4E-eIF4G 对 翻译 调控 外 ， 还 可 以 通过 mRNA 上 紧 接 帽子 的 〈Cap-
proximal) 一 段 序列 来 控制 【5 “末端 守 聚 喀 啶 序列 (5 "TOP)]，eIF4E-eIF4G、 翻
译 延 伸 因 子 1A 和 翻译 延伸 因子 2 以 及 polyA 结合 蛋白 可 与 mRNA 调控 序列 9
TOP (S$TOP 是 紧 接 帽子 的 一 段 序 列 ) 相互 作用 。 例 如 ， 在 铁 蛋 白 mRNA 中 ，
称 为 离子 应 答 因 子 (IRE) 的 一 段 序 列 就 位 于 $ TOP 内 ， 这 段 序列 与 离子 调控 蛋
自 〈IRP) 有 很 高 的 亲和力 ，IRP 与 IRE 结合 后 可 以 阻止 小 亚 基 的 装配 。

IRES 因子 及 核糖 体 40S 亚 基 召 集 (中 间 进 入 ): 正 链 RNA 病毒 的 RNA 53/
NCRS 长 达 300 一 1200nt， 含 有 多 个 “AUG” 和 一 段 称 为 “中 间 核 糖 体 进入 序
列 ”(IRES) 及 二 级 结构 ， 也 能 在 细胞 内 有 效 翻译 。 正 链 RNA 病毒 感染 抑制 宿
主 细胞 的 帽子 刺激 的 翻译 。 而 病毒 的 mRNA 翻译 由 IRES 介 导 ， 核 糖 体 从 $" 非
编码 区 内 部 进入 而 不 是 从 5 末端 进入 ， 这 种 翻译 机 制 也 称 “ 中 间 进 入 ”机 制 。
小 RNA 病毒 的 mRNA SNCR 可 分 成 三 类 : Typ I (poliovirus、enter virus and
rhinovirus) Typ II (ardio-and aphtovirus ， 如 EMCV) Typ III (HAV， 甲 型 肝炎

。 347 ，

病毒 )。

在 SNCR 的 近 3“ 端 有 喀 啶 丰富 的 保守 结构 (一 级 及 二 级 结构 )， 不 同类 型 的
差别 在 于 这 段 序列 与 起 始 密码 AUG 的 距离 。 在 typ 工 中 这 段 序列 在 起 始 码 AUG
上 游 50~100nt， 而 在 typ II 和 typIII 中 AUG 紧 接 这 段 序列 的 3' 端 边界 ， 预 料 这
段 序列 与 核糖 体 小 亚 基 中 的 18S rRNA 互补 ， 核 糖 体 从 这 里 进入 ， 这 段 序 列 的 三
级 结构 和 二 级 结构 对 核糖 体 进 入 都 是 必须 的 。

Typ IIRES 的 翻译 效率 在 无 细胞 系统 中 很 差 ， 在 不 同 的 细胞 内 翻译 效率 差
别 很 大 ， 在 eIF4G 被 病毒 蛋白 酶 切 开 情 况 下 ， 翻 译 效率 显著 提高 。

Typ I mRNA 通过 这 段 序 列 与 18S rRNA 序列 互补 结合 核糖 体 亚 基 ， 然 后 核
糖 体 沿 着 mRNA 向 下 游 移 动 扫描 出 AUG。

40S 亚 基 与 Typ I 或 Typ III mRNA 在 通过 互补 结合 后 ， 还 要 重新 放 在 AUG
上 ， 重 新 放置 过 程 需 起 始 因 子 作 用 ， 对 HCV RNA 翻译 研究 表明 ， 包 括 起 始 码
AUG 在 内 的 一 小 段 编码 区 RNA 序列 对 于 重新 放置 是 必需 的 。

已 发 现 有 几 种 细胞 的 mRNA 也 含有 这 类 $'NCR， 如 免疫 球 蛋 白 的 重 链 结合
蛋白 Bip 的 mRNA， 成 纤维 细胞 生长 因子 2 蛋白、 人 eIF4G 的 mRNA 等 ， 细 胞
的 这 些 mRNA 的 翻译 起 始 也 采用 核糖 体 中 间 进 入 机 制 。

5. 翻译 延伸 过 程 对 蛋白 质 合成 的 影响

在 翻译 起 始 之 后 , 核糖 体 并 非 一 定 能 从 起 始 密码 顺利 移动 到 终止 密码 , mRNA
编码 区 中 间 也 形成 一 些 二 级 结构 , 主要 是 小 的 葵 环 结构 成 为 核糖 体 沿 mRNA 移动
的 障碍 , 使 翻译 速度 下 降 甚至 中 途 停止 , 部 分 核糖 体 可 越过 障碍 翻译 到 终点 。

另外 有 些 mRNA (常见 于 反 转 病毒 ) 在 翻译 延伸 中 发 生 “ 移 框 翻译 ”
(translational frame shifting)， 改 变 翻译 的 产物 。 当 翻译 延伸 时 发 生 移 框 翻译 ， 因
而 清除 了 终止 密码 使 翻译 继续 进行 ， 使 原来 的 编码 改变 而 重新 编码 ， 这 种 现象 称
为 翻译 的 重新 编码 (translational recoding)。 移 框 翻译 可 以 在 翻译 时 把 阅读 框 向
前 (+1) 或 向 后 (=- 1) 移动 一 个 核 苷 酸 。 移 框 翻译 需要 mRNA 上 发 生 移 框 的
位 置 下 游 的 特异 序列 ， 称 为 重新 编码 信号。

HIV Gag 蛋白 合成 中 ， 约 90% 的 核糖 体 在 翻译 中 没有 发 生 阅读 框 改变 ， 约
10% 的 核糖 体 在 翻译 到 UUU UUA GGG 时 (Phe-Leu-Gly)， 在 亮 氨 酸 加 入 肽 链
后 向 后 移动 一 个 核 苷 酸 ， 使 下 一 个 甘氨酸 读 框 (GGG) 变 成 精 氨 酸 (AGG)， 从
而 使 以 后 的 阅读 框 在 翻译 中 都 向 后 移动 一 个 核 苷 酸 ， 于 是 产生 gag-pol ( 反 转 录
酶 ) 融合 蛋白 。

另 有 一 类 非常 军 见 的 重新 编码 的 形式 ， 是 在 翻译 延伸 至 终止 码 UGA 时 ， 受
到 此 终止 码 附近 信号 影响 ， 翻 译 不 会 终止 ， 而 是 渗入 一 个 含 Se 原子 代替 S 原子
的 修饰 的 半 胱 氨 酸 ， 翻 译 继续 下 去 ， 产 生 另 一 种 生日 。Se 原子 对 一 些 酶 的 活性
是 必需 的 。

348 。

6. 微小 的 干扰 RNA 对 mRNA 翻译 的 负 控 制

在 动 植物 细胞 中 普遍 存在 微小 的 干扰 RNA _ (siRNA)， 大 小 为 21 一 23 核 背
酸 ， 可 以 与 mRNA 互补 结合 ， 造 成 mRNA 不 能 翻译 和 降解 。 这 些微 小 的 干扰
RNA 对 mRNA 的 翻译 起 负 控 制作 用 。

349 ，

第 十 一 章 ” 细 有 信和 忌 调 控

前 几 章 论 述 了 基因 表达 调控 ， 可 以 说 是 基因 水 平 上 的 分 子 生 物 学 。 而 细胞 信
号 则 是 细胞 水 平和 整体 水 平 的 分 子 生物 学 。

在 多 细胞 组 成 的 生物 中 ， 尤 其 是 高 等 动物 体 中 ， 有 多 种 组 织 、 右 官 ， 每 种 组
织 和 髓 官 又 含 许 许 多 多 细胞 。 然 而 高 等 生物 的 个 体 是 高 度 协调 统一 的 一 个 整体 ，
对 外 界 的 刺激 能 做 出 迅速 而 准确 的 反应 。 例 如 一 个 人 受到 惊吓 时 ， 心 跳 加 速 、 腔
色 苍 白 、 全 身 冒 冷汗 ; 运动 员 在 做 体操 表演 时 全 身 的 运动 是 那样 协调 ;人 体 发 育
到 一 定 生理 阶段 具有 男人 或 女人 的 性 特征 等 。 神 经 、 情 绪 、 思 维 、 运 动 以 及 各 种
生理 、 病 理 状态 下 ， 机 体 的 不 同 部 位 都 做 出 不 同 的 协调 的 反应 。 这 就 需要 在 细胞
之 间 进 行 有 效 的 信息 联络 。 细 胞 接受 了 这 些 信息 ， 能 正确 地 决定 自己 应 该 做 伟
么 ， 是 死亡 、 是 生存 、 是 增生 ， 还 是 进行 一 些 特别 的 反应 《〈 例 如 改变 细胞 内 基因
表达 的 模式 )。 这 就 是 细胞 信号 〈cell signaling)。 机 体 通 过 细胞 信和 号 对 体内 的 许
多 细胞 进行 “社会 式 ” 控 制 。 一 旦 信号 控制 失灵 ， 就 造成 机 体 失 调 ， 甚 至 恶性 增
生 和 发 生 肿瘤 ， 导 致 机体 死 亡 。 细 胞 信号 联络 即使 在 单 细胞 生物 中 也 存在 ， 例 如
酵母 和 大 肠 杆 菌 的 接合 交配 是 通过 释放 出 一 种 称 为 交配 因子 (mating factor) 的
肽 向 周围 细胞 发 出 信号 的 。 不 过 ， 高 等 动物 的 细胞 信号 系统 更 加 复杂 和 精细 微

妙 。
第 一 他。 细胞 信号 的 一 般 概念
一 、 信 号 分 子 和 信号 受 体

显然 ， 细 胞 信号 最 少 包 括 两 方面 因素 : @ 四 细胞 外 的 信号 分 子 ; @ 信 和 号 受 体 。
信和 号 分 子 有 好 几 百 种 ， 包 括 蛋白 质 、 小 肽 、 氨 基 酸 、 核 酸 、 固 醇 类 、 脂 肪 酸 类 似
物质 、 类 维生素 A_ (retinoids)， 甚 至 小 分 子 可 溶性 气体 如 CO 和 NO。 绝 大 多 数
信和 号 分 子 由 发 出 信号 的 细胞 通过 外 排 作 用 (exocytosis) 或 扩散 作用 穿 过 质 膜
(小 分 子 信 号 ) 而 分 泌 到 胞 外 。 另 有 一 些 信号 分 子 并 不 分 泌 到 胞 外 ， 而 是 紧 紧 地
结合 在 发 出 信号 的 细胞 外 表面 ， 这 些 信号 只 能 影响 与 发 信号 细胞 接触 的 细胞 。 信
号 分 子 的 作用 浓度 很 低 〈 小 于 10-smoVL)， 而 且 浓度 可 在 短 时 间 内 变化 。

受 体 又 分 细胞 表面 受 体 和 细胞 内 受 体 。 受 体 是 靶 细 胞 接受 信和 号 或 对 信和 号 做 出
初步 反应 的 一 类 特殊 的 蛋白 质 。 细 胞 表面 受 体 是 一 类 跨 膜 蛋白 质 。 受 体 识 别 信和 号
分 子 能 以 很 高 的 亲和力 与 信号 分 子 结合 〈( 亲 和 第 数 氏 。>>10*movyL) 成 为 激活 状

， 350 ，

态 ， 引 起 靶 细 胞 内 一 连 串 反应 而 改变 细胞 的 行为 。 另 一 些 细胞 内 受 体 ， 是 催化 反
应 的 酶 〈 如 乌 苷 酸 环 化 酶 ) 或 基因 转录 的 调控 和 蛋白， 是 与 分 子 质量 足够 小 的 疏水
性 信号 分 子 结合 的 ， 因 为 疏水 〈 亲 脂 ) 的 很 小 的 信号 分 子 ， 如 NO、CO 和 一 些
激素 可 以 直接 扩散 穿 过 质 膜 和 核 膜 进入 驾 细 胞 内 激活 细胞 内 受 体重 折 ， 由 被 激活
的 受 体 蛋 白 直接 催化 反应 或 控制 基因 转录 。

信和 号 根据 来 源 、 作 用 范围 和 送 达 的 形式 可 以 分 为 三 种 形式 。

1. 近 分 泌 信和 号

近 分 沙 信 号 〈paracrine) 由 细胞 分 记 后 扩散 到 它 周 围 的 细胞 ， 因 此 它 的 作用
具 是 局 部 的 ， 不 能 远 距 离 输送 ， 也 不 允许 扩散 太 远 。 当 这 种 信号 分 泌 后 会 立即 被
附近 的 细胞 接受 ， 或 很 快 被 细胞 外 的 酶 降解 或 很 快 被 氧化 (如 NO、QCO)， 或 被
胞 外 的 基质 固定 不 能 再 扩散 。

2. 内 分 闷 信 号

内 分 泌 信 号 (endocrine) 由 各 种 腺 体 或 特殊 组 织 产 生 ， 如 各 种 激素 ， 这 种 形
式 的 信号 由 血液 循环 系统 (植物 则 通过 体液 ， 如 液 汁 ) 输送 到 全 身 ， 受 血液 稀
释 ， 浓 度 很 低 。

3. 神经 信号

神经 信号 〈synaptic) 是 由 神经 细胞 或 神经 元 受 外 界 环境 信号 或 别 的 神经 细
胞 发 出 的 信号 激活 而 发 出 的 电 脉冲 ， 电 脉冲 沿 着 神经 轴 突 高 速 传递 (每 秒 可 达
100m) 直至 轴 突 的 末端 ， 刺 激 末端 分 泌 一 种 称 为 “神经 传感器 ” (neurotransmit-
ter) 的 化 学 信号 ， 这 些 化 学 信和 号 被 快速 (距离 不 到 100nm， 时 间 少 于 千 分 之 一
秒 ) 而 特异 地 传递 到 与 神经 轴 突 接触 的 靶 细 胞 。 关 于 神经 信号 的 传递 过 程 ， 这 里
不 作 具 体 介 绍 。

还 有 一 种 叫 “ 自 家 分 泌 信 号 ” (autocrine signaling)。 上 面 介绍 的 信号 是 影响
远 或 近 距 离 的 别 的 细胞 的 ， 而 自家 分 泌 信 号 则 是 影响 周围 与 自己 同类 型 的 细胞 ，
包括 分 泌 信 号 的 细胞 本 身 在 内 ， 自 家 分 泌 信 号 在 发 育 分 化 过 程 中 决定 一 组 细胞 的
分 化 是 很 有 意义 的 。

二 、 细 胞 对 信号 的 反应

每 个 细胞 周围 有 许多 各 种 各 样 的 信号 分 子 ， 可 以 说 是 处 在 信号 分 子 的 包围 之
中 。 细 胞 可 以 通过 自己 的 表面 受 体 和 胞 内 受 体 获得 信号 ， 也 可 以 通过 连接 相 邻 细
胞 的 通道 而 共享 一 种 信号 。 几 百 种 信号 分 子 ， 除 可 单独 作用 外 ， 又 可 以 进行 组 合
可 能 产生 出 几 百 万 种 组 合 方式 ， 以 组 合 方式 起 作用 ， 就 像 由 4 种 核 苷 酸 可 以 组 合

8

成 60 多 种 氨基 酸 密码 一 样 。 那 么 细胞 接受 哪些 信和 号， 做 出 何 种 反应 ， 显 然 也 是 ，
千差万别 的 。

1. 每 个 细胞 对 某 种 特别 的 组 合 信号 的 反应 是 由 程序 决定 的

在 发 育 生 长 和 分 化 的 过 程 中 ， 每 个 细胞 内 都 形成 一 套 独特 的 程序 “就 像 我 们
在 计算 机 中 储存 程序 ， 当 我 们 用 指头 按 动 某 一 个 键 ， 计 算 机 就 按 程序 进行 工作
当 信和 号 与 受 体 结合 时 ， 细 胞 就 按 预定 程序 规定 做 出 各 种 反应 。

2. 细胞 对 不 同 的 信号 反应 不 同

细胞 在 发 育 过 程 中 获得 了 自己 的 特性 ， 对 信和 号 的 接受 和 反应 是 有 选择 性 的 ，
比如 对 一 组 信和 号 按 程 序 作 出 的 反应 是 增生 ， 对 另 一 组 信和 号 的 反应 是 行使 某 种 特别
的 功能 等 。 在 培养 的 一 瓶 细胞 中 ， 有 的 细胞 可 以 对 一 组 信号 做 出 按 程 序 自杀 的 反
应 〈 即 programmed of cell death， 也 叫 apoptosis) 。

3. 不 同 细胞 对 同一 信号 的 反应 可 以 不 同

在 不 同类 型 的 细胞 中 接收 同一 种 信号 的 受 体 可 以 不 相同 ， 对 信和 号 意义 的 解释
也 不 相同 ， 因 而 做 出 的 反应 不 同 。 在 许多 情况 下 ， 即 使 在 不 同类 型 细胞 中 接受 同
一 种 信和 号 的 受 体 完 全 相同 ， 也 可 以 对 信和 号 做 出 不 同 的 反应 ， 这 是 因为 在 不 同类 型
细胞 中 与 受 体 偶 联 的 细胞 内 的 机 制 不 同 所 致 。

下 面 我 们 将 重点 介绍 与 细胞 表面 受 体 有 关 的 信和 号 调控 。

三 、 三 类 已 知 的 细胞 表面 受 体

由 于 细胞 表面 受 体 含量 极 低 ， 还 不 到 整个 细胞 蛋白 的 万 分 之 一 ， 因 此 提纯 获
得 细胞 表面 受 体 以 研究 它们 的 性 质 是 极 困 难 的 。 重 组 DNA 技术 、 克 隆 和 表达 受
体 蛋 白 基因 ， 给 细胞 受 体 的 研究 带 来 了 革命 性 的 转变 ， 大 大 加 速 了 受 体 研 究 的 进
程 。 在 细胞 表面 ， 存 在 着 各 种 各 样 的 大 量 受 体 ， 目 前 根据 结构 和 作用 方式 不 同 被
分 万 三 大 类 。

大 多 数 的 受 体 属于 第 一 类 一 一 离子 通道 关联 受 体 〈ion-channel-linked recep-
tor)。 这 类 受 体 的 蛋白 质 位 于 通道 的 周围 ， 当 与 信号 结合 后 受 体 蛋白 变 构 而 控制
通道 的 形状 ， 从 而 改变 质 膜 的 离子 通 透 性 〈 有 关 这 类 受 体 及 其 作用 ， 这 里 不 再 详
细 介 绍 )。

第 二 类 是 G- 和 蛋白 关联 受 体 〈G-protein-linked receptor)。 它 的 作用 是 间接 地 调
节 另 一 种 结合 在 质 膜 上 的 靶 蛋 白 的 活性 。 轰 蛋白 可 以 是 离子 通道 蛋白 或 者 是 一 种
酶 ， 受 体 蛋 和 白 与 靶 蛋 白 之 间 的 相互 作用 是 通过 第 三 种 和 电 白 介 导 的 ， 这 介 导 的 第 三
者 称 为 “三 聚 体 GTP 结合 调控 蛋白 "”， 人 简称 G- 蛋 和 白 (trimeric GTP-binding regu-

”区 多 ”

latory protein，Gr-protein )， 这 类 受 体 因此 而 得 名 。. 这 类 受 体 与 信号 结合 后 通过
G- 和 蛋白 的 介 导 激活 靶 蛋 白 (关于 激活 的 方式 途径 下 面 将 介绍 )。 如 果 轰 蛋白 是 一
种 离子 通道 ， 就 改变 质 膜 的 通 透 性 ; 如 果 靶 蛋白 是 一 种 酶 ， 就 改变 一 种 或 几 种 介
导 物 的 浓度 ， 通 过 这 些 介 导 物 改变 细胞 行为 或 这 些 产 物 再 作用 于 细胞 内 别 的 蛋白
质 。G- 蛋 白 关 联 受 体 是 很 重要 的 一 类 受 体 ， 是 一 个 由 同 源 的 七 次 路 膜 的 蛋白 质
组 成 的 大 的 超级 家 族 。

第 三 类 是 酶 联 受 体 (enzyme-linked receptor)。 这 类 受 体 中 每 个 受 体 含 一 种 跨
膜 蛋 白 ， 它 本 身 就 是 一 种 酶 或 是 与 酶 相 联系 的 ， 通 常 是 蛋白 质 激 酶 。 当 信和 号 与 受
栖 蛋 白 的 膜 外 部 分 结合 后 ， 它 的 膜 内 部 分 变 构 而 表现 出 蛋白 质 激 酶 活性 ， 或 者 使
其 膜 内 部 分 相 结 合 的 另 一 种 蛋白 质 具 蛋白 激酶 活性 ， 结 果 使 细胞 内 的 一 些 蛋 白质
被 磷酸 化 。

一 一

二 节 “通过 G- 和 蛋白 关联 受 体 进行 的 信号 调控

一 、G- 重 白 关 联 受 体 结构 一 一 七 次 跨 膜

G- 蛋 白 关 联 受 体 是 细胞 表面 受 体 中 最 大 的 一 个 家 族 ， 在 哺乳 动物 细胞 中 已
发 现 100 多 种 ， 细 胞 对 大 量 的 多 种 多 样 的 信号 分 子 作 出 反应 是 由 这 一 类 受 体 介 导
的 ， 这 些 信 和 号 分 子 包括 蛋白 质 、 小 肽 、 氨 基 酸 和 脂肪 酸 的 衍生 物 、 多 种 激素 以 及
神经 信号 传送 器 (neurotrans mitter)， 带 有 相同 配 体 的 信号 分 子 可 以 激活 这 一 家
族 中 的 不 同 成 员 ， 例 如 乙酰 胆 碱 (acetylcholine) 可 激活 $ 种 以 上 的 G- 蛋 白 关 联

受 体 成 员 ，5- 产 色 胺 (serotonin) 最 少 能 激
活 15 种 。

从 DNA 的 序列 分 析 结 果 推 出 的 氨基 栈
顺序 来 看 ， 所 有 分 析 过 的 G- 蛋 白 关 联 受 体
的 结构 是 相 类 似 的 ， 肯 定 它们 在 进化 上 有
密切 关系 。 它 们 都 含 一 条 多 肽 链 ， 肽 链 中

肽 链 中 位 于 细胞 质 中 的 部 分 〈 图 中 所 示 ，
从 肽 链 N 端 起 第 五 和 第 六 跨 膜 片段 之 间 的
环 ) 是 主要 的 三 聚 G- 蛋 白 结合 部 位 。

部 是 亲 脂 的 ， 由 这 一 亲 脂 部 分 反复 折 醒 ， NSSNSNS
进出 七 次 穿 过 质 膜 (图 11-1); 近 N 端 部 分 NS
为 素 水 区 域 ， 这 部 分 伸 到 细胞 外 面 ， 含 有 NSSSNSNN
多 种 信号 的 结合 部 位 。C 端 伸 入 细胞 质 中 ， 2
汉 、

5

、
和

胞 外 空间

PAA
-ZTZLA

图 11-1 G- 蛋 白 关 联 受 体
， 353 ，

二 、 三 聚 体 G- 和 蛋白

下 面 讲 的 G- 蛋 白 关 联 受 体 作 用 于 靶 蛋 白 的 两 种 主要 途径 <AMP 途径 和 Ca 寻
途径 都 需要 三 聚 体 G- 蛋 白 介 导 ， 因 此 先 介绍 三 聚 体 G- 蛋 白 。 它 由 三 种 不 同 的 多
肽 链 组 成 : we、8B 和 Y。 不 同 的 G- 蛋 白 w 亚 基 是 不 同 的 。B 和 了 亚 基 形 成 紧密 的 复
合 物 ， 这 种 复合 物 通 过 y 亚 基 的 作用 而 固定 在 质 膜 上 。 当 a 亚 基 与 GDP 结合 时 ，
它 就 与 By 复合 物 结合 形成 三 聚 体 ， 这 时 的 G- 蛋 白 处 在 未 激活 状态 。 当 G- 蛋 和 白 关
联 受 体 与 细胞 外 的 信号 结合 时 ， 受 体 构象 改变 而 激活 ， 它 与 G- 蛋 白 的 " 亚 基 结
合 ，a 亚 基 释 放出 它 原 先 结合 的 GDP 而 与 GTP 结合 (这 时 信和 号 与 受 体 分 离 ， 受
体 复原 )， 于 是 亚 基 被 激活 ， 并 与 By 复合 物 分 离开 。 至 于 w 亚 基 再 与 何 种 蛋 自
作用 ， 是 激活 还 是 抑制 就 要 看 w 亚 基 的 类 型 了 。 如 果 是 os 它 就 与 腺 苷 酸 环 化 酶
结合 而 激活 腺 苷 酸 环 化 酶 ， 结 果 从 ATP 产生 环 式 AMP (cAMP); 与 此 同时 喇
亚 基 呈现 GTP 水 解 酶 的 活性 使 与 之 结合 的 GTP 变 为 GDP， 这 样 带 有 GDP 的 喇
亚 基 与 腺 苷 酸 环 化 酶 脱离 转 而 又 与 B7 复合 物 结合 而 恢复 三 聚 体 状 态 。

三 、G- 各 昌 关 联 受 体 作 用 的 两 条 主要 途径

G- 蛋 白 关 联 受 体 接受 了 细胞 外 的 信号 后 ， 通 过 激活 G- 蛋 白 作 用 于 一 种 酶 ，
再 由 酶 的 作用 产生 出 细胞 内 的 小 分 子 介 导 物 第 二 信使 ， 通 过 第 二 信使 作用 于 驾 和 蛋
白 。 所 以 可 以 说 ，G- 蛋 白 关联 受 体 实质 上 是 把 细胞 的 信号 转变 成 细胞 内 第 二 信
使 ，cAMP 和 Ca 就 是 它 间接 产生 的 两 种 第 二 信使 ， 图 11-2 叙述 这 两 种 途径 。

1.cAMP 途径

激活 的 三 聚 体 G- 蛋 白 的 v 亚 基 直 接 作用 于 腺 苷 酸 环 化 酶 ， 腺 苷 酸 环 化 酶 是
结合 在 质 膜 上 的 一 种 蛋白 。 当 wa 亚 基 与 它 结 合 时 它 变 构 被 激活 ， 从 ATP 合成
cAMPE。

cAMP 是 在 1959 年 被 最 先 发 现 的 一 种 激素 作用 的 细胞 内 介 导 因子 ， 它 的 功
能 是 在 所 有 原核 细胞 和 动物 细胞 中 作为 一 种 细胞 内 信和 号 介 导 多 种 反应 及 激活 基因
表达 。 受 激素 刺激 ， 在 细胞 内 的 水 平 可 在 几 秒 钟 内 提高 $ 倍 ， 又 能 很 快 被 <AMP
磷酸 二 酯 酶 水 解 变 成 $ AMP， 因 此 它 的 水 平 是 在 不 停 地 升降 变化 的 。 许 多 细胞
外 信和 号 起 调控 作用 是 通过 调节 cAMP 的 水 平 ， 它 们 一 般 是 通过 Gs G- 蛋 白 受 体
(a 亚 基 为 us) 激活 AMP 环 化 酶 而 不 是 激活 cAMP 磷酸 二 酯 酶 。 最 少 有 4 种 激素
可 激活 脂肪 细胞 中 的 <AMP 环 化 酶 而 介 导 储存 的 脂肪 转变 成 脂肪 酸 。 同 一 种 信
号 分 子 ， 例 如 肾上腺 素 既 可 增加 也 可 降低 细胞 内 cAMP 的 浓度 ， 这 取决 于 信和 号
分 子 结合 的 受 体 类 型 ， 如 果 结 合 的 受 体 不 是 Gs G- 蛋 日 而 是 Gi G- 和 蛋白 〈 抑 制 型

“54…，

图 11-2 “信和 号 通过 G- 蛋 白 关联 受 体 产生 小 的 细胞 内 介 导 物 的 两 种 途径

G- 蛋 白 ，a 亚 基 为 xi， 与 Gs G- 和 蛋白 相同 )， 则 降低 cAMP 的 水 平 。

在 绝 大 多 数 动物 细胞 中 ，cAMP 激活 依赖 AMP 的 蛋 日 质 激酶 (A-kinase)，
这 种 激酶 有 选择 地 催化 一 些 蛋 日 质 磷 酸化 。 众 化 磷酸 化 的 位 置 是 丝氨酸 或 苏 氨
酸 ， 被 磷酸 化 的 这 两 种 氨基 酸 的 N 端 与 两 个 以 上 的 碱 性 氨基 酸 相连 。 未 激活 的
A-kinase 由 两 个 调节 亚 基 和 两 个 催化 亚 基 组 成 ， 当 cAMP 与 两 个 调节 亚 基 结 合 时
引起 变 构 激活 和 释放 出 催化 亚 基 ， 使 某 些 和 蛋白质 磷酸 化 ， 从 而 起 到 调节 蛋白 质
( 酶 ) 活性 或 基因 表达 (调控 蛋 折 ) 的 作用 : 例如 当 A- 激 酶 使 CREB 蛋白
(cAMP response element binding protein) 磷酸 化 后 ， 结 合 于 DNA 上 的 CRE， 激
活 基 因 转 录 。
2. Ca 途径

受 体 接受 表面 信号 后 激活 一 种 三 聚 G- 蛋 白 ， 称 为 Gq。Gq 再 激活 一 种 肌 苷
酸 特 异性 的 磷 酯 酶 phospholipaseC-B 〈 膜 结合 蛋白 )， 这 种 酶 水 解 (切割 ) PIP, 产
生 IP; 和 乙酰 甘油 。IP; ( 肌 苷 酸 三 磷酸 ) 是 一 种 可 溶性 小 分 子 ， 它 离开 质 膜 通
过 细胞 浆 迅 速 扩散 ，IPs 结合 于 内 质 网 上 的 IP; 守门 的 Ca 释放 通道 (IP3-gated
Ca2+ -release channel)， 使 Ca 从 内 质 网 释放 出 来 ， 进 入 细胞 浆 。Ca 作为 细胞
内 介 导 物 ， 以 及 这 一 途径 中 产生 的 乙酰 甘油 都 能 影响 细胞 代谢 和 基因 表达 。 目 前
对 Ca 途径 的 细节 尚 不 是 很 清楚 。

游离 的 Ca 在 细胞 质 中 的 浓度 是 极 低 的 〈 迄 10 moyVL)， 但 在 胞 外 液体 及

“93 和

在 内 质 网 中 是 较 高 的 〈 约 10-3?moVyL 左右 )， 在 细胞 浆 中 的 Ca 生变 化 范围 在 1X
10- 一 5x 10-5mo/L 之 间 ， 维 持 和 调节 这 种 离子 浓度 梯度 显然 不 是 简单 的 扩散
作用 ， 而 是 靠 Ca 离子 通道 和 离子 泵 的 运输 。Ca2* 具有 广 谤 的 细胞 内 信使 的 荔
能 ， 早 在 1947 年 就 发 现在 肌肉 细胞 内 注入 Ca 和 可 引起 肌肉 收缩 ， 近 年 来 的 研究
表明 ，Ca2 在 介 导 细胞 的 多 种 不 同 的 反应 中 起 了 细胞 内 信使 的 作用 ， 包 括 神 经
传导 、 分 泌 和 细胞 增殖 。 另 外 Ca+ 和 乙酰 甘油 共同 参与 蛋白 质 激 酶 C (PKO)
的 激活 。 哺 乳 动物 细胞 中 有 8 种 以 上 的 PKC， 其 中 至 少 有 四 种 被 Ca2+ 和 乙酰 甘
油 激活 、 激 活 的 PKC 可 使 一 些 蛋 白质 磷酸 化 ， 例 如 使 <B 磷酸 化 而 使 NF-kB 与 下
KB 分 离 (LeB 和 NF-kB 两 种 蛋白 质 在 细胞 质 中 以 二 聚 体 的 形式 存在 )，NF-<B 才
能 进入 细胞 核 内 与 特异 性 DNA 序列 结合 而 激活 基因 转录 。NF-kB 是 一 种 很 重要
的 反 式 激活 因子 ， 不 少 基因 的 调控 区 有 NF-kB 的 结合 序列 。

钙 调 节 和 蛋白 (calmodulin) 是 普遍 存在 的 细胞 内 Ca 受 体 。 在 所 有 检查 过 的
动物 细胞 内 存在 ， 每 个 细胞 中 约 有 107 个 分 子 ， 占 全 部 细胞 蛋白 的 1%， 这 种 蛋
白 由 一 含 150 个 氨基 酸 的 多 肽 链 组 成 ， 有 四 个 高 亲和力 的 Ca 结合 位 点 ， 当 它
结合 Ca 后 变 构 。 它 可 以 作为 酶 的 亚 基 ， 但 更 重要 的 是 它 结 合 钙 后 能 与 多 种 不
同 的 蛋白 质 结 合 而 进一步 改变 构象 ， 改 变 被 结合 的 蛋白 质 的 活性 ， 受 Ca / 钙 调
节 蛋 白 控 制 的 靶 蛋 白 有 多 种 酶 类 ， 如 膜 运 输 蛋 白 (如 Ca -ATP 酶 ， 把 Ca 运
出 细胞 )。 其 中 CaM- 激 酶 〈Ca /calmodulin-dependent protein kinase) 是 重要 的
一 类 酶 ，CaM- 激 酶 II 与 动物 的 记忆 有 关 。

上 述 <AMP 和 Ca 两 种 途径 是 互相 作用 ， 互 相 影 响 的 。 首 先 ，cAMP 和
Ca 的 水 平 高 低 是 互相 影响 的 。 例 如 合成 和 降解 <AMP 的 酶 受 钙 调节 蛋白 控制 。
反之 ，A- 激 酶 可 以 影响 Ca 从 内 质 网 释放 ; 第 二 ， 一 些 受 Ca 或 cAMP 直接 控
制 的 酶 之 间 相 互 影 响 ， 如 CaM- 激 酶 被 A- 激 酶 磷酸 化 ; 第 三 ， 这 些 酶 之 间 可 共用
下 步 反 应 的 靶 分 子 。 这 样 ， 一 些 蛋 白质 就 同时 受 <AMP 和 Ca 的 控制 。

上 面 介绍 了 G- 和 蛋白 关联 受 体 通过 三 聚 体 G- 蛋 白 介 导 细胞 信号 反应 的 两 条 主
要 途径 。 必 须 记 住 ， 有 些 三 聚 体 G- 和 蛋白 能 直接 作用 于 质 膜 上 的 离子 通道 〈 如
Ca2+ 、K+ 的 离子 通道 ) 而 起 调节 作用 ， 这 点 不 能 忽略 。

三 节 ”通过 酶 天 联 细胞 表面 受 体 进 行 的 信号 调控

酶 关联 受 体 也 是 跨 膜 蛋 白 ， 质 膜 外 部 分 接受 信号 ， 细 胞 质 内 的 部 分 本 身 可 具

酶 活性 或 直接 与 酶 分 子 结合 。 已 知 有 五 类 : @ 受 体 GMP 环 化 酶 ; @ 受 体 酪 氨 酸

激酶 ; G) 酷 氨 酸 激酶 结合 受 体 ， 这 种 受 体 与 有 酷 氨 酸 激酶 活性 蛋白 质 直接 耦合 ;

田 受 体 酷 氨 酸 磷酸 酯 酶 ; @@ 受 体 丝氨酸 / 苏 氨 酸 激酶 。 受 体 GMP 环 化 酶 被 信号

激活 后 直接 产生 环 式 GMP (cGMP)。cGMP 激活 依赖 于 cGMP 的 蛋白 质 激酶

(G-kinase)。 它 使 蛋白 质 的 丝氨酸 或 苏 氨 酸 磷酸 化 ， 以 后 的 级 联 式 反 应 与 cAMP
“356 。

相似 。 许 多 已 知 受 体 属 于 酷 氨 酸 激酶 家 族 ， 所 以 我 们 在 下 面 着 重 对 这 类 受 体 进行
介绍 。

一 、 受 体 酷 氨 酸 激酶 是 大 多 数 生长 因子 的 受 体

在 1982 年 ， 人 们 发 现 上 皮 生 长 因子 (EGF) 是 一 种 含 53 个 氨基 酸 的 小 分 子
多 肽 ， 它 能 刺激 上 皮 细 胞 和 另外 一 些 类 型 的 细胞 增殖 。 它 的 受 体 是 一 种 酷 氨 酸 特
蜡 的 蛋白 质 激酶 。 这 种 受 体 是 一 条 跨 膜 的 多 肽 〈 一 次 路 膜 )， 约 含 1200 个 氢 基
酸 =。 它们 N 端 伸 出 胞 外 ， 占 肽 链 大 部 分 。 在 N 端 糖 基 化 富 含 半 胱 氨 酸 ， 肽 链 的
细胞 内 部 分 具 酷 氨 酸 激酶 活性 。 当 EGF 结合 于 受 体 ， 激 活 酪 氨 酸 激酶 ， 它 就 有
选择 地 把 ATP 上 的 磷酸 基 团 转移 到 它 自 己 以 及 别 的 一 些 蛋 白质 的 酷 氨 酸 侧 链 上 。
许多 生长 因子 与 细胞 增殖 和 分 化 有 关 ， 如 FCFS (成 纤维 细胞 生长 因子 )、HGF
( 肝 细 胞 生长 因子 )、NGF (神经 生长 因子 )、M-CSF (巨细 胞 克隆 刺激 因子 )
等 。 这 些 因子 都 是 通过 受 体 酷 氨 酸 激酶 的 作用 使 信号 转移 到 靶 蛋 白 。

二 、 形 成 二 聚 体 是 酶 关联 受 体 被 信号 激活 的 普遍 机 制

很 难 想像 出 一 条 路 膜 多 肽 的 一 端 与 信号 结合 后 如 何 引 起 在 膜 的 另 一 侧 的 肽 链
构象 改变 。 后 来 研究 证 实 当 EGF 与 受 体 结合 后 ， 可 引起 受 体 的 另 一 端 形 成 二 聚
体 。 三 聚 体 的 形成 是 由 于 受 体 在 细胞 质 中 的 多 个 酷 氨 酸 之 间 交 叉 磷 酸化 。PDGF
本 身 是 三 聚 体 ， 它 能 把 两 个 相 邻 的 受 体 联结 在 一 起 (每 个 亚 基 结 合 一 个 受 体 )。
因此 ， 使 受 体形 成 二 聚 体 是 信号 激活 酶 关联 受 体 的 普遍 机 制 。 受 体 自身 磷酸 化 的
酷 氨 酸 结构 区 域 ， 是 下 一 步 被 磁 酸化 的 靶 蛋 上 的 高 亲和力 结合 区 ， 一 旦 与 受 体 的
这 一 区 域 结 合 ， 划 蛋白 也 在 酷 氨 酸 残 基 上 被 磁 酸化 而 被 激活 。

对 胰 品 素 和 IGF-I (类 胰 品 素 因子 ) 的 信号 受 体 学 说 则 稍 有 区 别 ， 首 先 表面
受 体 是 四 聚 体 ， 四 个 亚 基 通 过 三 个 二 硫 键 相连 ; :第 二 ， 当 受 体 与 胰岛 素 结合 ， 引
起 两 个 亚 基 在 细胞 质 中 的 一 半 变 构 而 不 是 形成 二 聚 体 ， 使 受 体 的 催化 功能 区 域 棍
酸化 ， 这 个 功能 区 域 再 激活 另 一 种 称 为 胰岛 素 受 体 底 物 :TI (IRS) 的 重 日 质 〈 在
IRS-I 的 多 个 酷 氨 酸 上 磷酸 化 )， 由 IRS-I 再 激活 细胞 内 的 信号 蛋白 。

三 、 受 体 栈 氨 酸 激酶 上 的 磷酸 化 的 酷 委 酸
被 具有 SH2 结构 的 蛋白 质 识 别 和 结合

已 知 和 激活 的 受 体 酷 氨 酸 激酶 结合 的 蛋白 质 多 种 多 样 ， 例 如 : GTP 酶 激活
蛋白 (GAP) 、 磷 酯 酶 (C-yPLC-7y)、Src 类 非 受 体 蛋 自 质 酷 氨 酸 激 酶 、 磷 酯 酰
肌 醇 3- 激 酶 (PIL-kinase) 等 。 对 于 这 些 蛋 白质 的 功能 了 解 得 不 多 ， 但 它们 中 许

*、 弹 7 。

多 与 细胞 增殖 和 癌变 有 关 。 尽 管 它们 具有 不 同 的 结构 与 功能 ， 它 们 都 在 结构 上 有
两 个 高 度 保守 的 非 催化 区 域 ， 称 为 SH2 和 SH3， 这 样 称 呼 是 因为 它们 最 先 在 Sre
蛋白 的 同 源 性 区 域 2 和 3 发 现 (src homology region 2 and 3)，SH2 区 域 的 功能 是
与 磷酸 化 的 酷 氨 酸 结合 ，SH3 的 功能 不 太 清 楚 ， 人 们 认为 SH3 区 域 与 别 的 级 联
反应 下 游 的 蛋白 质 (没有 SH2 结构 ) 结合 有 关 ， 即 SH3 起 蛋白 质 “ 接 头 ” 作 用 ，
使 自身 没有 SH2 结构 的 蛋 白 质 通过 “接头 ”作用 而 间接 与 受 体 酷 氨 酸 激酶 联系
而 激活 。 例 如 Sem-5 蛋白 ， 在 绝 大 多 数 的 动物 细胞 中 都 有 与 它 同 源 的 蛋白 。 它
们 具有 SH2 和 SH3 结构 ，R 蛋白 就 是 通过 Sem-5 蛋白 的 作用 激活 ，R 是 把 信和 叶
控制 从 受 体 酷 蛋 白 激酶 癌 核 内 传递 的 重要 蛋 日 ， 它 与 基因 表达 、 细 胞 增殖 和 分 化
有 重要 关系 。 在 30% 的 癌 细 胞 中 发 现 R 基因 变异 。 在 受 体 酪 氨 酸 激酶 信号 途径
中 ， 许 多 参与 级 联 式 反 应 的 蛋白 与 恶性 肿瘤 有 关 ， 除 上 述 的 R 外 ， 还 有 SCR、
RAF、FOS、JUN 等 细胞 及 病毒 的 癌 基 因 。 因 此 ， 研 究 致癌 基因 有 助 于 鉴定 受 体
酷 氨 酸 酶 信号 途径 中 牵涉 的 各 种 成 分 。

第 四 节 “小 分 子 信号 调控
一 、NO 和 CO 能 直接 与 细胞 内 的 酶 结合

虽然 信号 分 子 大 多 数 为 细胞 外 亲 水 的 信号 分 子 ， 它 们 通过 细胞 表面 受 体 的 介
导 而 起 作用 ， 然 而 尚 有 些 朴 水 的 小 得 足以 穿 过 质 膜 的 分 子 如 NO 和 CO、 维 生 素
D 及 固 醇 类 激素 ( 当 类 化 合 物 ， 如 肾上腺 皮质 激素 ， 性 激素 等 )、 甲 状 腺 激素 等
也 属于 信号 分 子 。NO 和 CO 是 近年 来 才 认识 的 气体 信和 号 分 子 。

NO 由 精 氨 酸 脱 氨 产 生 ， 由 于 它 是 小 分 子 ， 很 易 穿 过 膜 在 附近 细胞 中 扩散 ，
所 以 NO 可 在 产生 它 的 细胞 及 附近 细胞 中 起 作用 ， 它 的 半衰期 具有 5 一 10s， 只 能

在 局 部 起 作用 。NO 能 直接 与 它 的 靶 蛋 白 〈 酶 ) 结合 而 激活 酶 。 天 们 用 硝酸 甘油

治疗 心绞痛 已 有 百年 历史 ， 然 而 到 现在 才 认 识 硝 酸 甘油 的 作用 机 理 ， 是 由 于 它 在
转变 过 程 中 产生 NO。NO 使 血管 的 平滑 肌 细 胞 松弛 ， 增 加 血液 流入 心脏 而 使 病
情 缓解 。 巨 吻 细 胞 和 哮 中 性 细胞 也 产生 NO 以 帮助 它们 消灭 入 侵 的 微生物 。 许 多
类 型 的 神经 细胞 使 用 NO 对 邻近 细胞 发 出 信号。

NO 与 乌 苷 酸 环 化 酶 的 活性 位 点 的 离子 反应 ， 刺 激 它 施放 产生 cGTP， 我 们
知道 ，cGMP 是 很 重要 的 细胞 内 介 导 物 。NO 影响 很 快 ， 在 几 秒 钟 内 即 能 发 生 。
因为 GMP 磷酸 二 酯 酶 降解 cGMP 的 速度 很 快 。 乌 苷 酸 环 化 酶 也 必须 很 快 从 GTP
产生 cGMP。

CO 刺激 鸟 苷 酸 环 化 酶 的 方式 与 NO 相同 。

“335

二 、 维 生 素 D 和 倪 类 激素 等 直接 和 基因 转录 的 调控 雪白 结合

NO 和 CO 是 直接 与 酶 结合 而 刺激 酶 的 活性 。 与 上 述 小 分 子 气 体 不 同 ， 性 激
素 、 甲 状 腺 激素 、 维 生 素 D 等 朴 水 的 小 信号 分 子 ， 尽 管 它 们 的 结构 、 功 能 各 不
相同 ， 但 它们 起 作用 的 机 制 是 类 似 的 。 它 们 都 穿 过 质 膜 而 直接 与 调控 某 种 基因 转
录 的 蛋白 质 结 合 而 使 这 些 蛋白 质 激活 。 这 些 调 控 基 因 转 录 的 蛋白 的 结构 通常 具有
激活 转录 区 域 、DNA 结合 区 域 、 信 和 号 (如 激素 ) 结合 区 域 。 在 无 活性 情况 下 ，
它们 与 抑制 蛋白 结合 形成 复合 物 ， 这 些 抑 制 蛋 白 封闭 了 它们 的 DNA 结合 部 位 ，
当 激 素 与 它 结合 后 变 构 与 抑制 蛋白 分 离 ， 暴 露出 DNA 结合 区 域 ， 于 是 成 为 激活
状态 ， 能 与 特定 的 DNA 序列 结合 而 激活 转录 (图 11-3)。

八
抑制 蛋白 复合 物 COOH 于 结合 位 点 -村上 上 全
皮质 醇 受 体
人 |
本 N 人
条 肉 激素 受 体
DNA 结合 域 绞 合 区 ET 生 生 二 二 RAPE 入 人
孕 激 素 受 体
甲状 腺 激素 和
IN
维生素 D 受 体
- -暴露 的 DNA 结合 位 点
SHE
AS COOH 甲状 腺 激素 受 体
ES
视 黄 酸 受 体

(a) (b)

11-3 细胞 内 受 体 超级 家 族
《a) 细胞 内 受 体 蛋 白 作 用 模型 ;(b) 各 受 体 的 短 DNA 结合 域 。

这 些 激 活 基 因 转 录 (偶尔 有 抑制 基因 转录 的 ) 的 蛋白 质 有 的 存在 于 核 中 ， 有
的 存在 于 细胞 质 中 ， 当 被 激活 后 才 进 入 核 中 与 DNA 结合 。 它 们 结合 的 DNA 序
列 紧 挨 着 被 其 所 激活 的 基因 。 这 些小 分 子 信号 引起 的 反应 在 许多 情况 下 可 分 为 一
级 反应 和 二 级 反应 。 一 级 反应 就 是 由 信和 号 结合 而 激活 的 基因 转录 调控 昌 白 直接 激
活 的 某 一 基因 产物 所 产生 ， 二 级 反应 是 这 一 基因 产物 又 激活 别 的 基因 转录 。

这 些 水 不 溶性 的 小 信号 分 子 比 水 溶性 信号 分 子 的 寿命 要 长 得 多 ， 可 以 介 导 更
长 时 间 的 反应 。 例 如 大 多 数 水 溶性 激素 在 数 分 钟 内 即 被 分 解 去 除 ， 有 的 信号 只 能
维持 几 秒 钟 ， 但 省 类 激素 可 在 血液 中 维持 几 小 时 ， 甲 状 腺 素 可 维持 几 天 。

9

第 五 节 细胞 对 信和 号 的 反应
一 、 细 胞 信号 未 辑 : 信号 网 络

在 多 细胞 动物 中 ， 每 个 细胞 要 接触 各 种 信号 和 信和 号 组 合 ， 信 号 调节 它们 的 代
谢 ; 信和 号 决定 它们 改变 或 继续 维持 分 化 状态 ; 信号 决定 它们 是 否 分 裂 ; 信和 号 命令
它们 生存 还 是 死亡 。 不 同 的 信号 和 不 同 的 途径 ， 可 互相 作用 、 互 相 联系 。 信 和 号 在
级 联 式 反应 中 可 以 同时 涉及 一 种 细胞 内 的 中 介 分 子 或 靶 分 子 。 细 胞 如 何 能 处 理 这
样 十 分 复杂 的 情况 而 做 到 十 分 协调 、 准 确 地 做 出 最 佳 的 反应 ? 显然 应 该 有 像 计算
机 网 络 那样 的 逻辑 系统 ， 以 协调 处 理 各 种 复杂 的 情况 ， 这 就 是 细胞 综合 处 理 各 种
信号 的 逻辑 -细胞 信号 网 络 ， 以 保证 多 细胞 动物 成 为 一 个 协调 的 整体 。 对 于 这 个
言 号 网 络 如 何 工作 ， 人 们 还 不 了 解 ， 可 能 将 来 借助 生物 计算 机 模拟 系统 的 研究 ，
逐步 揭示 其 中 的 一 些 奥 秘 。

二 、 细 胞 对 信和 号 的 适应 性

当 各 种 信号 刺激 强度 变化 〈 即 信号 浓度 变化 ) 范围 比较 宽 时 ， 细 胞 和 机 体 对
待 这 些 信 号 浓度 改变 的 反应 引起 的 变化 是 相同 的 。 这 就 要 求 细 胞 对 信号 适应 或 降
低 敏 感性 。 因 此 ， 当 细胞 长 期 接触 一 种 信号 时 ， 它 对 这 种 信号 刺激 的 反应 就 会 降
低 ， 这 种 适应 性 使 细胞 能 够 针对 信和 号 浓度 在 很 宽 范围 内 的 改变 而 调整 它 对 信和 号 的
敏感 性 。 适 应 性 的 一 般 原 理 很 简单 : 通过 负 反馈 抑制 完成 。 由 于 负 反 馈 有 一 段 时
间 推 色 ， 所 以 如 果 一 种 信号 刺激 突然 增加 。 在 起 初 的 短 时 间 能 引起 较 强 的 反应 。
适应 性 可 以 逐渐 减少 表面 受 体 数量 ， 这 需要 好 几 小 时 ( 慢 速 适应 ); 也 可 以 快速
灭 活 受 体 ， 只 要 几 分 钟 (快速 适应 )。 另 外 也 可 以 改变 信号 途径 中 级 联 式 反应 涉
及 的 一 些 重 日 (中 速 适 应 )， 所 以 细胞 对 信和 号 的 适应 有 快慢 之 分 。
1. 慢 适 应 是 细胞 表面 受 体 逐 渐 减 少

当 一 种 各 日 质 激素 或 生长 因子 与 细胞 表面 受 体 结合 后 ， 通 常 是 被 受 体 介 导 的
细胞 通过 内 吞 作 用 进入 细胞 并 被 送 进 内 体 ， 大 多 数 受 体 在 酸性 的 内 体 环境 中 钾 下
结合 的 信号 蛋 白 。 受 体 本 身 再 回 到 质 膜 上 重新 使 用 。 信 和 号 蛋白 质 或 生长 因子 由 浴
酶 体 进行 降解 。 一 部 分 受 体 在 内 体 中 不 能 释放 出 信和 号 蛋白 而 随 着 信号 蛋白 一 起 被
溶 酶 体 降 解 ， 所 以 当 细 胞 连续 接触 高 浓度 的 信号 ， 表 面 受 体 就 会 逐渐 降低 。 这 种
机 制 称 为 “ 受 体 下 降 调节 ”。
2. 快速 适应 : 受 体 磷 酸化 或 甲 基 化

细胞 对 信号 的 快速 适应 常常 是 与 信号 诱导 的 受 体 磷 酸化 或 甲 基 化 有 关 。 研 究
.360 ，

4

|

an 通过 G 蛋白 Gs 激活
AMP 环 化 酶 。 当 细胞 接触 高 浓度 的 肾上腺 素 时 ， 通 过 两 条 途径 在 几 分 钟 内 就 降
和 低 敏 感性 而 适应 高 浓度 的 肾上腺 素 。 第 一 条 途径 是 <AMP 浓度 升 高 ， 激 活 A- 激
酶 使 PP 受 体 的 丝氨酸 磷酸 化 而 干扰 受 体 激 活 Gs 的 能 力 ; 第 二 条 使 受 体 磷酸 化 的
为 呈 外 下 下 所 二 交 的 怕人 在 受
和 休 的 C 未 端 尾巴 多 个 丝氨酸 和 苏 氨 酸 磷酸 化 ， 这 磷酸 化 的 受 体 尾 巴 可 被 一 种 称
为 g 抑 制 物 (B arrestin) 的 抑制 蛋白 结合 ， 封 闭 了 受 体 激活 Gs 的 能 力 。

中。 在 研究 细菌 运动 的 趋 化 性 中 ， 发 现 化 学 引诱 物 受 体 的 一 些 酸性 氨基 酸 侧 链 甲
基 化 ， 二 COOH 上 的 一 H 被 一 CHs 代替 ， 这 是 由 甲 基 转 移 酶 催化 的 ， 有 的 多 至 8
下 氨基 酸 甲 基 化 。 如 引诱 物 去 除 ， 受 体 甲 基 化 也 会 解除 。 受 体 甲 基 化 也 是 一 种 负
反馈 控制 的 细胞 快速 适应 性 。

上 述 介绍 的 细胞 对 信号 适应 过 程 是 通过 负 反 馈 影响 受 体 的 数量 和 活性 。 另 外
的 一 些 适应 是 通过 由 信号 途径 中 下 游 的 级 联 式 反应 的 反应 介 导 物 的 改变 而 达到
的 。 例 如 改变 三 聚 体 G- 蛋 白 就 是 这 种 适应 途径 之 一 ， 典 型 例子 是 毒 瘾 。

人 LE

第 十 二 章 ” 交 分 子 生 物 学
第 一 节 “” 瘤 发 生 的 分 子 基 础 一 -DNA 序 列 改 变

如 果 说 一 个 发 生 了 变异 的 异常 细胞 经 过 漫长 的 道路 最 终 发 展 成 为 肿瘤 ， 这 个
细胞 必须 能 把 它 的 异常 性 质 遗 传 给 它 的 后 代 ， 即 这 种 变异 必须 是 可 遗传 的 。 要 了
解 一 种 癌 ， 首 要 的 问题 是 看 它 的 可 遗传 的 变异 是 由 于 遗传 学 上 的 改变 即 细胞
DNA 序 列 的 改变 ， 还 是 由 于 表面 遗传 的 改变 ， 即 只 改变 基因 表达 的 模式 但 不 改
变 DNA 序 列 。 这 种 表面 遗传 的 改变 反映 细胞 的 记忆 ， 是 我 们 熟悉 的 在 发 育 和 分
化 过 程 中 的 一 种 正常 现象 ， 它 表明 分 化 状态 的 稳定 性 。 虽 然 表 面 遗 传 的 改变 也 能
引起 肿瘤 ， 例 如 畸 胎 瘤 ， 但 我 们 并 不 把 它 作 为 引起 肿瘤 的 重要 原因 。 因 为 绝 大 多
数 的 瘤 症 都 是 由 于 DNA 序列 的 改变 引起 的 。

致癌 因子 有 三 类 : 四 化 学 致癌 剂 ; @ 物 理 射线 ， 如 放射 性 同位 素 产 生 的 射
线 、 紫 外 线 、X 射线 等 ; @@ 肿 瘤 病 毒 。 这 三 类 致 瘤 因 子 都 能 引起 DNA 序列 改变 ，，
或 引起 碱 基 蔡 换 或 DNA 断裂 、 易 位 、 重 组 等 ， 结 果 使 细胞 发 生变 异 或 转化 。

在 机 体 中 交 的 发 育 和 形成 往往 是 好 几 种 条 件 发 生 改变 和 累积 所 产生 的 结果 。
我 们 说 DNA 序列 改变 是 癌变 的 分 子 基础 ， 并 不 意味 着 DNA 上 任何 一 点 改变 其
至 发 生 在 瘤 基 因 上 的 一 点 改变 就 能 使 机 体 发 生 癌 。 事 实 上 ， 即 使 在 不 接触 致 瘤 因
子 的 情况 下 ， 细 胞 分 裂 循环 过 程 中 ，DNA 复制 、 损 伤 、 修 复 过 程 出 现 的 异常 改
变 的 频率 约 为 10 变异/ 〈 基 因 细 胞 )。 因 此 ， 在 人 的 一 生 中 每 个 基因 经 历 的 变
异 的 机 会 约 有 10 ，"。 从 这 一 观点 上 看 ， 发 生 瘤 变 并 不 奇怪 ， 奇 怪 的 倒是 为 什么
实际 上 瘤 发 生 会 那么 少 。

DNA 上 的 什么 地 方 发 生变 异 才 容 易 引 起 瘤 ? 瘤 的 一 个 特点 是 细胞 恶性 增
生 。 细 胞 增殖 是 直接 或 间接 受 调 控 的 ， 正 常 的 调控 基因 可 以 笼统 地 分 为 两 类 ，
一 类 的 作用 是 增加 细胞 的 生长 和 分 裂 速率 ， 增 加 细胞 的 数量 ; 另 一 类 的 作用 相
反 ， 降 低 细 胞 的 生长 和 分 裂 速率 从 而 减少 细胞 的 数量 。 如 果 DNA 上 的 变异 包
括 插入 、 转 位 、 放 大 、 碱 基 替 换 、 缺 失 等 使 原 瘤 基 因 激 活 而 成 为 瘤 基 因 表 达 出
活性 更 高 的 重 日 ， 或 者 使 其 正常 的 蛋白 过 量 表达 时 ， 就 可 能 造成 细胞 的 增殖 。
另 一 方面 ， 肿 瘤 抑制 蛋白 基因 缺失 或 变异 ， 不 能 产生 有 功能 的 肿瘤 抑制 蛋 自
时 ， 也 可 能 造成 细胞 的 恶性 增生 。 如 果 上 述 两 类 变异 琶 加 ， 就 会 大 大 提高 瘤 的
发 生 和 发 展 。

的

二 节 ， 瘤 的 发 生 和 发 展 包括 多 种 因素 的 协同 作用

一 个 变异 的 细胞 与 癌 细 胞 之 间 有 很 大 的 差别 。 单 是 DNA 上 的 一 点 变异 是 不
是 以 发 展 成 癌 的 ， 除 非 多 次 变异 的 累积 。 从 一 个 DNA 发 生变 异 的 细胞 发 展 成
癌 ， 要 经 过 一 些 中 间 类 型 细胞 的 阶段 ， 这 一 发 展 过 程 要 经 历 一 个 较 长 的 时 期 ， 这
一 时 期 中 往往 包括 多 种 条 件 和 因素 的 共同 作用 的 累积 ， 有 DNA 变异 的 累积 ， 肿
瘤 促进 因子 的 作用 ， 而 且 生 活 环境 、 生 活 方式 、 习 惯 等 也 有 影响 ， 因 此 ， 不 同 的
瘤 在 不 同 国家 和 地 区 、 不 同人 群 中 发 生 率 会 有 很 大 差别 。 从 这 一 观点 上 看 ，80%
以 上 的 癌 是 可 以 避免 的 。

目 本 广 品 受到 原子 弹 爆 炸 后 引起 的 白血病 ，5 年 后 才 明 显 上 升 ，8 年 后 达到
高 峰 ， 生 产 具 致癌 作用 药品 的 化 工厂 工人 ， 接 触 致癌 物质 到 肿瘤 发 生 要 经 过 10
年 甚至 20 年 ; 白血病 病人 在 发 病 好 几 年 前 可 以 在 病人 的 白细胞 中 检查 到 染色 体
易 位 ， 到 发 生 癌 后 可 检查 到 进一步 的 染色 体 异 常 ， 表 明 是 经 过 再 度 变 异 ， 才 发 展
为 白血病 的 。 从 细胞 的 第 一 次 变异 到 发 展 为 癌 的 每 个 中 间 阶 段 的 细胞 ， 都 必须 经
受 环境 的 选择 过 程 ， 在 机 体 中 重要 的 是 免疫 系统 和 信和 号。 事实 上 ， 细 胞 的 增殖 和
分 化 受 多 种 途径 的 综合 控制 。 这 些 控制 途径 受 遗 传 和 环境 的 双重 影响 ， 肿 瘤 引发
因子 (tumor initiator) 是 指引 起 细胞 DNA 改变 即 改 变 细 胞 遗传 状况 的 一 些 因
子 ; 肿瘤 促进 因子 〈tumor promoter) 本 身 并 非 诱 变 剂 ， 即 本 身 并 不 引起 DNA 序
列 的 改变 ， 但 这 类 物质 能 加 速 肿 瘤 的 发 生 和 发 展 过 程 。 不 同 的 肿瘤 促进 因子 可 选
择 性 地 加 速 某 种 肿瘤 的 发 生 。 例 如 佛 波 酯 类 物质 (phorbol ester) 就 是 一 种 肿瘤
促进 因子 ， 它 的 促 癌 作用 是 由 于 它 能 激活 酯 酰 肌 醇 细胞 内 信和 号 途径 中 的 重要 的
蛋 自 质 激 酶 一 一 蛋白 质 激酶 C。 一 些 肿 瘤 在 某 些 国家 或 地 区 的 发 病 率 显 著 高 于 其
他 地 区 ， 往 往 与 这 一 地 区 环境 中 的 致癌 因子 和 肿瘤 促进 因子 的 类 型 和 浓度 有 着 密
切 的 关系 。

多 种 因素 和 条 件 对 肿瘤 发 生发 展 的 协同 作用 可 以 通过 对 实验 小 鼠 的 致癌 试验
观察 到 。 最 容易 观察 的 是 皮肤 癌 ， 如 果 在 受伤 的 小 鼠 皮肤 反复 涂抹 肿瘤 引发 因子
如 DMBA (二 甲 基 葵 葛 ) 后 ， 接 着 又 用 肿瘤 促进 因子 如 佛 波 酯 类 物质 TPA 处 理 ，
则 可 很 快 观察 到 小 鼠 皮肤 癌 形 成 ， 比 单 用 DMBA 处 理 在 相同 时 间 内 发 生 皮 肤 瘤
的 比率 要 高 得 多 。 同 样 ， 在 用 癌 基 因 做 转基因 鼠 的 实验 结果 也 证 实 ， 单 独 带 有
C-mmyc 癌 基 因 的 转基因 鼠 的 恶性 肿瘤 发 生 率 只 有 10%， 单 带 有 vas 的 发 生 率 只
有 40%， 而 同时 带 有 C-my 和 ras 两 种 癌 基 因 的 转基因 鼠 ， 在 相同 时 间 内 瘤 的
发 生 率 达 100% 。 除 原 癌 基 因 变 异 或 因 插 入 、 重 排 、 基 因 放 大 提高 原 瘤 基因 产物
属性 或 表达 水 平 外 ， 肿 瘤 抑制 基因 的 变异 ， 失 去 正常 的 抑制 肿瘤 的 功能 也 是 肿瘤
发 生 的 重要 原因 。

53，，

第 三 节 。 原 癌 基 因 和 癌 基 因

原 癌 基因 存在 于 细胞 中 ， 它 们 是 癌 基 因 的 等 位 基因 ， 原 瘤 基 因 是 细胞 正常 功
能 不 可 缺少 的 ， 尤 其 是 在 胚胎 发 育 阶段 。 细 胞 原 癌 基 因 的 正常 功能 不 会 引起 肿
瘤 ， 但 如 果 原 癌 基 因由 于 DNA 变异 被 激活 造成 过 量 表达 ， 或 者 由 于 编码 区 的 变
异 产生 的 蛋白 质 具有 更 高 活性 ， 这 时 原 癌 基因 就 转变 为 癌 基 因 。 癌 基因 的 性 质 是
具有 转化 细胞 的 能 力 ， 因 此 判定 一 个 基因 是 和 否 属 癌 基 因 ， 往 往 是 通过 转化 实验 检
查 它 是 否 能 转化 细胞 。

癌 基 因 最 先是 在 反 转 病毒 中 发 现 的 ， 就 是 劳 氏 肉瘤 病毒 的 ras 基因 凡 后 来 发
现 ， 反 转 病毒 普遍 带 有 瘤 基 因 ， 例 如 : swrc、jas、mmos、1os、7imz er mmX 等 ， 而
且 在 细胞 中 通常 存在 着 这 些 癌 基 因 的 等 位 基因 。 除 了 RNA 病毒 外 ， 在 一 些 DNRA
病毒 中 也 带 有 一 些 具 转化 细胞 能 力 的 基因 ， 例 如 大 家 熟悉 的 SV40T 抗原 。DNRK
病毒 的 致癌 基因 通常 是 早期 基因 ， 它 们 的 功能 是 激活 多 种 病毒 和 细胞 的 基因 表达
或 DNA 复制 ， 如 多 瘤 病 毒 的 工 抗 原 、HPV 的 EB6 和 7 基因 、AdV 的 EIA 和
FE2B 基因 ， 也 有 的 是 与 病毒 潜伏 有 关 的 基因 ， 如 E-BV 的 BNFL-1 基因 。

目前 已 鉴定 出 的 癌 基 因 约 100 多 种 ， 按 照 癌 基 因 产 物 一 瘤 蛋 白 的 功能 ， 可
以 分 为 六 类 。

@ 生 长 因子 : 这 类 瘤 蛋 白 属于 分 泌 性 蛋白 ， 分 泌 到 细胞 外 ， 可 以 作用 于 自身
和 其 他 细胞 的 细胞 表面 受 体 。 这 类 癌 蛋 白 的 功能 与 正常 的 原 瘤 蛋 白 的 功能 有 何 蜡 ，
同 ， 目 前 还 缺少 这 方面 的 研究 资料 。@ 生 长 因子 受 体 : 这 类 瘤 蛋白 属 跨 膜 蛋 白 。
除 mas 外 ， 它 们 一 般 能 与 细胞 外 的 多 肽 信号 分 子 (生长 因子 ) 结合 后 被 激活 而 ，
具有 了 酷 氨 酸 激酶 活性 。mas 也 是 一 种 栈 氨 酸 蛋 白质 激酶 ， 它 的 致癌 活性 是 由 于 官 ，
不 需要 被 信号 分 子 激 活 而 能 保持 高 的 蛋白 质 激酶 活性 。@GTP 结合 蛋白 : 这 类
瘤 蛋 白 与 质 膜 相 连 ， 具 有 信和 号 转 导 功能 ， 即 能 把 表面 受 体 接受 的 信和 号 向 细胞 内 传
递 。@ 轿 细胞 内 的 蛋白 质 激酶 ; 重要 的 有 栈 氨 酸 激酶 、 丝 氨 酸 或 苏 氨 酸 激酶 两 类 ，
这 类 癌 蛋 白 分 布 在 细胞 质 中 ; 因此 用 “细胞 内 的 蛋白 质 激酶 ”来 和 器 膜 蛋白 中 的
具有 和 蛋白质 激 酶 活性 的 瘤 蛋 白 相 区 别 。@ 信 和 号 传递 分 子 (signaling): 这 类 蛋白
分 布 在 细胞 质 中 ， 具 有 SH2/SH3 结构 ， 可 以 其 信号 受 体 (或 蛋白 ) 接受 信号，
把 信号 向 级 联 反应 的 下 一 级 传递 。@ 激 活 转 录 的 调控 蛋白 : 这 类 瘤 蛋 白 分 布 在 细
胞 核 中 ， 常 具有 HLH、 亮 氨 酸 拉链 结构 (L-Z)。 能 通过 与 DNA 的 相互 作用 或 与
其 他 转录 因子 的 相互 作用 直接 或 间接 激活 转录 。 属 于 这 类 的 瘤 蛋 白 有 Cmyc、C
jun、C-fos、C-rel (NF-kB family) 以 及 其 他 一 些 病 毒 癌 基 因 ， 癌 蛋白 的 分 类 和 分
布 见 图 12-1。

从 上 面 所 述 可 以 看 出 ， 许 多 瘤 基因 产物 是 参与 信号 途径 中 的 各 级 联 式 反 应 ，
最 重要 的 是 传递 蛋白 质 磷 酸化 的 栈 氨 酸 激酶 ， 最 终 激 活 转录 ， 导 致 细胞 增殖 。 另

。364 ，

癌 基 因 可 能 编码 1 生长 因子
分 泌 和 蛋白， 穿 膜 i 本 c-sis PDGFB 链
蛋白 、 细 胞 质 蛋 1 :” sis KS-HST 与 FGF 相关
白 或 核 蛋 白 1 ; KS/hst wntl 与 残 怒 相关
1 wntl int2 与 FGF 相关
1 int2

生长 因子 受 体
c-erbB EGF 受 体 激酶
erbB2 EGE 类 受 体 激酶
c-ftms CSEF-1 受 体 激 酶
c-kit 受 体 激 酶

mas 血管 紧张 素 受 体

G 蛋白 / 信号 转 导
c-ras GTP- 结合 蛋白
gsplgip GaS 和 ai

细胞 内 酷 氨 酸 激酶
c-src 膜 连 素

c-abl 细胞 溶质 的
c-fps 细胞 溶质 的

YY

丝氨酸 / 苏 氨 酸 激酶
c-raf 细胞 溶质 的
c-mos 细胞 溶质 的

crk SH2/SH3 调控 因子
vav SH2 调控 因子
转录 因子

C-myc HLH 蛋白

Czfos 亮

C-jun 亮 氨 酸 拉链 蛋白
C-rel NF-xB 家 族
C-erbA 甲状 腺 激素 受 体

12_ 1 ， 癌 基因 可 能 编码 分 泌 蛋白 、 穿 膜 蛋白 、 细胞 质 蛋白 或 核 蛋 日

此 痛 基 因 产 物 并 不 参与 信号 传递 ， 它 们 存在 于 核 中 直接 或 间接 激活 转 永 ，“
致 细胞 增殖 。

第 四 节 ” 原 瘤 基因 的 激活
一 、 ras 原 癌 基因 可 被 基因 变异 所 激活
Cas 家 族 在 人 和 大 鼠 中 都 含 三 种 活动 的 基因 NPras， 百 7ras 和 天 -725 它
人 分 散在 基因 组 中 ， 关 系 十 分 密切 ， 它 们 编码 分 子 质量 为 21 000Da 的 蛋白 厂 。

为 P21lras。 Ras 原 癌 蛋 白 是 一 种 与 质 膜 相 连 的 GTP 结 硅 到 日 ， 在 病毒 中 存在
558

C-xras 的 等 位 基因 was。 在 鼠 肉 瘤 病 毒 (MSV) 的 Harvey 株 和 Kirsten 株 中 的
V-ras 分 别 与 瓦 ras、 开 -ras 同 源 ， 每 种 V-ras 与 C-ras 十 分 接近 ， 只 有 3 个 和 7 直
氨基 酸 不 同 。

从 各 种 原 发 性 肿瘤 或 肿瘤 细胞 系 制 备 的 转化 性 DNA 中 可 获得 Cas 的 各 种
癌 基 因 变 种 。 三 种 C-ras 原 瘤 基因 中 的 每 一 种 都 能 通过 一 个 碱 基 的 变异 而 成 为 具
转化 性 的 瘤 基 因 。 在 人 的 好 几 种 肿瘤 中 发 现 ， 第 12 位 或 第 61 位 氨基 酸 替 换 使
C-ras 原 癌 基 因 转 变 为 癌 基 因 ， 而 在 V-ras (病毒 ras) 中 第 12 位 氨基 酸 也 是 变异
了 的 。 在 正常 的 Cras 中 ， 第 12 位 氨基 酸 是 甘氨酸 ， 如 果 在 体外 诱 变 ， 用 除 且
氨 酸 之 外 的 其 他 18 种 氨基 酸 中 任意 一 种 代替 该 甘氨酸 都 能 使 原 瘤 C-ras 转变 成
癌 基 因 。C-ras 中 的 61 位 氨基 酸 是 谷 酰 氨 ， 如 果 被 除 且 氨 酸 和 谷 所 酸 之 外 的 18
种 氨基 酸 中 的 任何 一 种 取代 ， 也 能 使 它 转变 为 瘤 基因 。

ee 显然 是 转变 为 瘤 蛋 白 后 活性 故
变 。ras 蛋白 是 一 种 小 分 子 单 体 蛋白 ， 能 结合 GTP 并 具有 GTP 酶 活性 。 当 它 和
GTP 结合 时 具有 活性 而 作用 于 它 的 划 重 白 ， 之 后 GTP 水 解 成 GDP， 与 GDP 结
合 的 ras 蛋白 是 没有 活性 的 。 变 异 产 生 的 ras 癌 蛋 白 可 能 是 一 直 保 持 活 性 状态
(constitutive activation)。 而 保持 恒定 的 激活 状态 的 原因 ， 一 种 可 能 性 是 GTP 不
被 水 解 保 持 与 ras 蛋白 结合 ， 另 一 种 可 能 性 是 ras 蛋白 在 和 GDP 结合 时 也 具有 活
性 。

除了 上 述 ”as 基因 在 编码 区 的 变异 使 它 从 原 癌 基因 转变 为 癌 基 因 外 ， 也 发 现

在 ras 基因 的 一 个 内 含 子 (intron) 内 的 变异 使 mRNA 加 工 提高 约 10 倍 ， 从 而

增加 了 ras 基因 的 表达 水 平 。 在 一 些 肿瘤 细胞 系 中 ， 也 发 现 ras 基因 放大 造成 拷
贝 数 增加 20 倍 。 当 正常 的 C-ras 的 表达 水 平 显 著 提 高 时 ， 也 能 使 细胞 转化 。

二 、 插 人 、 转 位 和 基因 放大 可 激活 原 癌 基因

一 些 原 癌 基 因 可 以 通过 改变 它们 的 表达 水 平 而 被 激活 。 它 们 编码 的 蛋白 的 氢
基 酸 序列 并 没有 发 生 改 变 ， 已 发 现 的 这 些 原 瘤 基因 包括 C-myxc、Ca&、C-zoE

C-crpB、CK-ras 等 ， 其 中 研究 得 较为 详尽 的 是 种 xyx。C-myc 提高 表达 的 普遍

机 制 是 基因 的 近邻 插入 非 缺 损 的 反 转 病毒 的 EDNA。

反 转 病毒 在 不 表达 Vonc 基因 的 情况 下 仍 能 转化 细胞 。 首 先是 在 研究 avian 。

病毒 转化 的 了 B 淋 巴 细胞 引起 的 法 氏 过 淋 巴 瘤 中 发 现 ， 类 似 的 情况 也 在 鼠 白 血 病

病毒 引起 的 T 细胞 淋巴 瘤 中 发 现 。 在 上 述 两 种 情况 下 ， 反 转 病毒 引起 的 转化 并

非 是 它们 编码 的 蛋白 质 ， 而 是 它们 基因 组 中 的 LTR 序列 。 在 许多 肿瘤 中 ， 病 毒

基因 组 DNA 整合 到 细胞 基因 组 中 ， 整 合 的 位 置 在 C-xzyc 基因 内 或 靠近 C-zac 基

因 。C-myc 基因 含 三 个 外 显 子 ， 第 一 个 外 显 子 代表 mRNA 上 长 的 不 翻译 的 前 导

序列 ， 另 两 个 外 显 子 编码 Cmyc 蛋白 质 。 反 转 病毒 可 在 相对 于 C-yc 基因 的 不
， 366 ，

]
| 同位 置 竺 大 ， 以 不 同 的 方式 和 机 理 激活 Cmsc。 图 12.2 表示 反 转 病毒 ALV 的
| DNA 在 Cae 基因 座 中 不 同位 置 插 入 和 激活 Cmyc 基因 的 不 同方 式 。

启动 子 外 显 子
1 2 3
[全 于 三 下 ES 0X 请 基本 二 下- 一
基因 内 插入 通过 通读 激活 编码 外 显 子
] TITR LTR 包 3

[SRSSSSSSSSSSSSSSSSTTTTTDTTTTTTTTTTT

反 转 病毒 序列 7

|
|

让

LTR LTR

反 转 病毒
插入 偶然 激活 基因 的 启动 子

< mm

下 游 插入 激活 启动 子 〈 通 过 增强 子 )

PTPTAANO2 。 ESSSSSSSSsSNSy

12-2 在 Csyc 基因 座 上 不 同位 置 插入 ALV 以 不 同方 式 激 活该 基因

当 ALVDNA 插入 到 Cayc 的 第 一 个 内 含 子 ，LTR 提供 了 强大 的 启动 子 活
性 而 对 两 个 编码 的 外 显 子 进行 通 转录 ( readthrough)， 这 时 与 正常 的 Caxyc 表达
有 两 点 不 同 ， 第 一 是 在 强大 的 LTR 启动 子 活性 控制 下 高 水 平 转录 ， 第 二 是 转录
缺少 了 正常 的 长 不 翻译 前 导 序 列 ， 可 能 会 提高 翻译 的 水 平 ， 即 在 转录 和 翻译 两 方
面 提高 了 C-zyw 的 表达 。 图 中 另外 的 揪 入 位 置 激活 C-zzyc 基因 ， 可 能 是 由 于
LTR 的 增强 子 活 性 或 碰巧 激活 C-zaxyc 的 启动 子 。 在 上 述 的 情况 下 ， C-7axc 的 编
码 序列 都 没有 改变 ， 致 瘤 性 是 由 于 提高 了 Ce 的 表达 水 平 。

原 癌 基 因 从 染色 体 上 的 一 个 位 置 转移 到 染色 体 上 的 新 的 位 置 ， 是 原 癌 基 因 激

* 369 :

人

活 的 另 一 种 机 制 。 在 染色 体 断 裂 和 基因 重 排 中 ， 如 果 原 瘤 基因 的 位 置 舍 近 断 烈
点 ， 重 排 后 被 激活 的 可 能 性 就 很 大 。 这 种 染色 体 断 裂 后 重 接 使 基因 重 排 而 激活 基
因 的 现象 ， 起 初 是 在 免疫 球 蛋白 基因 和 某 些 肿瘤 中 发 现 的。 图 12.3 是 Cm 史 基 |
因 在 染色 体 上 位 置 改 变 后 导致 B 细胞 和 T 细胞 的 淋巴 瘤 的 情况 。 第 8 染色 体 上 上，
的 C-zayc 基因 分 别 靠拢 了 第 14 染色 体 上 的 HE 和 TCR 基因 座 。

染色 体 14 染色 体 8

8

图 12.3 妆 色 体 易 位 是 一 个 相互 的 事件 ， 两 条 染色 体 交换 ， 转 位 激活 人 Ce 原 癌 基 因 ,

包括 B 细 胞 中 的 态 座 位 和 工 细 胞 中 的 TCR 座位

除 第 14 染色 体 之 外 ，C-mae 如 与 第 2 染色 体 上 的 <、 第 22 染色 体 上 的 通

第 7 染色 体 上 的 TCR8 基因 座 靠 拢 也 可 能 引起 肿瘤 ， 这 些 位 置 的 转移 使 Cm 纲

的 表达 水 平 提高 。 例 如 靠拢 je 基因 座 时 表达 水 平 被 提高 2 10 倍 。 C-mzzyc 基因

的 致 瘤 性 可 能 暗示 ， 细 胞 的 分 化 需要 Cay 基因 关闭 。 Caxyc 基因 产物 〈 蛋 站 :

质 ) 可 能 抑制 与 分 化 有 关 的 基因 表达 或 激活 与 细胞 恶性 增殖 有 关 的 基因 表达 ， 或

两 者 兼 有 。 由 此 看 来 ， 提 高 原 癌 基 因 mRNA 的 翻译 水 平 如 改 恋 5 的 前 导 序 列 和
poly A 结构 也 可 以 致癌 。

许多 肿瘤 细胞 系 具有 可 见 的 染色 体 放 大 区 域 ， 在 染色 体 显 带 ( 同 源 桨 色 区 )

中 可 以 看 出 ， 有 的 放大 区 不 能 用 显 带 技术 直接 看 出 ， 通过 探 针 杂交 才能 检查 出 基

因 放大 ， 瘤 基因 放大 后 造成 拷贝 数目 增加 即 转录 的 模板 数目 增加 因而 导致 mRNA
368 ，

第 五 节 ， 肿 瘤 抑制 蛋白

二 肿瘤 的 发 生 有 不 同 机 制 ， 原 癌 基 因 的 激活 可 引发 肿瘤 ， 而 肿瘤 抑制 蛋白 基因
丢失 或 变异 也 是 发 生 肿瘤 的 重要 原因 ， 研 究 得 最 详细 的 是 RB 和 p53 两 种 肿瘤 抑
制 蛋白 。

视网膜 细胞 瘤 〈retinoblastoma) 是 少年 儿童 的 一 种 病 ， 可 以 遗传 ， 在 视网膜
止 出 现 神经 胶 质 瘤 。RB 基因 位 于 第 13 条 染色 体 上 Ql14 带 的 位 置 。 如 果 两 个
URB 拷贝 都 被 灭 活 就 发 生 这 种 病 。 病 人 常见 两 个 RB 等 位 基因 丢失 或 一 个 变异

(DNA 缺失 一 部 分 )， 一 个 丢失 。RB 蛋白 功能 丧失 不 但 可 引起 视网膜 瘤 ， 而 且 也
引起 另 一 些 肿 瘤 ， 如 骨肉 瘤 、 小 细胞 肺癌 。RB 和 蛋白 位 于 核 中 ， 有 磷酸 化 和 非 磷
酸化 形式 ， 它 对 细胞 周期 有 影响 。 当 细胞 处 在 GO/G1 期 ，RB 是 未 被 磷酸 化 的 ，
它 可 能 是 在 Gl 期 末 被 Cyclin-CDK 复合 物 磷 酸化 的 ， 在 细胞 有 丝 分 裂 期 间 RB 去
磷酸 化 。: 显 然 ， 未 磷酸 化 的 RB 蛋白 具有 防止 细胞 增殖 的 功能 ， 未 磷酸 化 的 RB
蛋 自 能 与 多 种 蛋白 质 相 互 作用 ， 包 括 多 种 癌 蛋 白 和 一 些 转录 因子 (调控 蛋白 )。
SV40T 抗原 、AdV 的 EIA、HPV 的 E7 蛋白 在 体外 都 能 与 RB 蛋白 相互 作用 形
成 二 聚 体 。RB 也 能 与 转录 因子 E2F、D 型 和 下 型 胞 环 素 (cyclin) 相互 作用 。 因
此 ，RB 抑制 肿瘤 和 影响 细胞 周期 的 机 制 ， 可 能 是 与 癌 基 因 产 物 ( 癌 蛋 白 ) 结合
使 之 失去 功能 。 它 与 E2F 的 结合 可 抑制 依赖 于 E2F 的 启动 子 控制 的 基因 的 表达 。
而 对 于 RB 蛋白 对 细胞 周期 的 影响 细节 ， 目 前 尚 不 大 清楚 。 另 有 一 种 肿瘤 抑制 蛋
自 一 二 P107， 在 结构 和 功能 方面 与 RB 相似 。
p53 是 近年 来 研究 得 很 多 的 分 子 之 一 ， 它 被 誉 为 1993 年 分 子 。p53 也 是 一 种
磷 和 蛋白 ， 最 初 是 在 SV40 转化 的 细胞 中 发 现 的 。 它 在 细胞 中 和 SV40 的 工 抗原 偶
合成 二 聚 体 。 在 许多 转化 的 细胞 和 肿瘤 细胞 系 中 p53 蛋白 的 量 大 大 增加 ， 而 且 初
期 的 实验 把 253 基因 的 克隆 引入 细胞 中 能 使 细胞 永生 ， 导 致 初期 错误 地 把 253
划 归 为 癌 基 因 ， 后 发 现 这 些 p53 都 是 变异 了 的 。 这 些 变异 的 p53 已 经 丧失 正常 的
p53 的 功能 。p53 没有 组 织 特异 性 ， 在 许多 类 型 的 人 癌 中 可 发 现 p53 的 变异 积累 ，
即使 在 同一 种 癌 ， 例 如 乳腺 癌 中 ， 对 不 同 的 乳腺 癌 病 人 癌 组 织 中 p53 的 PCR 测
序 发 现 ， 存 在 不 同 的 p53 变异 ， 变 异 集中 在 p53 的 中 部 。z253 也 有 两 个 等 位 基
因 ， 如 果 其 中 一 个 发 生变 异形 失 了 功能 ， 就 可 能 引发 癌 。 这 点 和 RB 不 同 ， 在 肿
瘤 病 人 中 一 般 发 现 253 的 变异 ， 其 中 的 氨基 酸 替 换 比 较 普 遍 ， 也 有 缺失 ， 很 少
发 现 153 基因 丢失 。
p53 可 能 以 同 源 四 聚 体 的 形式 存在 ， 如 果 野 生 型 (正常 的 ) p53 多 肽 和 变异

的 p53 多 肽 组 成 四 聚 体 ， 那 么 这 种 四 聚 体 呈现 变异 型 的 构象 ， 没 有 正常 功能 。
p53 能 抑制 各 种 癌 基 因 对 细胞 的 转化 作用 。 它 在 广 谤 的 组 织 中 起 防止 细胞 增殖 的
"369

作用 。 有 两 种 理论 解释 p53 对 肿瘤 的 抑制 功能 ，p53 的 一 种 功能 是 能 和 SV40T
抗原 结合 ， 它 和 工 抗原 的 结合 可 干扰 工 抗 原 对 DNA 复制 的 促进 作用 ， 而 变异 的
p53 则 不 能 和 了 抗原 结合 ， 推 测 p53 能 和 瘤 基 因 产 物 直接 结合 而 抑制 了 癌 蛋 白 的
活性 。p53 的 另 一 种 功能 是 直接 作用 于 DNA，Pp53 同时 是 一 种 DNA 结合 蛋白，
它 能 识别 启动 子 上 106bp 的 对 称 序 列 ， 能 激活 一 些 基 因 的 转录 ， 而 对 于 另 一 些 基
因 ， 它 的 结合 可 抑制 基因 表达 ， 即 它 对 基因 的 表达 具 调 控 作 用 ， 它 可 能 控制 与 细
胞 周期 有 关 的 一 些 基 因 的 表达 。

p53 的 许多 变异 发 生 在 不 同 生 物 共 有 的 保守 性 区 域内 ， 保 守 的 氢 基 酸 变异 可
能 涉及 p53 保守 的 功能 ， 影 响 p53 的 性 质 ， 有 些 变异 增加 p53 的 寿命 ， 半 衰 期 从
20min 增 至 几 小 时 ;有 的 引起 构象 改变 〈 可 被 正常 的 抗体 检 出 ); 有 的 变异 使 53
不 进入 核 中 而 存在 于 细胞 质 中 ， 不 能 结合 工 抗原 等 。p53 的 功能 缺陷 使 细胞 呈现
不 同 的 表 形 ， 哪 一 种 功能 直接 与 肿瘤 抑制 有 关 ， 是 结合 别 的 蛋白 质 还 是 结合
DNA， 目 前 还 不 能 确定 。

”3 了 王

第 十 三 盖 ”发 育 与 分 化 调控

| 研 ”发 育 生物 学 是 一 门 正 在 发 展 中 的 新 学 科 ， 它 的 最 终 目 标 是 揭 开 从 一 个 细胞 如
| 受精 卵 变 成 复杂 的 多 细胞 、 多 组 织 、 多 器 官 的 生物 之 谜 ， 这 一 过 程 十 分 复杂 、 精
| 细 和 奥妙 。 在 这 个 过 程 中 ， 一 系列 基因 表达 是 通过 级 联 (cascade) 反应 来 实现
| 的 。 级 联 反应 是 指 一些 基 因 的 表达 产物 可 激活 另 一 些 基 因 的 活性 ， 这 些 被 激活 的
| 医 因 的 产物 ， 又 调控 另外 一 些 基因 的 表达 。 这 样 ， 最 初 表达 的 基因 可 以 逐 级 地 激
活 和 调控 其 他 基因 的 活性 ， 其 效应 也 就 逐 级 放大 。 特 定 基因 在 特定 时 间 和 空间 上
被 激活 ， 产 生 构成 生命 有 机 体 的 不 同 组 织 和 特异 类 型 的 细胞 。 可 以 说 ， 在 合适 的
外界 条 件 下 ， 精 确 的 发 育 和 分 化 过 程 是 由 早已 存在 于 基因 组 中 的 程序 决定 的 。 在
这 一 章 中 ， 我 们 将 集中 盖 述 几 种 研究 得 比较 清楚 的 与 动物 和 植物 器 官 或 组 织 发 育
有 关 的 调控 机 制 ， 以 说 明生 物 在 发 育 过 程 中 基因 的 表达 受 严格 的 时 间 和 空间 限
制 。

第 一 节 “有 果 蝇 且 轴 的 形成

果 蝇 的 卵 、 胚 胎 、 幼 虫 和 成 体 都 具有 明确 的 前 后 轴 稍 腹 轴 ， 沿 前 后 轴 有 果 晶
豚 胎 和 幼虫 显示 有 规律 的 分 节 ， 从 前 到 后 分 为 头 节 、3 个 胸 节 和 8 个 腹 节 ， 在 幼
虫 的 两 末端 又 特 化 为 前 面 的 源头 和 后 端的 尾 节 。 在 早期 豚 胎 发 育 中 ， 沿 背 腹 轴 分
化 为 4 个 区 域 ， 即 背部 外 胚层 、 腹 侧 外 胚层 、 中 胚层 和 羊 浆 膜 。

、 果 蝇 胚胎 前 后 轴 决 定 的 基因 调控

果 蝇 胚胎 前 后 轴 的 决定 取决 于 bcd (bicoid) mRNA 在 卵细胞 前 区 的 定位 和
osk (osker) mRNA 在 卵细胞 后 区 极 小 圳 中 的 聚集 。 这 些 mRNA 翻译 产生 的 和 蛋 昌
质 扩 散 产 生 的 浓度 梯度 控制 着 沿 前 后 轴 不 同位 置 的 卵 裂 球 内 合子 基因 的 表达 ， 从
而 建立 起 胚胎 的 前 后 轴 。

bcd 是 一 种 母体 效应 基因 ， 在 卵子 发 生 中 bcd mRNA 在 营养 细胞 中 转录 ， 通
过 非 翻 译 的 3 区 锚 定 在 卵 前 极 而 直接 进入 卵 内 定位 于 卵子 中 预定 胚胎 的 前 极 ，
bcd mRNA 使 得 卵 前 端 成 为 组 织 中 心 。 已 经 发 现 bcd mRNA 的 定位 需要 3 个 基
因 : exuperantia (ezv )，swallow (sa ) 及 staufen (stax)， 其 中 每 一 个 基因 都
在 定位 途径 的 不 同 阶段 起 作用 。 基 因 ezx 和 sea 的 突变 可 破坏 卵子 发 生 过 程 中
bcd mRNA 的 定位 。stau mRNA 从 卵 的 表面 转移 到 前 端的 细胞 质 中 ， 并 在 卵子 发

994-

生 后 期 发 挥 作用 。 在 发 育 的 开始 数 分 钟 内 ，bcd mRNA 翻译 成 蛋白 质 ，Bcd 蛋 自
不 能 自由 扩散 ， 从 而 建立 起 Bcd 蛋白 梯度 ， 前 极 Bcd 蛋白 浓度 高 ， 并 沿 卵 的 纵 畏
方向 延伸 至 纵 轴 一 半 处 。zca 突变 可 引起 Bcd 产物 缺陷 ， 如 果 两 个 等 位 基因 都 有
缺陷 〈 一 个 同 源 异 型 框 子 无 效 突变 )， 则 幼虫 无 头 和 胸 ， 顶 节 ( 原 头 区 ) 即 被 三
个 反 回 的 尾 节 所 代替 。 可 引起 相似 形态 的 是 bicephalic 突变 体 ， 这 种 幼虫 两 端 各
有 一 个 头 〈 称 为 Janus 头 )， 且 2 个 头 呈 镜像 对 称 排 列 ， 这 种 具 Janus 头 的 幼虫 是
因为 卵细胞 与 两 端的 滋养 细胞 邻接 ， 接 受 两 端的 becd mRNA 产生 的 。 另 外 ， 如
果 将 纯化 的 bcd mRNA 注射 到 处 于 早期 卵 裂 的 豚 胎 中 ， 获 得 bed mRNA 的 任何
部 位 都 将 变 成 头 部 ;如果 bcd mRNA 被 注射 到 胚胎 中 央 ， 则 中 间 将 变 成 头 部 ，
而 它 的 两 边 则 变 成 胸部 结构 ; 如 果 把 bcd mRNA 注射 到 野生 型 果 蝇 胚胎 的 尾部 ，
那么 将 发 育 出 两 端 各 有 一 个 头 的 双 头 胚胎 。

Bcd 蛋白 结合 到 卵 前 区 的 豚 胎 细胞 核 上 ， 它 含有 一 个 螺旋 -转角 -螺旋 结构
域 ， 由 于 具有 这 个 结构 域 ，Bicoid 蛋白 可 以 结合 到 其 他 基因 的 启动 子 上 ， 并 把 这
些 基 因 置 于 自己 的 控制 之 下 。

一 般 认 为 ，Bcd 蛋白 梯度 提供 了 位 置信 息 ， 当 卵 前 部 Becd 蛋白 浓度 增加 时 ，
头 和 胸部 的 边缘 都 向 后 移 ， 头 和 胸 的 相对 大 小 也 增加 了 ， 大 量 Bicoid 蛋白 启动 尖
部 发 育 特异 基因 的 表达 ， 而 低 浓 度 的 Bcd 蛋白 使 得 与 胸部 形成 有 关 的 基因 特异 地
表达 。Bcd 还 可 启动 合子 基因 的 表达 ， 如 hunchback (四 ) 是 首 批 表达 的 基因 之
一 ， 开 始 ，hb mRNA 广泛 分 布 于 合 胞 体 卵 小 室 中 ， 但 由 于 受 抑制 蛋白 Nanos 的
影响 ， 它 在 体内 的 表达 空间 被 限制 在 卵 前 部 的 2/3 处 。

后 部 组 织 中 心 受 母 源 基 因 nanos (zxos) 和 oskar (o 迪 ) 的 产物 的 控制 ， ?5
和 os 的 产物 在 细胞 后 端的 定位 需要 $ 个 基因 的 参与 ， 其 中 ，Pbicaudal 了
(bic D)、cappucino (catpx ) 及 spire (szbire) 失 活 可 阻止 osk mRNA 在 卵 母 细胞
定位 的 第 一 步 一 一 即 在 前 端的 聚集 ， 而 sxex 和 mago nashi (nago) 的 突变 可 特
异性 地 阻止 这 个 过 程 后 期 的 一 个 步骤 一 一 即 转录 产物 从 前 端 移 到 后 端 。

在 野生 型 豚 胎 中 ，Nos 蛋白 从 卵 的 后 部 扩散 ， 形 成 与 Bcd 蛋白 梯度 方向 相反
的 浓度 梯度 ， 与 Becd 蛋白 不 同 ，Nos 不 是 一 个 转录 因子 ， 不 能 结合 到 DNA 上 ，
而 是 通过 卵 后 部 hb mRNA=- 核糖 体 复合 物 抑 制 转录 。

如 果 前 端 和 后 端 组 织 中 心 都 失 活 ， 果 蝇 豚 胎 仍 可 产生 某 些 前 后 图 式 ， 这 说 明
还 存在 第 三 个 与 前 后 轴 确 立 有 关 的 中 心 ， 即 末端 组 织 中心 ， 在 这 一 组 织 中 心中 起
关键 作用 的 是 torso (zior) 基因 。tzor 基因 编码 一 种 细胞 外 信和 号 分 子 受 体 蛋白 ，
该 信号 分 子 或 其 前 体 被 卵 两 端的 细胞 储存 在 卵细胞 膜 和 卵 周 孙 中 。Ter 受 体 (一
种 酷 氨 酸 激 酶 ) 被 配 体 占据 后 能 促使 身体 末端 结构 、 顶 节 和 尾 节 的 形成 。tor 基
因 存 在 两 类 突变 体 : 一 类 是 失 活 突 变 体 ， 胚 胎 缺 失 原 头 区 和 尾 节 ; 另 一 类 是 显 性
突变 体 ， 且 胎 中 部 区 域 ( 头 、 胸 、 腹 部 ) 的 分 节 缺 失 ， 末 端 结构 却 增 大 。

.372 ，

和

二 、 果 蝇 胚 胎 表 腹 轴 建 立 的 基因 调控

果 蝇 且 胎 背 腹 轴 的 建立 ， 涉 及 约 20 个 基因 ， 其 中 dorsal (&) 等 基因 的 突
变 会 导致 豚 胎 背部 化 ， 即 产生 具有 青 部 结构 而 没有 腹部 结构 的 豚 胎 。 而 cactus 等
基因 的 突变 则 引起 胚胎 腹部 化 ， 产 生 只 有 腹部 结构 的 豚 胎 。 卵 子 发 生 时 储存 了 dl
mRNA， 但 直到 受精 后 90min， 它 才 翻 译 成 背部 蛋白 ， 这 种 蛋白 质 开 始 时 均匀 分
布 于 整个 且 胎 ， 但 在 腹部 信号 的 诱导 下 ， 它 们 仅 定 位 在 豚 胎 腹部 的 细胞 核 中 ， 与
核 基因 结合 ， 形 成 从 腹部 到 背部 的 涤 度 梯度 ， 这 种 浓度 梯度 在 腹 侧 组 织 中 可 激活
腹部 化 基因 (如 snail 和 twisted) 的 表达 ， 同 时 抑制 背部 基因 如 Zpp 和 zen 的 表
达 ， 进 而 指导 腹部 结构 的 发 育 ， 建 立 起 且 胎 的 背 腹 轴 。 如 果 背 部 蛋白 进入 所 有 细
胞 核 中 ， 则 豚 胎 所 有 细胞 都 具有 腹部 的 表 型 。

在 正常 豚 胎 的 吉 豚 层 中 缺乏 DI 蛋白 的 细胞 将 释放 一 种 因子 到 背 侧 卵 黄 周 辽
中 。 这 种 因子 是 zpz 基因 编码 的 Dpp 因子 ， 属 于 生长 因子 TGFB 家 族 。 细 胞 外
Dpp 梯度 和 细胞 内 DI 梯度 把 细胞 宫 豚 再 分 成 几 个 不 同 区 域 : 沿 腹 中 线 是 未 来 中
肥 层 区 ; 两 侧 是 神经 外 胚层 ， 将 形成 神经 系统 ; 靠背 外 侧 是 背部 外 豚 层 ， 将 来 形
成 幼虫 表皮 。

三 、 参 与 果 蝇 胚胎 体 节 形成 控制 的 基因

果 蝇 胚胎 体 节 的 形成 是 通过 分 节 基 因 把 早期 豚 胎 沿 前 后 轴 分 为 一 系列 重复 的
体 节 原 基 ， 分 节 基 因 的 突变 可 使 豚 胎 缺失 某 些 体 节 或 体 节 的 某 些 部 分 。 根 据 分 节
基因 的 突变 表 型 及 作用 方式 可 分 为 三 类 : 缺口 (gap) 基因 、 成 对 控制 〈pair-
rule) 基因 和 体 节 极 性 (segment polarity) 基因 ， 这 三 类 基因 的 调控 是 逐 级 进行
的 。 在 细胞 吉 豚 层 形 成 之 前 的 割裂 中 ， 首 先 由 母体 效应 基因 (如 bd 和 zxos ) 控
制 gaz 基因 的 活化 ， 其 次 gazp 基因 之 间 互 相 调节 彼此 的 转录 并 共同 调节 zazr-
rule 基因 的 表达 ， 然 后 aaizr-rule 基因 之 间 相 互 作 用 ， 把 胚 体 分 隔 成 一 系列 重复
的 体 节 ， 并 且 进 一 步 控制 体 节 极 性 基因 的 表达 。 gcC 轧 基因 和 zaz7 一 7ULe 基因 再 共
同调 控 同 源 异 型 基因 的 表达 ， 所 以 ， 胚 盘 未 期 的 每 一 个 体 节 原 基 都 具有 其 独特 基
因 表达 的 组 合 ， 从 而 决定 每 个 体 节 的 特征 。 图 13-1 概括 了 果 蝇 体 节 发 育 过 程 中
参与 体 节 分 化 的 基因 的 级 联 调控 模式 。

1. 缺口 基因

缺口 基因 (gap gene)， 包 括 基因 hunchback [12， 在 第 1~3、13 和 了 到 副 体

节 (parasegment) 前 部 表达 ]、kruppel (Ar， 在 第 4 一 6 副 体 节 的 后 部 表达 ) 和

knirps (Ri ， 在 第 7 一 12 副 体 节 中 表达 ) 等 基因 ， 它 们 的 表达 区 域 为 一 些 较 宽 的
有

母体 基因

Gnt Kni Gnt
缺口 基因
Hmy 135791113
Rnt 240608101214
早期 匹配
规则 基因 Hry Hry Hry Hry Hry Hry Hry
Rnt Rnt Rnt Rnt Rnt Rnt Rnt
Bve，134790UNUS
Ftz 2468101214
后 期 匹配
规则 基因 Eve Eve Eve Eve Eve Eve Eve
EtzJEtziEtzFtz Etz PEFtzi Etz
同 源 异 型 基因

(a) (b) (c)
图 13-1 果 蝇 合 胞 体 圳 胚层 和 细胞 襄 胚 层 中 控制 节 段 化 的 基因 序 位
(a) 基因 的 序 位 : 母体 基因 调节 缺口 基因 ， 缺 口 基因 调节 匹配 规则 基因 ， 按 顺序 它 调节 同 源 异 型 基因 。
(b) 箭头 表示 各 种 基因 产物 如 何 调节 基因 活性 并 将 基因 产物 限制 在 沿 前 后 轴 确 定 的 区 带 。 基 因 活化 或
蛋白 质 合成 由 尖 箭 头 表示 (~~); 基因 的 抑制 由 钝 箭头 表示 〈 一 )。 双 箭头 表示 强烈 活化 或 抑制 (- 六 或
一 )， 在 某 些 情况 下 低 浓度 的 蛋白 质 活 化 基因 表达 ， 而 高 浓度 则 抑制 。 这 种 情况 从 Bed 到 Kr 由 两 个
不 同 的 箭头 〈~ 或 二 ) 表示 ， 蛋 白质 的 符号 和 名 称 见 表 12.2。(c) 沿 着 宫 胚 层 长 轴 的 蛋白 质 梯度 显示
了 基因 是 如 何 表达 以 及 基因 产物 的 限制 。Bcd 和 Nos 的 梯度 占据 赛 胚 层 各 一 半 ，Gnt、Kr 和 Kmni 的 梯度
在 囊 胚 层 的 后 2/3 被 发 现 。Hry 和 Rnt 交替 在 衷 胚层 的 后 2/3。 这 14 条 带 大 致 与 形成 成 虫 的 节 段
相对 应 。Eve 和 Ftz 的 14 条 带 在 宫 胚 层 后 2/3 交替 。 这 些 条 带 确定 副 节 段 。

,374 .

区 域 ， 每 个 区 域 的 宽度 约 为 3 个 体 节 ， 表 达 区 之 间 可 有 部 分 重 玲 ， 这 些 基因 突变
产生 的 缺陷 产物 将 引起 幼虫 体内 成 串 的 副 体 节 丢 失 。 例 如 zr 基因 突变 将 引起 胚
胎 对 应 区 域 的 缺失 。 缺 口 基因 的 表达 最 初 由 母体 效应 基因 启动 ， 其 表达 图 式 的 维
持 可 能 依赖 于 缺口 基因 间 的 相互 作用 。 例 如 思 基因 的 表达 受 Bcd 蛋白 的 激活 而
受 Nos 蛋白 的 抑制 ， 在 它们 的 相互 作用 下 确定 吧 基因 在 胚胎 前 部 表达 。Kr 基
因 同 样 受到 母体 效应 基因 产物 的 调控 ， 但 调节 方式 不 同 ，Bcd、Nos 蛋白 及 Ter
途径 均 可 抑制 和 基因 表达 。 在 bcd 突变 的 豚 胎 中 ，Ar 基因 的 表达 区 域 一 直到 达
胚胎 前 端 ， 当 Kg& 、zos 和 tor 均 失 活 时 ，Azr 基因 在 全 部 细胞 均 表 达 ; 而 在 胚胎
申 部 Bcd 和 Nos 蛋 日 的 浓度 及 Ter 活性 均 很 低 ， 所 以 杂 基因 能 够 表达 。 这 些 缺
目 基 因 的 表达 产物 全 部 是 转录 调节 因子 ， 它 们 相互 调节 又 具有 高 度 的 特异 性 。 一
种 基因 产物 可 以 与 其 他 多 种 基因 的 启动 子 结 合 ， 如 Kr 蛋白 既 能 与 凤 的 启动 子
结合 抑制 其 表达 ， 又 能 与 emi 基因 的 启动 子 结合 调节 其 转录 。Tailless 蛋白 也 识
别 友 i 的 启动 子 并 抑制 该 基因 的 转录 ，j0 基因 产物 还 可 以 识别 自己 的 启动 子 ，
说 明 Hb 蛋白 也 可 以 调节 自己 的 表达 。

因此 ， 这 些 基因 最 初 的 表达 图 式 通 过 不 同 缺口 基因 之 间 的 相互 作用 得 到 进 一
步 的 调节 和 稳定 。 如 好 基因 的 表达 区 域 的 前 端 界 线 处 受到 Hb 蛋 折 的 负 调 控 ，
在 后 端 界线 处 则 受到 Kni 蛋白 的 负 调控 ;如果 习 r 基因 缺失 ， 届 基因 的 表达 则 一
直 延 续 到 原来 ir 基因 的 表达 区 域 ， 这 种 边界 性 的 抑制 作用 可 能 是 这 些 基因 产物
， 间 直接 作用 的 结果 。

2. 成 对 控制 基因

成 对 控制 基因 (pair-rule gene): 成 对 控制 基因 以 每 隔 一 个 体 节 ，7 条 条 纹 的
模式 表达 ， 包 括 许多 基因 ， 如 hazry、even-skipped (eue )、rzuzmt 和 fushitaraz
(天 <) 等 ， 这 些 基因 的 功能 是 把 缺口 基因 确定 的 区 域 进一步 分 成 体 节 。 它 们 在 胚
胎 期 第 13 次 核 分 裂 时 开始 表达 ， 表 达 图 式 非 常 独 特 ， 沿 前 后 轴 形 成 一 系列 斑马
纹 状 的 条 带 ， 正 好 把 豚 胎 分 成 预定 体 节 。 如 eue 和 户 z 基因 在 胚胎 期 阶段 的 表达
区 域 均 为 7 条 带 ， 只 是 户 z 在 奇数 副 体 节 中 表达 ， 而 eve 在 偶数 副 体 节 中 表达 ，
也 就 是 说 ，eve 和 态 z 基因 共 形 成 14 条 表达 带 ， 这 些 基因 突变 将 产生 仅 有 奇数 或
仅 有 偶数 体 节 的 幼虫 。 成 对 控制 基因 由 缺口 基因 活化 或 抑制 ， 如 hazry、eze 和
72z2z 的 启动 子 ， 受 缺口 基因 成 对 调控 ， 如 当 Hb、Kr 和 ni 蛋白 都 缺失 时 ， 成 对
控制 基因 pairy 在 整个 胚胎 中 都 表达 ， 不 呈 条 纹 状 区 域 表 达 图 式 ， 说 明 在 这 种 情
况 下 ， 带 间 区 域 原 来 被 抑制 的 hairy 基因 被 激活 了 ， 如 果 在 成 对 控制 基因 表达 图
式 形成 的 时 期 向 豚 胎 注射 蛋白 质 合 成 抑制 剂 也 可 获得 类 似 的 结果 。

3. 体 节 极 性 基因

体 节 极 性 基因 〈segment polarity gene): 体 节 极 性 基因 在 每 一 体 节 的 特定 区
域 细胞 中 表达 ， 这 些 基 因 产 物 将 体 节 进 一 步 分 为 14 个 有 极 性 的 副 节 段 ， 当 这 类
人

基因 突变 时 每 个 体 节 都 缺失 一 个 特定 的 区 域 。Engrailed (ez ) 和 wingless 〈 了 二)
是 最 重要 的 体 节 极 性 基因 ， 在 原 肠 作 用 开始 时 ，er 和 wsg 的 表达 已 经 开始 ,但
在 原 肠 作用 过 程 中 成 对 控制 基因 的 表达 量 减少 。ez 基因 在 每 一 副 体 节 最 前 端的
一 列 细胞 中 表达 ，zwg 基因 的 表达 区 域 刚好 位 于 en 基因 表达 带 之 前 ， 即 每 一 副
体 节 的 最 后 一 列 细胞 ， 因 此 ， 这 两 个 基因 表达 区 域 的 界线 正好 确立 副 体 节 的 界
线 。enz 和 zwg 表达 的 维持 则 依赖 于 对 方 的 基因 活性 ，rwg 基因 只 在 ez 基因 表达
区 相 邻 的 一 列 细胞 中 维持 表达 ， 而 ez 基因 在 wwg 基因 表达 区 之 后 的 1 二 2 列 细 胞
中 表达 ，rwg 基因 编码 一 种 分 泌 性 蛋白 ， 可 能 直接 介 导 对 en 基因 表达 的 维持
体 节 极 性 基因 porec、dj 、zze3 和 arm 等 也 都 参与 这 一 过 程 。zg 基因 编码 三 种
转录 因子 ，rwg 基因 表达 的 维持 由 hedge-hog ( 雄 ) 基因 介 导 ， 雄 基因 编码 一 种
分 泥 性 蛋白 ， 表 达 区 域 与 en 基因 的 一 致 。 当 雄 基因 突变 时 ，rwg 基因 表达 和 缺
失 ， 与 en 基因 失 活 的 情况 相似 。zatc、 肥 和 zzp 基因 在 Hh 蛋白 调节 wwg 基因 表
达 的 过 程 中 起 作用 。 其 中 zxc 编码 一 种 跨 膜 受 体 蛋白 ， 它 是 Hh 蛋 白 功能 的 负 调
节 因 子 ， 当 pxc 失 活 时 ，zwg 基因 表达 范围 扩大 。enr 和 wsg 基因 的 表达 受到 成 对
控制 基因 ewe 和 瑚 z 等 的 激活 。ewe 和 户 z 等 基因 都 编码 转录 调节 因子 ， 这 是 调节
ez 和 zwg 的 基础 。en 基因 在 Ftz 和 Eve 的 浓度 达到 一 定 国 值 之 上 时 才能 被 激活 ，
而 zwg 基因 的 活化 可 低 于 这 一 疹 值 。 但 如 果 只 有 Eve 和 Ftz 还 不 能 激活 ex 和 并
基因 的 表达 ， 后 者 的 表达 还 需要 成 对 控制 基因 paired (za ) 和 odd paired (oza )
的 参与 。 za 基因 最 初 的 表达 图 式 为 7 条 较 宽 的 条 带 ， 后 者 很 快 变 成 14 条 和 军 的
条 带 ， 正 好 与 ex 和 zwg 基因 表达 区 域 一 致 。 虽 然 pra 基因 在 每 个 副 体 节 界 线 处
均 表 达 ， 但 起 作用 的 区 域 与 eue 的 表达 区 域 一 致 。 所 以 在 ra 基因 表达 有 目 Eve 的
汶 度 较 高 的 区 域 en 基因 被 激活 ; 而 在 rq 基因 表达 且 Eve 和 Ftz 的 浓度 均 较 低
的 区 域 wg 基因 被 激活 。ozau 基因 可 能 与 tra 基因 具有 类 似 的 表达 图 式 ， 而 其 功
能 区 域 可 能 与 pra 互补 。 在 opa 表达 和 Ftz 浓度 高 的 区 域 激 活 en 基因 的 表达 ，

而 在 Ftz 流 度 低 的 区 域 激活 zwg 基因 。

4. 同 源 异 型 基因

同 源 异 型 基因 最 终 决 定 身 体 体 节 将 出 现 哪 一 种 类 型 ， 例 如 一 个 指定 的 体 节 是
成 为 一 个 无 翅 的 前 胸 ， 还 是 有 翅 的 中 胸 或 有 平 衔 器 的 后 胸 ? 负责 做 出 决定 的 基因
是 同 源 异型 选择 基因 或 同 源 异 型 主导 基因 。 在 果 蝇 中 大 多 数 同 源 异 型 基因 位 于 第
三 染色 体 上 ， 主 要 集中 在 两 个 区 域 。 一 个 区 域 叫 触 角 足 复合 体 Anrennapdia
(Anpt-C)， 包 含 同 源 异 型 基因 labial (ep )、antennapedia (aztb) 、sex comb re-
duced (scr)、deformed (& 忆 ) 和 proboscipedia (2 )。Lo 和 az7 凤 基因 特 化 为 头
部 体 节 。scr 和 ant 的 作用 在 于 使 胸部 体 节 一 致 ， 特 化 有 翅 的 中 胸 需 要 基因
az 态 ， 在 触角 足 基因 azzp 显 性 突变 体 中 ， 该 基因 在 头 和 胸部 表达 ， 因 此 头 的 部
分 转变 为 胸 体 节 的 特征 ， 应 该 长 触角 的 地 方 却 长 出 了 一 对 附 肢 。 同 源 异 型 基因 的

”0

第 二 个 区 域 是 双 胸 复合 物 bithorax (bx-C)， 在 这 个 复合 物 中 ， 有 三 个 蛋白 质 编
码 基 因 :， ultrabithorax (xpz)， 它 对 于 第 三 胸 节 的 一 致 性 是 必需 的 。abdominal A
(55aA) 和 abdominal B (apdB) 负责 腹部 体 节 的 同一 性 。 当 vbpz 基因 缺失 时 ，
第 三 胸 节 (特征 是 具有 平衡 棒 ) 转变 成 另 一 个 第 二 胸 节 ， 结 果 是 形成 一 个 拥有 4
东 码 膀 的 果 蝇 。 包 含 antp 复合 物 (antp-C) 和 bithorax ( 双 胸 ) (bx-C) 复合 物
的 染色 体 区 经 常 被 看 成 同 源 异 型 复合 体 (Hom-C)。

“an 万 C 和 pzr-C 基因 排列 在 第 三 对 染色 体 上 ， 它 们 在 染色 体 上 的 直线 排列 顺
序 大 致 反映 了 它们 表达 上 的 时 间 和 空间 次 序 。 沿 果 蝇 身体 从 头 向 后 移动 ， 首 先 看
到 antp-C 蛋白 ， 并 且 这 些 蛋 白质 继续 出 现 ， 在 后 面 的 胸部 ， 第 一 个 是 Bx-C 蛋
自 ， 在 腹部 最 后 一 个 体 节 Ag8 出 现 由 Hom 复合 体 的 几 个 基因 编码 的 蛋白 。

二 节 “有 果 晶 体 细胞 的 性 别 分 化

20 世纪 初 ， 一 系列 遗传 学 实验 结果 确定 了 “ 果 蝇 的 性 别 由 X 染色 体 和 和 常 染
色 体 数 的 比率 〈(X:A) 决定 ”这 一 重要 概念 ， 即 X:A 的 比值 是 个 体 性 别 决 定 的

X:A 比率
XX XY
TCFePTCT 7
疝 | :
如 da
jer jer
ETIC 21IC
S70 370
0 Sxrl 无 活性
dsx
77ra、tra-2 无 活性
抑制 T7ra、Tyra-2 Ms/! 基因 族
雁 性 专 一
: Dsx 蛋白
二 笨
国力
筷 因
肉 性 分 抑制 |
化 基因 ”雄性 分
SR 志 是 次 全 | 拓 和 人
雄性 表 型 ” 肉 性 分 化 基因
肉 性 表 型 下

13-2” 果 晶体 细胞 性 别 决定 级 联 调控 通路 模式

-99 。

初始 信和 号 。

突变 分 析 表 明 ， 基 因 sex-lethal (szl! )、transformer (tra) 和 transformer2
(tra-2) 突变 可 使 XX 个 体 变 成 雄性 ， 但 这 种 突变 对 XY 雄性 个 体 无 作用 ; 基因
intersex ( 达 ) 突变 可 使 XX 果 蝇 成 为 间 性 者 ; 基因 doublesex (dsz) 在 两 种 性 别
的 分 化 过 程 中 都 起 重要 作用 ，csz 缺失 则 可 使 XX 和 XY 个 体 都 发 育成 间 性 。 那
么 这 些 基因 是 如 何在 果 蝇 体 细 胞 性 别 分 化 过 程 中 发 挥 作 用 的 呢 ? 除了 这 些 基因 )
果 蝇 体 细 胞 的 性 别 分 化 又 涉及 哪些 基因 ? 图 13-2 概括 了 果 蝇 性 别 决定 过 程 中 参
与 性 别 分 化 的 基因 的 级 联 调控 模式 。

一 、sxl 基因 一 一 果 蝇 性 别 决 定 的 枢纽

果 蝇 性 别 决定 的 第 一 阶段 涉及 X:A 的 比例 信号 ， 在 体 细胞 性 别 分 化 过 程 中 ，
X:A 比例 信号 是 通过 性 致死 基因 sex-lethal (sz ) 起 决定 作用 的 。szl 基因 有 时
期 PE 和 晚期 PL 两 个 启动 子 ，X:A 信和 号 首先 直接 作用 于 szl 基因 的 PE 启动 子 ，
在 雌性 胚胎 中 启动 szl 的 早期 转录 ，szl 基因 PE 启动 子 的 最 初 激 活 就 发 生 自 合
孢 体 宫 胚 形成 期 (受精 后 的 2h， 合 子 核 通过 12 一 13 次 快速 核 分 裂 )， sz; 基因 的
早期 功能 是 XX 且 胎 启动 肉 性 发 育 途 径 和 维持 两 个 X 染色 体 适 量 转录 水 平 所 必需
的 ， 对 体 细 胞 及 其 相应 的 剂量 补偿 过 程 来 说 ， 一 旦 这 个 遗传 开关 被 确定 ， 就 不 可
逆 地 进入 肉 性 或 雄性 发 育 模式 ， 不 再 依赖 于 X:A 比值 的 存在 。

X:A 是 细胞 自主 的 信号 ， 依 作用 的 不 同 被 分 为 “分 子 ” 和 “分 母 ” 记 数 因
素 : 所 谓 分 子 因素 就 是 那些 位 于 X 染色 体 上 的 基因 ， 增 加 它们 的 拷贝 数 会 增 大
X:A 的 比率 ， 激 活 szl 基因 ， 导 向 峻 性 化 发 育 ， 人 为 减少 它们 的 拷贝 数 则 会 降低
X:A 的 比值 ， 使 szz 无 法 激活 而 引起 雄性 化 发 育 ; 分 母 因素 指 的 是 具有 相反 效应
的 一 些 常 染色 体 基因 。

Cline (1998 年 ) 认为 sisterless-a (sis-a ) 和 sisterless-b (sis-p) 是 主要 的 两
个 分 子 基 因 ， 是 sz 的 正 调控 因子 ， 改 变 两 种 性 别 中 的 sz 基因 数量 ， 会 使 肉 性
缺乏 应 有 的 szl 活性 或 者 使 雄性 不 适当 地 激活 sx/ 。 另 一 个 分 子 因素 是 rwzz 基
因 ， 它 的 记 数 作用 要 比 szx 基因 弱 ， 在 胚胎 中 的 分 布 不 均一 ， 只 在 胚胎 的 中 央 区
影响 szl 的 激活 。

Daughterless (da ) 是 一 个 多 效应 基因 ， 参 与 多 个 发 育 过 程 ， 它 的 母 源 产物
对 szl 的 早期 表达 起 着 调控 作用 ， 在 卵 发 生 时 若 无 da 活性 ， 形 成 的 卵 在 受精 后
无 论 其 X 染 色 体 数量 如 何 ， 均 不 能 激活 szz， 缺 乏 da 并 不 影响 XY 雄性 个 体 的
发 育 ， 但 对 峻 性 个 体 是 致命 的 ， 使 32X 个 体 因 剂 量 不 适当 而 死亡 。 因 此 ， 受 精
后 ，Sisa、Sis-b、Runt 和 Da 使 szl 仅 在 峻 性 胚胎 中 转录 激活 。 另 一 个 母 本 效应
基因 是 extra macrochaetae (emc)， 与 da 的 作用 相反 ， 它 是 szl 的 一 个 负 调 控
子 ，eac 突变 对 雄性 发 育 是 不 利 的 。

“9Bc”

一 个 主要 的 分 母 因素 是 dead-pan (dzpz ) 基因 ， 它 是 一 个 母 本 效应 基因 ， 一
余 具 有 高 比例 〈sis-b:dpn) 的 雄性 个 体会 激活 szl 并 致死 ;， 相反， 具有 低 比例 的
sis-b:dpn) 雌性 个 体 将 无 法 激活 szl 并 致死 ， 这 两 种 致死 作用 均 与 szl 不 适当 的
有 咱 性 或 非 活性 状态 有 关 ， 但 与 是 否 带 有 母 本 来 源 的 dpn 多 余 拷 贝 无 关 。 另 一
分 母 因 素 是 extra maacrochr、aetae 的 基因 (emc)， 也 是 母 本 效应 基因 ， 其 编码
的 蛋白 与 da 竞争 szl! 启动 子 结合 位 点 ， 但 与 da 的 作用 相反 ， 它 是 szi 的 一 个 负
调控 子 ，ezc 的 突变 对 雄性 有 害 。

上 述 这 些 基 因 ， 都 参与 基因 转录 的 调节 ， 所 谓 X:A 信和 号 比例 实质 上 就 是 激
活 和 抑制 szz 转录 的 调控 蛋白 的 比例 ， 由 这 一 比例 决定 szl 的 开 和 关 及 维持 表达
水 平 ， 从 而 决定 性 别 的 发 育 。

二 、sxl 功能 的 维持

szl 的 早期 启动 子 PE 仅 在 胚胎 发 育 极 早 期 的 瞬间 转录 过 程 中 起 作用 ，szl 基
因 早 期 的 转录 和 表达 模式 均 为 雌性 专 一 ， 此 阶段 的 调控 发 生 在 转录 水 平 。szl 开
始 转录 后 不 久 ， 晚 期 启动 子 PL 就 被 激活 ，szl 进入 RNA 剪接 水 平 的 调控 。PL
位 于 PE 上 游 Skb 处 ， 在 两 种 性 别 中 均 被 激活 ， 并 贯穿 随后 的 发 育 过 程 ， 呈 组 成
型 表达 。 对 sxl mRNA 的 cDNA 的 分 析 结 果 表 明 ， 因 mRNA 差异 性 剪接 ， 雌 雄
两 性 的 sxl mRNA 并 不 相同 ， 在 峻 性 中 ，Sxl 蛋白 可 与 自身 的 前 体 mRNA 结合 ，
并 将 其 按 雌 性 方式 剪接 为 成 熟 mRNA， 编 码 一 个 含 354 个 氨基 酸 的 蛋白 质 ， 该
蛋 自 质 与 峻 性 特异 的 szl 早期 转录 产物 相同 或 相近 ， 而 在 雄性 个 体 中 ， 南 于 缺 和
初始 的 Sxl 蛋白 ， 新 的 szl! 初级 转录 物 按 雄性 方式 进行 剪接 ，RNA 的 差异 剪接 使
该 终止 子 包含 和 信雄 性 特异 mRNA 中 ， 因 此 雄性 特异 的 转录 物 在 48 位 氨基 酸 后 有
一 终止 密码 子 (UGA)， 从 而 产生 一 个 没有 功能 的 雄性 sxl RNA。 在 雄性 个 体 中 ，
通过 剪接 产生 的 雄性 sxl RNA 包含 3 个 外 显 子 ， 其 中 终止 密码 子 位 于 中 间 外 显 子
中 ， 而 在 肉 性 个 体 中 ，RNA 剪接 只 产生 2 个 外 显 子 ， 因 为 雄性 特异 的 中 间 外 显
子 作为 一 个 大 的 内 含 子 被 剪接 掉 。

因此 ， 可 以 说 Sxl 蛋白 的 表达 始终 是 雌性 专 一 的 ， 只 有 在 雌性 个 体 中 ，PL
的 转录 物 才 被 剪接 成 能 产生 有 功能 的 Sxl 蛋白 的 mRNA， 这 一 过 程 由 一 个 包括
Sxl 蛋白 〈 早 期 或 晚期 ) 的 正 反 馈 作用 在 内 的 自动 调节 机 制 所 控制 。
直 构 上 包含 2 个 含 90 个 氨基 酸 的 RNA 识别 域 (RRM)， 这 是
A 结 合 蛋白 的 特 ， 。 体 外 研究 也 显示 szl 编码 的 RNA 结合 蛋白 〈 即 Sxl
or 和 两 个 靶 目 标 结合 : 一 个 结合 靶 目 标 是 转化 子 基 因 tra; 另 一 个 结合 靶 目
标 是 szl 前 mRNA， 通过 这 种 结合 合作 用 ，Sxl 蛋白 可 阻止 利用 雄性 特异 外 显 子 的
剪接 位 点 ， 导 致 肉 性 发 育 途 径 。
szl 基因 产物 除了 自我 调控 外 ， 一 个 更 重要 的 作用 是 调节 下 游 的 性 别 分 化 基
SI9

因 。 在 体 细 胞 中 ， 这 些 基 因 依 次 是 trae、tra-2、dsz 和 这 。

此 外 还 有 几 个 基因 是 雌性 个 体 中 维持 szl 基因 正常 表达 所 需 的 ， 如 femalE
lethal-2d [A(2)d] 基 因 ， 它 是 一 个 母性 效应 基因 ， 一 旦 发 生 突变 ， 会 影响 s 允 晚
期 转录 物 的 雌性 化 剪接 ， 其 他 的 还 有 pz [又 称 sans fille (sp)] 和 viriliz 评
(zwr) 基因 。 肉 性 个 体 中 ， 这 些 基 因 中 的 任何 一 个 突变 都 将 使 szl 因 不 能 维持 其
高 水 平 表达 而 无 法 扮演 它 在 峻 性 发 育 中 的 多 重 角色 。

三 、 性 别 分 化 调控 途径 中 的 靶 基 因

位 于 dsz 下 游 的 是 体 细胞 性 别 分 化 的 末端 基因 ， 它 们 在 两 性 中 的 差异 表达
确立 了 成 虫 果 蝇 性 别 的 二 态 性 。 果 蝇 中 很 多 蛋白 质 仅 在 一 种 性 别 中 存在 ， 如 峻 性
个 体 中 的 卵黄 和 蛋白 和 卵 壳 蛋 白 ， dsz 对 这 些 靶 结构 基因 的 调控 可 能 是 在 转录 水 平
上 进行 的 。 研 究 表明 ，dsz 的 雌雄 两 种 转录 物 在 卵黄 蛋白 基因 127bp 的 增强 子 内
有 3 个 结合 位 点 ， 雄 性 特异 产物 与 这 些 位 点 结合 ， 阻 止 卵黄 蛋白 的 转录 ， 而 雌性
特异 蛋白 通过 与 这 些 位 点 结合 并 激活 转录 。 除 了 阻碍 峻 性 特异 基因 产物 和 咒 官 的
产生 ， 雄 性 Dsx 蛋白 还 可 能 促进 雄性 性 梨 的 分 化 。

性 别 决定 基因 的 温度 敏感 型 突变 株 有 助 于 研究 者 了 解 特 定 基因 对 性 别 诀 定 开
关 敏 感 的 确切 时 间 。 当 注入 tra2 基因 的 温度 敏感 等 位 基因 (temperature-sensi
tive，ts) 时 ， 果 晶 性 别 发 育 途 径 从 幼虫 晚期 到 成 虫 期 都 处 于 有 活性 状态 。z7ra 和 5
基因 为 温度 敏感 等 位 基因 ， 在 许可 温度 (低温 ) 下 表达 雌性 表 型 ， 而 在 非 许 可 温 ”
度 (高 温 ) 下 表达 雄性 表 型 。 在 幼虫 晚期 和 化 晴 期 ， 将 温度 从 许可 温度 提升 至 非
许可 温度 时 ，XX 幼虫 和 晴 发 育成 雄性 。 当 成 虫 突变 体 在 低温 饲养 ， 成 虫 的 脂肪
体 将 生成 卵黄 蛋白 ， 并 进入 卵子 。 而 当 此 成 虫 突变 体 在 高 温 下 饲养 ， 卵 黄 蛋 白 基
因 的 表达 将 停止 。

三 丰 ”光滑 爪 蟾 豚 中 组 织 和 轴 的 发 育

卵 母 细胞 的 动物 -植物 极 形 成 归 因 于 在 两 个 半球 中 缺失 不 同 的 母体 效应 基因 。
精子 进入 卵子 后 ， 通 过 引起 细胞 质 的 重 排 而 打破 原 有 的 辐射 对 称 模式 ， 使 胚胎 形
背 腹 极 性 ， 同 时 激活 一 些 植物 极 细 胞 中 的 背部 化 决定 因子 (dorsolizing
determinant)， 如 碱 性 成 纤维 细胞 生长 因子 (basic fibroblast growth factor，bDEGF，
附着 于 植物 半球 的 外 皮 ， 和 刺激 赤道 细胞 分 化 成 中 胚层 ) 和 头 和 蛋白 〈 当 它 与 动物 极
细胞 质 接 触 时 ， 其 母 本 mRNA 表达 ， 产 生 的 头 蛋 日 位 于 灰 新 月 下 面 )， 这 些 背 部
化 的 植物 极 细胞 被 称 为 Nieuwkoop 中 心 (Nieuwkoop center)。Nieuwkoop 中 心 表
达 vgl RNA ( 专 一 的 与 植物 极 外 皮 相 关 )。vgl RNA 编码 大 量 的 转化 生长 因子
(transforming growth factor，TGF) 家 族 ， 可 能 是 光滑 爪 蟾 信号 蛋白 之 一 。 另

一

外 ， 头 蛋白 影响 位 于 赤道 〈 即 灰 新 月 所 处 的 位 置 ) 邻近 的 细胞 ， 形 成 Spemann
组 织 者 (organizer)。Spemann 组 织 者 刺激 原 肠 胚 形成 并 定位 于 胚 孔 的 背 唇 。

在 吉 豚 $ 一 7h 之 间 ， 赤 道 细 胞 已 分 化 成 赤道 中 豚 层 和 Spemann 组 织 者 。 产
生 于 Nieuwkoop 中 心 的 头 蛋 白 被 认为 可 诱导 Spemann 组 织 者 中 属于 转化 因子
(TGF) 家 族 至 少 两 种 蛋白 质 的 合成 。 蛋 白质 Xwnt 和 活化 素 B (activin B) 合成
于 Spemann 组 织 者 。

高 浓度 的 Xwnt 蛋 日 质 促进 原 肠 胚 形 成 中 背 侧 中 胚层 的 发 育 ， 由 植物 极 产生
的 bFGF 在 中 胚层 组 织 的 发 育 中 尤为 重要 。bFGF 和 活化 素 B (由 Spemann 组 织
者 产生 ) 的 梯度 共同 产生 了 大 量 的 不 同 中 胚层 组 织 ， 有 助 于 确定 腹 背 轴 。 在 植物
极 中 ， 由 高 浓度 骨 形 态 发 生 和 蛋白 (bone morphogenetic protein-4，BMP-4)，bFGF
和 BMP-4 刺激 腹 侧 中 胚层 的 发 育 。BMP-4 是 生长 因子 TGF-B 家 族 的 成 员 。 生 长
因子 〈 以 合成 的 顺序 编号 ) 和 产生 生长 因子 的 组 织 (VV、VD、Mv、SO 等 ) 发
育 之 间 的 关系 简要 概括 如 图 13-3。

活化 素 B 可 诱导 原 肠 胚 形 成 和 建立 前 后 轴 与 腹 背 轴 ， 将 活化 素 B 的 mRNA
注射 到 动物 极 或 植物 极 可 诱导 不 完整 的 第 二 个 胚 。

原 肠 入 口 处 〈 原 始 肠 道 的 腔 ) 高 浓度 的 Xwnt 和 活化 素 B 在 该 区 域 促 进 尾 的
形成 ， 可 能 与 原 肠 入 口 处 高 浓度 的 活化 素 能 够 刺激 一 种 尾 发 育 所 需 蛋 白质 短 尾
(brachyury) 的 产生 有 关 。 而 低 涤 度 的 这 些 蛋 白质 扩散 到 豚 更 远 的 区 域 ， 刺 激 称
为 Gossecoid (Ged) 的 蛋白 质 产生 ， 该 蛋白 质 所 在 区 域 将 变 成 头 。

Bcatenaza 是 一 种 母 本 效应 基因 ， 是 Nieuwkoop 中 心 的 一 个 主要 细胞 因子 ，
其 编码 的 蛋白 质 BCatenin 是 一 种 多 功能 蛋白 ， 既 能 锚 定 细胞 膜 上 的 钙 黏 蛋白 ，
又 是 个 核 内 转录 因子 。 在 爪 蟾 有 凸 胎 发 育 中 B-Catenin 在 预定 豚 胎 背部 的 积累 最 初
开始 于 受精 时 卵 质 的 旋转 移动 过 程 。 在 整个 早期 卵 裂 阶段 BCatenin 继续 积累 ，
主要 位 置 仍然 在 有 推 胎 背 部 〈 图 13-4)， 同 时 在 背部 细胞 的 核 仁 中 也 能 检测 到 B-
Catenin。B-Catenin 开始 存在 的 区 域 包括 Nieuwkoop 中 心 和 组 织 者 区 ， 但 是 到 卵
裂 晚 期 只 存在 于 Nieuwkoop 中 心 的 细胞 中 。

p-Catenin 对 于 形成 背部 结构 是 必需 的 ， 如 用 反 义 寡 核 苷 酸 消耗 BCatenin 的
转录 产物 ， 将 引起 背部 结构 的 缺失 。 而 将 外 源 性 BCatenin 注射 进 正 常 且 胎 的 腹
侧 可 诱导 次 生 胚 轴 产 生 。GSK-3 在 胚 轴 的 形成 中 也 起 着 非常 重要 的 作用 ， 者 在
豚 胎 细胞 期 注射 具有 活性 的 GSK-3， 以 后 胚 发 育 将 受到 抑制 ; 若 在 早期 豚 胎 发
育 阶段 用 具有 极 强 副 作用 的 蛋白 质 抑 制 腹 侧 细胞 GSK-3 的 活性 ， 可 引起 次 生 胚
轴 形 成 。 糖 原 合成 激酶 -3 (GSK-3) 对 8-Cateniz 有 负 调控 作 用 ， 进 而 对 于 背 侧
细胞 分 化 起 抑制 作用 ， 这 是 因为 开始 在 整个 胚胎 中 均 分 布 有 BCatenin， 在 腹 侧
细胞 中 由 于 GSK-3 介 导 的 磷酸 化 作用 而 特异 降解 ， 而 在 背 侧 细胞 中 由 于 存在
GSK-3 的 抑制 子 Disheveled (Dsh) 蛋白 ， 所 以 B-Catenin 不 会 降解 。DW 是 参与
背 侧 发 育 的 另 一 个 基因 ，Dsh 蛋白 开始 存在 于 爪 昌 未 受精 卵 植 物 半 球 的 皮质 部 ，

38i

(a) 卵 母 细胞 (Cb) 合子 动物 极

侧 视 图

(c) 囊 胚

前 后 轴

<

腹 背 轴

图 13-3 ”两 栖 动物 中 控制 组 织 发 育 的 信和 号
(a) 两 栖 动物 卵 母 细胞 有 由 两 个 半球 不 同 成 分 确定 的 动物 -植物 轴 。(b) 卵 母 细胞 受精 触发 了 外 皮 和 和 与
细胞 质 相 关联 的 胞 膜 的 旋转 ， 产 生 了 灰 新 月 。 腹 植物 极 〈(VV) 和 腹 背 区 (VD) 起 始 表达 不 同 信和 号 肽 。
从 这 些 区 域 引 出 的 箭头 表示 了 生长 因子 向 overlying 区 域 的 扩散 。 箭 头 旁 边 的 数字 表示 生长 因子 合成 大
致 的 顺序 。(c) VV 区 的 细胞 产生 碱 性 成 纤维 生成 因子 (bFGF) 一 一 第 一 信号 ; VD 区 (Nieuwkoop 中
心 ) 的 细胞 产生 肽 段 头 蛋白 (Nog) 和 转化 生长 因子 (Xwnt) 一 一 第 二 信号 。 腹 侧 中 胚层 (Mv)》 由
bFGF 诱导 ， 而 Nog 和 Xwnt 诱导 Spemann 组 织 者 〈(Spemann organizet，SO) 的 发 育 和 原 肠 胚 形 成 的 起
始 ; 〈d) 远 端 豚 孔 唇 的 Spemann 组 织 者 产生 肽 段 活化 素 B 和 Xwnt， 诱 导 中 胚层 的 间 介 型 (Md、Mi 和
Mii) 一 一 第 三 信号 : 〈e) Spemann 组 织 者 还 建立 了 胚 的 腹 背 轴 和 前 后 轴 。 中 胚层 和 内 胚层 被 另 一 个 称
为 骨 形 态 发 生 蛋 白 (BMP-4) 一 一 第 四 信和 号 的 转化 生长 因子 (由 VV 区 产生 ) 影响 。goosecoid 一 一 第 五
信和 号 一 一 在 豚 的 前 区 最 大 表达 ， 短 尾 一 一 第 六 信号 一 一 主要 在 生物 体 的 后 部 产生 。

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图 13-4 两栖 类 背 - 腹 轴 的 形成 从 精子 入 卵 时 开始 ，
DSH，B-Catenin 和 GSK-3 在 背 - 腹 轴 形成 中 具有 重要 作用

3 中。

在 受精 时 Dsh 蛋白 沿 微 管束 迁移 到 豚 胎 的 背 侧 起 作用 。

由 于 BCatenin 是 转录 因子 ， 它 可 以 与 其 他 转录 因子 结合 并 赋予 后 者 新 的 特
征 。 如 爪 蟾 B-Catenin 与 一 种 普遍 存在 的 转录 因子 TCF3 结合 ， 形 成 的 BCatenin/
TCF3 复合 物 能 够 与 对 肘 轴 形成 具有 重要 作用 的 其 他 几 个 基因 的 启动 子 结合 并 激
活 他 们 的 转录 。 被 激活 的 基因 中 也 包括 siamois (ss) 基因 ， 该 基因 于 圳 豚 中 期
转换 后 立即 在 Nieuwkoop 中 心 表 达 。TCF3 是 sms 基因 转录 的 抑制 因子 ， 但 当
BCateninVTCF3 复 合 物 与 ss 基因 的 启动 子 结合 时 可 使 swzs 基因 激活 。ss 基因
编码 的 蛋白 Sms 在 组 织 者 特异 性 基因 的 表达 中 起 着 关键 性 的 作用 。Sms 能 与 gcd
基因 的 启动 子 结合 并 激活 该 基因 表达 ， 其 蛋白 质 产物 Gcd 又 为 Spenmann 组 织 者
许多 基因 的 激活 所 必需 。 存 在 于 组 织 者 细胞 中 的 gca 基因 是 Nieuwkoop 中 心 分
泥 蛋 白 因子 作用 的 主要 丢 基 因 之 一 。gcd mRNA 表达 的 区 域 与 组 织 者 的 范围 有
关 。 如 果 用 氧化 锂 处 理 原 肠 期 以 前 的 豚 胎 可 引起 组 织 者 中 豚 层 的 范围 扩大 到 整个
边缘 带 ，gcd 基因 的 表达 区 域 也 同样 被 扩大 。 与 此 相反 ， 如 果 在 第 一 次 卵 裂 前 用
紫外 线 照 射 使 豚 胎 发 育 缺 乏 背 部 和 前 端的 诱导 ，gcd 基因 的 表达 也 受到 抑制 。 移
植 实验 进 一 步 表 明 注射 标记 gca 基因 的 供 体 细胞 能 够 支配 邻近 寄主 细胞 形成 背
轴 。Gcd 是 一 种 DNA 结合 蛋白 ， 具 有 激活 胚 孔 背 唇 细胞 迁移 的 属性 ， 能 够 激活
控制 脑 形成 的 关键 基因 Xoxz2， 使 后 者 在 前 端 中 胚层 和 预定 脑 外 胚 层 中 表达 。

除 swas 的 作用 之 外 ，gcda 基因 的 激活 也 受到 定位 于 植物 半球 和 Nieuwkoop 中
心 的 TGF-8 基 因 家 族 和 蛋白 产物 的 协同 作用 ， 这 些 蛋 白质 由 内 胚层 合成 ， 包 括
Vgl，VegT 和 Nodal- 相 关 基 因 编 码 蛋白 。 他 们 中 最 重要 的 是 Nodal- 相 关 和 蛋白 ， 在
圳 豚 晚 期 有 三 种 Nodal- 相 关 和 蛋白: Xnrl，Xnr2 和 Xnr4， 在 内 胚层 中 Nodal- 相 关
基因 的 表达 从 背 侧 到 腹 侧 呈 一 定 的 浓度 梯度 分 布 。 这 种 浓度 梯度 是 由 于 定位 于 背
侧 的 BCatenin 与 定位 于 植物 极 的 Vgl，Vegt 信和 号 相互 作用 的 结果 。Nodal- 相 关 和 蛋
自 的 浓度 梯度 使 中 胚层 细胞 分 化 ， 含 有 大 量 Nodal- 相 关 和 蛋白 的 中 胚层 细胞 分 化 成
组 织 者 ， 含 有 较 少 Nodal- 相 关 和 蛋白 的 中 豚 层 细胞 分 化 成 侧 板 中 胚层 ， 不 含 Nodal-
相关 和 蛋白 或 含量 极 低 的 中 豚 层 细胞 分 化 成 腹 侧 中 胚层 。

综 上 所 述 ， 为 维持 正常 的 发 育 在 胚胎 背部 细胞 中 必须 含有 B-Catenin， 并 使
5115 基因 表达 ，Sms 与 TCF- 基 因 家 族 的 蛋白 产物 协同 作用 使 gcd 基因 激活 ， 在
Sms 和 Gecd 等 共同 作用 下 才能 形成 组 织 者 。 组 织 者 的 形成 涉及 多 种 基因 的 激活 ，
存在 于 Nieuwkoop 中 心 的 分 泌 和 蛋白 激活 位 于 其 上 方 中 胚层 细胞 中 一 系列 转录 因
子 ， 后 者 再 激活 编码 组 织 者 分 泌 产 物 的 一 些 基 因 。 目 前 已 经 发 现 多 种 组 织 者 特异
性 转录 因子 和 分 泌 性 蛋白 因子 。

第 四 节 ” 哺乳 类 体 轴 建 立 的 基因 调控

最 近 的 研究 发 现 ， 哺 乳 类 和 人 类 受精 卵 中 极 体 的 位 置 几 乎 总 是 与 私 胎 内 细胞
383 ，

团 (ICM) 的 宫 胚 腔 表 面 定位 在 一 条 线 上 ， 且 在 卵 裂 过 程 中 这 些 蛋 自 被 分 离 到 滋
豚 层 中 而 不 是 ICM 细胞 中 。 这 意味 着 ， 哺 乳 动 物 卵 子 的 极 性 确实 影响 到 胎 体 的
模式 形成 ， 且 很 可 能 影响 胚胎 本 身 。

一 、 参 与 背 腹 轴 和 前 后 轴 形 成 的 基因

小 鼠 在 原 肠 作 用 开始 前 12h， 位 于 上 胚层 前 部 约 1X3 处 的 前 部 肠 内 胚层
(AVE) 的 中 央 部 分 有 VE-1 抗原 的 出 现 ， 还 有 一 些 基 因 的 表达 ， 如 o 友 2
1izz1 、gcd 、cerberus-related-l 及 jer。 原 条 形成 时 ，AVE 的 最 前 端 ， 将 来 发 育
为 心脏 的 地 方 ， 开 始 表达 mrgl1。 在 AVE 稍 后 一 点 ， 即 覆盖 着 将 来 形成 口 部 外
豚 层 和 前 胸 的 上 胚层 的 AVE 区 域 ， 有 jpesz-1l 的 表达 。

许多 在 AVE 中 表达 后 ， 并 在 上 胚层 衍生 物 中 表达 的 基因 发 生 突变 ， 将 会 影
响 前 部 发 育 。 例 如 ， 在 otx2-/- 胚 胎 中 ， 当 卵 还 呈 圆 柱 形 的 阶段 ， 上 胚层 后 端的
定向 似乎 是 正常 的 ， 但 肠 内 胚层 却 在 远 端 ， 最 后 导致 豚 胎 没有 中 脑 和 前 胸 。

当 将 野生 型 有 乓 胎 干细胞 加 入 otx2-/- 桑 划 胚 细胞 组 成 谋 合 体 时 ， 尽 管 上 胚层
可 以 突变 型 或 野生 型 的 形式 存在 ， 但 不 开始 前 部 的 发 育 。 当 用 cotx2-/- 胚 胎 干 细
胞 加 野生 型 桑 车 胚 细胞 组 成 嵌 合 体 时 ， 将 会 产生 以 突变 型 为 主要 特征 的 上 胚层 ，
前 部 的 发 育 可 以 正确 地 开始 ， 但 不 能 维持 。 因 此 ， 在 且 外 组 织 ， 可 能 在 它 表 达 的
肠 内 胚层 中 ， 前 部 模式 形成 正 要 开始 时 ，otx2 的 功能 似乎 是 必需 的 。

最 近 的 研究 发 现 ， 小 鼠 cripto 基因 的 突变 体 不 能 使 肠 内 胚层 和 上 胚层 正确
定向 ，AVE 的 标志 物 和 前 部 外 胚层 的 标记 物 ， 如 hesz-1 基因 却 定位 于 远 端 ， 应
该 位 于 后 部 的 胚 外 中 胚层 标记 却 位 于 前 端 。Cripto 蛋 白 是 激活 MAOK 途径 的 一
个 信号 分 子 ， 在 斑马 鱼 中 ，one-eyed pinhead 基因 产物 也 是 属于 这 一 家 族 ， 该 基
因 的 突变 会 导致 头 部 发 育 的 缺陷 和 独眼 畸形 。 在 小 鼠 肘 胎 中 ，crizzo 基因 开始 在
上 胚层 中 表达 ， 但 在 原 肠 作 用 前 ， 其 转录 本 仅 限 于 上 胚层 的 近 端 边缘 区 ， 此 处 将
产生 原 条 。

哺乳 动物 类 似 于 两 栖 类 胚 孔 唇 的 位 置 是 其 原 条 前 端的 享 氏 结 。 哺 乳 动 物 的 享
氏 结 包括 许多 在 蛙 组 织 者 中 发 现 的 蛋白 质 ， 如 Gecd，Nodal，Lim-1 和 Hnf38 等 。
nodal 基因 对 原 条 的 起 始 发 育 和 维持 发 育 是 必需 的 。 在 原 肠 开 始 处 ， 即 腹部 区 域
首先 看 到 zxoda; 基因 的 表达 ， 此 后 在 原 条 的 最 前 端 发 现 Nodal 蛋白 ， 当 这 个 基因
被 剔除 时 ， 发 育 中 的 且 胎 将 缺失 原 条 ， 且 不 能 进行 原 肠 作用 。 在 原 肠 后 期 ，
nocdal 基因 的 表达 对 胚胎 左右 轴 的 形成 很 重要 。

当 形 成 原 条 的 细胞 聚集 成 灸 形 时 ， 可 在 这 些 细胞 中 发 现 gcd mRNA， 此 后 当
原 条 向 前 移动 时 ， 又 在 亨氏 结 处 发 现 gcd mRNA。 但 当 享 氏 结 退化 时 ， 就 像 在 两
栖 类 中 的 一 样 ， 能 表达 gcd 的 细胞 保存 在 头 部 中 胚层 和 咽 部 内 胚层 ( 关 索 前 板 )
中 。 当 头 部 形成 时 ， 在 最 前 端的 细胞 有 sgcda 的 表达 。 很 明显 ， 它 的 表达 对 于 激

.384 ，

由 活 与 头 部 形成 有 关 的 基因 起 着 关键 性 的 作用 。 如 果 鼠 胚胎 中 缺失 gca 基因 ， 可

以 形成 正常 的 体 轴 ， 但 不 能 形成 头 部 。

Ged、Lim-1 和 Hnf38 蛋白 对 于 特 化 前 背部 中 胚层 的 细胞 是 必需 的 ， 而 中 间
和 后 面 背部 胚 轴 是 由 BrAchyury (T) 蛋白 特 化 的 。 兰 索 的 形成 和 分 化 要 求 有 工
基因 的 表达 ，TT 基因 的 突变 引起 后 部 豚 轴 的 畸形 。 最 近 的 研究 表明 ， 哺 乳 动 物
前 后 轴 的 特 化 也 是 由 包含 同 源 异 型 盒 的 基因 来 完成 的 。

蝇 类 和 哺乳 类 动物 不 仅 有 相同 的 同 源 异 型 基因 的 基本 类 型 ， 而 且 这 些 基因 在
各 自 染 色 体 上 的 顺序 也 非常 相似 ， 甚 至 这 些 基 因 的 表达 形式 也 遵循 相同 的 规律 。
小 饼 和 人 类 基因 组 在 每 个 单 倍 体 上 包含 4 个 拷贝 的 hom-C (小 鼠 中 是 hox A 一 D，
人 类 是 hox A 一 D)。 一 些 哺乳 类 动物 的 基因 (类 似 于 果 晶 的 lab、Proboscipedia 和
Deformed) 在 前 端 表 达 ， 另 一 些 基因 (类 似 于 果 蝇 Abdominal-B) 在 后 端 表 达 。
由 于 果 蝇 hoxz-C 和 哺乳 动物 hoz 基因 没有 一 一 对 应 ， 所 以 在 这 两 类 动物 开始 趋
异 分 化 时 可 能 发 生 了 独立 的 基因 重复 。

二 、 左 右 轴 形成 的 基因 调控

在 小 鼠 中 ，inversus viscerum (〈( 妈 ) 基因 突变 导致 心脏 和 体位 随机 分 布 ， 相
反哺 乳 动 物 inversus of embryonic turning (inzzo) 基因 的 纯 合 突变 使 得 胚胎 体位 完
全 反 转 。 遗 传 控制 左右 分 化 的 途径 是 在 不 同 水 平 、 不 同 级 别 等 方面 经 过 强加 的 干
扰 、 精 细 的 平衡 才 造成 最 后 的 体位 。 早 期 的 干扰 可 使 全 部 体位 随机 化 或 反 转 ， 而
晚期 的 干扰 仅 改 变 一 些 器 官 。 人 类 不 动 纤 毛 综合 征 (immotile cilia syndrome，
ICS) 导致 整个 体位 的 随机 分 布 ， 表 明 在 发 育 早 期 有 负责 分 化 左右 轴 的 基因 激
活 ，ICS 是 由 于 与 微 管 有 关 的 动力 蛋 日 发 生 突变 而 引起 的 。 在 原先 iwWiv 品系 的
鼠 中 ， 这 种 突变 在 运动 区 的 高 保守 区 引起 一 个 氨基 酸 的 变化 ， 因 此 这 个 基因 现在
称 为 left-right dynein (zz )。Lrd 也 定位 在 与 基因 捅 入 突变 legless 有 关 的 600kb
的 缺失 区 ，legless (1g!) 是 zo 的 等 位 基因 。 纯 合 的 je: 突变 体 没有 Za， 且 也 表
现 出 体位 随机 分 布 的 特性 。 哺 乳 动 物 左 右 轴 的 随机 化 可 能 由 于 细胞 间 运 动 的 缺
失 ， 这 与 分 子 的 不 对 称 运动 是 启动 左右 轴 特 化 的 关键 这 个 观点 是 一 致 的 。

在 鼠 中 ，?zoda;: 在 左边 侧 板 中 胚层 (LPM) 表达 ， 但 其 行为 似乎 与 两 个
TGFB 家 族 的 新 成 员 /efiy1l 和 efzv2 一 致 。 在 非常 早 的 体 节 期 ， 所 有 3 个 信和 号
分 子 仅 在 胚胎 左边 的 细胞 群 中 被 诱导 表达 。/ejzyl 在 左边 底板 的 5 个 细胞 中 大
量 表达 ， 而 zoda! 和 ,efty2 在 预定 腹部 体 壁 的 左边 侧 板 中 胚层 同时 表达 。 而 在
蛙 类 、 鸡 和 鼠 中 ， 在 LPM 发 现 nodal 之 后 不 久 ， 就 发 现 titz-2 的 表达 ，Ztz-2
的 表达 区 域 比 noda: 的 大 ， 包 括 左 边 的 LMP， 持 续 时 间 长 ， 而 且 对 发 展 中 的 中
肠管 和 心脏 左 侧 也 有 作用 。

二

第 五 节 ” 拟 南 价 花 的 发 育 调控

高 等 植物 中 花 的 形成 经 历 两 个 阶段 : 先是 营养 顶端 和 腋生 分 生 组 织 转变 成 花
分 生 组 织 ， 然 后 再 发 育成 花 。 控 制 营 养 组织 回 花 分 生 组 织 分 化 的 基因 主要 有
leafy (及 ) 、apetala-1 (ap1) 和 cauliflower (ca )。Lfy 诱导 产生 Ap-1 和 Cal
这 后 两 种 蛋白 可 使 营养 顶端 和 腋生 分 生 组 织 转化 为 花 分 生 组 织 。 由 花 分 生 组 织 开
台 的 花 发 育 依赖 于 像 动物 中 同 源 异 型 基因 那样 的 基因 ， 包 括 a 思 2、o 恩 3 和
agamous (ag)， 这 些 植物 同 源 异型 基因 的 突变 产生 异 位 (ectopia) 的 花 组 织 。

一 条 典型 的 花 由 四 个 从 中 心 回 外 的 同心 环 组 织 构成 : 心 皮 (封闭 胚珠 )、 雄
入 (产生 花粉 )、 花 瓣 [吸引 传粉 者 〈pollinator)， 供 传粉 者 附着 ] 和 划 片 〈 保 护
花 在 芽 中 的 部 分 )。 同 源 异 型 基因 ag 在 花 分 生 组 织 的 中 心 表 达 并 影响 心 皮 (中
心 环 ) 和 雄 营 〈 自 中 心 的 第 二 环 ) 的 发 育 ，ag 突变 可 阻止 心 皮 和 雄 和 的 发 育 以
及 配子 的 产生 ， 这 样 花 组 织 虽然 发 育 了 ， 但 葛 片 代替 了 心 皮 在 中 心 的 位 置 ， 花 为
代替 了 雄蕊 的 位 置 。

同 源 异 型 基因 at-2 在 两 个 外 轮 生体 中 表达 ， 并 且 它 可 影响 花瓣 〈 自 中 心 阿
外 的 第 3 轮 生 体 ) 得 片 〈 自 中 心 向 外 的 第 四 轮 生 体 ) 的 发 育 。az2 突变 可 阻
碍 花 准 和 葛 片 的 发 育 ， 该 花瓣 将 被 另外 的 雄 蓉 所 取代 ， 而 苯 片 则 被 心 皮 所 取代 。

实验 表明 上 述 两 个 同 源 异 型 基因 产物 Ag 和 Ap-2 彼此 之 间 互 相 限 制 二 者 在
花 分 生 组 织 中 表达 的 区 域 ， 就 如 同 果 蝇 的 缺口 基因 彼此 限制 表达 一 样 (图 13-5)。
如 果 这 两 个 同 产 异型 基因 中 的 一 个 丢失 ， 另 一 个 基因 的 表达 就 会 遍及 整个 伦 ， 并

图 13-5 ”长 日 对 拟 南 芥 成 花 诱 导 过 程 中 基因 表达 的 影响

省

引起 环 沿 着 不 同 的 方向 发 育 。 遗 传 学 实验 和 DNA 结合 区 的 发 现 表明 Ap-2 是 ag
的 转录 抑制 因子 ， 而 Ag 是 a 轧 2 的 转录 抑制 因子 。

另 一 个 同 源 异 型 基因 at-3 的 表达 被 限制 在 两 个 中 心 环 发 育 的 区 域 。 基 因
superman 的 产物 使 sz-3 保持 在 中 心 环 之 外 ， 可 能 还 有 其 他 基因 限制 az-3 在 花边
缘 的 表达 。Azp-3 和 azp-2 都 是 花瓣 发 育 所 必须 的 ，az3 突变 导致 更 片 蔡 代 花 瘀 ;
雄 蓉 的 发 育 依赖 于 a 思 3 和 ag，c 轧 3 突变 导致 心 皮 替 代 雄 蕊 。

高 等 植物 成 花 过 程 是 一 个 极其 复杂 的 生理 过 程 ， 受 植物 内 部 生长 状态 和 外 界
环境 因子 不 同方 式 和 程度 的 影响 ， 那 么 ， 控 制 花 发 育 的 基因 在 花形 成 过 程 中 是 如
何 发 挥 作用 的 呢 ?

从 营养 型 分 生 组 织 转化 为 生殖 型 分 生 组 织 的 发 育 过 程 中 ， 基 因 Z 户 和 a 记 1
起 到 关键 性 的 调控 作用 ， 其 他 的 一 些 基 因 如 cl 、azt-2 、xv 万 等 可 能 通过 调节 / 户
和 wa 轧 1 而 间接 发 挥 作 用 。co、exj 和 8 则 为 成 花 计 时 基因 ， 它 们 在 植物 器 官 中
的 表达 具有 数量 效应 ， 只 有 达到 某 个 域 值 后 ， 才 能 导致 特异 性 基因 的 表达 。 当 控
制 开 花 时 间 的 基因 co 的 表达 增加 到 一 定 的 限度 时 ，?z 思 基因 的 表达 随 co 表达 的
提高 而 提高 ; 而 a 思 1 的 表达 只 在 有 Ld 存 在 的 条 件 下 提高 ， 这 说 明 co 基因 的 表
达 在 Z 扩 和 ao 轧 1 之 前 ， 且 前 者 可 诱导 后 者 的 表达 ， 但 是 az1 的 表达 还 需要 有 和 蛋
自 质 Ld 的 存在 。Co 蛋白 可 正 调控 大 基因 ， 后 者 可 能 处 于 与 / 户 基因 无 关 的 另
一 条 调控 路 径 上 ，Pww 处 在 大 的 下 游 ， 这 两 个 基因 可 同时 被 Co 激活 ， 并 通过 不
同 的 调控 路 径 激 活 花 器 官 特异 基因 的 表达 ， 另 外 ， 太 也 能 被 Co 诱导 。 通 过 序
列 分 析 发 现 ， 产 、 压 与 哺乳 动物 中 的 zc 有 较 高 的 同 源 性 ，Hncp 是 一 种 膜 相
关 和 蛋白， 通过 剪 切 形成 游离 肽 ， 起 到 信和 号 传递 作用 。 因 此 ，tft 可 能 通过 蛋白 质 相
互 作用 而 改变 其 他 基因 的 转录 活性 ， 导 致 不 同 的 基因 被 转录 。 在 侧 生 分 生 组 织 发
育成 生殖 分 生 组 织 的 过 程 中 ， 花 原 基 特 异性 基因 ;及 、azt-1 和 cal 的 相互 协作 有
重要 作用 。az1L 至 少 通过 两 条 途径 被 激活 ， 通 过 原 位 杂交 分 析 得 知 ， 在 花 分 生
时 期 ，az1I 的 早期 转录 是 由 12 轧 激 活 的 ; 而 在 花 器 官 形成 阶段 ，atp-1l 的 表达 在
数量 上 依赖 于 / 久 ， 说 明 oa 户 1 的 表达 可 能 是 由 z 轧 间接 调控 的 。 而 在 花 器 官 转变
之 前 或 其 他 营养 组 织 中 即使 7 访 表 达 ， 也 不 能 导致 * 轧 1 的 表达 ， 可 见 cp1 的 转
录 激 活 是 发 生 在 适当 的 时 间 、 空 间 ， 可 能 是 多 蛋白 质 复合 体 相 互 作用 的 结果 。
Ly 是 ao 太 1 的 正 调节 因子 ， 反 之 ，Ap-l 能 正 调 控 1A 基因 ， 因 为 在 转 3SS-a 太 1
的 拟 楠 芥 中 ，z 轧 能 在 已 改变 的 未 成 熟 的 花 原 基 中 表达 。THfl 能 够 通过 两 条 途径
抑制 花 原 基 特 异性 基因 在 营养 器 官 中 表达 : 一 条 是 抑制 它们 的 上 调控 ; 另 一 条 是
阻碍 分 生 组 织 对 / 记 和 喀 1I 的 响应 ， 因 此 ， 在 营养 分 生 组 织 癌 生殖 分 生 组 织
变 的 过 程 中 ， 应 有 一 确定 时 期 。! 户 、aztp-1 和 太 基因 均 表 达 之 后 ， 通 过 态 和
a 思 1 的 正 相互 作用 ， 以 及 其 他 因子 的 协同 作用 ， 使 得 / 户 和 az1 表达 量 增 加 ;
而 由 于 坊 对 妨 和 azp-1 具有 负 相 互 作用 ， 通 过 降低 场 的 表达 量 ， 使 其 失去 抑
制 2 和 ao 记 1 表达 的 作用 ， 从 而 促进 花 器 官 特 异性 基因 的 表达 。Z 护 、cz1 和

人 和

态 基因 在 花 发 育 过程 中 是 不 可 蔡 代 的 。 在 花 原 基 分 生 组 织 向 花 器 官 转变 过 程 中 ，
/ 户 基因 起 到 关键 性 的 作用 ， 花 器 官 发 育 的 同 源 异 型 基因 a 思 1、 亡 入 3 等 都
是 由 /2 户 直接 或 间接 调控 的 。z 户 基因 在 整个 花 分 生 组 织 中 都 表达 ， 而 它 所 调控
的 花 器 官 特异 性 基因 却 只 在 特定 的 花 器 官 中 表达 ， 这 可 能 需要 一 些 中 间 因 子 同 它
相互 作用 ， 而 调控 轧 在 不 同 花 器 官 中 的 转录 ， 例 如 在 拟 柄 芥 中 zx 襄 是 咏 3 的
上 游 调 控 因 子 ， 但 在 为 突变 体 中 x 万 没有 显著 的 变化 ， 这 些 现象 表明 zx 万 不 是
一 个 简单 的 中 间 因 子 连 接 花 原 基 和 人 花 器 官 的 发 育 ， 它 很 可 能 是 必需 的 共 调 控 因
子 ， 同 ] 户 一 起 作用 于 花 器 官 基因 。 研 究 x 匈 同 / 户 的 相互 影响 可 以 作为 一 个 范 “
例 ， 让 我 们 了 解 像 / 访 基因 这 种 在 整个 分 生 组 织 中 表达 的 基因 是 如 何 选择 性 地 激
活 特定 区 域 的 基因 表达 。

第 六 节 ” 阁 血 系 统 发 育 的 分 子 机 制

血液 细胞 可 分 为 两 大 类 ， 即 淋巴 细胞 (包括 工 细胞 、B 细胞 和 NK 细胞 ) 和
信 细 胞 〈 包 括 粒 细胞 、 单 核 细 胞 、 红 细胞 和 巨 核 细胞 )。 血 液 干 细胞 具有 向 造血
系统 细胞 包括 各 系 仙 细 胞 和 淋巴 细胞 发 育 的 潜能 。 根 据 干细胞 发 育 的 连续 性 ， 血
液 干细胞 只 是 血液 细胞 池 的 一 个 发 育 阶段 。 随 着 增殖 分 化 ， 血 液 干细胞 逐渐 减弱
其 自我 更 新 和 分 化 潜能 ， 最 终 失去 干细胞 特征 ， 成 为 没有 上 自我 更 新 分 裂 增殖 能 力
和 功能 限定 的 血细胞 。 所 有 血细胞 的 寿命 都 很 有 限 ， 粒 细胞 仅 存活 几 个 小 时 ， 红
细胞 能 存活 几 周 ， 寿 命 最 长 的 是 记忆 工 细 胞 ， 也 仅 存 活 几 年 。 这 样 ， 机 体 为 了
维持 一 定数 量 的 血细胞 ， 就 必需 持续 产生 大 量 血细胞 ， 而 在 哺乳 动物 中 ， 所 有 的
血细胞 均 产 生 于 一 种 普通 的 多 能 干细胞 ， 即 造血 干细胞 。 这 一 部 分 将 主要 阐述 造
血 干细胞 向 各 细胞 谱系 分 化 及 也 淋 巴 细胞 分 化 的 分 子 机 理 。

一 、 细 胞 谱系 选择 的 分 子 基础

一 个 特定 的 细胞 谱系 (如 工 细胞 、B 细胞 ) 如 何 从 造血 干细胞 、 多 能 干 祖 细
胞 发 育 而 来 是 研究 造血 过 程 的 中 心 问题 。 我 们 知道 ， 不 同 谱系 细胞 间 的 分 化 或 选
择 过 程 是 基因 差异 表达 的 结果 。 同 源 盒 (hoz ) 基因 是 发 育 过 程 中 重要 的 基因 ，
属于 转录 因子 家 族 ， 这 个 家 族 的 成 员 除 在 胚胎 形成 过 程 中 决定 细胞 命运 之 外 ， 还
与 造血 细胞 形成 过 程 中 的 细胞 谱系 特 化 的 控制 有 关 。joz 在 造血 细胞 系 的 差异 表
达 ， 对 造血 干细胞 的 发 育 、 祖 细胞 的 决定 或 增殖 、 细 胞 谱系 的 特异 性 分 化 有 着 不
同 的 作用 。

一 些 hoz 基因 如 hozB3 和 jhozB4 在 含 不 成 熟 的 造血 细胞 群 中 高 水 平 表 达 。

至 今 发 现 至 少 有 16 个 hoz 基因 (主要 是 hoza 与 hozB 得) 在 人 类 骨髓 造血
干细胞 CD34” 细胞 中 表达 ， 在 最 原始 的 CD34” CD45RA-CD71- 造 血 干 细胞

5 8 ，

VE Se

(HSC) 亚 群 中 ，jPozB3 和 jhozB4 高 水 平 表 达 ， 在 CD34- 细胞 各 亚 群 中 ，jozA10
基因 则 等 量 表 达 ， 而 在 CD34 -细胞 中 ，hozB3 、jozB4 与 hozA10 不 表达 。

静止 期 的 造血 干细胞 (HSC) 只 表达 nozB3， 随 着 分 化 的 进行 ， 位 于 3 端的
jaozB3、jhozB4、jhozB5 基因 按 次 序 先 后 表达 ， 而 $ 端 hnozB7、jhorB8 、jhozrB9
在 造血 干细胞 分 化 的 各 阶段 均 未 检测 到 。 用 原 位 杂交 技术 在 成 年 鼠 、 新 生 鼠 及 不
同 孕 期 胎 鼠 的 多 个 部 位 分 析 nozB6 、 促 红细胞 生成 素 (EPO) 及 其 受 体 基因 的 表
达 ， 发 现在 造血 发 生 中 ， 三 者 之 间 具 有 时 间 与 空间 上 的 一 致 性 。 来 自 CFU-E、
BFU-E 和 TER-119” (一 种 红细胞 的 特异 标记 ) 的 红 系 造 血 祖 细胞 中 有 hozB6
基因 表达 ， 而 在 HSC 及 非 造血 系统 的 干细胞 中 无 hozB6 基因 表达 ; 当 后 两 种 细
胞 分 化 进入 红 系 系 列 ，jozB6 和 红 系 相关 标记 又 重新 表达 。 因 此 认为 ， 在 红 系 与
粒 系 的 发 育 分 化 过 程 中 ， 特 别 在 HSC 分 化 的 早期 阶段 有 hozB 徐 基 因 的 表达 ; 在 造
血细胞 分 化 过 程 中 ，jpozB 簇 基 因 按 3 向 5 方向 逐渐 活化 。hozB3 是 早期 造血 的 主
控 基 因 。 hozB6 基因 与 红 系 造 血 密 切 相 关 ， 可 被 视 为 红 系 造 血细胞 的 标志 。

用 针对 hoxB mRNA 的 反 义 硫 代 磷 酸 守 聚 核 苷 酸 处 理 造 血 干 细胞 (HPC)，

， 以 阻 遇 hozB 基因 表达 ，HPC 形成 BFU-E 与 CFU-GM 的 能 力 显著 降低 。

用 定点 阻 断 (targetedinterruption) 造成 小 鼠 hozA9 基因 纯 合 子 型 缺失 ， 小
鼠 外 周 血 白细胞 与 淋巴 细胞 总 数 减少 30% 一 40%， 粒 系 细胞 对 粒 细 胞 集落 刺激

因子 〈G-CSF) 的 反应 性 降低 ， 小 鼠 胸 腺 体积 显著 变 小 ， 骨 信 中 粒 系 、 红 系 和 前

B 祖 细胞 数目 也 显著 减少 ; 但 混合 集落 、12 天 的 CFU-S 和 长 期 培养 起 始 细胞
(LTC-IC) 则 无 明显 减少 。

在 造血 祖 细胞 中 ，hozB8 的 表达 能 特异 地 影响 谱系 发 育 ， 即 抑制 粒 系 发 育 而
促进 巨 叭 细胞 系 的 分 化 。

hozB4 能 增强 ES 细胞 的 造血 潜能 ， 促 进 且 胎 干细胞 (ES 细胞 ) 辐 造 血 细
胞 分 化 形成 红 系 集落 (CEFCE) 和 粒 、 红 、 单 核 及 巨 核 系 混合 集落 (CEFC-
GEMM)。jhozB4 基因 转 导 的 骨 艇 细胞 有 很 强 的 扩 增 原始 HSC 池 的 能 力 ， 使 可
移植 的 全 能 HSC 数量 增加 $0 倍 ， 且 这 种 HSC 的 高 度 扩 增 不 伴随 外 周 血 细胞 的
形态 异常 ， 不 影响 细胞 的 正常 分 化 。

hozAl0 的 过 度 表达 显著 地 干扰 矫 系 和 也 淋 巴 细胞 系 的 分 化 ， 并 导致 含 巨 核
细胞 和 原始 细胞 的 大 集落 形成 。 在 受 致死 量 照射 的 鼠 体 内 移植 kor410 转 导 的 鼠
骨 艇 细胞 能 使 受 体 鼠 重建 骨髓 造血 ;在 移植 后 8 一 15 周 ， 小 鼠 艇 系 干 / 祖 细胞 数
量 明 显 增加 ， 且 有 较 强 的 巨 核 细胞 集落 形成 能 力 。 如 果 将 nozB4，jhozA10 基因
转 导 的 骨 艇 细胞 在 含 生 长 因子 的 液体 培养 基 中 培养 7 天 后 ， 注 入 受 致死 量 照射 的
鼠 体 内 ， 然 后 测定 其 12 天 的 CFU-S， 与 对 照 组 比较 ，jhozB4 和 jhozAl10 的 过 度
表达 可 显著 增加 CFU-S 数量 。 研 究 认为 ， 在 造血 细胞 增殖 分 化 早期 ，jozB4 基
因 发 挥 重 要 的 调节 作用 ; hozAl0 的 过 度 表 达 可 导致 血 系 干 / 祖 细胞 的 扩 增 ， 能
改变 祖 细胞 的 正常 分 化 。

"。 389 。

hoz 基因 表达 对 淋巴 细胞 的 分 化 也 有 很 大 影响 。G.Saucagvau 等 〈1997 年 )
建立 了 hozB3 过 度 表 达 模 型 ， 将 hozB3 基因 导入 小 鼠 骨 仙 细 胞 并 移植 进入 鼠 体
内 ， 结 果 受 体 鼠 胸腺 减 小 ，CD4* CD8* 细胞 绝对 数量 减少 为 原来 的 JX24， 而 含
7YSTCR 细胞 的 CD4- CD8 -胸腺 细胞 数量 增加 3 倍 ; B 细胞 分 化 紊乱 ; 骨 散 与 脾
脏 中 粒 - 巨 叹 细 胞 集落 形成 细胞 增加 。 提 示 在 早期 髓 系 和 淋巴 系 发 育 中 ，HhozB3
基因 的 表达 能 影响 其 增殖 与 分 化 。

可 见 ，jozB3 是 早期 造血 的 主 控 基 因 ，jhozB4 能 促进 胚胎 干细胞 (ES 细胞 )
向 造血 细胞 分 化 ， 形 成 红 系 集 落 (CFC-E) 和 粒 、 红 、 单 核 及 巨 核 系 混合 集落
(CFC-GEMM)，hozB6 基因 是 红 系 造血 细胞 的 标志 基因 ，HhozB8 决定 造血 干 祖
细胞 向 巨 噬 细 胞 系 的 分 化 方向 ，jpozAl0 的 过 度 表 达 可 导致 含 巨 核 细 胞 和 原始 细
胞 的 大 集落 形成 。

骨 形 态 发 生 蛋 白 (BMPs) 是 参与 造血 干细胞 发 育 的 另 一 个 重要 的 调节 因子 ，
它 是 信和 号 传导 生长 因子 B (TGF-8B) 超 家 族 的 成 员 。 编 码 BMPs 的 基因 是 同 源 盒
基因 上 游 及 下 游 的 发 育 调节 网 络 的 一 部 分 。BMP 基因 在 造血 细胞 系 中 表达 ， 表
达 模 式 与 造血 干细胞 谱系 相关 ， 造 血细胞 能 表达 如 下 基因 : BMP.2、BMP.4、
BMP-6、BMP.7、 胎 盘 骨 形态 发 生 和 蛋白 (PLAB)， 生 长 和 分 化 因子 -1 (GDF-1)，
转化 因子 -83 (TGF-8B3)。 这 些 基 因 的 表达 具有 细胞 谱系 限制 性 ，BMP-4 仅 在 开
淋巴 细胞 系 中 表达 ，BMP-7 在 正常 循环 的 淋巴 细胞 和 肉瘤 中 的 也 淋巴 细胞 中 都 “
表达 ，PLAB 在 具有 分 化 为 单 核 细胞 / 巨 核 细胞 能 力 的 细胞 系 中 表达 ，GDF-1 主
要 在 髓 细胞 中 表达 ， 而 BMP-2、GDF-1 和 PLAB 的 表达 受 细胞 分 化 程度 的 影响 。
与 正常 组 织 相 比 ，BMP-4 和 PLAB 在 白血病 细胞 系 中 的 表达 水 平 明 显 升 高 ， 表
明 BMP 信和 号 传递 功能 紊乱 是 引起 造血 细胞 不 正常 发 育 的 一 个 因素 。

Adams 及 其 同事 〈1992 年 ) 发 现 ， 叉 细胞 416B 在 分 化 成 巨 核 细胞 时 表达 造
血 转 录 因 子 GATA-1， 同 时 失去 了 艇 细胞 的 表 型 。GATA-L 表达 水 平 也 可 影响 细
胞 的 表 型 ， 即 GATA-1 具有 剂量 效应 ， 如 嗜 酸性 粒 细胞 表达 中 等 水 平 的 GATA-
1， 而 成 血小板 则 表达 高 水 平 的 GATA-1。NEF-M (小 鸡 的 CEBP8 的 同 聚 物 ) 诱
导 嗜 酸性 粒 细胞 的 分 化 ， 并 与 Vmyb DNA 结合 阻 断 血 小 板 分 化 途径 。mafB 是
AF-1 超 家 族 的 成 员 ， 可 在 骨 仙 单 核 细 胞 中 特异 表达 ， 并 阻止 艇 细胞 向 红细胞 分
化 ， 另 外 ， 抑 制 内 源 性 转 铁 蛋 白 受 体 基因 表达 也 可 减弱 红细胞 的 分 化 。

4-1BB (CD137ILA) 是 神经 生长 因子 受 体 (NGFR ) 肿瘤 坏死 因子 受 体
(TNFR) 家 族 的 成 员 之 一 ， 它 介 导 的 协同 刺激 信号 能 促进 工 细 胞 活化 、 增 殖 、
分 化 ， 也 能 诱导 工 细 胞 凋 亡 。4-1BB 既 能 协同 CD28 对 工 细胞 的 共 刺 激 作 用 ， 也
能 不 依赖 于 CD28 而 发 挥 共 刺 激 效应 。4-1BB 通过 它 在 胞 浆 一 端的 聚集 ， 与 肿瘤
坏死 因子 受 体 相关 因子 2 (TRAF2) 交 联 ， 依 次 活化 ASK1、JNK SAPK 或
p38MAP， 启 动 级 联 放 大 效应 。 活 化 也 细胞 表达 4-1BB 配 体 (4-1BBL)。4-1BB
单 抗 提高 NK 细胞 杀伤 肿瘤 的 活性 。4-1BB 通过 双向 信和 号 传导 ， 使 单 核 细胞 活

。 390 ，

和

化 、 增 殖 ， 并 促进 单 核 细胞 的 黏附 作用 。

综 上 所 述 ， 血 液 细胞 的 谱系 决定 是 基因 差异 表达 的 结果 ， 那 么 决定 了 的 细
胞 谱系 又 如 何 发 育成 执行 特定 功能 的 成 熟 细 胞 呢 ? 下 面 以 孔 淋巴 细胞 为 例 ， 介
绍 执 行 特殊 功能 的 成 芍 细 胞 发 育 的 分 子 机 制 。

二 、B 亲 巴 细胞 发 育 的 分 子 机 制

B 细 胞 的 发 育 过 程 分 为 抗原 非 依赖 阶段 和 抗原 依赖 阶段 ， 前 一 发 育 阶段 指 由
干细胞 - 祖 细 胞 -~ 原 了 B 细 胞 -> 前 B 细胞 -不 成 熟 了 细胞 ， 这 一 发 育 过 程 在 骨 般
中 进行 ;后 一 阶段 指 未 受 抗原 刺激 的 天 然 (native) B 细胞 一 激活 B 细胞 一 浆 细
胞 以 及 从 活化 也 细胞 转 为 静止 记忆 B 细胞 ;在 外 周 淋巴 器 官 中 进行 。 整 个 发 育
过 程 中 有 许多 特征 性 的 基因 表达 。 而 这 些 特 定 基 因 的 表达 是 由 众多 的 转录 因子 调
节 的 。 下 面 主要 介绍 也 细胞 各 发 育 阶段 基因 的 表达 及 其 调节 的 转录 因子 。

1. 抗原 非 依赖 发 育 阶段 基因 表达 及 相关 转录 因子

在 抗原 非 依 赖 发 育 阶 段 ，B 细胞 在 骨 艇 中 经 历 祖 B (PrO-B) 细胞 和 前 也
(preB) 细胞 ， 发 育成 表达 表面 IgM 的 未 成 熟 B 细胞 。Pro-B 以 及 定向 B 细胞 各
阶段 都 表达 B220 (CD45) 分 子 ，Pro B 还 表达 CD43、 末 端 脱氧 核 甘酸 转移 酶
(TdT、RAG-1、RAG-2)、 蔡 代 性 轻 链 (X5 和 VPre-B)、CD19、Iga (mb-1) 和
IgB (B29)。 芭 重 链 基因 进行 重 排 ，pre-B 细胞 CD43 表达 水 平 下 降 ， 后 期 不 表达
TdT，fIg 重 链 重 排 成 功 ， 并 出 现 pre-B 细胞 受 体 复 合体 〈 由 到 链 、 蔡 代 轻 链 、lga
和 1lgB 组 成 )。 处 于 分 型 周期 中 的 大 的 pre-B 细胞 RAG-1 和 RAG-2 在 早期 的 表达
水 平 下 降 ， 当 进一步 分 化 时 ，RAG 基因 又 被 诱导 表达 ， 并 出 现 轻 链 基因 的 重 排 ;
轻 链 基因 的 重 排 及 表面 IgM 的 表达 标志 着 B 细胞 抗原 非 依赖 阶段 发 育 的 完成 。
参与 B 细 胞 这 个 发 育 阶 段 的 转录 因子 有 PU-L/Spi1、EtS-1、Ikaxos、E2A、
EBF、BSAP、NFKkB/Rel、Sox-4 等 。

Ets 转录 因子 家 族 包 括 Ets-1、Ets-2、EI、Pui 和 Spi-B 等 多 个 成 员 ; 它们 含
有 Ets 结构 域 ， 通 过 类 似 环 -螺旋 - 环 方式 与 DNA 的 味 叭 区 结合 。 这 个 家 族 参 与
B 细 胞 早期 发 育 的 成 员 主 要 有 PU-1 和 Ets-1。PU-L 中 的 谷 氨 酸 富 集 区 和 酸性 氢
基 酸 富 集 区 为 其 调节 功能 所 必需 ， 另 外 它 还 有 一 个 介 导 和 蛋白质 相互 作用 的 PEST
结构 域 。 在 了 B 细 胞 中 ，Rag-1、Iga、IgB、Vpre-B、NX5、BTK、bclZ、TadT、CDl19
以 及 丁 链 基因 的 转录 调节 元 件 中 含有 ETS 结合 位 点 。Vpre-B、X 与 六 链 形成 前 B
细胞 受 体 〈B cell receptor precursor，Pre-BCR)， 对 B 细 胞 的 发 育 至 关 重 要 。 了 II
1 基因 吻 除 的 小 鼠 缺 失 也 细胞 ， 在 胚胎 期 死亡 。PU-1 的 调节 作用 需要 其 他 辅助
因子 的 参与 ， 只 有 当 它 和 干扰 素 调节 因子 (IRF) 家 族 的 NFEMS/P 访 结合 后
才 对 3 链 基因 增强 子 (3%E) 有 激活 作用 ， 下 F 家 族 的 另 一 成 员 ICSBP 负 调

sr 39& 3

节 PU-1 对 ， 链 基 因 增 强 子 (AE) 的 作用 。

Jaros 属于 zzzppie C22 锌 指 和 蛋白 家 族 成 员 ; 与 DNA 上 的 GGGAAT 结
合 。 有 aros 在 细胞 早期 发 育 中 起 关键 调节 作用 ， 在 发 育 的 最 早期 就 开始 起 作用 ，
参与 限定 祖 细胞 向 如 细胞 方向 发 育 ， 在 它 的 作用 下 产生 召 前 体 细 胞 。 它 调节 的
靶 基 因 包 括 RAG-1、JIgae、Vare-B、)15 和 TaT 等 。 其 中 与 Vere-B、)15 和 TaT
基因 结合 的 位 点 和 Ets 识别 的 序列 有 重 释 。 获 除 及 azros 基因 的 小 鼠 胚 胎 缺 失 B 细
胞 ， 而 且 发 育 是 在 proB 之 前 受阻 ， 其 中 与 也 细胞 定向 和 分 化 相关 的 两 种 受 体 型
酷 氨 酸 激 酶 flk-2 和 c-kit 分 别 不 表达 和 表达 降低 ; 如 果 小 鼠 表达 具有 显 性 负 调 节
作用 的 Ikaros， 免 疫 系 统 的 发 育 将 完全 受阻 ， 而 且 大 多 数 小 鼠 三 周 内 死亡 。 另
外 ， 最 近 克 隆 了 Ikaros 相关 分 子 Aiolos， 它 于 后 期 的 胚胎 胸腺 和 成 年 个 体 的 淋巴
器 官 中 表达 ， 稍 晚 于 Ikaros 的 表达 。 最 近 研 究 表明 ，Ikaros 和 Aiolos 可 以 通过 组
蛋白 脱 酰基 酶 依赖 的 方式 抑制 转录 。

eza 基因 通过 不 同 的 剪接 方式 可 产生 E47、E12 和 EZ 一 E5 几 种 产物 ， 它 们
属于 碱 性 螺旋 - 环 - 螺 旋 (base helix loop helix，bHLH) 转录 因子 家 族 ， 其 中 碱 性
结构 域 与 DNA 结合 ，HLH 结构 参与 蛋白 二 聚 体 的 形成 。EZA 蛋白 〈E47) 与 免
疫 球 蛋 白 基 因 增 强 子 结合 后 能 激活 其 转录 及 基因 的 重 排 。 EZA 基因 吻 除 使 B 细
胞 发 育 过 程 中 的 DJH 重 排 受阻 ，B220+CD43+*B 前 体 细 胞 缺失 。 在 EZA- 的 基
础 上 ， 通 过 E47 或 BI12 转基因 小 鼠 表明 两 者 在 了 细胞 发 育 过 程 中 功能 有 所 不 同 ，
前 者 限定 向 也 细胞 方向 发 育 ， 后 者 则 为 B 细胞 分 化 所 需 。EZA 蛋白 的 功能 受 Id
蛋白 的 负 调 节 。Id 蛋白 含有 HLH 结构 域 ， 但 不 能 与 DNA 结合 ， 因 此 与 EZA 蛋
白 形 成 的 二 聚 体 没 有 功能 。Id 仅 表达 于 pro-B 细胞 中 ， 友 转基因 小 鼠 与 EZA 基
因 吻 除 小 鼠 的 表 型 相似 。 除 Id 外 ， 锌 指 蛋白 ZEB 也 可 抑制 EZA 的 功能 。

EBF 早期 B 细胞 因子 (early B cell factor，EBF) 是 在 研究 xz 基因 的 启动
子 时 发 现 的 ， 其 C 端 有 HLH 样 结 构 ， 介 导 和 蛋白 二 聚 体 化 ，N 端 含 有 一 类 新 的 能
结合 锌 离子 的 基 序 (H-X3-C-X2-C-X5-C)， 与 DNA 识别 相关 。EBF 表达 于 早期
B 细胞 发 育 的 整个 过 程 ， 但 在 终 末 分 化 的 浆 细 胞 中 不 表达 。EBF 能 与 EE 和 链
基因 增强 子 (kE) 结合 ，EBF 和 E47 能 协同 诱导 免疫 球 蛋白 替代 轻 链 X5 和
VPpre-B 的 表达 。EBF 在 proB 癌 pre-B 发 育 中 起 至 关 重 要 的 作用 ，EBF 基因 缺失
使 B 细 胞 的 发 育 阻 断 在 Pro-B 阶段 ; 这 种 B220" CD43 的 Pro-B 细胞 表达 胚 系 交
链 和 IL-7 受 体 ， 但 当 DJH 没 有 重 排 时 ，Iga、Ig8B、 蔡 代 性 轻 链 、RAG-1 和 RAG-
2 的 基因 也 不 表达 。

BSAPB 细胞 特异 性 激活 蛋白 〈(B-cellspecific ativating protein，BSAP) 属于 配
对 盒 同 源 域 (aired-box homeodomain) 转录 因子 家 族 成 员 ， 在 调节 B 细胞 早期 发
育 和 中 脑 发 育 中 起 十 分 重要 的 作用 。 在 免疫 细胞 中 ， 只 有 B 细胞 表达 BSAP， 在
B 细 胞 特异 性 CD19、15、VareB 及 BAR 基因 的 启动 子 中 含有 BSAP 结合 位 点 ，
但 是 在 BSAP- 汪 小 鼠 B 细胞 中 只 有 CD 19 表达 异常 。BSAP 与 ETS 协同 调节

。 392 。

RE

Iga 的 表达 ; 与 ETS 家 族 的 NF-aP 竞争 3'CoE 结合 位 点 ， 起 负 调 节 作 用 ; 另外 ，
BSAP 还 抑制 未 成 熟 也 细胞 中 丁 链 的 表达 。BSAP 汪 小 鼠 一 般 于 出 生 后 三 周 内 死
辫 ， 这 种 小 鼠 中 没有 pre-B 细胞 、B 细胞 和 浆 细胞 ， 在 骨髓 中 存在 CD19- 、c-
Kit+、B2207 、CD43”、IL7R+ 、DJH 已 重 排 的 ProB 细胞 ， 但 是 胎 肝 中 没有
B220+ Pro-B 细胞 。

NEF-kB 是 一 种 分 布 和 作用 均 十 分 广泛 的 真 核 细胞 转录 因子 ， 因 首先 发 现 于 B
细胞 Igk 轻 链 转录 调控 中 而 得 名 。NEF-kB 由 Rel 蛋白 家 族 的 成 员 以 同 源 或 异 源 二
聚 体 的 形式 组 成 。Rel 家 族 中 至 少 有 5 个 成 员 与 B 细胞 发 育 相 关 ， 包 括 RelA
(P65)、c-Rel、RelB、NF-<B (P105) 和 NEF-kB 2 (P100)。NF-kB 因 能 与 k 链 基
因 内 源 性 增强 子 〈intronic k enhancer，kEi) 结合 而 被 认为 是 一 种 Pre-B 诱导 性 转
录 因 子 ; 但 各 种 NF-kB 基因 的 敲 除 对 也 细胞 发 育 影响 不 大 。 最 近 发 现 NF-kB
(RelA 和 c-ReP) 对 了 细胞 的 分 化 十 分 必要 ， 一 种 具有 显 性 负 调 节 作 用 而 又 不 被
降解 的 [kB 在 pre-B 细胞 中 过 量 表达 ,- 使 < 转录 降低 ，VrkjJk 重 排 受阻 。

Sox-4 是 一 种 Sry 样 的 可 溶性 HMG 盒 蛋 白 (Sry-like HMG box protein)， 是
调节 淋巴 细胞 的 一 种 转录 激活 子 。Sox-4 于 工 和 pre-B 细胞 系 和 小 鼠 胸 腺 中 表达 。
Soxu 小 鼠 的 循环 系统 发 育 和 B 细胞 的 发 育 受 阻 ，B 细胞 停滞 在 Pro-B 细胞 阶
段 ， 胎 肝 中 对 IL-7 刺激 发 生 增 殖 的 B 前 体 细胞 数量 明显 减少 ， 增 殖 能 力也 严重
降低 。

上 述 的 转录 因子 在 B 细胞 早期 发 育 的 不 同时 期 发 挥 作用 ， 主 要 调节 着 两 个

” 过 渡 点 ， 即 限定 祖 细胞 向 B 细胞 发 育 和 Pro-B 向 Pre-B 发 育 两 个 关卡 〈check-

point)。 目 前 已 知 PUI 和 Ikaxos 在 第 一 个 关卡 起 作用 ， 而 EZA、EBF 和 了 BSAP 可
能 在 第 二 个 关卡 起 作用 。

2. 抗原 依赖 发 育 阶 段 的 基因 表达 及 相关 转录 因子

进入 外 周 循环 的 静止 B 细胞 首先 进入 初级 滤 泡 ，BCR 与 抗原 结合 后 ， 援 取 、
加 工 和 提 呈 胸腺 依赖 抗原 ，B 细胞 表达 MHC II、B71 (CD8)、B72 (CD86)、
CD40 分 子 的 水 平 上 调 。 初 级 滤 泡 中 B 细胞 扩 增 后 形成 生发 中 心 ，B 细胞 与 滤 泡
树 突 状 细胞 相互 作用 ， 并 进行 体 细胞 突变 、 高 亲和力 抗体 的 选择 、 类 型 转换 和 阴
性 选择 ， 其 中 B 细胞 所 表达 的 CD40、CD19、B7-2、LTa、TNF-a、Fas 等 分 子
以 及 它们 相应 的 配 体 参 与 了 此 过 程 。 当 了 B 细胞 成 功 地 进行 了 体 细 胞 突变 、 受 体
编辑 、 类 型 转换 、 亲 和 力 成 熟 及 负 选 择 后 离开 生发 中 心 ， 进 一 步 分 化 为 记忆 细胞
和 浆 细胞 。 参 与 B 细胞 抗原 依赖 发 育 阶 段 的 转录 因子 有 Oct-1/2、OCA-B/BOPB-
1/OBF-1、Ets-1、PUI、STATs、NEF-kB/Rel、C/EBP、TEFE3/MYCANIGIITA、
BclL-6 和 BLIMP-1 等 。

Octamer 结合 蛋白 (Oct-1，Oct-2) 属于 POU 和 蛋白 家 族 ， 它 们 能 与 DNA 中
oct 元 件 (ATGCAAAT) 结合 ， 这 种 元 件 存在 于 所 有 芭 轻 链 基 因 和 重 链 V 基因

。 393 。

的 启动 子 中 。Oct-1 广泛 分 布 于 各 种 细胞 ， 而 Oct-2 主要 存在 于 了 细胞 中 。Ocf
L/Oct-2 的 作用 受到 共 激 活 因子 OCA-B 的 调节 ，OCA-B 特异 表达 于 B 细胞 中 ，
能 提高 Oct1/Oct-2 增强 转录 的 活性 及 其 调节 的 特异 性 。OCA-B 与 CIITA 一 起 激
活 MHCIT 基因 的 启动 子 ， 与 Ets 因子 一 起 激活 PU-1 基因 的 启动 子 ，CD20 和
CD36 基因 增强 子 中 的 oct 元 件 在 成 熟 B 细胞 的 表达 中 起 重要 调节 作用 。Ocz2 基
因 缺 失 小 鼠 的 也 前 体 细 胞 正常 ， 但 IgM+ 细胞 变 少 ， 这 种 也 细胞 对 多 克隆 有 丝 分
裂 原 的 刺激 不 反应 ， 但 对 T 工 细胞 提供 的 刺激 信号 反应 正常 。OCA4-B 基因 剔除
后 ，BI 亚 群 细胞 和 初级 滤 泡 正常 ， 但 没有 生发 中 心 ， 成 熟 的 B 细胞 很 少 ， 循 环
的 也 细胞 减少 ，Ig 亚 类 及 其 分 泌 水 平 异 常 ， 小 鼠 对 TI 和 TD 抗原 的 反应 均 降 低 。
由 此 看 来 ，OCA-B 和 Oct-2 主要 作用 于 B2 亚 群 细胞 抗原 依赖 阶段 ， 而 对 瑟 细 胞
早期 的 发 育 影响 不 大 。

Ets 转录 因子 家 族 除 调节 B 细胞 抗原 非 依 赖 发 育 阶 段 外 ， 在 也 细胞 抗原 依赖
发 育 阶 段 也 发 挥 作用 。Ets-1 和 PU-1 分 别 与 六 链 基 因 增 强 子 (pE) 中 的 mA 和
/ 吕 结 合 ， 它 们 与 TFE3 协同 作用 ， 可 能 还 有 CVEBF 参与 。 当 刺激 BCR 和 CD40
时 ，Ets-l 与 AP-1 形成 复合 体 ， 与 3 下 结合 。PU-1 能 与 VE 和 Vx 基因 启动 子
的 喀 啶 富 含 区 结合 ， 另 外 还 参与 丁 链 基 因 及 其 本 身 启动 子 的 调节 ; Ets-1 激活 也
细胞 中 DRA 基因 的 启动 子 ; Ef 是 B 细胞 特异 性 T2T 启动 子 的 一 个 重要 调节 因
子 。 由 于 Ets 转录 因子 家 族 成 员 功 能 的 元 余 性 (redundancy); Ets-1 -一 小 鼠 Ig 水
平 正 常 。 但 有 意思 的 是 ，Ets-l 的 缺失 增加 了 工 细 胞 死亡 和 也 细胞 的 分 化 。Spi-B
在 了 细胞 抗原 依赖 发 育 阶段 中 也 起 十 分 重要 的 作用 。Spi-B “小 鼠 虽 然 有 成 熟 的
B 和 工 淋 巴 细胞 ， 但 它们 的 了 细胞 功能 和 T 细 胞 依赖 的 体液 免疫 应 答 严 重 异 常 ，
这 种 也 细胞 对 BCR 交 联 的 增殖 能 力 很 差 ， 而 且 引 起 死亡 ， 免 疫 小 鼠 的 IgG1、
IgG2a 和 IgG2b 水 平 很 低 。

STAT 参与 细胞 信和 号 向 胞 核 内 传送 与 基因 转录 的 活化 调节 ; STAT 与 Jak 组
成 Jak/STAT 信和 号 途径 ， 主 要 参与 一 些 细胞 因子 、 激 素 和 可 溶性 配 体 结合 相应 的
受 体 所 介 导 的 信号 转 导 。B 细胞 中 表达 4 种 Jak 激酶 ，Jakl、Jak2、Jak3 和 tyk2。
其 中 Jak3 选择 性 地 表达 于 血液 细胞 中 。 能 被 Jak 信和 号 活化 的 STATS 有 7 种 ;
STATSI 一 STATS4、STATS$a、STAT5b 和 STAT6。 如 WEHI1231B 细胞 BCR
结合 相应 配 体 后 ， 胞 内 Jak-1 和 Jak-2 丰 度 升 高 ， 活 化 的 正常 人 外 周 血 B 细胞
Jak-3 水 平 升 高 。 对 BCR 的 刺激 引起 STAT3、STATS 和 STAT6 的 激活 。 细 胞
因子 引起 的 s 免疫 球 蛋白 类 型 转换 也 是 通过 激活 STAT 实现 的 。 例 如 ，IL4 激活
的 STATW 与 sT 基因 的 启动 子 结合 并 激活 其 转录 。Jak-3- 全 小 鼠 B 细胞 发 育 在
pre-B 阶段 发 生 障 碍 ; IL-4 不 能 激活 这 种 B 细胞 的 STATN6 也 不 能 提高 CD23 和
MHCII 的 表达 ，IL-4 与 抗 IgM 抗体 一 起 不 能 引起 B 细胞 的 增殖 。STAT6 -小
鼠 淋 巴 细胞 在 IL-4 刺 激 下 不 能 增殖 ，IL-4 参与 的 抗体 类 型 转换 也 被 阻 断 ， 小 鼠 经
抗 IgD 抗体 免疫 后 不 能 产生 IgE。STAT- “一 小 鼠 模型 表明 ，STAT1 参与 介 导

，394 。

AI

TENa BA7 传递 的 信和 号， 为 IFNYy 诱导 IRF-1 和 CIITA 所 必需 。 敲 除 STATS5a 和
1STAT4 后 未 发 现 刀 细 胞 有 明显 的 异常 。

NEF-kB 除 在 了 细胞 早期 发 育 中 发 挥 作用 外 ， 还 调节 免疫 球 蛋 白 类 型 转换 中
的 基因 重 排 。CD40 与 其 配 体 CD40L 结合 后 所 引起 了 细胞 NF-<B 和 71 基因 的 转
录 有 赖 于 yl 基因 启动 子 中 的 两 个 NF-kB 结合 位 点 与 NF-kB 的 结合 ; 在 IL-4 诱
导 下 ，NF-kB 与 STATN6 协同 激活 下 基因 的 启动 子 ， 另 外 ，NF-kB 还 调节 1L6、
MEBCIT 和 cyc 基因 的 表达 ， 其 中 c-znyc 的 表达 影响 成 熟 B 细胞 的 凋 亡 。 抗
BCR 抗体 刺激 WEHI1231 B 细胞 后 ， 胞 浆 中 p50 二 聚 体 水 平 升 高 ， 抑 制 cayc
的 转录 ， 最 后 导致 翌 亡 。 小 鼠 缺 失 p50 或 p52 后 ，B 细胞 的 免疫 球 蛋白 类 型 转换
和 成 熟 了 细胞 的 发 育 受 影响 。

C/EBP CVEBP (CCAATVenhancer-binding protein) 属于 碱 性 亮 氨 酸 拉链 转
录 因 子 家 族 。B 细胞 中 的 CEBP 蛋白 有 CVEBPa、NF-IL-6、C/VEBPB、Ig/EBP、
CRP3、LIP 和 CHOP 等 ， 其 中 Ig/EBP、LIP 和 CHOP 是 CVEBPa、NF-IL-6 和
CRP3 活性 的 抑制 因子 。C/BBP 结合 位 点 存在 于 / 正 、cEE、 丰 、17y1 和 多 种 VH
基因 的 启动 子 中 ，B 细胞 中 的 CD22 、 芭 / 和 下 -8 基因 中 也 有 C/EBP 结合 位 点 。
C/EBP 多 数 情 况 下 是 与 其 他 转录 因子 包括 NF-kB/Rel、STAT6、AP-I、PU-1、
AMIL-1 以 及 SP1 协同 发 挥 作用 的 。 基 因 打 靶 实 验 表 明 ，CV/EBP 的 负 调 节 作 用 具
有 重要 意义 。Ig/EBF- “小 鼠 死 于 胚胎 期 ，NF-IL6 -和 小 鼠 的 巨 叹 细 胞 和 B 细胞
功能 异常 ， 小 鼠 脾 脏 和 淋巴 结 变 大 ，IL-6 过 度 表 达 。

TFE3/myc 属于 bHLHZip 蛋白 家 族 ， 它 们 均 以 二 聚 体形 式 存在 。 根 据 拉 链
结构 域 的 不 同 ，TFE3/myc 可 分 为 三 个 亚 家 族 : DTFE3、TEFEB、TEFEC 和 Mii
Q@USF II; mycomax。 它 们 之 间 可 形成 异 源 二 聚 体 。/ 正 和 一 些 VE 基因 的
启动 子 中 存在 TFE3 结合 位 点 ， 结 合 于 转录 起 始 位 点 远 端 的 TFE3 通过 bHLH zip
结构 域 可 与 基因 转录 起 始 区 的 序列 相 结合 ， 介 导 转 录 因 子 远 距 离 的 调节 作用 ;
CD23 也 是 TFE3 调节 的 靶 基 因 。 显 性 负 调 控 基 因 转 染 和 基因 缺失 实验 表明 ，
TFE3 和 TFEB 调节 / 尼 的 作用 比 USF 更 重要 。TFE3 -全 与 RAG-2- 一 艇 合 小 鼠
的 工 细 胞 和 也 细 胞 数目 正常 ， 但 血清 Ig 水 平 比 正常 降低 50% 一 83.3%， 这 可 能
是 因为 接受 工 细胞 提供 的 信号 能 力 受 影响 。 最 近 发 现 e 瓦 基因 内 部 增强 子 中 的
TEFE3 结合 位 点 保守 性 很 差 ; 核 结合 因子 (core binding factor; CBF) 也 与 这 些 位
点 结合 ， 并 能 激活 相应 的 基因 。CBF 由 w、B 两 个 亚 基 组 成 ，a 亚 基 能 与 DNA 结
合 ， 而 8B 亚 基 能 提高 整个 蛋白 分 子 对 DNA 的 亲和力 。CBFu 或 B 亚 基 基 因 吻 除 的
小 鼠 于 胚胎 期 即 发 生死 亡 。

CIITA 和 REFXS，MHCII 类 分 子 转录 激活 子 (MHC class II transactivator，
CIITA) 是 从 淋巴 细胞 缺少 综合 征 〈bare lymphocyte syndrome，BLS) 病人 中 分
离 到 的 一 种 MBC 厅 基因 的 共 激 活 因 子 ， 它 与 RFXS 协同 激活 MHRC 开 的 启动
子 。 缺 失 CIITA 基因 小 鼠 特 定 组 织 的 MHC IT 表达 受 损 。 除 MHC II 外 ，CIITA

“1 399。

还 调节 与 MHC II 抗原 提 呈 相关 的 工 链 和 DM 基因 的 表达 。CIITA 本 身 不 能 结
合 DNA， 它 需要 其 他 共 激 活 因子 协同 作用 ， 包 括 OCA-B\、TAFII32 等 CIITA
只 表达 于 MHC II 细胞 中 ， 它 的 表达 可 由 IFN-7Y 诱 导 。CIITA 是 通过 第 本 个 启
动 子 的 激活 来 表达 的 ， 启 动 子 ITV 的 活化 需要 转录 因子 STATI 和 IRF21 的 参与 4
STAT1 只 有 当 与 USF1 同时 存在 时 才能 结合 GAS 盒 ， 其 中 USF1 与 ,GAS 颌 旁边
的 B 盒 结合 。X 盒 结合 调节 因子 $ (regulator factors binding to X box 9 REXS5)
也 是 从 BLS 病人 中 克隆 到 的 。RFXI1 一 REFX5S 及 p36 能 与 MHCIT 启动 子 中 的 习
盒 结合 ，RFX1 和 REFX5S 分 别 以 同 源 二 聚 体 或 与 p36 形成 异 源 二 聚 体 后 与 DNA
结合 。RFX5-“ 小 鼠 的 胸腺 艇 质 、 成 熟 的 树 突 状 细胞 和 激活 的 B 细胞 仍 表 达
MHC II 类 分 子 ， 但 胸腺 皮质 不 表达 MHCII， 因 而 不 能 进行 对 CD4+T 细胞 的 阳
性 选择 ， 并 引起 严重 的 免疫 缺陷 ; 另外 ， 巨 噬 细 胞 和 藤 止 的 吾 细 胞 也 不 表达
MHC 开 分 子 ;

Bcl6，C2H2 锌 指 蛋 白 家 族 ， 是 在 研究 B 淋巴 瘤 中 的 染色 体 移 位 和 在
Hodgkins 病 中 的 基因 重 排 时 克隆 的 ， 它 能 抑制 某 些 基因 的 转录 。 了 Bcl6 表达 于
生发 中 心 ， 在 静止 了 B 细胞 和 工 细胞 中 表达 水 平 也 很 高 ， 但 随 着 细胞 的 活化 表达
降低 。 目 前 尚未 发 现 Bcl-6 特异 性 调节 的 靶 基 因 ， 与 STATS5 竞争 结合 STAT 位
点 可 能 是 其 调节 基因 转录 的 一 种 方式 。Bcl-6-“ 小 鼠 没 有 生发 中 心 ， 也 没有 亲 和
力 成 熟 的 抗体 ， 并 出 现 因 Th2 细胞 因子 升 高 所 引起 的 炎症 。

BLIMP-1，B 细 胞 成 熟 诱导 蛋白 〈(B lymphocyte-induced maturation protei 闷
BLIMP -1) 是 用 扣除 杂交 方法 筛选 IL-5 和 IL-2 诱导 分 化 的 BCLIB 细胞 的
mRNA 而 克隆 到 的 一 种 转录 因子 ， 是 小 鼠 与 人 IFN-8 启动 子 抑制 因子 PRD:BFI
的 同类 蛋白 。BLIMP-1 特异 表达 于 成 熟 刀 细 胞 和 浆 细 胞 中 ， 它 的 表达 足以 引起
B 细胞 的 分 化 。 最 近 发 现 BLIMP-1 能 与 cyc 基因 表达 调节 序列 中 的 抑制 位 点
结合 ， 并 抑制 它 在 B 细胞 中 的 表达 ， 由 此 介 导 也 细胞 的 成 熟 分 化 。 小 鼠 缺 失
BLIMP-1 基因 于 胚胎 期 死亡 ， 提 示 它 可 能 还 参与 了 且 胎 的 早期 发 育 。

B 细胞 发 育 过 程 中 转录 因子 及 其 他 调控 基因 的 表达 并 发 挥 作用 是 一 个 多 步
又 、 调 控 严 谨 的 过 程 ， 随 着 与 发 育 过 程 相 关 转 录 因 子 的 研究 ， 发 育 调控 的 分 子 机
制 逐 步 得 以 阐明 。 转 录 因 子 调节 多 种 谱系 特征 性 基因 的 转录 ， 使 多 能 或 双 能 前 体
细胞 在 向 某 个 谱系 发 育 时 ， 失 去 向 其 他 谱系 发 育 的 潜能 ， 它 们 调节 的 具体 靶 基因
正 逐 渐 被 确定 下 来 ， 这 方面 的 深入 研究 将 有 助 于 全 面 认识 淋巴 细胞 的 发 育 过 程 ，
并 为 探索 整个 生命 发 育 过 程 开辟 先河 。

时 90

~

第 十 四 细胞 凋 蕊

死亡 意味 着 生命 的 终止 ， 是 生物 界 普遍 存在 的 现象 。 细 胞 的 死亡 ， 顾 名 思
义 ， 是 指 细胞 生命 的 结束 。 发 育 生 物 学 和 细胞 生物 学 研究 的 焦点 是 生 与 死 的 问
题 : 生 即 关于 细胞 的 发 育 、 分 化 和 成 熟 ， 关 于 这 方面 的 研究 已 有 一 百 多 年 的 历
史 ， 目 前 已 发 展 到 在 分 子 水 平 上 研究 相关 基因 的 表达 调控 ; 但 长 期 以 来 人 们 一 直
忽视 了 对 细胞 死亡 规律 的 研究 。 最 近 这 几 年 ， 生 物 学 家 逐渐 认识 到 细胞 死亡 特别
是 程序 化 细胞 死亡 即 凋 亡 有 其 特殊 的 生物 学 意义 。

第 一 节 ”细胞 凋 亡 的 概念 及 意义
一 、 凋 亡 的 概念

在 多 细胞 生物 中 ， 细 胞 的 死亡 有 两 种 不 同 的 形式 。 一 种 是 细胞 坏死 或 意外 和 死
亡 〈necrosis 或 accidental cell death) 。 它 是 由 于 某 些 外 界 的 因素 ， 比 如 局 部 贫血 、
高 热 以 及 物理 、 化 学 损伤 或 生物 的 侵袭 等 ， 造 成 细胞 急速 死亡 ; 另 一 种 称 为 细胞
凋 亡 〈apoptosis)， 这 是 1972 年 Kerr 等 建议 用 来 描述 伴随 细胞 死亡 的 一 系列 形态
学 上 特定 的 现象 ， 正 如 秋天 枫叶 的 凋谢 ， 它 是 指 细胞 在 一 定 的 生理 或 病理 条 件
下 ,遵循 自身 的 程序 ， 自 己 结束 其 生命 的 过 程 ， 细 胞 最 后 脱落 离 体 或 裂解 成 若干
凋 亡 小 体 〈apoptotic body)， 而 被 其 他 细胞 吞 鸣 。

细胞 凋 亡 的 形态 特征 与 坏死 性 细胞 死亡 的 形态 特征 不 同 。 坏 死 性 细胞 死亡 的
形态 特征 是 : 膜 通 透 性 增加 ， 细 胞 外 形 发 生 不 规则 变化 ， 内 质 网 扩张 ， 核 染色 质
不 规则 地 位 移 ， 进 而 线粒体 及 核 肿 胀 ， 溶 酶 体 被 破坏 ， 细 胞 膜 破裂 ， 胞 质 外 洲 。
这 种 细胞 死亡 过 程 常 党 引起 炎症 反应 。 细胞 凋 亡 是 由 细胞 内 在 的 有 规律 的 变化 引
”起 的 ， 它 可 由 某 些 因素 诱导 但 不 是 坏死 性 的 改变 。 这 种 细胞 死亡 的 特征 是 细胞 首
先 变 圆 ， 随 即 与 相 邻 细胞 脱离 ， 失 去 微 绕 毛 ， 胞 质 浓 缩 ， 内 质 网 扩张 呈 泡 状 并 与
细胞 膜 融合 ， 线 粒 体 无 大 变化 ， 核 染色 质 密 度 增 高 呈 半 月 形 ， 并 凝聚 在 核 膜 周
边 ， 核 仁 有 裂解 ， 核 固 缩 ， 进 而 细胞 膜 内 陷 将 细胞 自行 分 割 为 多 个 外 有 膜 包 右 、 内
含 物 不 外 泄 的 细胞 凋 亡 小 体 。 由 于 这 种 死亡 过 程 不 导致 溶 酶 体 及 细胞 膜 破裂 ， 没
有 细胞 内 含 物 外 泄 ， 故 不 引起 炎症 反应 和 次 级 损伤 ， 它 的 结局 是 被 吞噬 细胞 或 邻
细胞 所 识别 、 香 鸣 或 自然 脱落 ， 其 生物 化 学 反应 主要 是 细胞 核 内 的 DNA 被 内 切
核酸 酶 在 核 小 体 之 间 降 解 ， 产 生 若 干 大 小 不 一 的 穿 核 苷 酸 片段 ， 在 琼脂 糖 凝 胶 电
泳 上 呈现 阶梯 状 DNA 区 带 图 谱 (DNA ladder)， 这 些 区 带 由 180 一 200bp 的 不 同

,97

倍数 的 窒 核 苷 酸 片段 组 成 ， 这 个 长 度 即 是 核 小 体 间 重 复 单 位 的 大 小 。 有 趣 的 是 有
些 细胞 发 生 凋 亡 时 ， 染 色 质 DNA 并 不 降解 ， 表 明 DNA 降解 并 不 是 细胞 凋 它 必
不 可 少 的 内 容 〈 图 14-1)。

图 14-1 “淋巴 细胞 凋 亡 过 程 示意 图
(a) 正常 淋巴 细胞 有 稀 臣 的 胞 质 和 蜡染 色 质 。(b) 细胞 体积 变 小 ， 细 胞 器 聚集 ， 染 色 质 凝 集 为 团 块 。
(c) 细胞 呈现 沸腾 运动 。(d) 染色 质 沿 核 内 膜 凝集 成 月 牙 状 。(e) 核 凝 集 为 黑 孔 。
(f) 核 裂 解 为 小 球 ， 细 胞 凋 亡 小 体 发 泡 。(g) 细胞 裂解 为 油 亡 小 体 。

1980 年 ，Wgllie 等 在 糖 皮 质 激素 (glucocortocoid，GC) 诱导 胸腺 细胞 死亡
的 实验 中 ， 观 察 到 内 源 性 内 切 核酸 酶 活化 及 引起 一 系列 形态 学 和 生物 化 学 方面 的
变化 ， 提 出 了 程序 化 细胞 死亡 〈programmed cell death，PCD) 的 概念 。 目 前 ，
这 一 概念 已 为 科学 家 广泛 接受 。 但 是 不 同 的 科学 工作 者 对 PCD 概念 有 不 同 的 解
释 。 发 育 生物 学 家 使 用 PCD 来 描述 在 多 细胞 生物 的 发 育 过 程 中 ， 正 常生 理 诱导
的 ， 以 时 空 上 不 可 预料 的 方式 失去 细胞 的 现象 ， 如 哺乳 动物 趾 〈 指 ) 间 细 胞 的 丢
失 ， 晴 昨 尾 巴 脱落 等 。 而 免疫 学 家 用 PCD 来 描述 依赖 于 新 的 基因 表达 而 引起 的
任何 细胞 死亡 ， 与 刺激 物 的 性 质 无 关 ， 如 Y 射线 ， 特 异 抗体 和 糖 皮质 激素 等 引起
的 细胞 死亡 。 实 际 上 发 育 生 物 学 家 和 免疫 学 家 对 PCD 的 看 法 有 一 点 是 共同 的 ，
即 PCD 需要 新 的 基因 表达 和 和 蛋 日 质 合 成 。 这 一 结果 已 在 无 脊 椎 和 兰 椎 动物 的 细
胞 培养 中 使 用 RNA 和 蛋白质 合成 或 抑制 的 许多 实验 中 所 证 实 。

大 多 数 程序 化 细胞 死亡 ， 呈 现 细 胞 凋 亡 的 形态 特征 。 因 此 ， 不 少 研 究 人 员 认
为 PCD 和 细胞 凋 亡 可 以 互 用 ， 可 以 等 同 。 但 是 严格 说 来 ， 两 者 指 的 不 是 同一 现
和 象 。 前 者 是 功能 上 概念 ， 而 后 者 是 以 许多 细胞 死亡 中 所 见 到 的 固定 形式 的 形态 学
描述 。 已 经 发 现 ， 不 是 所 有 的 PCD 都 表现 为 细胞 凋 亡 的 形态 特征 ， 例 如 ， 烟 草
幼 座 蛾 变态 时 ， 其 幼虫 体 节 间 的 肌 细 胞 由 于 某 些 激素 的 作用 而 死亡 ， 使 幼虫 变 成
蛾 。 与 其 他 PCD 类 似 ， 这 些 肌 了 肉 细胞 的 丢失 需要 新 的 基因 表达 ， 但 这 些 细胞 死
亡 时 不 产生 膜 泡 、 染 色 质 浓缩 ，DNA 降解 等 细胞 凋 亡 的 共同 特征 。 这 一 类 细胞

。 398 。

死亡 称 为 非 凋 亡 的 程序 化 细胞 死亡 〈non-apoptotic programmed cell death )。

二 、 细 胞 凋 亡 的 意义
1. 程序 化 细胞 死亡 与 个 体 发 育

生物 的 诞生 、 发 育 、 成 长 、 存 活 以 及 死亡 是 天 然 的 有 规律 的 程序 化 过 程 ， 其
存活 至 死亡 的 时 间 称 为 寿命 。 构 成 生物 组 织 的 细胞 ， 其 生存 和 死亡 的 过 程 也 是 天
然 的 规律 的 程序 化 过 程 ， 也 有 其 寿命 。 生 物 整 体 和 细胞 虽然 都 有 自然 死亡 的 现
象 ， 但 两 者 的 生物 学 意义 却 有 显著 的 差别 。 程 序 化 细胞 死亡 是 多 细胞 动物 生命 活
动 过 程 中 不 可 缺少 的 组 成 内 容 ， 是 动物 借以 存活 的 需要 ， 因 而 贯穿 于 动物 全 部 寿
命 周期 中 。 无 论 是 低 等 动物 还 是 高 等 动物 都 是 如 此 。 例 如 某 些 昆虫 从 卵 到 成 虫 ，
牛 间 要 经 过 几 个 晓 变 期 ， 每 个 时 期 组 织 结构 以 及 外 形 都 要 发 生 改 变 ， 在 这 些 过 程
中 均 有 赖 于 新 旧 细 胞 的 生死 交替 。 死 亡 的 细胞 是 在 完成 了 它 的 使 命 而 被 淘汰 消失
的 ， 天 然 有 序 。 晴 昨 变 为 青蛙 时 尾巴 自然 消失 ， 这 种 消失 的 机 制 是 细胞 有 序 凋 亡
的 过 程 。 多 种 动物 的 趾 ( 指 ) 的 形成 ， 是 肢 柄 端 某 几 部 分 细胞 有 序 凋 亡 而 被 吞噬
消除 的 结果 。 在 哺乳 动物 胚胎 发 生 、 发 育 和 成 熟 过 程 中 ， 构 成 组 织 的 细胞 生死 交
蔡 ， 程 序 化 细胞 死亡 是 保证 个 体 发 育成 熟 所 必需 的 。PCD 规律 一 是 失常， 个 体
即 不 能 正常 发 育 ， 或 发 生 畸 形 ， 或 不 能 存活 。 皮 肤 分 为 真皮 和 表皮 ， 表 皮 和 趾
( 指 ) 甲 是 细胞 从 有 生命 向 无 生命 的 转化 ， 也 属于 程序 化 细胞 死亡 的 过 程 。 无 此
过 程 ， 动 物 即 无 鳞 、 无 皮 、 无 爪 ， 就 失去 了 保护 和 防御 机 制 的 结构 。

大 类 免疫 系统 是 最 有 代表 性 的 例子 ， 淋 巴 系统 发 育 分 化 成 熟 过 程 中 ， 始 终 伴
随 着 程序 化 细胞 死亡 。 在 工 淋巴 细胞 发 育 过 程 中 ， 多 能 干细胞 首先 发 育成 原 工
(pro-T) 淋巴 细胞 ， 原 工 淋巴 细胞 一 般 没 有 表面 标志 。 原 工 淋 巴 细胞 进入 胸腺
后 发 育成 为 前 T (pre-T) 淋巴 细胞 ， 前 工 淋 巴 细胞 主要 是 TCR -CD4- CD8&8 -的
双 阴 性 (DN) 细胞 。DN 细胞 进一步 增殖 为 双阳 性 (DP) 细胞 ， 即 TCR CD4-
CD8 细胞， 这 是 胸腺 中 最 大 的 细胞 群 。 在 这 一 阶段 ， 工 淋巴 细胞 抗原 受 体
(TCR) 基因 开始 重 排 ， 如 果 在 TCR 基因 某 一 连接 点 上 发 生 等 位 基因 无 意义 突
变 ， 不 能 产生 或 产生 不 正确 的 TCR 分 子 ， 细 胞 即 走向 程序 化 死亡 。 产 生 了 正确
的 TCR 分 子 的 DP 细胞 ， 还 必须 经 过 进一步 的 严格 选择 机 制 ， 使 可 能 识别 自身
胸腺 基质 细胞 的 ， 即 有 导致 自身 免疫 病危 险 的 细胞 走向 程序 化 死亡 ， 这 就 是 胸腺
的 阴性 选择 作用 。95% 以 上 的 DP 细胞 都 是 在 胸腺 皮质 区 内 凋 亡 ， 调 亡 小 体 被 胸
腺 上 皮 细 胞 吞噬 。 少 数 DP 细胞 进一步 发 育成 为 单 阳 性 (SP) 细胞 ， 即 TCR
CD4” CD8 -或 TCR CD4- CD8&+ 的 细胞 ， 这 就 是 成 熟 的 工 淋 巴 细胞 表 型 。 一 些
不 成 熟 的 SP 细胞 也 可 以 发 生 程序 性 死亡 。 胸 腺 微 环 境 中 细胞 和 其 他 因子 的 不 平
衡 分 布 可 以 调节 胸腺 细胞 对 程序 化 死亡 的 敏感 性 。 在 许多 情况 下 ， 细 胞 的 存活 依
赖 于 生长 因子 的 存在 ， 从 环境 中 去 除 生 长 因子 时 细胞 则 走向 程序 化 死亡 。 实 验证

。，399 ，

明 ，IL-1，IL-2，IL-3，EPO 和 CSF 都 有 抑制 细胞 发 生 程序 化 死亡 的 作用 。

B 淋巴 细胞 的 发 育 过 程 与 工 淋 巴 细胞 相似 ， 前 也 淋巴 细胞 发 育成 为 成 熟 的 也
淋巴 细胞 过 程 中 ， 编 码 免疫 球 蛋 白 的 基因 片段 要 经 过 基因 重 排 ， 才 能 在 细胞 表面
产生 独特 的 个 体型 免疫 球 蛋 白 受 体 。 如 果 发 生 错误 重组 ， 分 泌 型 免疫 球 蛋 自
(sIg) 就 不 能 正常 表达 。 很 难 精 确 计算 多 少 前 了 淋巴 细胞 可 发 育 为 成 熟 的 了 淋巴
细胞 ， 但 一 般 来 说 ， 免 疫 球 和 蛋白 基因 只 有 按 LV/LJ、HVWD 和 DVHJ 的 方式 连接
才能 形成 正确 的 密码 ， 产 生 正 确 的 sIg， 在 抗原 的 刺激 下 ， 引 起 克隆 消除 ， 从 而
把 可 能 引起 自身 反应 性 的 了 B 淋巴 细胞 克隆 清除 掉 ， 这 就 是 了 淋巴 细胞 的 阴性 选
择机 制 。 重 排 的 免疫 球 蛋白 转基因 对 鼠 的 研究 表明 ， 如 果 这 种 小 鼠 表达 同 种 抗
原 ， 则 机 体内 几乎 没有 也 淋巴 细胞 。B 淋巴 细胞 这 种 消除 过 程 也 是 通过 程序 化 细
胞 死亡 而 实现 的 。 不 成 熟 了 淋巴 细胞 株 WEHI-231 的 细胞 表面 只 有 IgM， 而 没
有 IgD， 当 使 用 抗原 免疫 蛋白 的 抗体 刺激 时 ， 即 走向 程序 化 细胞 死亡 ， 核 小 体 降
解 为 DNA 片段 。

成 熟 的 淋巴 细胞 ， 也 包括 其 他 成 熟 白细胞 的 寿命 以 天 计算 ， 死 一 批 ， 再 生 三
批 ， 互 相交 替 ， 非 常 严格 有 序 。 若 程序 化 细胞 死亡 发 生 障 碍 ， 只 生 不 死 ， 就 会 出
现 白 细胞 堆积 ， 发 生 和 白血病。 该 死 的 不 死 还 会 发 生 自身 免疫 病 。 可 见 这 一 程序 失
常 可 能 是 血 癌 和 自身 免疫 病 的 病因 之 一 。

人 的 红细胞 分 化 成 熟 后 是 无 核 有 功能 结构 的 ， 存 活 约 120 天 ， 然 后 走 朵 死
亡 ， 被 吞噬 细胞 清除 。 这 种 有 序 变化 ， 在 程序 化 细胞 死亡 过 程 中 的 红细胞 才 有 此
功能 ， 这 是 程序 化 细胞 死亡 中 的 一 个 特殊 现象 。

上 述 事 例 清楚 地 说 明 ， 程 序 化 细胞 死亡 是 多 细胞 生物 保证 个 体 正 常 发 育成 熟
和 维持 正常 生理 过 程 所 必须 的 。

2. 程序 化 细胞 死亡 与 肿瘤

在 肿瘤 的 研究 中 ， 人 们 一 直 在 试图 前 明 肿瘤 细胞 是 如 何 接受 异常 的 增殖 信和 号
而 使 其 得 以 无 限 增殖 的 ， 至 今 已 取得 了 不 少 进展 。20 世纪 80 年 代 以 来 ， 人 们 越
来 越 认识 到 ， 很 多 肿瘤 不 仅 由 于 其 细胞 增殖 率 很 高 ， 而 且 由 于 其 细胞 死亡 速度 很
低 ， 即 细胞 增殖 与 死亡 平衡 失调 造成 的 。 在 肿瘤 组 织 中 ， 通 常 存在 两 种 细胞 死守
的 形式 ， 即 坏死 性 细胞 死亡 和 细胞 凋 亡 ， 后 者 是 由 于 程序 化 细胞 死亡 造成 的 。 存
在 于 肿瘤 组 织 中 的 凋 亡 小 体 和 正常 组 织 发 育 过 程 中 产生 的 凋 亡 小 体 具 有 相同 的 超
微 结构 。 肿 瘤 细 胞 的 增殖 率 与 程序 化 细胞 死亡 的 速率 处 于 一 种 平衡 状态 ， 此 平衡
状态 决定 了 肿瘤 生长 的 速率 。 因 此 ， 在 肿瘤 发 生 过 程 中 如 何 实现 人 为 地 调控 程序
化 细胞 死亡 的 速率 是 当前 肿瘤 研究 的 一 个 焦点 。

使 用 切除 小 鼠 前 列 腺 降低 雄 激素 的 方法 诱导 程序 化 细胞 死亡 ， 发 现 雄 激素 婚
可 促进 细胞 增殖 ， 又 可 封闭 程序 化 细胞 死亡 。 去 除 雄 激素 后 ， 即 使 细胞 处 于 G0
期 也 可 走向 程序 化 死亡 ， 而 且 ， 使 用 站 3 基因 吻 除 小 鼠 的 研究 表明 ， 去 除 雄 激

.400 ，

素 诱导 的 程序 化 细胞 死亡 过 程 与 p53 的 功能 无 关 。

有 实验 表明 ， 程 序 化 细胞 死亡 参与 了 肿瘤 的 起 始 过程 ， 并 对 肿瘤 的 发 生起 负
作用 ， 瘤 前 病灶 中 程序 化 细胞 死亡 率 比 周围 正常 组 织 高 8 倍 左右 ， 由 于 肿瘤 细胞
分 裂 周 期 短 ， 必 须 通 过 程序 化 细胞 死亡 机 制 及 时 地 清除 老化 细胞 ， 肿 瘤 细 胞 增殖
过 程 中 也 可 能 产生 了 一 些 表 型 近乎 正常 的 细胞 ， 需 要 通过 程序 化 机 制 加 以 清除 ，
从 而 维持 肿瘤 细胞 群 的 高 增殖 率 。 此 外 ， 有 些 间接 的 证 据 表 明 ， 正 常 肝 细胞 癌变
过 程 中 ， 癌 前 细胞 的 程序 化 细胞 死亡 更 加 敏感 ， 容 易 被 清除 ， 这 是 机 体 上 自我 保护
功能 的 表现 。 最 近 的 实验 证 明 ， 肿 瘤 促进 剂 烟 碱 可 抑制 肿瘤 坏死 因子 。 紫 外 线 、
化 疗 药物 和 Ca 载体 介 导 的 程序 化 细胞 死亡 ， 提 示 程 序 化 细胞 死亡 可 以 抑制 肿
瘤 的 发 生 。

某 些 病毒 癌 基 因 介 导 的 细胞 转化 也 涉及 程序 化 细胞 死亡 ， 如 研究 较 多 的 腺 病
毒 基因 EIA 和 El1B。EI1A 单 独 转 染 原 代 培 养 细胞 ， 使 细胞 增殖 率 大 大 增加 ， 如
果 细 胞 表达 野生 型 p53 蛋白 ， 则 使 程序 化 细胞 死亡 大 大 增加 。E1B 可 以 抑制 p53
介 导 的 程序 化 细胞 死亡 ， 对 转化 起 决定 性 作用 ， 其 分 子 机 制 是 E1B 蛋白 能 与 野
生 型 p53 结合 而 使 其 构象 向 突变 型 转化 ， 使 p53 的 功能 丧失 ， 从 而 在 腺 病毒 转化
过 程 中 对 转化 的 启动 起 负 调 控 作 用 。

大 多 数 抗 癌 药 物 ， 如 拓扑 异 构 酶 抑制 剂 、 烷 化 剂 、 抗 代谢 物 和 激素 持 抗 齐
等 ， 都 可 在 不 同类 型 的 肿瘤 细胞 中 诱导 程序 化 细胞 死亡 。 大 量 的 研究 表明 ， 抗 瘤
药物 与 各 自 特异 靶 细 胞 的 相互 作用 ， 也 取决 于 这 些 药物 诱导 程序 化 细胞 死亡 的 能
力 。 因 此 ， 肿 瘤 细 胞 对 程序 化 细胞 死亡 的 敏感 度 是 决定 化 疗效 果 的 关键 因素 。 如
何在 治疗 中 提高 特异 肿瘤 细胞 死亡 增殖 比 已 成 为 新 的 化 疗 目标 和 筛选 抗 癌 新 药 的
标准 。

前 列 腺 瘤 细胞 常常 表现 雄 激 素 的 不 依赖 性 ， 这 是 很 危险 的 。 但 这 些 细胞 仍然
可 以 通过 其 他 信号 诱导 进入 凋 亡 途径 ， 例 如 ， 用 一 种 植物 衍生 出 来 的 倍 半 杰 Y 内
酯 处 理 这 种 细胞 ， 可 提高 并 维持 细胞 内 的 Ca 浓度， 从 而 诱导 细胞 凋 亡 ， 据 此
已 经 研制 了 一 种 新 药 治疗 前 列 腺 癌 ， 这 种 药物 只 有 在 前 列 腺 瘤 组 织 中 有 高 水 平 的
前 列 腺 特异 抗原 (PSA) 时 ， 其 活性 才 释放 出 来 。

在 肝癌 诱 变 剂 和 促进 剂 的 研究 中 发 现 ， 内 菲 诺 品 和 革 巴 比 妥 等 非 诱 变 致癌 物
的 作用 是 通过 抑制 凋 亡 而 促进 癌 前 病灶 内 细胞 存活 的 ， 提 示人 们 能 够 找到 保护 性
的 营养 物 或 药物 ， 甚 至 只 要 简单 地 限制 摄 入 的 能 量 总 量 ， 就 可 以 促进 瘤 前 细胞 或
瘤 细 胞 的 程序 化 死亡 。2- 氯 脱氧 腺 苷 〈2-cdA) 就 是 这 样 一 种 药物 ， 有 效 地 作用
于 正在 增殖 的 或 不 增殖 的 细胞 ， 引 起 细胞 内 DNA 链 断 裂 和 辅酶 (NAD) 消耗 ，
最 终 导 致 程序 化 细胞 死亡 。 但 是 在 体外 用 佛 波 酯 处 理 ， 可 以 防止 2-cdA 介 导 的
DNA 降解 ， 提 示 佛 波 酯 的 处 理 ， 激 活 了 蛋白 激酶 (PKC)， 而 PKC 干扰 了 内 切
核酸 酶 的 激活 。

增强 抗 肿瘤 药物 特异 地 诱导 程序 化 细胞 死亡 或 抑制 药物 对 正常 细胞 的 损伤 是

401 ，

改善 化 疗 的 有 效 措施 。 目 前 临床 上 使 用 的 粒 细胞 集落 因子 (G:CSF) 可 诱导 细胞
分 裂 ， 增 加 细胞 存活 率 ， 化 疗 后 病人 给 以 G-CSF， 可 使 成 熟 及 未 成 熟 的 粒 细胞 增
加 分 裂 ， 延 长 寿命 ， 使 化 疗 对 白细胞 的 损伤 很 快 恢复 。 现 在 已 知 的 大 多 数 细胞 因
子 均 能 抑制 抗 肿瘤 药物 诱导 的 程序 化 细胞 死亡 ， 提 示 内 源 性 的 细胞 因子 能 影响 化
疗 结果 。 同 时 ， 也 有 文献 报道 ， 在 某 些 情况 下 ， 提 高 细胞 内 IL-2，IL-3，IL-6 玉
G-CSF 的 水 平 ， 对 抑制 肿瘤 的 发 生 有 一 定 作用 。

毫 无 疑问 ， 随 着 程序 化 细胞 死亡 机 制 的 前 明 ， 人 们 必 将 越 来 越 多 地 把 相关 的
知识 应 用 于 各 种 临床 疾病 ， 特 别 是 肿瘤 的 预防 与 治疗 。 虽 然 目 前 还 不 能 宣布 已 经
战胜 了 肿瘤 ， 值 得 欣慰 的 是 ， 在 攻击 肿瘤 的 武器 中 又 增加 了 一 个 极 有 价值 的 新 武
器 。

二 节 “细胞 凋 亡 的 诱导 因素 、 受 体 、 相 关 基 因
一 、 细 胞 凋 亡 的 诱导 因素

诱导 凋 亡 的 因素 众多 ， 可 分 为 : 四 物理 因素 ， 如 放射 线 、 紫 外 线 、 高 温 ;
@ 化 学 因素 ， 如 抗 癌 药 物 、 氧 自由 基 、 氧 化 氮 ; @ 微 生物 ， 如 HIV、EB 病毒 ;
田 缺 乏 细胞 生长 必需 因子 、 如 肝 细 胞 生长 因子 、 雌 激素 乳腺 依赖 性 )、 雄 激素
(前 列 腺 依赖 性 ); @@ 免 疫 性 ， 是 指 抗原 和 免疫 应 答 过 程 中 所 产生 的 细胞 因子 和 细
胞 膜 分 子 。 另 外 ， 慢 性 缺 血 、 去 除 血清 或 生长 因子 、 和 营养 耗 尽 以 及 生存 信号 的 缺
失 也 可 导致 细胞 凋 亡 。 本 节 主 要 介绍 免疫 性 诱导 细胞 凋 亡 的 有 关 因 素 。

1. 细胞 因子 的 作用

不 同 的 细胞 因子 对 于 不 同 的 细胞 有 不 同 的 作用 ， 可 诱导 细胞 凋 亡 或 抑制 细胞
凋 亡 ， 后 者 常 表现 为 缺乏 某 种 细胞 因子 而 产生 “撤退 性 ”细胞 凋 亡 。 对 同一 种 细
胞 最 终 调控 的 结果 往往 表现 为 多 种 因子 相互 持 抗 或 相互 协同 的 综合 作用 。

白细胞 介 素 IL-6 对 茶 些 细胞 可 诱导 凋 亡 ， 而 多 数 ILs 起 抑制 调 亡 作用 ( 表
14-1)。

表 14-1 某 些 白细胞 介 素 在 细胞 凋 亡 中 的 作用

白细胞 介 素 轰 细 胞 效应
Ia 胸腺 细胞 抑制 凋 亡
IE2 工 细胞 增殖
IL-4 慢性 B 细 胞 ， 白 血 病 细胞 抑制 凋 亡
IL-5 外 因 血 嗜 酸性 粒 细胞 抑制 凋 亡
IL-6 人 早 幼 粒 白 血 病 、 细 胞 系 U937 诱导 凋 亡

成 熟 中 性 粒 细胞
"402 ，

2. 造血 生长 因子

此 类 细胞 因子 主要 包括 EPO ( 促 红 细胞 生成 素 )、G-CSF、GM-CSF、IL-3、
SCF (干细胞 因子 ) 等 。 造 血 生 长 因子 一 方面 促进 造血 祖 细胞 和 造血 干细胞 的 存
活 、 增 殖 、 分 化 和 发 育 ; 另 一 方面 调控 骨髓 造血 细胞 及 外 周 血 细胞 的 寿命 ， 使 血
细胞 的 增殖 和 死亡 保持 适当 的 比例 ， 维 持 血细胞 数目 在 一 定 范 围 内 保持 动态 平
衡 。 造 血 生 长 因子 调控 血细胞 发 生 于 胚胎 期 ， 并 贯穿 整个 造血 过 程 。

3. 肿瘤 坏死 因子 (TNF )

TNF 既 可 诱导 细胞 坏死 ， 又 可 诱导 细胞 凋 亡 。 细 胞 的 死亡 方式 与 细胞 种 类
有 关 ， 如 TNF-a 可 抑制 体外 培养 的 单 核 细胞 发 生 凋 亡 ， 却 可 诱导 一 些 肿 瘤 细 胞
的 调 亡 。TNF 作用 原理 是 通过 TNF 受 体 激活 细胞 膜 的 磷脂 ， 产 生 第 二 信使 神经
酰胺 。 其 作用 类 似 Fas 配 体 与 Fas 之 间 的 作用 。

二 、 与 细胞 凋 亡 相 关 的 受 体
1. Fas 和 FasL

Fas 又 称 APO-1， 现 命名 为 CD95 分 子 。Fas 与 其 配 体 FasL_ (Fas ligand) 相
互 作 用 是 引起 细胞 凋 亡 的 主要 途径 之 一 ， 因 而 是 当前 免疫 性 凋 亡 研 究 的 热点 。

(1) Fas 属 TNEFR/NGEFR 家 族 成 员

Fas 基因 十 位 于 人 染色 体 10q924.1， 小 鼠 中 是 在 第 19 号 染色 体 上 。 其 编码 产
物 分 子 质量 为 4$SkDa I 型 跨 膜 蛋 白 ， 由 胞 外 区 (157aa) 、 跨 膜 区 (17aa) 及 胞 浆
区 (145aa) 组 成 。 其 胞 浆 区 的 60 一 70 氮 基 酸 序 列 与 TNFR 胞 浆 区 有 高 度 同 源
性 ， 因 介 导 细胞 死亡 ， 故 称 之 为 死亡 域 (death domain)， 因 此 ，Fas 又 可 称 做 死
亡 分 子 。Fas 主要 以 膜 受 体形 式 存 在 ， 还 可 通过 在 转录 水 平 的 不 同 拼接 产生 可 洲
性 Fas 分 子 ， 后 者 在 细胞 凋 亡 中 起 调节 作用 。Fas 较 广 泛 地 分 布 于 多 种 类 型 的 细
胞 ， 包 括 外 周 活化 工 也 淋 巴 细胞 、NK 细胞 、 单 核 细胞 、 成 纤维 细胞 、 内 皮 细
胞 等 。 某 些 组 织 细胞 经 活化 后 也 可 诱导 Fas 表达 。

Fas 工 为 TNF 相关 的 II 型 分 子 ， 分 子 质量 40kDa， 其 N 端 在 胞 浆 内 ， 路 膜
部 有 一 朴 水 域 ， 其 C 端 位 于 胞 膜 外 ， 胞 外 区 约 150 个 氨基 酸 与 TNF 家 族 成 员 高
度 同 源 。 因 Fas 工 能 与 Fas 结合 诱发 凋 亡 ， 故 把 Fas L 称 死 亡 因 子 。 忌 Fas 工 基
因 定 位 于 第 1 号 染色 体 。 鼠 和 人 Fas 工 蛋白 分 子 同 源 性 高 达 76.9%， 且 无 种 属 特
异性 ， 所 以 人 的 Fos 工 基因 转 染 给 小 鼠 细 胞 ， 可 诱发 凋 亡 。Fas 工 亦 可 分 泌 或 脱落
至 细胞 外 ， 成 为 可 溶性 的 功能 活性 分 子 。Fas 世 主要 表达 于 活化 的 工 淋巴 细胞 。

(2) Fas 和 FasL 的 生物 学 效应

TNFR/VNGFR 超 家 族 中 ， 只 有 Fas 和 TNFR1 型 可 介 导 细胞 凋 亡 ， 而 且 Fas

， 403 ，

抗原 呈 递 细胞
MHC

电离 辐射

2

糖 皮 质 激素 受
体 诱 导 的 基因 C-11IYC p53

细胞 凋 亡

图 14-2 外周 工 细胞 凋 亡 时 的
信和 号 传递 通路

介 导 细胞 凋 亡 必 须 具 备 3 个 条 件 : @ 细
胞 表达 足够 密度 的 Fas; @OFas 与 其 配 体
或 单 抗 作 用 形成 三 聚 体 ; 图 细胞 关闭 抗
凋 亡 程 序 而 成 为 调 亡 敏 感 型 细胞 。 许 多
组 织 均 可 表达 Fas， 但 仅 免 疫 系 统 对 Fas
系统 介 导 的 细胞 凋 亡 最 为 敏感 。 如 Fas
可 诱导 胸腺 细胞 阴性 选择 ， 诱 导 外 周 自
身 反 应 性 工 细 胞 凋 亡 ， 诱 导 被 某 些 抗原
活化 的 T、B 细胞 凋 亡 以 及 诱导 和 白血病
细胞 凋 亡 。

2. T 细 胞 受 体 (TCR

胸腺 中 未 成 熟 工 细胞 通过 TCR 与 自
身 抗原 相 结合 可 发 生 凋 亡 (图 14-2，
14-3)。CD3 单 抗 可 诱导 成 熟 工 细胞 增
殖 ， 对 未 成 熟 的 工 细 胞 则 导致 调 亡 ， 但
凋 亡 作 用 可 被 佛 波 酯 (PMA) 所 持 抗 。
在 小 鼠 胸 腺 未 成 熟 工 细胞 培养 结束 前
18h 加 入 CD3 单 抗 ， 观 察 到 细胞 数 减少
了 45%， 同 时 伴 有 大 量 DNA 片段 释 出 。
电镜 下 也 只 见 到 典型 的 凋 亡 形态 特征 。
用 CD4 单 抗 预先 处 理 工 细 胞 ， 然 后 再 用

TCR 抗体 一 起 孵育 过 夜 ， 就 可 见 大 量 细胞 凋 亡 ， 而 将 CD4 单 抗 与 TCR 单 抗 同时
加 入 工 细 胞 孵育 则 不 出 现 凋 亡 而 发 生 增 殖 ， 说 明 CD4 分 子 对 细胞 在 接受 刺激 时

是 否 发 生 凋 亡 也 起 作用 。

T 细 胞

图 14-3 抗原 诱导 工 细 胞 凋 亡 的 机 制

”404 ，

三 、 细 胞 凋 亡 相关 基因

大 多 数 细胞 在 凋 亡 过 程 中 需要 新 的 基因 表达 ， 因 而 人 们 认为 ， 发 生 凋 亡 的 细
胞 是 接受 外 来 信号 后 ， 发 生 自杀 ， 而 不 是 他 杀 。 对 胸腺 细胞 和 工 细 胞 比较 研究
表明 ， 胸 腺 细胞 经 糖 皮质 激素 处 理 后 发 生 凋 亡 ， 而 成 熟 的 工 细胞 经 糖 皮质 激素
同样 处 理 后 不 发 生 凋 亡 ， 说 明 前 者 表达 了 自杀 基因 ， 而 后 者 没有 表达 。 进 入 20
世纪 90 年 代 ， 应 用 分 子 生 物 学 技术 进一步 开展 了 凋 亡 相关 基因 和 诱导 凋 亡 信和 号
传导 途径 的 研究 。 对 线虫 和 哺乳 动物 的 研究 证 明 存 在 调 亡 相 关 基 因 。 一 类 为 促进
凋 它 基因 或 称 为 细胞 死亡 基因 (cell death gene，Ced)， 线 虫 为 Ced-3， Cecd-4，
哺乳 类 为 白细胞 介 素 -18 转换 酶 〈(IL-18 converting enzyme，ICE) 基因 ，z253 基
因 ，Fes 基因 ，?axr77 基因 等 。 另 一 类 为 抑制 调 亡 基因 或 称 为 细胞 死亡 抑制 基因
(cell death suppressor gene)， 线 虫 为 Ced&9， 哺 乳 类 为 bc/L-2 (B-cell lymphomay
leukemia-2) 和 Bauz 等 。

1. 线虫 细胞 凋 亡 的 基因 调控

人 们 对 细胞 凋 亡 发 生机 制 的 认识 大 多 来 自 对 美丽 隐 杆 线虫 〈caezorpapditis
elegazs，CE) 发 育 中 的 凋 亡 基因 调控 的 研究 。 体 积 微小 的 CE 在 且 胎 发 育 期 间 共
产生 1090 个 体 细胞 ， 而 在 发 育 过 程 中 有 131 个 细胞 死亡 ， 因 此 ， 成 熟 的 CE 有
959 个 体 细 胞 。CE 发 育 中 的 细胞 死亡 是 一 种 典型 的 细胞 凋 亡 。 与 CE 死亡 有 关 的
基因 共有 14 个 。 各 自发 挥 不 同 功能 ， 其 中 直接 控制 CE 凋 亡 的 基因 主要 有 3 个 ，
即 ced-3，ced-4 和 ced-9. 在 缺失 ced-3 或 ced-4 的 CE 突变 体 中 不 发 生 凋 亡 ， 而 在
成 长 期 仍 保留 多 余 细 胞 。Ced-9 对 ced-3 和 ced-4 具有 调控 作用 ， 可 防止 凋 亡 过 度
发 生 。Cedz-9 过 度 表 达 时 ， 可 抑制 ced-3 和 ced-4 的 功能 ， 使 油 亡 不 能 发 生 。 而
ced-9 功能 不 良 时 CE 往往 在 胚胎 期 即 因 细胞 过 度 凋 亡 而 死亡 。 因 此 ，ced-9 是
CE 发 育 过 程 中 控制 细胞 生 与 死 的 开关 。

2. 哺乳 类 动物 细胞 凋 亡 相关 基因

哺乳 类 动物 细胞 凋 亡 的 基因 调控 要 比 线虫 复杂 得 多 。 主 要 有 下 述 4 类 。

(1) pcl-2 基因 家 族

pcL-2 基因 家 族 的 基因 包括 : pcL-2，pcLz，paz，z7nzcL-1l 和 Al 等 。

1) pcL-2。pcL-2 因 首 先 发 现 于 人 类 也 细胞 淋巴 瘤 而 得 名 ， 随 后 发 现 Bel-2 可
调节 细胞 凋 亡 。BclL2 蛋白 的 分 子 质量 为 23SkDa 一 26kDa。 Bcl!-2 转基因 小 鼠 可 明
显 延长 小 鼠 细胞 寿命 。 即 使 在 某 些 生长 因子 缺乏 时 ，Bcl-2 也 可 阻止 骨 艇 细胞 和
淋巴 细胞 死亡 ， 并 阻止 cmyc 介 导 的 细胞 死亡 。 但 Bcl2 的 表达 不 能 阻止 所 有 类
型 的 生理 性 细胞 死亡 ， 也 不 能 使 细胞 抵抗 CTL 的 杀伤 作用 。Bcl2 抑制 哺乳 类 动

' 405 ，

物 细胞 凋 亡 的 能 力 类 似 于 Ced-9 抑制 CE 细胞 凋 亡 的 能 力 。 人 类 zcL2 基因 转 染
CE 时， 也 可 阻止 CE 中 Ced-3 和 Ced-4 所 介 导 的 细胞 凋 亡 。Bcl2 的 作用 广泛 ，
如 哺乳 类 动物 细胞 对 麦 氮 钠 、 秋 水 仙 碱 、DNA、RNA 和 和 蛋白质 合成 抑制 剂 ， 类
固 醇 ， 射 线 作 用 以 及 生长 因子 耗竭 所 致 的 死亡 的 抵抗 作用 。

2) pcl-z。pc/-z 编码 241 个 氨基 酸 的 蛋 白 质 ， 与 Ba-2 有 74% 同 源 性 。 进 一
步 分 析 发 现 ，pcjz 分 两 型 ， 一 型 为 pcLzL， 编 码 241 个 氨基 酸 ， 存 在 于 长 寿 细
胞 〈 如 神经 元 ) 中 ， 与 bc-2 有 相同 作用 ; 另 一 型 为 kcl-zs， 缺 乏 5cL-2 编码 的 63
个 氨基 酸 的 高 度 保护 区 ， 存 在 于 短 寿 细 胞 中 〈 如 未 成 熟 的 CD4`“，CD8" T 细
胞 )， 对 bclL-2 有 抑制 作用 。

3) parz。Bax (bcl-2 associated x protein ) 蛋白 由 192 个 氨基 酸 组 成 ， 分 子
质量 为 21kD。 它 与 Bcl-2 蛋白 有 21% 同 源 性 ， 可 与 Bcl-2 形成 异 二 聚 体 ， 从 而 使
Bcl-2 失 活 ， 故 Bax 在 功能 上 与 Bcl-2 相反 。BclL-2 和 Bax 的 表达 程度 决定 了 细胞
命运 。Bax 占 优 势 时 细胞 趋向 调 亡 ， 而 Bcl2 占 优势 时 阻止 细胞 凋 亡 发 生 。

4) aclL-1 和 Al 的 生物 学 功能 至 今 不 明 。

(2) ICE 基因

ICE 即 和 白细胞 介 素 -18 转换 酶 ， 在 体内 是 以 非 活性 形式 存在 的 ， 在 颗粒 酶
(来 自杀 伤 细胞 ) 的 作用 下 可 形成 活性 ICE。ICE 是 半 胱 氨 酸 蛋白 酶 ， 能 使 无 活
隆 IL-18 前 体 转 成 有 活性 IL-18， 后 者 可 诱导 Fas 基因 表达 。 又 由 于 ICE 在 结构
上 与 线虫 Ced-3 凋 亡 蛋白 有 28% 的 同 源 性 ， 故 ICE 本 身 有 类 似 Ced-3 直接 诱导 凋
亡 的 作用 。 已 知 Bc/-2 和 P53 基因 可 持 抗 ICE 诱导 凋 亡 作用 ， 故 Be/-2 失 活 或
ICE 基因 过 度 表 达 时 ， 易 诱发 细胞 凋 亡 。

(3) c-zzyc 癌 基 因

目前 已 知 cmyc 分 子 有 诱导 凋 亡 活性 的 结构 域 ， 但 c-myc 分 子 正 常 功能 是 使
GO/G1 期 细胞 进入 S 期 ， 促 进 细 胞 增殖 。 进 入 S 期 的 细胞 在 生长 因子 作用 下 ，
细胞 才能 进入 有 效 分 裂 期 ， 如 缺乏 生长 因子 时 ， 则 cmyc 激活 Fas 基因 即 诱 发 细
胞 凋 亡 。 因 此 ，c-myc 有 既 可 引起 细胞 增殖 ， 又 可 引起 凋 亡 的 双向 作用 ， 主 要 决
定 于 其 他 因子 对 它 的 影响 。

C-712VYC 基因 在 许多 哺乳 类 动物 肿瘤 (如 人 类 乳腺 癌 、 结 肠 癌 、 富 颈 癌 ) 中 呈
高 表达 ， 且 表达 程度 与 瘤 细 胞 体外 生长 速度 相关 ， 表 明 cyc 基因 与 肿瘤 增殖 有
关 。 但 是 ， 在 缺乏 营养 物质 或 抗体 作用 下 ，c-yc 高 表达 的 瘤 细 胞 则 易 发 生 油 亡 。
例如 高 表达 cnyc 基因 的 抗 工 细胞 杂交 瘤 在 抗 CD3 单 抗 作用 下 易 发 生 凋 亡 。

(4) 253 抑 癌 基 因

抑 癌 基 因 253 在 细胞 凋 亡 中 起 重要 作用 。 射 线 或 化 疗 药物 引起 淋巴 细胞
DNA 损伤 引起 的 细胞 凋 亡 绝 对 需要 p53 蛋白 的 存在 ， 而 糖 皮质 激素 ， 钙 离子 载
| 周 亡 却 无 需 p53 蛋白 参与 。p53 蛋白 功能 是 多 方面 的 ;四 与
特定 序列 DNA 结合 ， 使 细胞 停滞 于 G1 期 ; @ 与 复制 蛋白 A 结合 ， 阻 止 细胞 进

"， 406 ，

ji 入 S 期 ; @ 是 WAFVcizl 基因 的 转录 因子 ， 诱 导 产 生 p21， 而 后 者 又 与 周期 素 依

赖 的 激酶 〈cedk) 相 结合 ， 从 而 抑制 细胞 增殖 ; 四 如 果 损 伤 的 DNA 在 Gl 期 未 能 修
复 ， 则 p53 直接 诱发 细胞 凋 它 ， 以 防止 受 损 的 DNA 进 入 S 期 ， 产 生 突 变 细胞 。

临床 上 许多 肿瘤 如 结肠 癌 、 肺 癌 常 伴 有 253 突变 。 这 样 就 使 肿瘤 细胞 不 但
增殖 显著 ， 而 且 凋 亡 又 明显 减弱 ， 故 肿瘤 多 呈 恶 性 生长 。

第 三 节 ”病毒 感染 与 细胞 翌 记
一 、 病 毒 基 因 与 细胞 凋 亡

病毒 感染 细胞 早期 〈 吸 附和 穿 透 时 期 ) 往往 能 诱导 细胞 凋 亡 。 其 结果 是 病毒
的 复制 和 当代 病毒 的 产生 及 在 宿主 细胞 中 的 扩散 受到 极 大 限制 ， 由 于 病毒 的 复制
和 党 殖 是 笨 主 依赖 性 的 ， 病 毒 利用 宿主 细胞 的 能 量 和 物质 合成 病毒 基因 组 和 复 白
质 ， 所 以 ， 在 长 期 的 进化 过 程 中 ， 病 毒 已 形成 一 种 抑制 或 延迟 宿主 细胞 凋 亡 的 机
制 ， 进 入 笨 主 后 立即 表达 出 的 最 早期 蛋 昌 常 常 能 抑制 宿主 的 凋 疡 ， 以 完成 自身 的
生命 周期 并 维持 繁衍 。 病 毒 编 码 的 细胞 凋 亡 抑制 蛋白 在 凋 亡 抑 制 中 起 重要 作用 。
目前 已 知 的 病毒 基因 编码 的 细胞 凋 亡 抑制 蛋白 见 表 14-2。

表 14-2 ”病毒 编码 的 凋 亡 抑制 蛋白

病毒 病毒 编码 的 凋 亡 抑制 蛋白

人 腺 病毒 E1B-19K，E1B-55SK，E3-14.7K
E3-10.4/14.5K，E3-6.7K

人 巨细 胞 病毒 IE1 下 2 VICA

牛 总 病 毒 CrmA

痘 苗 病毒 SPIL2，A53R

黏 病毒 MT2 MI1L

猴 病 毒 40 Large 工

非洲 黄 热 病 病毒 LMW-5-HL (Bcl-2 同 源 物 )
A224L (IAP 同 源 物 )

人 免疫 缺陷 性 病毒 Tat Vpr pl7/24

杆 状 病毒 p35，p49，IAP

人 鼻 咽 癌 病 毒 BHRF-1，LMP-1，BALF1

人 乳头 瘤 病 毒 E6

二 、 病 毒 对 细胞 凋 亡 的 抑制 机 制 及 生物 学 意义

病毒 基因 编码 的 抑制 细胞 凋 亡 蛋白 种 类 很 多 ， 其 抑制 细胞 凋 亡 的 机 制 不 尽 相
407

同 ， 涉 及 细胞 凋 亡 信号 传导 途径 中 的 各 个 环节 。@ 抑 制 死 亡 受 体 在 细胞 表面 的 聚
集 ; @ 抑 制 死 亡 受 体 与 死亡 配 体 的 结合 ; @@ 抑 制 Bcl-2 家 族 中 促 凋 亡 成 员 的 功
能 ; 人 抑制 Ca 活性 。 当 受到 病毒 感染 时 ， 宿 主 发 生 一 系列 极其 复杂 的 反应
细胞 合成 一 系列 蛋白 质 〈 包 括 水 解 酶 和 蛋白 酶 )， 并 启动 吞噬 细胞 、 自 然 杀 伤 细
胞 、 细 胞 毒 工 细胞 和 辅助 工 细胞 ， 以 及 中 性 粒 细胞 和 也 细胞 发 挥 功能 ， 另 外 ,在
病毒 侵 染 细胞 的 部 位 ， 细 胞 还 通过 干扰 素 (IFN) 通过 传导 信和 号 的 潜能 进行 反应 。
可 见 ， 和 宿主 对 病毒 感染 有 着 极其 复杂 的 反应 。 病 毒 能 够 最 终 通过 宿主 的 内 在 防护 网
而 完成 感染 过 程 。

在 宿主 对 病毒 感染 所 产生 的 众多 反应 中 ， 细 胞 凋 亡 是 宿主 抵制 病毒 感染 的 有
效 方式 。 病 毒 感染 早期 的 细胞 凋 亡 可 抑制 病毒 DNA 的 复制 ， 病 毒 基因 的 表达 ，
因而 导致 子 代 病毒 量 显著 减少 。

病毒 以 各 种 方式 抑制 这 种 感染 早期 的 宿主 细胞 凋 亡 ， 才 使 得 病毒 能 够 进行
DNA 复制 ， 蛋 白 质 合 成 ， 完 成 子 代 病毒 装配 ， 完 成 病毒 本 身 的 生命 周期 。 病 毒
对 细胞 凋 亡 的 抑制 是 在 进化 过 程 中 自然 选择 的 结果 。

从 病毒 和 宿主 的 相互 关系 中 看 ， 很 自然 地 理解 有 效 抑制 宿主 细胞 在 病毒 感染
早期 的 调 亡 对 病毒 乏 衍 的 重要 性 ， 因 而 也 能 够 理解 正 是 自然 选择 的 压力 ， 使 得 那
些 能 够 有 效 抑制 簿 主 细胞 早期 凋 亡 的 病毒 得 以 选择 生存 。

第 四 市 ”细胞 凋 亡 信和 号 传导 放 径 及 调控

细胞 凋 亡 的 信号 途径 就 是 指 装 配 “ 死 亡 复 合 物 ” 的 上 游 信号 通路 ， 也 就 是 从
细胞 接收 或 感应 到 死亡 刺激 信号 直至 形成 “死亡 复合 物 ” 这 之 间 死 亡 刺 激 信号 所
走 过 的 路 程 ， 目 前 普遍 认为 在 哺乳 动物 细胞 内 ， 存 在 两 条 经 典 的 细胞 凋 它 信号 途
径 。 即 : @ 线 粒 体 介 导 的 细胞 调 亡 信号 传导 途径 ， 这 也 是 一 种 内 在 的 信号 传导 途
径 ， 简 称 线粒体 途径 ; @ 死 亡 受 体 介 导 的 细胞 凋 亡 信号 传导 途径 ， 简 称 死亡 受 体
途径 ;又 称 为 外 在 的 信号 传导 途径 ， 另 外 ， 内 质 网 介 导 的 细胞 凋 亡 信号 作为 哺乳
动物 细胞 凋 亡 的 一 条 新 的 细胞 凋 亡 信 号 传导 途径 ， 正 在 为 人 们 接受 。 但 每 个 信和 号
传导 途径 并 不 是 彼此 独立 ， 它 们 之 间 存 在 着 交叉 。

一 、 线 粒 体 介 导 的 细胞 凋 亡 信号 传导 途径

线粒体 在 细胞 凋 亡 中 举足轻重 ， 是 通过 利用 无 细胞 体系 所 进行 的 一 系列 研究
被 发 现 并 被 证 实 。 在 无 细胞 体系 中 ， 受 BclL2 抑制 的 核 固 缩 和 DNA 片段 化 依赖
于 线粒体 的 存在 。 在 LiuX 等 人 1996 年 所 进行 的 无 细胞 体系 实验 中 ， 加 入 脱氧 腺
三 磷酸 所 诱导 的 Caspase 激活 依赖 于 细胞 抽 提 过 程 中 细胞 色素 c 从 线粒体 释放 这
一 过 程 的 存在 。 另 外 ， 细 胞 凋 亡 的 体内 和 体外 实验 均 证 明 ， 在 细胞 凋 亡 过 程 中 细
408 ，

1
和

胞 色素 c 从 线粒体 释放 ， 并 且 这 一 过 程 受 位 于 线粒体 上 的 Bcl-2 抑制 。

线粒体 途径 在 细胞 受到 诱导 DNA 损伤 或 抑制 DNA 修复 的 试剂 处 理 时 得 到
启动 ， 此 时 细胞 色素 c 从 线粒体 释放 到 细胞 质 中 ， 细 胞 色素 从 线粒体 释放 到 细胞
质 中 后 成 为 调 亡 体 (apoptosome) 的 一 个 基本 组 成 部 分 ， 调 亡 体 由 细胞 色素 e，
凋 亡 蛋白 酶 活化 因子 -1 和 Pro-Caspase-9 组 成 。 凋 亡 体形 成 的 结果 是 Pro-Caspase-
9 被 激活 。 被 激活 的 Caspase-9 再 切割 和 激活 下 游 的 Caspase。Caspase 切割 细胞 内
多 种 底 物 ， 执 行 细胞 凋 亡 。 在 线粒体 途径 中 ， 除 了 细胞 色素 c 外 ， 还 有 一 些 其 他
的 凋 亡 介 导 物质 在 凋 亡 过 程 中 从 线粒体 释放 到 细胞 质 中 ， 如 APF (apoptotic pro-
tein activating factor-1， 调 亡 诱导 因子 )。 有 些 细胞 的 线粒体 含 Pro-caspase-3， 其
功能 尚 在 研究 中 。

由 此 可 见 ， 从 细胞 接收 或 感应 到 引起 DNA 损伤 的 刺激 信号 开始 ， 线 粒 体 作
为 细胞 应 激 反应 的 感受 硕 感 应 刺激 ， 释 放 细 胞 色素 到 细胞 质 ， 最 终 诱 发 细胞 凋
亡 ， 线 粒 体 途 径 如 图 14-4 所 示 。

DNA 损伤 等 信号
|

细胞

CCaspase3
ED sa

图 14-4 ”线粒体 介 导 的 细胞 凋 亡 信号 传导 途径
(一 ) 线粒体 凋 亡 信和 号 传导 途径 的 调控

细胞 凋 亡 是 一 个 严密 调控 的 过 程 。 线 粒 体 介 导 的 细胞 凋 亡 传导 途径 的 调控 在
两 个 水 平 上 进行 。

1. Bcl-2 家 族 和 蛋白 对 线粒体 膜 完整 性 的 调控

对 线粒体 膜 的 完整 性 的 调控 主要 由 Bcl-2 家 族 成 员 完成 。Bcl2 家 族 成 员 以 不

同 的 方式 调控 着 线粒体 膜 的 完整 性 ， 其 中 抑制 凋 亡 成 员 能 够 保持 线粒体 膜 的 完整

性 ， 抑 制 调 亡 激 活 因子 从 线粒体 内 膜 空间 的 释放 。 如 BclL-2 和 Bcl-XL 是 BclL2 家

族 中 两 个 抑制 细胞 凋 亡 的 成 员 。 二 者 均 可 保持 线粒体 外 膜 的 完整 ， 抑 制 细 胞 色素

c 从 线粒体 释放 到 细胞 质 ， 从 而 阻 断 调 亡 信号 的 传导 ， 抑 制 细 胞 凋 亡 。Bcl2 家 族
。 409 ，

成 员 对 细胞 凋 亡 的 调控 作用 并 不 是 单 癌 的 直线 形式 ， 例 如 Bcl2 对 细胞 凋 记 的 抑
制 受 Caspase 的 调节 ， 凋 亡 细 胞 中 活化 的 Caspase-3 能 够 在 ASP34 的 位 置 切 割
Bcl-2，Bcl-2 被 切割 后 转移 到 线粒体 中 ， 促 使 线粒体 释放 细胞 色素 c。 从 而 促进
细胞 凋 亡 ， 可 见 Bcl-2 细胞 凋 亡 不 仅 存在 着 负 调 控 作 用 ， 而 且 还 有 正 调控 作用 。

Bcl-2 家 族 中 促进 调 亡 的 成 员 则 破坏 线粒体 膜 的 完整 性 ， 加 速 调 亡 激活 因子
从 线粒体 内 膜 空 间 向 细胞 质 释 放 ， 促 进 凋 亡 发 生 。 例 如 BAK 是 BclL2 家 族 成 员
中 的 促 凋 亡 蛋 白 ， 可 通过 与 线粒体 外 膜 上 的 电压 依赖 型 离子 通道 结合 ， 改 变 线 粒
体 膜 透 性 ， 使 线粒体 膜 通 透 性 转换 孔 开 关 ， 细 胞 色素 c 得 以 释放 。 了 BclL2 家 族 中
的 另 一 个 促 凋 亡 成 员 同 BID 诱导 线粒体 释放 细胞 色素 c 的 功能 ， 可 被 Caspase-8
的 专 一 性 抑制 剂 ZVAD-fmk 及 cr mA 所 抑制 ， 进 一 步 的 研究 发 现 ，BID 只 有 在
被 活化 的 Caspase 切割 以 后 ， 才 易 位 到 线粒体 外 膜 表 面 ， 在 线粒体 膜 上 形成 孔
道 ， 诱 导 细 胞 色素 c 的 释放 。

Bcl2 家 族 成 员 对 细胞 凋 亡 的 调控 作用 并 不 是 简单 孤立 的 ， 它 们 在 对 线粒体
膜 完 整 性 的 调控 上 也 同样 表现 出 相互 联系 和 交叉 。

2. Caspase-9 激活 水 平 的 调控

IAP、SmacDIALO 和 Htr2A/Omi 均 参 与 Caspase-9 的 激活 水 平 的 调控 。
IAP 家 族 成 员 可 以 抑制 Caspase-9 的 激活 ， 而 IAP 的 这 种 抑制 作用 又 可 以 被 另外
两 个 从 线粒体 释放 的 蛋白 质 所 抑制 。 这 两 个 蛋白 质 即 Smat/DIABLO 和 Htr2A/
Omi。 最 近 的 研究 结果 表明 : 特异 性 蛋白 质 - 生 白质 相互 作用 功能 区 参与 Caspase-
9 的 激活 。 人 和 上 鼠 的 Caspase-9 分 别 含 有 ATPF 和 AVPY 四 肽 功能 区 。 此 功能 区
与 XIAP 中 的 BIR3 功能 区 相互 作用 抑制 了 Caspase-9 的 激活 。Smac/DIABLO 结合
到 XIAP 的 BTR3 区 后 ，Caspase-9 便 从 XIAP 的 抑制 中 释放 出 来 。 最 近 人 们 发
现 ，Htr2A/Omi 所 含 的 AVPS 四 肽 功能 区 与 XIAP 的 相同 作用 也 能 够 抑制 XIAP
的 功能 ，Htr2A/Omi 与 XIAP、BIR2 和 BIR3 结合 也 起 到 促进 Caspase-9 激活 从
而 促进 凋 亡 的 功能 。

二 、 和 亡 受 体 介 导 的 细胞 凋 亡 信号 传导 途径
1. 死亡 受 体 (death receptor，DR) 和 和 死亡 配 体 (death ligand，DL)

死亡 受 体 (DR) 是 存在 于 某 些 细胞 表面 的 一 类 和 蛋 昌 质 ， 它 们 可 以 通过 与 死
亡 配 体 结合 ， 传 导 死 亡 配 体 携带 的 凋 亡 信号 迅速 激活 Caspase 而 诱导 细胞 凋 亡 。
死亡 受 体 是 肿瘤 坏死 因子 (tumor necrosis factor，TNF) 受 体 超 家 族 (superfamii-
ly) 成 员 。 它 们 的 结构 特点 是 有 胞 外 半 胱 氨 酸 富 集 结构 域 (cystein-rich domain，
CRD) 和 胞 内 死亡 结构 域 (death domain，DD)。 目 前 研究 最 清楚 的 死亡 受 体 是
CD95 (也 称 Fas 或 Apol) 和 TNFRI1 (又 称 P55 或 CD120a)。 已 发 现 的 死亡 受 体

“40 ，

3

有 禽类 的 CAR1 和 死亡 受 体 3CDRS (又 称 APO; )， 死 亡 受 体 4 (DR4)， 死 亡 受

体 SDR5 (又 称 APO)，TRAIL-R2，TRICK-2 或 KILLER)。P75 神经 生长 因子
(NGF) 受 体 (又 称 NTR) 也 含有 死亡 结构 域 (DD)。P75 (NTR) 的 分 子 结构
和 介 导 细胞 凋 亡 的 性 能 与 CD120a (TNFR1，PS5$) 和 Fas (CD95) 有 明显 的 相

， 似 性 ， 也 属于 TNEFVNGEF 受 体 成 员 。 目 前 已 知 的 死亡 配 体 有 CD95 配 体 ， 又 称

CD95L (CD95，Fas ligand) 其 可 结合 CD95 ( 即 Fas); TNF 和 淋巴 毒素 可 以
结合 THFR1，APO; 配 体 ( 即 APO3L 或 TWEAK) 可 以 结合 死亡 受 体 3 (DR3);
APO， ( 即 DR5，TRALR2) 配 体 (又 称 APO)L 或 TRAIL) 可 以 结合 死亡 受 体 4
(DR4) 和 死亡 受 体 5 (DR5)。CARI1 的 配 体 尚未 发 现 。

死亡 受 体 途 径 的 主要 环节 如 下 : 死亡 配 体 携带 着 凋 亡 信号 ， 通 过 与 死亡 受 体
结合 将 凋 亡 信号 传 到 死亡 受 体 。 死 亡 受 体 在 与 死亡 配 体 的 结合 中 守 聚 化 并 被 激
活 。 激 活 的 守 聚 化 死亡 受 体 通过 死亡 结构 域 (DD) 与 接头 分 子 结合 ， 将 凋 亡 信
号 传 到 接头 分 子 并 使 接头 分 子 窒 聚 化 而 被 激活 ， 接 头 分 子 再 通过 死亡 效应 结构 域
(DED) 或 Caspase 已 接收 到 凋 亡 信 号 ， 细 胞 凋 亡 得 到 启动 。Caspase 在 凋 亡 体 中
被 激活 ， 激 活 后 的 Caspase 或 继续 激活 下 游 Caspase， 或 直接 分 解 细胞 蛋白 质 ， 最
终 完成 细胞 凋 亡 。

由 于 死亡 受 体 和 接头 分 子 种 类 较 多 ， 其 相应 激活 的 Caspase 又 有 一 定 的 特异
性 ， 所 以 上 述 的 死亡 受 体 途 径 中 的 主要 环节 ， 对
不 同 的 死亡 受 体 和 接头 分 子 而 言 ， 每 一 环节 都 各
具 特 点 。 现 以 Fas 和 FADD 介 导 的 凋 亡 信 号 传导
途径 为 例 ， 说 明 死 亡 受 体 介 导 的 细胞 凋 亡 信和 号 传
导 途 径 的 分 子 结构 基础 。

_Fas 的 死亡 结构 域 DD 含有 6 个 由 短 的 loop
环 相 连 的 c 螺旋 ， 其 中 ww， o-asloop 环 和 oa 人 参与
Fas 和 FADD 死亡 结构 域 DD 的 结合 。FADD 的
DD 含有 类 似 的 6 个 螺旋 。FADD 和 Fas 的 DD
中 的 和 om 均 含 有 许多 带电 荷 氨基 酸 残 基 ， 故
推测 二 者 的 相互 作用 涉及 静电 相互 作用 。

FADD 的 死亡 效应 结构 域 DED 具有 与 其 死亡

结构 域 DD 非常 相似 的 三 维 结构 ， 而 且 也 含 6 个 。 Caspases
螺旋 。 但 是 螺旋 的 长 度 、 方 向 以 及 连结 各 螺旋 的 及
loop 环 的 长 度 与 DD 的 不 同 。 另 外 ，DED 有 2 个 本 1:
玻 水 区 是 DD 所 没有 的 。 已 有 实验 结果 表明 DD 浊

和 JDED 用 不 同 的 氨基 酸 残 基 进 行 蛋白 质 相 互 作

用 。DED 与 Caspase 的 相互 作用 并 不 涉及 静电 作 .图 14-5 Fas 和 FADD 介 导 的 细

用 ， 而 是 通过 和 中 所 含 的 朴 水 氨基 酸 的 朴 胞 凋 亡 信号 传导 途径
"411 ，

水 相互 作用 来 完成 。
由 Fas 和 FADD 介 导 的 细胞 凋 亡 信和 号 传导 途径 见 图 14-5。

2. 有 亡 受 体 途 径 的 调控 。

死亡 受 体 介 导 的 细胞 凋 亡 信 号 传导 途径 可 在 多 个 水 平 上 受到 调控 。

(1) 基因 表达 水 平 的 调控

死亡 配 体 (如 FasL 和 TRAIL) 的 表达 是 被 调控 的 。 如 Fas 配 体 在 工 细 胞 申
的 表达 受 工 细胞 激活 的 上 调 。 死 亡 受 体 的 表达 也 是 被 调控 的 ， 如 Fas 的 表达 随 着
B 细 胞 或 工 细 胞 激活 而 增加 。

(2) 胞 外 调节 分 子 对 死亡 受 体 的 调控

FLIP (Flice inhibitory protein) 是 调控 死亡 受 体 介 导 的 细胞 调 亡 途 径 的 主要
调节 分 子 。FLIP 有 两 个 嵌 合 的 DED， 但 没有 功能 性 和 蛋白酶 结构 域 。 它 通过 与
FADD 结合 抑制 Caspase 的 招募 和 激活 。

(3) 黏附 分 子 对 死亡 受 体 与 死亡 配 体 相 互 作用 的 调控

位 于 工 细 胞 上 的 FasL 和 位 于 也 细 胞 上 的 Fas 可 以 相互 作用 ， 从 而 诱导 也 细胞
Fas 依赖 型 细胞 凋 亡 。 这 种 特异 的 Fasl 和 Fas 的 相互 作用 需 有 黏附 分 子 的 存在 。

三 、 内 质 网 介 导 的 细胞 凋 亡 信号 传导 途径

内 质 网 (endoplasmic reticulum，ER) 是 蛋白 质 翻译 、 加 工 的 场所 ， 同 时 又
是 细胞 内 钙 的 储存 地 之 一 。 当 内 质 网 蛋白 质 过 度 积 累 ， 或 内 质 网 中 钙 离 子平 衔 被
打破 时 ， 导 致 内 质 网 应 激 和 细胞 凋 亡 。 缺 失 Caspase-12 的 小 鼠 对 内 质 网 引起 的 凋
亡 不 敏感 ， 而 对 其 他 途径 的 细胞 凋 亡 依然 敏感 ， 故 此 人 们 推 新 ，Caspase-12 参与
内 质 网 介 导 的 细胞 凋 亡 。 同 时 ， 由 于 Caspase-12 缺失 的 小 鼠 发 育 正常 ， 无 任何 明
显 缺 陷 ， 所 以 推测 由 内 质 网 介 导 的 细胞 凋 亡 途 径 在 某 些 病理 条 件 下 发 挥 作 用 。

内 质 网 介 导 的 细胞 凋 亡 是 一 条 新 发 现 的 凋 亡 途径 ， 其 具体 信号 传导 途径 和 机
制 尚 待 深入 研究 。

四 、 细 胞 凋 亡 信 号 传导 途径 的 相互 交叉
上 述 三 条 细胞 凋 亡 途径 并 不 是 绝对 孤立 的 ， 它 们 之 间 在 一 定 条 件 下 互相 交
又 ， 共 同调 节 细胞 凋 亡 这 一 重要 生命 过 程 ， 使 之 利于 生物 个 体 的 生存 。
1. 死亡 受 体 途径 与 线粒体 途径 间 的 相互 交叉

Caspase-8 在 死亡 受 体 途径 中 被 激活 。 激 活 的 Caspase-8 可 切割 Bcl-2 家 族 成

员 BID 形成 截 短 的 小 BID。 截 短 的 小 BID 转 位 到 线粒体 上 ， 改 变 线粒体 膜 的 通

透 性 ， 促 进 细 胞 色素 c 从 线粒体 向 细胞 质 释 放 ， 从 而 激活 线粒体 介 导 的 细胞 凋 亡
”9 才 这 0)

途径 。 由 此 ， 死 亡 受 体 途 径 通过 BID 激活 了 线粒体 途径 。 这 两 条 凋 亡 途径 的 相
互 交 叉 见 图 14-6 所 示 。

线粒体 死亡 受 体
Bak
Bad
砷 FADDI(UMORT1)
一 ED<EDD St
TCRRRESSRPS 志

Bcl-XL 2 | sa 过

< <D -5 1
< Procaspase 8
“人

程序 性 细胞 死亡

图 14-6 ”BID 是 线粒体 铀 亡 途径 和 死亡 受 体 凋 亡 途 径 交 义 的 媒介

2. 线粒体 途径 和 内 质 网 途径 的 交叉

已 有 证 据 显 示 ， 线 粒 体 途径 和 内 质 网 途径 间 存 在 凋 亡 信号 的 相互 对 话
(cross-talk)， 当 内 质 网 新 的 Ca 释放 时 ， 与 内 质 网 邻近 的 线粒体 感受 到 的 钙 离
子 浓 度 比 胞 浆 中 平均 钙 离 子 浓度 高 得 多 ， 这 使 线粒体 摄 入 钙 离 子 能 力 增 加 ， 导 致
钙 离 子 超载 ， 线 粒 体外 膜 破裂 ， 线 粒 体内 的 凋 亡 相关 因子 细胞 色素 c、AlF1 释
放 到 细胞 质 中 ， 局 动 线粒体 介 导 的 凋 亡 途径 。

五 、CTL 诱导 划 细 胞 的 凋 亡

近 几 年 来 ， 对 CTL 杀 死 靶 细 胞 机 制 的 研究 引起 了 免疫 学 家 的 极 大 兴趣 。
CTL 强大 而 特异 的 溶 细胞 活性 至 少 可 通过 两 条 途径 来 实现 。 即 穿孔 素 (perforin )
介 导 和 Fas 外 导 。

1. 穿孔 素 介 导 的 靶 细 胞 死亡

当 CTL 的 TCR 与 靶 细 胞 上 MHC 呈 递 的 抗原 结合 时 ，CTL 排出 胞 桨 颗粒 ，
后 者 含有 罕 孔 素 、 颗 粒 酶 等 成 分 。 颗 粒 酶 包括 颗粒 酶 A (granzyme A，GzmA)
和 颗粒 酶 B (granzyme B)， 颗 粒 酶 可 通过 穿孔 素 在 靶 细 胞 膜 局 部 形成 的 孔道 或
通过 靶 细 胞 内 吞 作 用 进入 靶 细 胞 。GzmA 切割 IGAAD (inhibited granzyme A acti-
vated dnase 即 set)， 使 后 者 不 再 结合 并 抑制 GAAD (NM23-1)。 未 被 抑制 的

“如 139”

GAAD 催化 DNA 单 链 切 口 ，GZMB 直接 或 间接 通过 Caspase 损伤 CAD 的 抑制 剂
ICAD。 被 切割 的 ICAD 可 与 CAD 结合 ， 转 移 到 核 内 切割 双 链 DNA 产生 大 水 相
差 180bp 的 DNA 片段 。 由 GZMA 催化 形成 DNA 单 链 切 口 的 DNA 链 大 片段 ， 可
以 加 快 GzmB 催化 形成 朝 核 小 体 的 速度 。 所 以 GzmA 和 GzmB 在 促进 染色 体 分 裂
上 是 呈现 协同 作用 。GzmB 诱导 的 凋 亡 途径 中 有 cytc 的 释放 和 依赖 Pro Caspase9/
3 的 激活 等 ， 故 对 于 有 高 表达 Bcl-2 的 肿瘤 细胞 ， 对 GzmB 诱导 的 调 庆 表现 抵抗
性 ， 但 对 GzmA 诱导 的 凋 亡 作用 呈现 敏感 性 。 在 GzmA 和 GzmB 二 者 的 诱导 凋 亡
途径 中 ， 已 知 尚 有 许多 正 负 性 调节 因子 参与 ， 关 于 它们 的 调节 机 制 正在 研究 中 。
如 图 14-7。

Procaspase-3

〇 Gzms
GE 有 一 一

Caspase-3

图 14-7 CTL 介 导 的 凋 亡 DNA 剪 切 的 模型 图
2.Fas 介 导 的 靶 细 胞 凋 亡

聚 合 穿 孔 素 的 形成 ， 有 利于 颗粒 酶 等 成 分 进入 靶 细 胞 ， 进 而 使 ICE 活化 ， 通
过 ICEF 途径 诱导 细胞 凋 亡 。 由 于 缺失 穿孔 素 的 CTL 仍 能 杀伤 Fas* 的 靶 细 胞 ， 但 都
不 杀伤 Fas -的 靶 细 胞 ， 表 明 FasL 与 Fas 结合 是 CTL 杀 死 靶 细 胞 的 另 一 重要 机 制 。

. 414 .

第 十 五 章 ”重组 DNA 技术 及 其 应 用

重组 DNA 技术 (recombinant DNA technique) 又 称 基 因 工 程 (gene engi-
neering) 或 基因 操作 (gene manipulation)， 是 指 将 来 源 于 不 同 生 物 或 者 人 工 合成
的 DNA， 有 目的 的 在 体外 进行 改造 和 重新 组 合 ， 再 转 入 微生物 或 真 核 细胞 内 进
行 无 性 繁殖 〈cloning)， 使 重组 基因 在 细胞 或 生物 体内 得 到 表达 ， 从 而 改变 生物
的 遗传 特性 或 者 创造 新 类 型 的 生物 。 与 经 典 的 遗传 学 手段 相 比 ， 重 组 DNA 技术
是 在 基因 水 平 上 进行 的 操作 ， 目 的 更 明确 、 方 法 更 简捷 ， 因 而 自发 展 之 初 它 就 成
为 遗传 工程 中 一 个 重要 的 领域 。

重组 DNA 技术 兴起 于 20 世纪 70 年 代 ， 它 的 发 现 有 深刻 的 理论 依据 和 坚实
的 实验 基础 。20 世纪 40 年 代 Avery 等 证 实 DNA 是 遗传 物质 、50 年 代 Watson 和
Crick 提出 的 DNA 结构 的 双 螺 旋 模 型 以 及 60 年 代 以 Nirenberg 为 首 的 科学 家 发 现
的 64 个 遗传 密码 和 遗传 中 心 法 则 ， 为 重组 DNA 技术 提供 了 理论 根据 ; 20 世纪
60 年 代 未 ， 限 制 性 内 切 核酸 酶 、DNA 连接 酶 、 载 体 的 发 现 则 为 重组 DNA 技术
芮 定 了 实验 基础 : 限制 性 内 切 核酸 酶 使 分 离 单个 基因 成 为 可 能 ，DNA 连接 酶 使
体外 基因 重组 得 以 实现 ， 而 载体 则 提供 了 单个 基因 富 集 以 及 基因 表达 的 途径 。

随 着 分 子 生 物 学 的 发 展 ， 重 组 DNA 技术 现 已 成 为 一 门 内 容 广 谤 的 综合 性 生
物 技 术 学 科 ， 为 基础 理论 研究 和 应 用 科学 带 来 了 革命 性 的 进步 。 在 理论 研究 方
面 ， 重 组 DNA 技术 可 以 分 离 和 扩 增 到 某 一 具体 基因 ， 从 而 可 以 研究 基因 的 精细
结构 和 功能 。 人 们 借助 重组 DNA 技术 ， 不 仅 明 确 了 多 种 基因 的 结构 及 功能 ， 还
发 现 了 断裂 基因 、 重 倒 基 因 、 假 基因 等 多 种 基因 类 型 ， 同 时 在 基因 表达 调控 方面
也 取得 了 很 多 本 质 上 的 认识 ， 所 有 这 些 ， 使 人 类 对 生命 现象 的 认识 在 分 子 水 平 上
产生 了 质 的 飞跃 。 在 生产 应 用 方面 ， 人 们 利用 重组 DNA 技术 ， 使 基因 在 微 生
物 、 真 核 细胞 乃至 动 植物 中 表达 ， 获 得 了 许多 重要 的 产品 ， 尤 其 是 医药 领域 ， 如
干扰 素 、 激 素 、 免 疫 调节 剂 和 和 蛋 日 质 疫苗 等 ;利用 重组 DNA 技术 ， 人 们 还 创造
出 新 的 抗 病 、 抗 虫害 、 优 质 高 产 的 动 植物 品种 或 生物 反应 器 ， 到 目前 重组 DNA
技术 已 经 为 人 类 带 来 了 巨大 的 经 济 效益 和 社会 效益 。

重组 DNA 技术 包含 三 个 要 素 : 载体 、 工 具 酶 和 表达 系统 (原核 或 真 核 和 宿主
细胞 )。 其 技术 路 线 大 致 包括 几 个 程序 : 四 目的 DNA 片段 的 分 离 制备 ; @ 目 的
片段 与 载体 的 体外 重组 ; @ 将 重组 的 DNA 分 子 转化 到 表达 系统 中 (原核 或 真 核
宿主 细胞 ); 田 筛 选 、 鉴 定 重组 DNA 分 子 。 下 面 我 们 围绕 这 些 要素 和 程序 分 别
进行 叙述 。

. 415 .

第 一 六 ”载体 和 工具 酶
“二 莽 | 本 全

载体 〈vector) 是 指 能 将 目的 DNA 片段 带 入 宿主 细胞 、 并 能 进行 扩 增 的 一
类 DNA 分 子 。 载 体 一 般 都 能 在 细胞 内 建立 稳定 的 遗传 状态 ， 可 在 细胞 内 独立 繁
殖 、 传 代 ， 或 是 整合 到 宿主 细胞 染色 体 基因 组 中 随 基因 组 的 复制 而 复制 。 表 达 型
载体 还 可 表达 携带 的 目的 基因 。 载 体 应 具备 以 下 条 件 。 〇 自主 复制 : 载体 必须 含
有 复制 起 点 ， 可 在 适当 的 入 主 细胞 中 上 自主 复制 。@ 包 含 多 克隆 位 点 : 载体 上 应 具
有 多 种 限制 性 内 切 核 酸 酶 的 位 点 ， 便 于 外 源 目 的 基因 的 插入 和 连接 。@ 具 有 可 供
选择 的 遗传 学 标记 : 借助 这 些 标记 可 以 区 别 转化 和 未 转化 的 宿主 细胞 、 阳 性 重组
分 子 和 未 重组 分 子 。 四 其 特征 是 被 充分 掌握 的 : 应 知道 载体 的 全 核 苷 酸 序 列 ; 对
于 载体 基因 的 作用 、 载 体 基因 之 间 的 相互 关系 以 及 载体 基因 与 宿主 细胞 的 基因 或
蛋白 之 间 的 相互 关系 ， 应 该 有 深入 的 了 解 。 需 特别 注意 的 是 ， 载 体 必须 是 安全
的 ， 在 任何 对 于 人 类 和 其 他 物种 的 危害 程度 未 明了 之 前 ， 载 体 的 使 用 应 置 于 严格
控制 之 下 。

一 般 而 言 ， 载 体 是 通过 改造 天 然 质 粒 、 鸣 菌 体 和 病毒 而 成 。 目 前 ， 全 世界 构
建 和 应 用 的 载体 有 数 生 种 之 多 。 根 据 载 体 用 途 、 应 用 对 象 不 同 ， 可 以 对 其 分 类 。
从 用 途 可 以 将 载体 分 为 克隆 载体 、 表 达 载 体 、 转 移 载 体 、 探 针 载 体 等 ;从 应 用 对
象 可 以 分 为 原核 克隆 载体 、 植 物 克 隆 载 体 、 动 物 克 隆 载 体 。

(一 ) 质粒 载体

质粒 (plasmid) 是 存在 于 细菌 染色 体 以 外 的 独立 的 复制 子 。 它 们 是 一 类 闭
合 环 状 的 双 链 DNA 分 子 ， 不 同 质粒 分 子 大 小 差别 很 大 ， 从 1.5kb 至 100kb 以 上
都 有 ， 多 数 质粒 大 小 在 3 一 10kb 之 间 。 在 革 兰 氏 阴 性 细菌 中 ， 质 粒 的 复制 有 两 种
模式 : 严 紧 型 和 松弛 型 ， 严 紧 型 质粒 的 复制 除了 依赖 于 宿主 的 DNA 聚合 酶 III
外 ， 还 依赖 于 宿主 其 他 蛋白 质 ， 通 常 在 一 个 细胞 中 只 有 1 一 5 个 拷贝 ， 这 对 于 基
因 的 扩 增 和 表达 是 不 利 的 ; 松弛 型 质粒 的 复制 则 不 同 ， 除 了 DNA 聚合 酶 III， 基
本 上 不 依赖 宿主 其 他 蛋白 质 。 因 此 ， 即 使 在 宿主 染色 体 复制 和 蛋白 质 合成 停止
时 ， 仍 能 大 量 扩 增 。 通 常 一 个 细胞 中 可 含 30~ 50 个 松弛 型 质粒 ， 大 量 扩 增 时 甚
至 可 达 上 千 个 。 松 弛 型 质粒 在 重组 DNA 技术 中 得 到 广泛 应 用 。

用 于 重组 DNA 技术 的 质粒 载体 都 是 人 工 重 建 的 ， 本 身 的 DNA 大 小 多 在
3kb 一 5$kb 间 ， 含 一 个 复制 原点 ， 一 个 多 克隆 位 点 区 ， 一 个 或 两 个 抗 药 基因 以 及
用 作 遗 传 标记 的 报告 基因 。 抗 药 基 因 和 报告 基因 用 于 下 一 步 的 筛选 。 质 粒 进 入 细

. 416 ，

EDIT ca

胞 是 通过 转化 技术 实现 的 ， 但 重组 质粒 大 于 1$kb 时 ， 用 普通 的 冷 CaCb 转化 技
术 转 化 时 效率 明显 降低 ， 因 此 质粒 一 般 用 于 10kb 以 下 的 DNA 片段 的 克隆 。 下
面 是 几 种 代表 性 的 质粒 载体 。

1.pBR322 质粒 载体 和 pUC 系列 质粒 载体

重组 DNA 技术 早期 发 展 中 ，pBR322 质粒 是 应 用 得 最 为 广泛 的 质粒 克隆 载
体 之 一 。pBR322 质粒 分 子 大 小 4.3kb， 内 含 松弛 型 质粒 CuJE1 的 复制 原点 、 选
择 性 标记 基因 Az ( 抗 氨 共 青霉素 基因 ) 和 Tc" ( 抗 四 环 素 标记 基因 )。 在 AZ
基因 和 Tez 基因 内 各 有 一 些 限 制 性 内 切 核 酸 酶 的 位 点 (图 1$3-1)， 一 旦 被 插入 外
源 片段 ， 这 个 基因 即 被 灭 活 ， 产 生 的 重组 质粒 所 转化 的 细菌 不 再 具备 对 该 抗生素
的 抗 性 ， 利 用 这 种 性 质 就 很 容易 筛选 所 需 的 重组 质粒 。pPBR322 还 笛 用 作 构 建
新 载体 的 基础 ， 如 pBR324 一 329 等 一 系列 的 克隆 载体 都 是 从 pBR322 出 发 构建
的 。

Bsx15 [ 23

5ind II 29
Eco32 [ 185

EcoR [L, Xap [ 4359

Sca T3844
Pvx [ 3733

PsiT3607

Eco521 [ 939
Bsp68 [972

pBR322
4361 bp

BspM [I 1063

Mfval1269 [1353
Ecol130 [1369
Eco88 [ 1425

Cai [2884 AM1y [ 1444
Bpxl10 工 1580
Be [ 165S0
41iII，BspLUII IT2473 Kpj12T1664
Sap [ 2350
ByeJ] 1668
Xe T 2295 Pyvx 本 2064 3

FEsp3 I 2122

Bstl11071 ] 2244
Pyy 2217

Byad [ 2225
图 15-1 _pBR322 质粒 示意 图

pUC 系列 质粒 载体 也 是 常用 的 质粒 克隆 载体 ， 由 pBR322 载体 衍生 构建 而
成 。 它 是 用 严 . coli 的 乳糖 操纵 子 基因 N 端 部 分 人 /二 代替 了 PDBR322 的 选择

多 也

标记 Tc 基因 (图 15-2)， 并 在 vecZ “中 组装 了 多 克隆 位 点 区 。 当 这 种 质粒 被 转化
到 可 以 与 lac2Z' 基 因 互 补 的 大 肠 杆 菌 中 ， 在 含 IPTG ( 异 丙 醇 -B.D 硫 代 半 乳糖 昔 )
和 X-gal (5- 澳 -4- 毛 -3- 吗 | 唆 -B-D- 半 乳糖 ) 的 诱导 培养 基 上 培养 时 ， 可 形成 蓝 色 菌
落 ; 如 果 在 /ac2 “中 的 多 克隆 位 点 区 插入 外 源 片 段 ， 可 造成 LacZ“ 失 活 ， 形 成 白色
菌落 。 这 样 可 以 直接 筛选 重组 DNA， 而 不 必 采 用 类 似 于 pBR322 质粒 相对 麻烦
的 负 筛 选 法 进行 筛选 。

尼 co 01091 2674 BsIAP [179
4afJ2617

Padnmz [ 2294

Bcg [ 2215
SC 下 2T797

pUC18/19

2686bp Sap [683

41iII，BspLUI11 I 806

CHr101 TI 1779
Eco31 1 1766

Eamzl 1051 1694

CGi 让 2
15-2 ”pUC18/19 质粒 示意 图
2. 细菌 质粒 表达 载体

通常 用 于 表达 外 产 目 的 基因 的 质粒 载体 ， 主 要 目的 是 为 了 在 细菌 中 表达 真 核
基因 ， 因 此 这 类 载体 有 个 共同 的 特点 : 在 多 克隆 位 点 区 的 上 游 有 强大 的 原核 基因
启动 子 (一 般 来 源 于 /ac、zrz 或 使 用 T7 promoter) 和 细菌 核糖 体 结合 的 SD 序
列 ， 在 克隆 位 点 的 下 游 常 常 还 有 一 段 转 录 终 止 的 序列 。 这 样 可 以 在 转录 和 翻译 水
平 上 保证 外 源 片 段 的 高 效 表 达 。 图 15-3 是 一 种 强大 的 表达 质粒 PET 质粒 的 示意
图 ， 在 多 克隆 位 点 的 上 游 有 一 段 天 然 的 T7RNA 聚合 酶 局 动 子 。 用 pET 质粒 在
大 肠 杆菌 中 表达 外 源 基 因 ， 表 达 的 蛋白 量 常 可 达 细 菌 总 蛋白 量 的 30% 以 上 ( 随
基因 不 同 而 异 )， 并 且 可 以 利用 融合 的 6 个 组 氮 酸 ， 很 方便 地 用 Ni 柱 纯化 所 表达
的 蛋 昌 。

3. 体外 转录 质粒 载体

由 pUC 质粒 构建 而 来 ， 主 要 有 pPGEM 质粒 系列 和 pSP 质粒 系列 。pGEM 质
粒 含有 一 个 4 六 基因 和 一 个 /ac2 基因 ， 多 克隆 位 点 区 位 于 /ac2 基因 内 (图
. 418 ，

EcoR [ (4638)
4po [(4638)

Cla 1 和
4atI[(4567) |/ 瑟 nd II (29) Bpy1102 TI (458)
Ssp [ (4449) BamH [I(S10)
Sca [ (4125) Nde | (550)
Pwu T (4015) X2a 工 (588)
Begl I(640)

Eam1105 [ (3645)

PET-3a
(4640bp)

有 eg 正 11(3338)

4UwN [(3168)

4vaT(1702)

BspLU11I(2752
411 TI (2752)

图 15-3_pPET-3a 质粒 示意 图

15-4)。pGEM 质粒 与 pbUC 质粒 主要 的 不 同 在 于 pPGEM 质粒 的 多 克隆 位 点 的 上 、
下 游 分 别 含有 鸣 菌 体 T7 和 SP6 的 启动 子 ， 在 体外 可 以 利用 T7 和 SP6 的 RNA 聚
合 酶 进行 转录 。pSP 质粒 利用 的 是 叭 菌 体 的 SP6 启动 子 。 体 外 转录 质粒 提供 的
mRNA 转录 本 可 以 用 作 制 备 RNA 探 针 ， 也 可 用 于 兔 网 织 红 细胞 裂解 物 翻 译 系
中 进行 体外 翻译 。

4. 穿梭 质粒 载体

穿梭 质粒 载体 (shuttle plasmid vector) 是 指 含 有 两 种 不 同 的 复制 起 点 和 选择
标记 的 重组 质粒 ， 它 可 以 在 两 种 不 同 的 宿主 细胞 中 存在 和 复制 。 这 种 特性 可 以 使
质粒 穿梭 存在 于 真 核 和 原核 两 种 细胞 之 间 ， 对 于 重组 DNA 技术 的 研究 非常 有 用 。

pKSV-10 是 一 种 细菌 -哺乳 动物 细胞 穿梭 质粒 载体 ， 由 pBR322 的 一 段 DNA
和 病毒 SV-40 的 一 段 DNA 组 建 而 成 。 它 具有 pBR322 和 SV-40 的 两 种 复制 原点 ，
既 能 在 细菌 宿主 中 复制 和 扩 增 ， 也 可 以 在 真 核 宿 主 中 复制 和 表达 。

YEp24 是 一 种 细菌 -酵母 穿梭 质粒 载体 。 根 据 复制 模式 不 同 可 以 将 酵母 质粒

， 419 ，

TIT7 801

pGEM3Z
3199bp

SP6 869

图 15-4” pGEM32Z 质粒 示意 图

分 为 五 类 ，YIp、YRp、YEp、YCp 和 YLp， 除 了 线性 质粒 YLp 外 ， 其 余 的 质粒
均 能 与 大 肠 杆菌 质粒 构成 穿梭 载体 。YEp24 是 由 酵母 2zrm 质粒 的 一 部 分 加 上 酵
母 染 色 体 URA3 基因 的 一 部 分 ， 分 别 插入 pBR322 的 两 个 不 同位 点 而 成 的 。 因
此 ， 既 可 以 在 大 肠 杆 菌 中 复制 ， 也 可 以 在 酵母 中 复制 和 表达 。

5$. 真 核 细胞 表达 质粒

真 核 表达 质粒 实质 上 是 一 种 穿梭 质粒 ， 广 谤 应 用 于 人 和 动物 细胞 中 表达 外 源
基因 ， 也 可 以 用 于 DNA 疫苗 的 研究 。 如 pcDNA 质粒 系列 (图 15-53)， 除 了 含有
必需 的 原核 系统 元 件 外 ， 它 还 含有 一 个 极 强 的 人 巨细 胞 病毒 (CMV) 立即 早期
启动 子 ， 用 于 高 水 平 的 外 源 基 因 表 达 ， 并 且 pcDNA 质粒 可 以 转 染 到 绝 大 多 数 的
哺乳 动物 培养 细胞 ， 应 用 极为 广泛 。

6. 启动 子 探 针 载体

启动 子 探 针 载 体 可 用 于 研究 调控 的 DNA 序列 的 特征 。 它 们 含有 一 个 产量 容
易 定 量 检测 的 报告 基因 ， 此 基因 上 游 因 缺乏 启动 子 而 处 于 非 转 录 状 态 。 常 用 的 报
告 基 因 有 昌 半 乳糖 苷 酶 基因 (2 基因 )、 和 毛 霉 素 乙 酰基 转移 酶 基因 (CAT 基因 )、
荧光 素 酶 或 者 绿色 荧光 蛋白 (GEFP) 基因 。 一 旦 在 非 转录 的 报告 基因 上 游 插入
具有 启动 子 活性 的 DNA 序列 ， 就 可 立即 激活 报告 基因 进行 转录 和 表达 ， 启 动 子
的 活性 和 强度 可 以 通过 定量 检测 基因 产物 来 确定 ， 除 此 以 外 ， 启 动 子 探 针 载 体 还
常常 用 于 研究 某 种 蛋白 对 某 一 基因 表达 的 影响 。

， 420 ，

pcDNA3.1(+/ 一 )
S428/S427bp

图 1$5-5 pcDNA 质粒 系列 示意 图

(二 ) 叭 菌 体 载 体

喉 菌 体 指 专门 感染 细菌 的 病毒 ， 由 它 构建 的 载体 称 为 噬菌体 载体 。 鸣 菌 体 的
结构 比 质 粒 要 复杂 得 多 ， 就 两 者 的 DNA 本 质 比 较 而 言 ， 质 粒 仅仅 是 一 种 含有 复
制 原点 的 裸露 的 DNA 分 子 ， 而 鸣 菌 体 DNA 分 子 除 了 含有 复制 原点 外 ， 还 含有
编码 外 壳 蛋 白质 、 与 DNA 整合 、 重 组 等 有 关 的 基因 以 及 一 些 调 节 基 因 。 从 鸣 菌
体 ( 叭 菌 体 ) 出 发 构建 的 载体 可 以 克隆 的 DNA 片段 比 质粒 载体 可 克隆 的 DNA
片段 大 得 多 ， 并 且 重 组 DNA 被 包装 成 叹 菌 体 后 可 通过 感染 而 导入 细胞 ， 其 效率
比 质 粒 DNA 转化 效率 要 高 得 多 。 因 此 鸣 菌 体 载体 特别 适用 于 真 核 基因 的 研究
( 真 核 基因 一 般 都 比较 大 )。 人 迄今 为 止 ， 运 用 鸣 菌 体 载体 实现 了 大 量 成 功 的 基因 克
隆 和 表达 ， 表 明 它 们 是 一 种 良好 的 基因 克隆 载体 。 目 前 已 有 大 量 的 只 菌 体 突变 体
供 研 究 者 使 用 ， 主 要 用 于 cDNA 文库 以 及 表达 肽 库 ( 鸣 菌 体 表 面 展示 ) 的 构建 。

1. 单 链 丝 状 噬 菌 体 载体 (MI13 载体 )
单 链 丝 状 噬菌体 载体 一 般 由 M13 单 链 噬菌体 衍生 而 来 。M13 噬菌体 是 一 种

.421 ，

丝 状 唉 菌 体 ， 基 因 组 为 一 有 6407 个 核 苷 酸 的 单 链 环 状 DNA 分 子 。 基 因 组 上 有
一 段 长 S07nt 的 基因 间隔 区 (IS 区 ) 可 揪 入 选择 性 标记 和 多 克隆 位 点 ， 其 余部 分
都 是 喉 菌 体 生长 繁殖 所 必需 的 。

MI13 叭 菌 体 仅 感染 含 F 因子 的 大 肠 杆菌 。 进 入 细胞 的 “+ ” 链 DNA 作为 模
板 复制 出 互补 的 “-” 链 DNA， 由 此 产生 复制 型 的 双 链 DNA (REF-DNA)。
RFDNA 可 按 环 状 DNA 的 方式 复制 ， 到 200 个 拷贝 时 , “+” 链 DNA 可 被 单 链 结
合 蛋 日 结合 ， 终 止 “-” 链 DNA 的 复制 ， 而 “-” 链 DNA“ 复 制 ” 产 生 “+”
链 DNA 的 过 程 持 续 进 行 。 这 样 新 合成 的 “+ ” 链 DNA 不 断 地 被 噬菌体 衣 壳 蛋
白 包 装 形成 新 的 唆 菌 体 ， 以 非 溶菌 的 方式 释放 到 宿主 细胞 外 。

MI13DNA 虽然 是 单 链 DNA， 但 在 细胞 内 仍 可 形成 环 状 双 链 DNA (复制 型
DNA)， 并 且 无 论 单 、 双 链 M13DNA， 不 需要 体外 包装 均 可 直接 转 染 大 肠 杆菌 受
体 细 胞 ， 这 一 点 使 得 Ml3 载体 成 为 一 种 操作 十 分 简便 的 载体 。MI13 载体 的 多 克
隆 位 点 下 游 含 有 有 B 半 乳糖 苷 酶 基因 (2 基因 )， 其 筛选 方法 与 pUC 质粒 系列 是 一
样 的 ， 通 过 鸣 菌 斑 是 蓝 色 还 是 白色 来 鉴定 重组 喉 菌 体 。

重组 M13 鸣 菌 体 的 单 链 DNA， 主 要 用 于 Sanger 法 DNA 测序 ， 也 经 常用 作
oligo 诱导 定点 突变 的 模板 。MI13 可 以 克隆 大 的 DNA 片段 ， 但 克隆 了 大 片段 的
MI13 载体 在 传代 过 程 中 不 稳定 ， 因 此 其 克隆 片段 长 度 一 般 不 超过 1kb。

2. 入 鸣 菌 体 载体

和 喉 菌 体 颗粒 中 的 DNA 是 一 线性 双 链 DNA 分 子 ， 长 48 052bp， 两 端 各 有 12
个 碱 基 的 $ 凸 出 黏 性 末端 ， 两 个 黏 性 未 端 是 互补 的 。ADNA 上 共有 50 多 个 基因 ，
几乎 所 有 基因 的 功能 及 其 表达 调控 已 经 研究 得 非常 清楚 。ADNA 上 的 有 些 区 域 对
于 入 史 菌 体 的 生长 繁殖 不 是 绝对 需要 的 ， 可 以 被 外 源 DNA 片段 所 取代 ， 这 一 点
是 入 鸣 菌 体 成 为 克隆 载体 的 基础 。

入 鸣 菌 体感 染 大 肠 杆菌 后 ， 进 入 细胞 的 ADNA 通过 两 端的 黏 性 末端 环 化 ， 在
感染 早期 以 环 状 DNA 进行 转录 ， 随 后 进入 两 条 不 同 的 生长 途径 : 其 一 为 溶菌 循
环 ， 环 状 DNA 经 复制 、 切 割 产 生子 代 线 性 DNA 分 子 ， 与 大 量 合成 的 鸣 菌 体 结
构 蛋 白 一 起 装配 成 子 代 喉 菌 体 颗粒 ， 通 过 宿主 细胞 裂解 释放 出 子 代 叹 菌 体 颗粒 ，
感染 新 的 细胞 ;其 二 为 溶 源 生 长 ，MDNA 可 以 整合 到 宿主 细胞 基因 组 中 ， 以 无 活
性 的 原 叹 菌 体形 式 随 宿主 基因 组 的 复制 而 复制 。 当 宿主 细胞 处 于 一 定 的 胁迫 条 件
下 时 ， 原 叭 菌 体 可 以 脱离 宿主 细胞 基因 组 ， 重 新 进入 循环 。

入 喉 菌 体 载体 主要 有 如 下 特点 : @ 四 筛选 简便 ， 如 果 没 有 外 源 DNA 片段 的 揪
和 入， 载体 本 身 的 DNA 太 小 难以 被 包装 ,转化 后 产生 的 空 斑 一 般 都 是 重组 体 。 此
外 ， 还 可 以 利用 特殊 的 DNA 片段 取代 XDNA 的 非 必 要 区 段 ， 通 过 改变 入 喉 菌 体
的 表 型 (如 Spi- 筛选 法 ) 或 引入 报告 基因 (如 Lac2 基因 筛选 法 ) 来 筛选 重组 入
喉 菌 体 载 体 。@ 可 克隆 的 片段 大 ， 最 大 可 达 22kb。@ 转 化 效率 高 ， 重 组 的 XDNA

5 二 2

”加

都 要 经 过 体外 包装 ， 成 为 有 感染 力 的 鸣 菌 体 ， 与 重组 质粒 DNA 转化 相 比 ， 具 有
高 得 多 的 转化 效率 。

和 喉 菌 体 载 体 是 最 先 使 用 的 分 子 克隆 载体 ， 主 要 用 于 cDNA 文库 构建 ， 也 经
常用 于 外 源 目的 基因 的 克隆 。 和 叭 菌 体 载体 的 种 类 包括 Charon 系列 、Xgt 系列
等 。

(三 ) cosmid 克隆 载体

cosmid 克隆 载体 由 质粒 载体 和 入 噬菌体 的 两 个 黏 性 未 端 〈cos 位 点 ) 组 装 而
成 。cosmid 是 英文 cos site-carrying plasmid 缩写 而 成 ， 因 此 cosmid 克隆 载体 又 称
黏 性 未 端 质粒 ， 它 集中 了 质粒 载体 和 入 鸣 菌 体 载体 的 优点 。 载 体 本 身 大 小 4 一
6kb， 可 克隆 的 DNA 片段 大 小 可 达 30 一 45kb， 广 谤 应 用 于 基因 组 DNA 文库 的 构
建 。

(四 ) 植物 、 动 物 病毒 载体

随 着 人 们 对 植物 病毒 和 动物 病毒 的 分 子 生物 学 机 理 的 深入 了 解 ， 一 些 遗传 背
景 研究 较为 清楚 的 植物 、 动 物 病毒 已 被 构建 成 载体 ， 用 于 外 源 基 因 (主要 是 真 核
基因 ) 的 克隆 和 表达 。 这 些 非 噬菌体 病毒 载体 的 优点 显而易见 : 在 真 核 生物 宿主
或 宿主 细胞 中 表达 的 真 核 生 物 蛋 白质 ， 比 原核 系统 中 表达 的 蛋白 质 在 修饰 、 构 象
等 方面 更 趋 近 天 然 重 白 ， 因 而 在 活性 上 更 趋同 于 天 然 蛋白 。

植物 、 动 物 病毒 载体 构建 的 基本 策略 大 致 有 几 种 : @ 构 建 转移 载体 或 置换 型
克隆 载体 。 选 择 病毒 基因 组 中 对 其 自身 生长 繁殖 非 必需 的 区 域 ， 用 外 源 基 因 进 行
置换 ， 转 染 宿主 细胞 或 动 植物 体 进行 表达 。 通 常 外 源 基 因 上 游 需要 设计 一 个 适应
于 宿主 的 强 启动 子 以 利于 基因 的 高 效 转 录 和 表达 。@ 构 建 互 补 克 隆 载体 。 利 用 两
种 不 同 缺陷 型 病毒 之 间 的 互补 ， 表 达 克 隆 于 其 中 一 种 缺陷 病毒 上 的 外 源 基 因 。 由
于 这 一 策略 可 能 会 重组 产生 野生 型 病毒 ， 很 少 被 采用 。@) 构 建 混合 克隆 载体 。 通 常
这 种 克隆 载体 通过 质粒 与 病毒 之 间 的 重组 来 构建 ， 前 述 的 穿梭 质粒 载体 即 属 此 类 。

植物 病毒 中 的 花 郁 菜花 叶 病毒 (CaMV)、 烟 草花 叶 病 毒 (TMV) 以 及 动物
病毒 中 的 猴 空 泡 病毒 40 (SV40)、 腺 病毒 (Ad) 、 冶 病 毒 等 已 被 广泛 地 构建 成 不
同类 型 的 载体 。 值 得 一 提 的 是 ， 来 源 于 两 种 杆 状 病毒 : 首 蕃 银 纹 夜 蛾 核 型 多 角 体
病毒 (AcNPV) 和 家 乔 核 型 多 角 体 病毒 (BmNPV) 的 AcNPV 表达 载体 和
BmNPV 表 达 载 体 ， 在 昆虫 细胞 中 已 经 成 功 表 达 了 多 种 真 核 蛋 自 分子， 因 其 操作
简便 、 表 达 量 高 、 所 表达 蛋白 质 活性 好 而 成 为 目前 最 好 的 表达 系统 之 一 。 此 外 ，
目前 发 展 较 快 的 还 有 反 转 录 病 毒 载体 ， 其 特点 是 接近 100% 的 基因 转移 效率 以 及
具有 整合 到 宿主 基因 组 的 能 力 。

“4428 一

二 、 工 有 具 酶

工具 酶 指 在 重组 DNA 技术 中 用 于 切割 、 连 接 、 修 饰 DNA 或 RNA 的 一 系列
酶 。 它 们 是 重组 DNA 技术 中 的 基本 工具 ， 其 中 最 重要 的 是 限制 性 内 切 核酸 酶 和
DNA 连接 酶 ， 是 DNA 重组 技术 出 现 的 酶 学 基础 。 其 他 常用 的 工具 酶 包括 DNA
多 聚 酶 、 反 转录 酶 、 核 酸 酶 H、 碱 性 磷酸 酶 等 。 本 节 扼 要 介绍 主要 工具 酶 的 性
质 、 用 途 和 使 用 特点 。

(一 ) 限制 性 内 切 核酸 酶 (restriction endonuclease)
1. 种 类 及 命名

限制 性 内 切 核酸 酶 是 一 类 能 特异 地 识别 双 链 DNA 序列 并 进行 切割 的 酶 ， 根
据 酶 性 质 的 不 同 可 以 分 为 三 类 : I 型 酶 、II 型 酶 和 III 型 酶 ( 表 15-1)， 由 表 中 可
见 在 重组 DNA 技术 中 真正 有 用 的 是 II 型 酶 ， 它 既 能 识别 特异 性 的 序列 ， 又 能 在
识别 序列 中 或 近 旁 切割 。 所 以 ， 如 不 特别 说 明 ， 重 组 DNA 技术 中 提 到 的 限制 性
内 切 核酸 酶 是 指 II 型 酶 。

表 15-1 不 同类 型 限制 性 内 切 核酸 酶 的 主要 性 质

类 型 IT 型 II 型 III 型
识别 序列 特异 ， 但 无 规律 特异 ， 旋 转 对 称 特异 ， 但 无 规律
在 识别 序列 前 后 在 识别 序列 之 中 在 识别 序列 之 后
切割 位 点 100~ 1000bp 范围 或 在 附近 25 一 27bp 处
内
切割 位 点 特异 性 非特 异 特异 特异
所 需 辅 因子 NIE RATP、 Mg2+ Mg 、ATP、
S- 腺 苷 甲 硫 氨 酸 (S 腺 苷 甲 硫 氨 酸 )

限制 性 内 切 核酸 酶 主要 来 源 于 细菌 ， 在 少数 霉菌 和 蓝藻 中 也 有 发 现 。 它 的 命
名 一 般 是 取 来 源 生物 属 名 的 第 一 个 字母 (大写 )、 种 名 的 前 两 个 字母 (小 写 )， 再
加 上 菌株 代号 的 第 一 个 字母 组 合 而 成 。 如 果 同 一 种 生物 中 具有 不 同 特 异性 的 限制
性 内 切 核酸 酶 ， 则 分 别 用 大 写 罗 马 数字 IT、II、III 等 来 表示 。 例 如 ， 从 流感 嗜 血
菌 d (Eeemopjhilus 刀 1uenxae d) 中 提取 的 第 三 种 限制 性 内 切 核酸 酶 被 命名 为
HizdIII ( 见 下 画 线 处 )。

2. 限制 性 内 切 核酸 酶 ( 专 指 开 型 酶 ， 下 同 ) 的 识别 序列 与 切割

绝 大 多 数 的 限制 性 内 切 核酸 酶 识别 4 一 6 个 核 苷 酸 长 度 的 序列 ， 极 少数 酶 识
424 ，

别 更 长 的 序列 ， 这 些 序列 是 旋转 对 称 的 〈 即 呈 回 文 结构 ) ( 表 15-2)。 不 同 酶 的
切割 位 点 有 所 不 同 : 一 些 酶 可 以 从 识别 序列 的 对 称 中 心 处 切割 ， 产 生 的 DNA 片
段 带 平 齐 末端 ， 如 HeeIII， 识 别 序列 是 $-GGCC-3， 切 割 位 点 在 G、C 之 间 ，
切割 后 是 平 齐 末 端 [图 15-6 (a)]; 另 一 些 酶 在 序列 对 称 轴 外 的 两 个 对 称 点 切 开
DNA 的 两 条 链 ， 切 割 后 产生 黏 性 未 端 ， 如 EcoR 工 的 识别 序列 是 $-GAATTC-3 '，
产生 的 DNA 是 黏 性 未 端 [图 1$-6 (b) ]。

5-GGCC-3' ”BoeI SGG YEG-3 5-GAATTC-3' ”EcoR IT 545G ARTGe3
人 5/ SAEGETGGSS SCTTAAG54 7 一 EGRUAA G-5'
(a) BaoeIII 酶 切 位 点 (b) EcoR I 酶 切 位 点

图 15-6 不同 限制 性 内 切 核 酸 酶 切割 后 产生 不 同 的 末端

至 今 已 分 离 到 400 多 种 限制 性 内 切 核酸 酶 ， 表 15-2 中 列 出 了 一 些 常用 的 限
制 性 内 切 核 酸 酶 。 有 些 酶 具有 相同 的 识别 序列 ， 称 为 同 裂 酶 。 同 裂 酶 可 以 具有 相
同 的 切割 位 点 ， 称 为 同 裂 同 功 酶 ; 也 可 以 具有 不 同 的 切割 位 点 。 有 些 同 裂 酶 对 于
切割 位 点 上 的 甲 基 化 碱 基 敏 感度 不 同 ， 常 常用 于 DNA 甲 基 化 作用 的 研究 。 还 有
一 些 限制 性 内 切 核酸 酶 识别 序列 不 同 ， 但 切割 后 产生 相同 的 黏 性 末端 ， 称 为 同 尾
酶 ， 如 BamzHI 和 Beg!II。 同 尾 酶 产生 的 相同 黏 性 末端 可 以 彼此 互补 相连 ， 经 常
被 用 于 基因 克隆 实验 中 。

表 15-2 ”一 些 常用 的 限制 性 内 切 核 酸 酶
限制 性 内 切 核 酸 酶 识别 序列 和 切割 位 点

限制 性 内 切 核 酸 酶 识别 序列 和 切割 位 点

一 GYGATCC 一 一 AYGATCT 一
号 就 机 BelII
-CCcTAG1CG 一 =TEOTAIGTA
XING 一 AYAGCTT 一
上 coRI 号 zzdIII
人 AAA 一 一 TICGAA+A 一
一 GTIT7 AAKC 一 一 GT GTACC 一
五 paT 天 zzzI 了 上 飞 二 专人
一 CAA， > 二 一 龟 二 ATG+4 Cr 一
芷 二 WANYERATYS- 一 GT7CTAGC 一
Naei NeiI 本 <
一 人 下 AC 一 一 CCGATCA G 一
一 GC Y GGCCGC 一 一 (CCA 到 (G 一
NozI PstT
一 CCGC6cGC7Tec 一 一 (7(ACGCTIC 一
二 TARCYGTA 一 一 TVCIAGA
9S7QBI XpalI va
EC7TOGAG
10 下
CAGGRNC 一

.425 ，

3. 限制 性 内 切 核酸 酶 的 反应 条 件

所 有 限制 性 内 切 核酸 酶 的 作用 都 需要 镁 离子 。 绝 大 多 数 酶 作用 的 最 适 pH 在
7.5 一 8.0 之 间 ， 最 适 温度 为 37C 。 不 同 的 限制 性 内 切 核 酶 酶 表达 最 大 活力 的 条
件 有 所 不 同 ， 主 要 体现 在 对 NaCl 浓度 要 求 差别 较 大 ， 另 外 ， 斑 基 乙 醇和 二 硫 区
糖 醇 可 以 稳定 酶 的 活性 ， 经 常 被 使 用 。 现 在 限制 性 内 切 核 酸 酶 基本 上 都 已 商品
化 ， 按 照 说 明 书 进行 操作 即 可 。 有 些 酶 在 非 标准 条 件 下 ， 识 别 序列 的 特异 性 降低
或 发 生 改 变 ， 能 够 切割 非特 异 的 识别 序列 ， 这 种 现象 称 星 号 活性 ， 在 相应 限制 性
内 切 核 酸 酶 的 右上 角 加 (* ) 表示 。 酶 的 星 号 活性 可 造成 切割 位 点 的 大 量 增加 ，
在 实验 中 应 避免 。 有 关 限 制 性 内 切 核 酸 酶 的 使 用 和 注意 事项 在 第 三 节 详 述 。

(二 ) DNA 连接 酶 〈ligase)

最 常用 的 是 T4DNA 连接 酶 ， 是 在 T4 叹 菌 体感 染 的 大 肠 杆 菌 中 发 现 和 分 离
的 。 它 可 以 催化 两 条 DNA 链 的 3-OH 和 5 -POj - 之 间 形 成 磷酸 二 酯 键 ， 从 而 把
两 段 DNA 连接 起 来 。T4DNA 连接 酶 不 仅 适 用 于 DNA 之 间 的 黏 性 末端 连接 ， 也
可 用 于 平 齐 末 端的 连接 ， 只 是 对 于 前 者 的 连接 效率 要 比 对 后 者 高 很 多 。

T4DNA 连接 酶 催化 的 反应 需要 Mg 和 ATP。 最 适 pH 为 7.5 一 7.6。 就 酶
活力 而 言 是 在 温度 37X 时 最 高 ， 但 考虑 到 连接 反应 时 DNA 的 稳定 性 和 DNA 睫
段 之 间 的 末端 相互 作用 ， 在 实验 中 进行 连接 时 ， 平 齐 末端 一 般 采 用 20 一 2SY，
黏 性 未 端 12 一 16? 。

(三 ) 其 他 主要 工具 酶
1. 大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 I (DNA ploymerase 工 )

此 酶 由 一 条 分 子 质量 109 000Da 的 多 肽 组 成 ， 是 一 多 功能 酶 。 具 有 三 种 活
性 : 5 一 3DNA 聚合 酶 活性 、5 一 3 外 切 核酸 酶 活性 和 3 “一 5 外 切 核 酸 酶 活性 。
主要 用 于 缺口 平移 法 制备 DNA 探 针 ， 也 可 用 于 3“ 凸 出 的 黏 性 末端 的 平 端 化 和 标
浊 必
2. 大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 IT 的 Klenow 片段

大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 工 可 被 枯草 杆菌 蛋白 酶 或 胰 和 蛋白 酶 切割 成 相对 分 子 质

量 分 别 为 76 000 和 36 000 的 两 个 片段 ， 其 中 大 片段 称 Klenow 片段 ， 它 保留 了

大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 工 的 $ 一 3'DNA 聚合 酶 活性 和 3 一 外 切 核酸 酶 活性 ， 而

小 片段 保留 5 一 3 外 切 核酸 酶 活性 。Klenow 片段 的 5 一 3DNA 聚合 酶 活性 可 用

于 双 脱 氧 DNA 序 列 测定 、cDNA 链 中 第 二 链 的 合成 以 及 补 齐 或 标记 带 3 四 端的
:426 ，

DNA 片段 ， 其 3 一 5 外 切 核酸 酶 活性 也 可 用 于 3 凸 出 的 黏 性 未 端的 平 端 化 。 也
可 用 于 以 Ml3 单 链 DNA 为 模板 的 oligo 诱导 突变 实验 中 突变 链 的 合成 。

3. TaqDNA 聚合 酶

分 子 质 量 95 000Da， 具 有 强 的 $ -3 DNA 聚合 酶 活性 。 最 适 反 应 温度
7S$ 一 80C ， 即 使 9SY 处 理 仍 保持 活性 。 主 要 用 于 PCR 反应 。

4. 反 转 录 酶 (reverse transcriptase RTase)

由 两 条 肽 链 组 成 ， 其 中 一 条 同时 具有 $' ->3DNA 聚合 酶 活性 和 $ ->3?RNA 外
切 核酸 酶 活性 。 它 可 以 以 单 链 RNA 或 单 链 DNA 为 模板 ， 在 引物 参与 下 催化 合成 与
模板 互补 的 DNA 子 链 。 主 要 用 于 以 mRNA 为 模板 的 cDNA 第 一 链 的 合成 。

S. 核酸 酶 S1

在 适当 的 酶 浓度 下 ， 可 特异 地 降解 单 链 DNA 或 单 链 RNA， 而 对 双 链 DNA、
双 链 RNA 以 及 DNA-RNA 杂交 分 子 没有 作用 ， 在 高 浓度 下 也 可 降解 双 链 核酸 。
常用 于 DNA 黏 性 未 端的 平 齐 、 打 开 双 链 DNA 中 的 发 夹 环 、 分 析 DNA-RNA 的
杂交 结构 (S1 mapping)。

6. 核糖 核酸 酶 H

是 一 种 内 切 核酸 酶 ， 可 特异 地 降解 DNA-RNA 杂 合 链 的 RNA 链 。 在 cDNA
的 第 一 链 合成 完成 后 ， 常 用 核糖 核酸 酶 H 去 除 mRNA 模板 以 进行 下 步 反 应 。

7. 碱 性 磷酸 酶 (alkaline phosphatase)

该 酶 在 碱 性 条 件 下 ， 可 以 催化 DNA 或 RNA 的 $ 端 脱 去 磷酸 基 团 。 在
DNA5 端 进行 放射 性 标记 时 ， 先 通过 此 酶 产生 $ -OH， 再 通过 核 苷 酸 激酶 的 作用
将 放射 性 核 苷 酸 加 到 3“ 端 进行 标记 ; 此 酶 还 有 一 个 用 途 ， 在 载体 和 目的 基因 的
连接 反应 中 去 除 载体 $ 端的 磷酸 基 团 ， 防 止 载体 自 连 。 目 前 常用 的 有 两 种 酶 ;
细菌 碱 性 磷酸 酶 (BAP) 和 和 牛 小 肠 碱 性 磷酸 酶 (CIP)。

8. 末端 脱氧 核 苷 酸 转移 酶 (terminal deoxynuleotidyl transferase)

这 种 酶 可 以 将 脱氧 核 苷 酸 反复 地 加 在 单 链 和 双 链 DNA 的 3-OH 端 。 如 果 是
单 链 DNA 或 3-OH 端 凸 出 的 双 链 DNA， 反 应 在 Mg 存在 的 条 件 下 进行 ; 如果
是 平 齐 末端 或 3 -OH 端 上 四 进 的 双 链 DNA， 则 需要 Co ” 。 林 端 脱 氧 核 苷 酸 转移 酶
主要 用 于 在 载体 和 外 源 DNA 片段 上 加 上 可 以 互补 的 同 聚 体 尾 部 (如 在 载体 两 端
加 上 AAAAA， 在 外 源 片 断 上 加 上 TTTTT)， 以 便 两 者 能 在 体外 进行 重组 。 另
外 ， 此 酶 也 常用 于 DNA 片段 的 3“ 端 标记 。

。 427 ，

和

9. T4 多 核 苷 酸 激酶

具有 两 种 活性 。 可 以 将 ATP 的 7Y- 磷 酸 转移 到 DNA 或 RNA 的 5 端 羟 基 ， 这
种 正 向 反应 活性 是 高 效率 的 ， 常 用 于 DNA、RNA 5 “ 端 标记 和 在 oligo DNA ( 引
物 ) 5 端 加 上 磷酸 基 团 。 另 外 一 个 活性 是 交换 活性 ， 催 化 5 端 磷酸 的 交换 ， 即 在 和
ADP 过 量 存在 的 条 件 下 ， 可 以 将 $ 端的 磷酸 基 团 转移 到 ADP 上 ， 这 种 活性 很
低 ， 但 可 以 用 于 DNA、RNA 5 端的 去 磷酸 化 ， 以 便 加 上 标记 的 磷酸 。

二 节目 的 基因 制备

人 们 将 那些 已 被 分 离 或 欲 分 离 、 扩 增 、 表 达 、 改 造 的 基因 或 DNA 片段 称 为
目的 基因 。 显 然 “ 目 的 基因 ”不 仅仅 指 那些 能 编码 蛋白 质 的 DNA 片段 ， 它 是 一
个 包含 了 诸如 启动 子 、 终 止 子 、 增 强 子 等 调控 序列 以 及 非 编码 区 域 在 内 的 一 个 广
泛 的 定义 。 人 类 细胞 的 基因 数目 可 能 高 到 几 万 个 ， 即 使 是 简单 的 大 肠 杆菌 也 有 几
千 个 基因 ， 如 何 从 如 此 庞大 的 基因 组 中 获取 我 们 所 需要 的 目的 基因 是 重组 DNA
技术 的 第 一 个 难题 。 随 着 分 子 生 物 学 及 其 相关 技术 的 发 展 ， 人 们 已 经 用 多 种 多 样
的 方法 分 离 目 的 基因 ， 主 要 有 直接 分 离 法 、 构 建 基因 组 文库 或 cDNA 文库 分 离
法 、PCR 法 和 化 学 合成 法 等 。

一 、 直 接 分 离 法
1. 基因 分 离 的 物理 化 学 法

这 是 重组 DNA 技术 发 展 初期 的 方法 ， 基 本 原理 是 DNA 分 子 的 GC 碱 基 配 对 时
中 存在 3 个 氢 键 、AT 间 只 有 两 个 氨 键 。 如 果 不 同 基因 片段 间 的 碱 基 组 成 差异 较
大 ， 其 理化 性 质 如 浮力 密度 、 解 链 温度 等 就 有 明显 不 同 ， 采 用 相应 的 办 法 即 可 分
离 到 目的 基因 。 这 种 方法 可 以 分 离 到 某 些 生物 的 rDNA 基因 ， 但 目前 已 很 少 应 用
此 方法 分 离 目的 基因 。

2. 限制 性 内 切 核酸 酶 酶 切 分 离

适用 于 从 简单 基因 组 中 分 离 含 目的 基因 的 DNA 片段 。 质 粒 和 病毒 等 的 DNA
分 子 只 有 几 千 到 几 十 万 个 碱 基 ， 目 的 基因 较 少 ， 获 得 目的 基因 的 方法 也 比较 简
单 ， 但 是 ， 由 于 受 限 制 性 内 切 核酸 酶 位 点 要 求 的 限制 ， 难 以 获得 较为 理想 的 片段 。

3. 利用 反 转 录 法 直接 从 特定 mRNA 上 分 离 基因

主要 用 于 转录 产物 mRNA 以 分 离 目的 基因 。 以 目的 基因 的 mRNA 为 模板 ，
在 反 转 录 酶 的 作用 下 合成 互补 的 EDNA， 然 后 在 DNA 聚 合 酶 的 作用 下 合成 双 链
428

eeF

DNA， 与 适当 的 载体 重组 后 转 入 宿主 细胞 扩 增 ， 即 可 获得 目的 基因 的 cDNA 克
隆 。 对 于 一 些 低 丰 度 mRNA， 直接 用 细胞 的 总 mRNA 为 模板 往往 难以 得 到 cDNA
克隆 ， 现 在 发 展 出 的 双 抗体 免疫 分 离 目的 基因 技术 解决 了 这 个 问题 ， 其 主要 原理
是 利用 已 纯化 的 蛋白 、 蛋 自 抗体 以 及 蛋白 抗体 的 第 二 抗体 ， 通 过 上 芒 糖 密度 离心 等
方法 将 含有 特定 mRNA 的 多 聚 核糖 体 从 总 多 聚 核糖 体 中 分 离 出 来 ， 利 用 反 转 录
法 获得 目的 基因 。

二 、 构 建 基因 组 文库 或 cDNA 基因 文库 分 离 法

对 于 高 等 真 核 生物 而 言 ， 基 因 组 DNA 十 分 庞大 ， 且 基因 组 成 及 结构 复杂 :
除了 编码 序列 ， 还 有 调控 序列 、 间 隔 序列、 重复 序列 等 ， 绝 大 多 数 基 因 难 以 直接
分 离 。 一 个 可 行 的 方法 是 对 所 有 的 基因 进行 克隆 和 扩 增 ， 也 就 是 建立 某 种 生物 的
基因 组 文库 或 cDNA 文库 ， 然 后 根据 不 同 的 方法 将 所 需 的 克隆 分 离 出 来 ， 最 终 分
离 获得 目的 基因 。 从 cDNA 文库 中 获得 基因 的 编码 区 ， 本 晤 各 湖 旺 机 汪汪 用 人 避
者 含有 多 个 内 含 子 的 麻烦 。

1. 基因 组 文库

基因 组 文库 是 指 将 某 种 生物 基因 组 上 所 有 的 遗传 信息 通过 克隆 储存 在 一 个 受
体 菌 的 群体 中 。 者 受 体 群 体 中 只 储存 了 部 分 的 遗传 信息 ， 则 称 部 分 基因 组 文库 。
染色 体 上 的 DNA 是 生物 遗传 信息 的 主要 携带 者 ， 将 其 比较 均匀 地 “剪断 ”是 构
建 基因 组 文库 的 第 一 步 ， 在 早期 人 们 用 超声 波 等 物理 方法 或 限制 性 内 切 核酸 酶 等
生化 方法 将 染色 体 DNA 打 断 ， 通 过 与 适当 的 载体 相连 得 到 数目 众多 的 重组 体 ，
再 用 探 针 杂交 等 方法 将 目的 基因 “ 钓 ” 出 ， 这 就 是 所 谓 的 “ 乌 枪 法 ”， 这 种 方法
在 很 大 程度 上 是 依赖 于 运气 ， 因 为 目的 基因 ， 尤 其 是 单 拷贝 基因 ， 在 整个 基因 组
中 的 比例 是 非常 低 的 。 在 以 后 的 发 展 中 ， 这 项 技术 不 断 得 到 完善 ， 包 括 特 异性 更
适合 的 限制 性 内 切 核 酸 酶 、 能 容纳 更 大 片段 的 载体 (如 鸣 菌 体 载体 、cosmid 载体
和 YAC 载体)、 更 先进 的 筛选 鉴定 方法 等 ， 从 而 使 目的 基因 的 分 离 主要 是 依赖 于
技术 手段 而 非 运气 ， AR
内 容 。

2.cDNA 基因 文库

将 某 种 生物 基因 组 转录 的 部 分 或 全 部 mRNA 经 反 转 录 法 产生 的 各 种 EDNA
和 适当 的 载体 相连 ， 储 存 于 一 种 受 体 菌 群体 中 ， 称 为 构建 cDNA 基因 文库 。 在 细
胞 中 ， 表 达 基 因 一 般 仅 占 基因 总 数 的 13% 左 右 ， 所 以 从 mRNA 出 发 分 离 目 的 基
因 极 大 地 缩小 了 搜索 目的 基因 的 范围 。 与 基因 组 文库 相 比 ，cDNA 基因 文库 有 其
自身 的 特点 : DecDNA 序列 只 反应 基因 组 的 编码 序列 ， 文 库 的 复杂 性 较 低 。@ 生

. 429 ，

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物 在 不 同 的 发 育 阶段 或 特定 的 组 织 中 ， 表 达 的 基因 有 所 不 同 ， 因 而 构建 的 cDNA
文库 也 会 有 差别 。@@ 从 cDNA 文库 筛选 的 目的 基因 可 直接 用 于 表达 。

三 、PCR 法 分 离 目的 基因

如 果 知 道 目 的 基因 的 全 序列 或 其 两 侧 序 列 ， 可 以 通过 合成 一 对 与 模板 DNA
互补 的 引物 ， 采 用 PCR 方法 即 可 有 效 地 分 离 目的 基因 。 与 传统 的 DNA 克隆 方法
相 比 PCR 方法 显得 十 分 简捷 s。 现代 分 子 生物 学 发 展 到 今天 ， 人 类 基因 组 全 序列
已 经 测 出 ， 并 且 越 来 越 多 的 模式 生物 的 基因 组 全 序列 正在 被 测 出 ，PCR 法 已 经
成 为 分 离 目 的 基因 的 主要 手段 。

四 、 目 的 基因 的 化 学 合成 法

是 指 根据 已 知 的 或 设计 的 蛋 白 质 氨基 酸 的 顺序 ， 推 断 出 目的 基因 的 碱 基 顺
序 ， 通 过 化 学 合成 的 方法 合成 目的 基因 。 化 学 合成 法 适用 于 小 DNA 分 子 质量 的
基因 ， 也 可 以 进一步 通过 酶 学 方法 再 连接 出 较 大 的 基因 。 随 着 结构 生物 学 和 生物
信息 学 的 快速 发 展 ，DNA 的 化 学 合成 法 已 经 成 为 分 子 生物 学 实验 室 的 一 种 非常
重要 的 常规 技术 手段 。

三 节目 的 基因 壹 载体 的 体外 重组

顾名思义 ， 目 的 基因 与 载体 的 体外 重组 是 重组 DNA 技术 中 的 核心 步骤 。 通
常 所 说 的 体外 重组 指 DNA 片段 之 间 的 体外 连接 ， 即 由 DNA 连接 酶 催化 两 个 双
链 DNA 片段 间 的 5 端 磷酸 基因 和 3 端 羟基 形成 磷 酸 二 酯 键 的 过 程 。 目 前 常用 的
DNA 连接 酶 有 两 类 ， 一 类 来 源 于 大 肠 杆 菌 ， 另 一 类 来 源 于 T4 鸣 菌 体 。 其 中 以
T4 连接 酶 最 常用 ， 它 既 可 以 催化 带 有 互补 黏 末 端的 DNA 片段 的 连接 ， 也 可 以 用
于 平 齐 末端 的 DNA 片段 的 连接 。DNA 体外 重组 主要 由 这 两 种 连接 方式 进行 。 体
外 重组 技术 发 展 到 现在 ， 已 经 与 限制 性 内 切 核 酸 的 酶 切 作 用 密 不 可 分 了 。 无 论 是
DNA 片段 间 的 互补 黏 性 末端 ， 抑 或 是 平 端 末 端 ， 绝 大 多 数 由 限制 性 内 切 核酸 酶
酶 切 而 得 (当然 ， 还 包括 一 些 其 他 辅助 手段 )。 因 此 ， 我 们 将 目的 基因 与 载体 的
剪 切 纳入 此 节令 述 。

一 、 目 的 基因 与 载体 的 剪 切
目的 基因 与 载体 的 剪 切 一 般 通过 限制 性 内 切 核酸 酶 进行 切割 。 即 使 获得 的 目
的 基因 片段 没有 合适 的 酶 切 位 点 ， 也 可 以 通过 PCR 等 常规 方法 在 其 两 端 加 上 。

“30R

”一 个 普遍 性 的 原则 是 采用 相同 的 限制 性 内 切 核 酸 酶 (或 同 尾 酶 ) 分 别 切割 目的 基

因 和 载体 ， 使 两 者 的 末端 能 够 互补 ， 便 于 下 一 步 的 连接 反应 。 目 的 基因 和 载体 的
剪 切 主要 有 以 下 几 种 方式 ;

(一 ) 限制 性 内 切 核酸 酶 切割 后 形成 黏 性 末端

由 限制 性 内 切 核酸 酶 切割 形成 的 黏 性 未 端 有 两 种 : 5 凸 出 末端 (如 BamzHI
切割 后 ) 和 3' 凸 出 末端 (如 Psz 工 切割 后 )。 两 种 黏 性 末端 都 可 以 使 用 ， 但 前 者
的 连接 效率 更 高 。 限 制 性 内 切 核 酸 酶 有 几 百 种 ， 其 选择 方法 很 简单 : 先 看 载体 上
有 哪些 合适 的 单一 酶 切 位 点 ， 再 看 这 些 酶 切 位 点 有 哪些 不 包含 在 目的 基因 中 ， 即
可 被 选用 。 当 然 ， 有 时 构建 一 些 特 殊 载体 如 表达 型 载体 时 还 要 考虑 避免 移 框 、 符
合 表达 型 载体 的 启动 子 要 求 等 问题 ， 这 一 般 在 载体 的 使 用 说 明 中 有 详细 叙述 。

在 第 一 节 中 已 简要 提 及 限制 性 内 切 核酸 酶 的 一 些 使 用 要 求 ， 以 下 具体 谈 谈 影
啊 限 制 性 内 切 核 酸 酶 的 几 个 因素 。

1. DNA 样品 的 质量

一 般 而 言 ， 经 过 碱 法 提取 的 DNA 样品 ， 大 多 数 限制 性 内 切 核酸 酶 都 可 以 直
接 使 用 ， 并 且 有 较 好 的 酶 切 效 果 。 但 DNA 样品 的 某 些 污染 物 ， 如 苯酚 、 氯 仿 、
乙醇 、EDTA，SDS、 和 蛋白 质 以 及 高 浓度 的 盐 离 子 等 ， 有 可 能 抑制 限制 性 内 切 核
酸 酶 的 活性 ， 因 此 制备 DNA 样品 时 首先 是 要 求 操作 规范 。 少 数 限 制 性 内 切 核酸
酶 ， 即 使 用 规范 操作 提取 的 DNA 样品 其 酶 切 活性 也 很 低 ， 通 常 采用 增 大 酶 用
量 、 延 长 反应 时 间 、 扩 大 反应 体积 或 者 提高 DNA 纯度 等 方法 来 获得 满意 的 切割
结果 。

有 些 DNA 样品 ， 尤 其 是 采用 碱 变性 法 制备 的 ， 会 含有 少量 的 DNase 的 污
染 。 一 般 DNA 储存 液 中 含有 EDTA， 鳌 合 了 DNase 活性 所 需 的 Mgz+ ， 因 此
DNA 是 稳定 的 。 但 随 着 限制 性 内 切 核酸 酶 缓冲 液 中 Mg 的 加 入 ， 有 时 DNA 会
被 DNase 很 快 的 降解 。 一 般 采 用 提高 样品 中 DNA 的 浓度 来 避免 这 种 情况 。

2. DNA 的 甲 基 化

大 肠 杆菌 有 两 种 甲 基 化 酶 ，dam 甲 基 化 酶 和 dcm 甲 基 化 酶 。 识 别 序列 中 核
苷 酸 的 甲 基 化 作用 ， 会 强烈 的 影响 大 多 数 限制 性 内 切 核 酸 酶 的 活性 。 为 避免 产生
这 样 的 问题 ， 重 组 DNA 技术 中 一 般 使 用 失去 了 甲 基 化 酶 的 大 肠 杆菌 菌株 制备
DNA。

3. 酶 切 反应 体积 、 酶 的 用 量 和 反应 时 间

商品 化 的 酶 一 般 有 $S0% 的 甘油 和 少量 EDTA。 如 果 反 应 体积 太 小 ， 甘 油 和
4 同 34

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EDTA 都 会 影响 到 酶 的 活性 。 一 般 切割 1xgDNA 的 体积 在 20 一 30 岂 为 宜 ， 酶 用
量 一 般 为 1xgDNA 5 单位 酶 时 足够 了 (注意 切割 1vgDNA 的 不 同 限制 性 内 切 核 酸
酶 用 量 要 求 是 不 同 的 )。 由 于 通常 酶 的 用 量 大 于 所 需 量 ， 故 反应 时 间 不 能 过 长
一 般 不 超过 2h， 以 免 其 他 杂 酶 影响 酶 切 效 果 。 有 时 酶 切 的 DNA 较 多 ， 体 积 较
大 ， 酶 的 用 量 可 减少 到 1vgDNA 2 一 3 单位 酶 ， 同 时 把 反应 时 间 延 长 至 3h。

4. 限制 性 内 切 核酸 酶 的 缓冲 液

第 一 节 已 经 提 及 限制 性 内 切 核 酸 酶 的 反应 条 件 ， 依 据 反 应 条 件 建立 的 标准 组
冲 液 的 组 分 包括 氯化镁 、 和 氧化 钠 或 毛 化 钊 、Tris-HCI、B- 琉 基 乙 醇 或 二 硫 苏 糖 醇
(DTT)。 对 于 不 同 的 酶 ， 变 化 最 大 的 是 氯 化 钠 或 毛 化 钾 的 浓度 。 使 用 单 酶 进行
酶 切 时 ， 商 业 化 的 酶 制剂 已 经 很 好 地 解决 了 这 个 问题 ， 不 用 多 作 考 虑 。 使 用 两 个
或 两 个 以 上 的 酶 进行 酶 切 时 ， 可 以 按 产品 说 明 寻 找 它 们 的 共用 缓冲 液 ， 每 种 酶 的
酶 活 都 达到 50% 以 上 即 可 。 如 果 没 有 合适 的 共用 缓冲 液 ， 可 以 考虑 先 使 用 低 盐
浓度 缓冲 液 的 酶 ， 再 使 用 高 浓度 缓冲 液 的 内 切 核 酸 酶 进行 酶 切 ， 也 可 以 在 一 种 酶
酶 切 之 后 ， 将 DNA 重新 提纯 、 溶 解 ， 再 用 另 一 种 酶 酶 切 。

(二 ) 形成 带 平 末 端的 DNA 片段

DNA 片段 之 间 平 末端 的 连接 效率 不 到 5 凸 出 黏 性 末端 的 1/50。 一 般 在 特殊
情况 下 才 使 用 平 端 连接 ， 如 找 不 到 合适 的 黏 性 末端 限制 性 内 切 核酸 酶 切割 目的 基
因 和 载体 ， 或 是 为 下 一 步 某 些 特殊 的 修饰 而 使 用 ， 有 时 也 是 为 了 基因 表达 中 形成
正确 的 框架 连接 。

1. 用 限制 性 内 切 核酸 酶 获得 平 末端

一 些 限制 性 内 切 核酸 酶 ， 如 SnzaBI、 严 xcII、HzeII 等 可 以 剪 切 形成 平 未
端 。 平 端 内 切 核酸 酶 的 反应 条 件 与 前 述 的 黏 性 末端 内 切 核酸 酶 相同 。

2. 由 黏 性 末端 改造 成 平 末端

通常 有 两 种 方法 ， 补 平 法 和 切 平 法 。 补 平 法 是 用 DNA 聚合 酶 I〈Klenow
I )， 以 限制 性 内 切 核酸 酶 切割 的 5 凸 出 末端 的 单 链 部 分 为 模板 ， 催 化 DNA
链 形成 平 未 端 。 而 切 平 法 则 是 用 S 核酸 酶 或 绿豆 核酸 酶 对 5 凸 出 末端 和 3' 凸
出 末端 的 单 链 部 分 进行 切割 ， 使 DNA 片段 形成 平 末端 ， 这 两 种 酶 要 求 的 切割
条 件 都 比较 严格 ，S 核酸 酶 常常 会 切割 过 头 而 形成 “切入 ”现象 ， 而 绿豆 核酸
酶 常常 会 切割 不 完全 ， 遗 留 1 一 2 个 核 苷 酸 。 因 此 由 黏 末 端 改 造成 平 末端 多 采
用 补 平 法 。

. 432 ，

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(三 ) 从 平 未 端 改 造成 黏 末端

通常 ， 连 接 平 末端 DNA 分 子 的 方法 除了 直接 利用 T4 连接 酶 进行 连接 ， 或

是 通过 PCR 方法 加 上 酶 切 点 之 外 ， 还 可 以 在 平 齐 末端 DNA 分 子 的 未 端 加 上 -一些

1
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核 苷 酸 ， 改 造成 黏 性 末端， 利用 T4 连接 酶 进行 连接 。 常 用 的 方法 有 同 聚 物 加 尾

法 、 接 头 法 和 衔接 子 法 。
1. 同 聚 物 加 尾 法

利用 末端 脱氧 核 苷 酸 转移 酶 ， 分 别 在 载体 和 目的 基因 的 两 端 分 别 加 上 互补 的
单 核 苷 酸 同 聚 物 ， 如 在 载体 的 两 端 加 上 poly (dG)， 在 目的 基因 的 两 端 加 上
poly (dC)， 使 DNA 分子 之 间 具 有 能 够 互补 的 黏 性 末端 便于 连接 。

”2. 接头 法

接头 是 指 一 类 人 工 合成 的 双 链 窒 核 苷 酸 片 段 ， 它 一 头 具 有 可 与 载体 连接 的 某
种 限制 酶 的 黏 性 末端 ， 另 一 头 具 有 平 末端 。 通 过 平 端 连接 将 接头 接 在 目的 基因 的
末端 ， 为 避免 平 端 连接 时 形成 接头 二 聚 体 ， 需 要 将 黏 性 末端 的 5 基 磁 酸 基 团 在
平 闪 连 接 前 先 去 除 ， 在 平 端 连接 后 再 用 T4 多 核 苷 酸 激酶 加 上 ， 进 一 步 进 行 与 载
体 的 连接 。

3. 衔接 子 法

衔接 子 也 是 一 类 人 工 合成 的 双 链 寡 核 苷 酸 链 。 与 接头 不 同 的 是 它 两 头 都 是 平
齐 末端 ， 且 常常 含有 两 个 或 两 个 以 上 的 酶 切 位 点 ， 因 此 它 比 接头 要 长 一 些 。 在 与
目的 基因 进行 平 端 连 接 后 ， 可 以 用 适当 的 限制 性 内 切 核 酸 酶 酶 切 目 的 基因 和 载
体 ， 使 两 者 产生 能 互补 的 黏 性 末端 。

二 、 目 的 基因 和 载体 的 体外 连接

大 肠 杆 菌 连 接 酶 只 能 催化 DNA 片段 间 互 补 黏 性 未 端的 连接 ， 不 能 催化 平 齐
末端 的 连接 ， 其 催化 连接 反应 这 一 耗 能 过 程 的 能 量 来 自 于 氧化 型 烟 酰 胺 腺 叶 叭 二
核 苷 酸 (NAD” )， 因 此 反应 系统 中 需要 添加 NAD- 作为 辅助 因子 。T4 连接 酶 既
能 催化 黏 性 末端 之 间 的 连接 ， 也 能 催化 平 末端 之 间 的 连接 ， 因 而 比 前 者 更 为 常
用 ， 其 催化 反应 的 能 量 来 自 于 ATP。

连接 酶 催化 连接 反应 时 的 最 适 温度 是 37C ， 但 在 这 个 温度 下 黏 性 末端 之 间
的 氢 键 结合 不 稳定 。 综 合 考虑 酶 催化 效率 和 黏 性 末端 结合 速率 ， 一 般 认 为 实际 反
应 的 温度 在 4 一 1SY 比较 合适 ， 反 应 时 间 在 2h 以 上 甚至 过 夜 。T4 连接 酶 催化 平

.433 ，

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端 连接 时 ， 效 率 比 黏 性 末端 要 低 得 多 ， 因 此 反应 温度 相应 地 提高 到 22 一 30C 。
体外 连接 主要 以 黏 性 末端 连接 和 平 齐 末端 连接 两 种 方式 为 主 ， 根 据 具体 策略
的 不 同 ， 主 要 有 以 下 几 种 连接 方法 。

1. 单一 限制 性 内 切 核酸 酶 酶 切 产生 的 同 源 黏 性 末端 之 间 的 连接

目的 基因 和 载体 分 别 用 同一 种 限制 性 内 切 核 酸 酶 酶 切 后 ， 它 们 两 端 都 带 有 相
同 的 、 彼 此 之 间 能 够 互补 的 黏 性 未 端 (当然 也 可 以 用 同 尾 酶 酶 切 得 到 )。 为 防止
载体 自身 连接 ， 线 性 化 的 载体 在 连接 前 需 用 碱 性 磷酸 酶 去 除 5 的 磷 酸 基 团 ， 在
进行 连接 反应 时 ， 连 接 酶 的 用 量 要 比 不 脱 磷 酸 基 团 时 大 得 多 ， 同 时 ， 载 体 与 目的
基因 的 摩尔 数量 比例 一 般 控 制 在 1:5 左右 ， 目 的 片段 再 多 的 话 ， 容 易 造 成 多 拷贝
插入 ， 反 而 不 利 。

采用 这 种 连接 方法 ， 目 的 基因 是 随机 连接 上 载体 的 ， 因 此 会 有 两 种 插 六 方
向 。 对 于 表达 型 重组 子 必 须 鉴 定 正 确 的 连接 方向 ， 鉴 定 方法 很 简单 ， 一 般 采 用 目
的 基因 上 的 一 个 单 酶 切 位 点 ， 辅 以 载体 上 的 一 个 单 酶 切 位 点 ， 进 行 限制 性 酶 切 图
谱 分 析 ， 根 据 切 出 片段 的 大 小 即 可 鉴定 方向 。 同 时 ， 这 种 连接 常常 会 造成 目的 基
因 的 多 拷贝 插入 ， 也 需要 用 限制 酶 酶 切 图 谱 进行 鉴定 。 如 果 电 泳 中 载体 的 带 和 择
入 片段 的 带 所 含 的 DNA 含量 不 合 比例 ， 就 可 能 是 多 拷贝 插入 。

2. 定向 克隆

定向 克隆 是 指 将 目的 基因 定向 的 插入 到 载体 中 。 它 要 求 线性 化 载体 两 端 〈 目
的 基因 ) 的 两 个 末端 不 能 形成 互补 ， 只 能 与 目的 基因 (载体 ) 相应 的 末端 相连
接 。 达 到 这 一 要 求 的 DNA 分 子 末 端 有 两 种 形式 : 中 线性 化 载体 〈 目 的 基因 ) 两
端 为 非 互补 的 两 个 黏 性 末端 ; @ 载 体 〈 目 的 基因 ) 两 端 一 侧 为 黏 性 末端 ， 另 一 侧
为 平 末端 。 对 于 第 一 种 形式 而 言 ， 可 以 通过 两 种 不 同 的 非 同 尾 限制 性 内 切 核酸 酶
分 别 对 载体 和 目的 基因 酶 切 而 得 ， 这 种 连接 形式 的 定向 克隆 连接 效率 非常 高 ， 是
重组 连接 中 最 简捷 ， 最 常用 的 方式 。 至 于 第 二 种 形式 ， 可 以 由 两 种 途径 得 到 : 用
一 个 产生 黏 性 末端 的 限制 性 内 切 核 酸 酶 和 一 个 产生 平 齐 末端 的 限制 性 内 切 核酸 酶
对 载体 和 目的 基因 进行 酶 切 ; 或 者 先 用 一 个 产生 黏 性 未 端的 限制 性 内 切 核 酸 酶 酶
切 ， 用 核酸 酶 切 平 或 用 DNA 聚合 酶 补 齐 后 ， 再 用 另 一 产生 黏 性 末端 的 限制 性 内
切 核 酸 酶 进行 酶 切 而 得 。

定向 克隆 有 很 多 优点 : 可 以 防止 载体 的 自身 环 化 、 阳 性 重组 子 的 得 率 高 、 对
于 表达 型 重组 子 可 以 保证 目的 基因 的 正确 插入 。

3. 平 端 连 接

DNA 片段 间 的 平 端 连接 也 是 重组 DNA 技术 中 的 常用 技术 。 因 为 很 多 限制 性
内 切 核酸 酶 酶 切 可 产生 平 末端 、PCR 和 机 械 剪 切 也 可 产生 平 末端 ， 此 外 还 可 以

. 434 ，

用 DNA 聚合 酶 补 平 或 核酸 酶 切 平 黏 性 末端， 这 些 不 同 来 源 的 平 末端 之 间 都 可 以
进行 连接 ， 这 给 不 同 DNA 分 子 间 的 连接 带 来 了 极 大 的 方便 。

平 端 连接 时 要 加 大 T4 连接 酶 的 用 量 ， 一 般 要 达到 黏 末 端 连 接 的 2 一 5 倍 ;
为 防止 载体 自 连 一 般 也 要 进行 去 磷酸 化 处 理 ; 载体 与 目的 基因 的 摩尔 数量 比 在
1:10 左 右 ; 并 且 常 加 8% 的 聚 乙 二 醇 以 便 提 高 连接 效率 。 与 单一 限制 性 内 切 核 酸
酶 酶 切 产生 的 同 源 黏 性 末端 之 间 的 连接 相 类 似 ， 平 端 连接 中 目的 基因 的 插入 也 是
双向 的 ， 且 可 能 形成 多 拷贝 ， 重 组 子 需 要 进行 限制 性 内 切 核 酸 酶 酶 切 鉴定 。

第 四 ， 重 组 子 导 入 细胞 技术

体外 重组 的 DNA 分 子 ， 必 须 进 入 到 合适 的 和 宿主 细胞 (host cell) 才能 进行 扩
增 和 表达 。 在 基因 克隆 技术 中 ， 依 据 重 组 载体 和 宿主 细胞 的 不 同 ， 运 用 不 同 的 名
词 描述 进入 过 程 。 质 粒 DNA 或 以 质粒 为 载体 构建 的 重组 子 导 入 细菌 细胞 ， 并 得
以 稳定 维持 或 表达 的 过 程 称 为 转化 (〈transformation)。 通 过 病毒 导入 宿主 细胞 并
建立 稳定 状态 的 过 程 称 为 转 染 (transfection)， 如 果 病 毒 是 叭 菌 体 ， 即 以 噬菌体
为 媒介 ， 将 外 源 DNA 导入 细胞 的 过 程 ， 又 常常 被 称 为 转 导 (transduction)。 实
际 上 三 者 没有 本 质 的 区 别 。

随 着 基因 工程 技术 的 发 展 ， 从 低 等 的 原核 细胞 ， 到 简单 的 真 核 细 胞 ， 进 一 步
到 结构 复杂 的 高 等 动 、 植 物 细 胞 都 可 以 作为 重组 DNA 的 宿主 细胞 。 至 今 为 止 ，
用 作 受 体 菌 的 原核 生物 主要 有 大 肠 杆 菌 、 枯 草 杆菌 、 链 霉菌 和 蓝 细菌 等 ， 真 核 生
物 中 也 发 展 了 酵母 细胞 、 植 物 细胞 、 哺 乳 动物 细胞 和 昆虫 细胞 等 作为 宿主 细胞 。-
一 般 情况 下 ， 和 宿主 细胞 的 选择 有 如 下 几 个 原则 : 四 便于 重组 DNA 分 子 的 导入 ;
@ 没 有 特异 的 限制 性 内 切 核酸 酶 系统 降解 重组 DNA; @ 导 入 的 重组 DNA 具有 和 较
高 的 遗传 稳定 性 ， 不 易 发 生变 异 ; @@ 重 组 DNA 扩 增 过 程 中 不 对 其 进行 修饰 ， 或
尽量 接近 于 目的 基因 来 源 的 修饰 @ 和 宿主 细胞 在 遗传 密码 的 应 用 上 没有 明显 的 偏
好 性 ; @ 菌 株 或 细胞 株 的 遗传 稳定 性 高 ， 易 于 扩大 培养 或 发 酵 生 长 ; @ 安 全 性

现 已 发 展 了 多 种 方法 将 重组 DNA 分 子 导 入 到 宿主 细胞 中 ， 如 冷 CaCl 法 、
类 脂 法 、 磷 酸 钙 共 沉 淀 法 、 电 击 法 、 鸣 菌 体 介 导 法 等 。 宿 主 细胞 不 同 ， 选 用 的 方
法 有 所 不 同 ， 下 面 逐 一 进行 简要 介绍 。

一 、 重 组 DNA 分 子 转化 原核 生物 细胞 (大 肠 杆 菌 )

用 原核 生物 为 宿主 细胞 进行 的 基因 工程 操作 中 ， 以 大 肠 杆 菌 的 应 用 最 为 广
泛 。 重 组 DNA 分 子 转化 大 肠 杆 菌 细胞 主要 采用 冷 CacCl 法 和 电击 法 。
.435 ，

1. 冷 Cacl 法

转化 是 指 细菌 由 于 吸收 了 外 源 DNA 而 发 生 可 遗传 表 型 变化 的 过 程 ， 是 自然
存在 的 过 程 。 转 化 发 生 时 ， 要 求 细 胞 处 于 能 吸收 外 源 DNA 的 生理 状态 ， 即 感受
态 (competence) 状态 。 冷 CaCb 法 利用 上 述 原 理 ， 在 低温 (0C )、 低 Ca 强度
的 条 件 下 ， 人 为 地 制备 感受 态 细胞 ， 随 后 加 入 重组 DNA 分 子 ， 它 能 和 Ca 形成
抗 DNA 酶 的 复合 物 黏附 于 细胞 表面 ， 通 过 后 续 的 热 激 处 理 等 步骤 而 进入 细胞 。

冷 CaCl 法 的 转化 效率 较 高 ，1lpwg 的 环 状 DNA 分 子 可 以 获得 10? 一 104 个 转
化 子 ， 足 以 满足 一 般 条 件 下 T4 连接 酶 所 产生 重组 子 的 转化 。 如 果 加 上 Mg 、
DMSO 等 物质 的 联合 处 理 ， 可 以 使 冷 CaCl 法 的 转化 效率 提高 100 一 1000 倍 ， 用
于 某 些 连接 效率 很 低 或 有 特殊 要 求 (如 文库 构建 中 ) 的 重组 DNA 分 子 的 转化 。

2. 电击 法

电击 法 最 早 用 于 将 外 源 DNA 导入 真 核 细 胞 ， 后 来 也 成 功 地 应 用 于 大 肠 杆 菌
的 转化 。 电 击 法 不 需要 预先 制备 感受 态 细胞 ， 其 原理 是 利用 高 压 电 脉冲 作用 ， 在
大 肠 杆菌 的 细胞 膜 上 进行 电 穿孔 ， 形 成 通道 ， 从 而 促进 了 外 源 DNA 的 进入 。 电
击 法 的 转化 效率 可 达 10? 一 108 转 化 子 /1wg 环 状 DNA。 电 击 法 常用 于 转化 分 子 质
量 大 于 1Skb 的 重组 DNA 的 转化 。

除了 冷 CaCb 法 和 电击 法 之 外 ， 还 有 三 亲本 杂交 (tri-parental mating) 结合
转化 法 用 于 重组 DNA 分 子 转化 细菌 ， 它 主要 适用 于 那些 难以 用 冷 CaCl 法 和 电
击 法 直接 进行 转化 的 受 体 细菌 。

二 、 重 组 DNA 分 子 导 人 哺乳 动物 细胞

外 源 DNA 是 很 难 进 入 哺乳 动物 细胞 的 ， 这 在 一 定 程度 上 影响 了 哺乳 动物 基
因 工 程 技术 的 发 展 。 不 过 ， 现 在 已 经 建立 了 多 种 技术 能 有 效 地 将 外 源 DNA 导入
哺乳 动物 细胞 。
1. 磷酸 钙 沉 淀 法

其 原理 是 哺乳 动物 细胞 能 捕获 黏附 在 细胞 表面 的 DNA- 磷 酸 钙 沉 淀 物 ， 使
DNA 转 入 细胞 。 磷 酸 钙 沉淀 法 曾 被 广泛 地 应 用 于 DNA 转 染 哺乳 动物 细胞 (以 及
昆虫 细胞 )。 一 般 情 况 下 转 染 的 细胞 可 占 总 数 的 10% 。 磷 酸 钙 沉 淀 法 的 操作 步骤
比较 繁琐 ， 试 剂 要 求 很 严格 ， 尤 其 是 Hepes 组 名 液 和 钙 盐 溶液 的 pH 要 求 准确 到
7.05。 磷 酸 钙 沉 省 法 成 本 低廉 ， 到 目前 为 止 仍 是 比较 党 用 的 转 染 方法 之 一 。
2. 电击 法

电击 法 转 染 哺乳 动物 细胞 的 原理 与 电击 法 转化 大 肠 杆 菌 的 相同 ， 不 同 的 是 前

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者 的 转 染 效率 要 远 远 低 于 后 者 的 转化 效率 ， 一 般 在 每 10” 个 存活 细胞 中 ， 可 得 到
20 一 30 个 转化 子 ， 并 且 转 染 效率 与 宿主 细胞 类 型 密切 相关 。 由 于 电击 时 的 介质
溶液 电阻 越 大 越 好 〈 低 离子 强度 溶液 )， 但 又 不 能 使 细胞 在 低 渗 条 件 下 过 度 膨 胀
破裂 ， 因 此 一 般 情况 下 是 选择 合适 的 电压 、 介 质 离子 强度 以 及 脉冲 时 间 ， 使 电击
后 有 50% 一 60% 的 细胞 死亡 ， 才 能 获得 满意 的 结果 。 电 击 法 转 染 真 核 细胞 的 操
作 过 程 增加 了 细胞 污染 其 他 杂 菌 的 机 会 ， 因 此 并 不 常用 ， 不 如 脂 质 体 法 便利 和 安
全 。

3. 脂 质 体 法

脂 质 体 是 一 类 人 工 合成 的 脂 类 物质 颗粒 ， 可 以 把 外 源 DNA 包 庄 在 其 中 。 与
裸露 的 DNA 分 子 相 比 ， 它 与 真 核 细胞 细胞 膜 的 脂 质 双 分 子 层 有 更 好 的 亲 和 人 性 ，
因而 脂 质 体 法 的 转 染 效率 可 达 磷 酸 钙 沉淀 法 的 一 倍 以 上 。 由 于 脂 质 体 无 毒 、 无 锡
疫 原 性 ， 不 仅 可 以 用 于 体外 的 细胞 转 染 ， 而 且 还 可 以 在 动物 体内 将 基因 转 入 靶 细
胞 、 轰 组 织 、 靶 需 官 位 点 ， 实 现 瞬 间 表 达 或 稳定 表达 ， 因 而 它 具 有 极 大 的 应 用 前
景 。 目 前 ， 脂 质 体 已 经 商品 化 生产 ， 如 美国 BRL 公司 的 lipofectin 产品 。 利 用 脂
质 体 转 染 哺乳 动物 细胞 已 经 成 为 实验 室 的 常规 技术 。

4. 显 微 注射 转基因 技术

应 用 显 微 注射 器 可 以 把 重组 DNA 直接 注入 哺乳 动物 细胞 内 。 用 这 种 方法 转
基因 的 效率 很 高 ， 获 得 稳定 转化 子 的 数量 主要 取决 于 重组 DNA 的 性 质 。

除了 上 述 四 种 方法 ， 还 可 以 采用 DEAE- 葡 聚 糖 转 染 法 和 聚 阳 离子 -DMSO 转
染 法 将 外 源 DNA 导入 哺乳 动物 细胞 ， 它 们 的 原理 与 磷酸 钙 沉 淀 法 类 似 ， 葡 聚 糖
和 聚 阳离子 的 使 用 都 是 为 了 促进 细胞 表面 对 DNA 的 吸附 力 ，DMSO 的 使 用 则 是
为 了 增加 细胞 膜 的 通 透 性 。 此 外 ， 病 毒 颗粒 的 感染 也 可 实现 外 源 DNA 的 导入 。

三 、 重 组 入 噬菌体 DNA 分 子 转 导 大 肠 杆 菌

和 鸣 菌 体 载体 主要 用 于 较 大 的 基因 片段 的 克隆 。 和 叹 菌 体 本 身 的 基因 组 就 很
大 ， 加 上 外 源 片段 后 其 大 小 可 达 S0kb 左右 ， 这 么 大 的 DNA 分 子 通过 转化 进入
细胞 的 可 能 性 非常 小 。 现 在 运用 重组 和 叭 菌 体 DNA 分 子 转 导 大 肠 杆菌 的 技术 已
经 发 展 成 熟 ， 其 要 点 是 将 重组 入 鸣 菌 体 DNA 进行 体外 包装 ， 形 成 具有 感染 能 力
的 病毒 颗粒 ， 通 过 感染 细胞 将 外 源 DNA 带 入 细胞 内 。

四 、 重 组 DNA 分 子 导 人 植物 细胞

植物 细胞 有 细胞 壁 的 结构 ， 因 此 重组 DNA 导入 的 方法 与 动物 细胞 有 所 不
.437 ，

同 。

目前 在 植物 细胞 中 最 常用 的 方法 是 农 杆菌 介 导 的 Ti 质粒 载体 转化 法 农 杆
菌 是 一 类 音 兰 氏 阴 性 菌 ， 能 够 通过 伤口 感染 双子 叶 植 物 和 裸子 植物 ， 并 将 其 宙
质粒 上 的 TDNA (可 以 包含 目的 基因 片段 ) 转移 至 细胞 内 部 ， 与 染色 体 DNA 整
合 ， 从 而 得 到 稳定 维持 或 表达 。 农 杆菌 介 导 的 Ti 质粒 载体 转化 法 已 经 成 束 ， 迄
今 为 止 约 有 80% 的 转基因 植物 是 通过 这 种 方法 得 到 的 。

但 是 农 杆菌 对 于 绝 大 多 数 的 单子 叶 植 物 没 有 感染 力 ， 为 了 在 这 类 和 宿主 细胞 申
实现 外 源 基 因 的 导入 ， 至 今 已 发 展 了 电击 法 、 基 因 枪 法 、 脂 质 体 法 、 显 微 注射
法 、 多 聚 物 介 导 法 等 方法 。 这 些 方法 多 是 参照 哺乳 动物 细胞 而 来 ， 只 不 过 在 多 数
情形 下 需要 去 除 植物 细胞 的 细胞 壁 ， 以 原生 质 体 的 形式 完成 重组 DNA 的 导 六 。

第 五 节 ”重组 子 的 躲 选 与 仅 定

在 重组 DNA 分 子 导 入 到 和 宿主 细胞 的 过 程 中 ， 一 般 只 有 少数 重组 子 能 进入 笨
主 细胞 并 且 稳 定 存在 。 以 质粒 转化 大 肠 杆 菌 为 例 ， 转 化 效率 在 一 般 情 况 下 只 能 达
到 10 一 10-“， 这 意味 着 如 果 有 10" 个 宿主 受 体 细胞 ， 只 有 10 一 100 个 细胞 被
转化 ， 这 些 被 转化 的 细胞 与 其 他 非 转化 细胞 是 混杂 在 一 起 的 ， 并 且 其 中 还 包括 自
连 的 载体 或 者 一 个 载体 与 多 拷贝 目的 基因 片段 的 连接 等 非 目 标 重 组 子 的 被 转化 细 生
胞 。 因 此 ， 筛 选 与 鉴定 含有 阳性 重组 子 的 宿主 细胞 是 重组 DNA 技术 中 一 个 重要
的 环节 。
不 同 克隆 载体 、 宿 主 细胞 类 型 以 及 不 同 的 重组 DNA 分 子 导 入 细胞 方法 ， 其
重组 子 的 筛选 与 鉴定 也 不 尽 相 同 ， 一 般 主 要 包括 以 下 几 方面 。
3
间

一 、 根 据 重 组 载体 的 选择 性 标记 进行 竹 选

目前 经 常 使 用 的 载体 都 携带 有 选择 性 遗传 标记 ， 或 具有 一 种 可 供 选 择 的 遗传
学 特征 ， 这 样 重组 载体 导入 宿主 细胞 后 ， 可 以 使 宿主 细胞 呈现 出 特殊 的 表 型 或 遗
传 学 特征 。 据 此 可 对 重组 子 或 转化 子 进行 初步 的 筛选 。

1. 抗 药性 筛选

载体 携带 的 选择 性 标记 中 最 稼 见 是 抗 药 性 标记 ， 如 抗 氨 苯 青霉素 基因
(am 太 )、 抗 四 环 素 基因 (tez )、 抗 卡 那 霉 素 基 因 〈&axr ) 等 。

如 果 外 源 基 因 片 段 插 入 载体 的 位 点 在 抗 药性 基因 之 外 ， 不 导致 抗 药性 基因 的
失 活 ， 仍 能 编码 抗 药性 基因 产物 。 含 有 这 种 重组 子 的 转化 细胞 可 以 在 含有 相应 抗
生 素 的 琼脂 平板 上 生长 成 菌落 ， 那 些 未 能 接受 载体 DNA 的 细胞 因 不 能 生长 而 被
筛 除 ， 但 是 除了 阳性 重组 子 之 外 ， 自 身 环 化 的 载体 、 未 酶 切 完 全 的 载体 以 及 非 目

. 438 .

OO

省 加

的 基因 插入 载体 形成 的 重组 子 均 能 导入 宿主 细胞 并 进行 抗 药性 生长 形成 菌落 ， 这
些 菌 落 需要 用 进一步 的 鉴定 进行 排除 。

如 果 外 源 基 因 片 段 是 插入 在 载体 的 抗 药性 基因 中 间 ， 导 致 抗 药性 基因 失 活 ，
这 个 抗 药 性 标志 就 会 消失 。 例 如 质粒 pPBR322 含有 azpr 和 tetr 两 个 抗 药 基因 ，
若 将 目的 序列 插入 ter” 基因 序列 中 ， 转 化 大 肠 杆 菌 ， 将 细菌 涂 布 含 氨 休 青霉素
或 四 环 素 的 琼脂 平板 上 ， EN 在 含 氨 休 青霉素
和 四 环 素 的 琼脂 平板 中 都 能 生长 的 细菌 是 含有 空 质粒 pbPBR322 的 (未 能 插入 目的
二 析 拉 能 生长、 而 在 含 四 环 素 的 琼脂 平板 中 不 能
生长 的 细菌 就 很 可 能 是 含有 目的 基因 的 重组 质粒 。

2. 显 色 互 补 筛选 法

最 常用 的 是 久 半 乳糖 苷 酶 系统 。 一 个 完整 的 乳糖 操纵 子 包含 有 调控 序列 、R-
半 乳 糖苷 酶 基因 (acZ )、 透 性 酶 基因 (ccY) 和 乙酰 转移 酶 基因 (ac4A )，8B- 半
乳糖 昔 酶 系统 是 利用 其 中 的 B- 半 乳糖 昔 酶 的 活性 特征 : 当 培 养 基 中 含有 诱导 物 异
丙 基 -B_D- 硫 代 半 乳糖 苷 〈IPTG) 和 生 色 底 物 X-gal 时 ， 含 有 调控 序列 和 完整 B
半 乳 糖苷 酶 基因 〈;acZ) 的 细菌 或 者 唆 菌 体会 因 蓝 色 沉淀 物 的 产生 而 形成 蓝 色 菌
落 或 蓝 色 叭 菌 斑 。 根 据 这 个 原理 ， 将 此 操纵 子 的 调控 序列 和 8- 半 乳糖 背 酶 基因
(1acZ) 分 成 两 部 分 ， 载 体 或 噬菌体 上 含有 调控 序列 以 及 B 半 乳糖 苷 酶 基因
(5Z) N 端 146 个 氨基 酸 (w- 肽 ) 的 编码 序列 ， 并 在 这 个 编码 序列 中 插入 了 一
个 多 克隆 位 点 区 ， 它 不 破坏 操纵 子 的 阅读 框 ， 在 产生 蛋白 时 只 是 在 B- 半 乳糖 苷 酶
的 氨基 端 增加 几 个 氨基 酸 而 不 影响 功能 ;操纵 子 的 另 一 部 分 包含 于 宿主 细胞 的 基
因 组 中 ， 质 粒 和 宿主 细胞 的 编码 产物 可 以 进行 互补 而 形成 有 酶 学 活性 的 蛋白
质 ， 在 IPTG 和 X-gal 存在 的 条 件 下 可 以 形成 蓝 色 菌 落 或 者 蓝 色 叭 菌 斑 。 但 如 果
外 源 目 的 基因 插入 到 质粒 的 多 克隆 位 点 以 后 ， 导 致 了 ac2 的 失 活 ， 不 能 形成 w-
互补 ， 在 含有 IPTG 和 X-gal 的 平板 上 形成 的 是 白色 菌落 或 者 无 色 哗 菌 斑 。 这 样
经 目测 即 可 对 阳性 重组 子 进行 初步 筛选 。

目前 使 用 的 很 多 载体 带 有 B- 半 乳糖 苷 酶 基因 〈acZ) 部 分 缺失 的 片段 ， 采 用
B 半 乳糖 苷 酶 系统 的 显 色 进行 筛选 在 近年 来 应 用 甚 为 广泛 。

3. 插 人 表达 筛选 法

一 些 载体 在 筛选 标记 基因 的 上 游 连接 一 段 负 调控 序列 ， 当 外 源 片 段 插 入 负 调
控 序列 使 其 失 活 时， 筛选 标记 基因 才能 得 以 表达 。 例 如 pTR262 质粒 ， 它 由
pBR322 衡 生 而 来 ， 其 标记 基因 er 上游 存在 cr 的 负 调 控 序 列 ，crI 基因 表达 的 阻
过 蛋白 可 以 抑制 terr 基因 的 表达 。 当 外 源 片 段 插 入 cI 中 的 下 mdIII 位 点 ， 可 以
造成 cI 基因 的 失 活 而 解除 了 对 te 基因 的 抑制 ， 从 而 使 阳性 重组 子 呈 现 zerr 表
型 。

.439 ，

二 、PCR 法

PCR 技术 的 出 现 给 区 隆 的 筛选 增加 了 一 个 新 手段 。 如 果 已 知 目的 序列 的 长
度 和 两 端的 序列 ， 则 可 以 设计 一 对 引物 ， 以 转化 细胞 的 质粒 DNA 为 模板 或 以 重
组 后 的 细胞 基因 组 DNA 为 模板 进行 PCR 扩 增 ， 阁 能 得 到 预期 长 度 的 PCR 产物 ，
则 该 转化 细胞 就 可 能 含有 目的 序列 。

三 、 限 制 性 内 切 核酸 酶 酶 切 分 析 法

利用 限制 性 内 切 核 酸 酶 酶 切 分 析 法 可 以 进一步 筛选 鉴定 重组 子 ， 而 且 能 判断
外 源 DNA 片段 的 插入 方向 以 及 大 小 。 其 基本 方法 是 快速 提取 转化 细菌 中 的 质粒
DNA 后 ， 选 用 合适 的 限制 性 内 切 核酸 酶 对 质粒 DNA 进行 单 、 双 酶 切 ， 再 通过 凝
胶 电 泳 分 析 外 源 基因 的 揪 入 方向 和 大 小 。

四 、 核 酸 杂 交 法
1. 菌落 (或 吃 菌 斑 ) 杂交 筛选 法

利用 标记 的 核酸 作为 探 针 与 转化 细胞 中 的 DNA 进行 分 子 杂 交 ， 可 以 直接 得
选 和 鉴定 阳性 重组 子 。 常 用 的 方法 是 将 转化 后 生长 的 菌落 复印 到 硝酸 纤维 素 腊
上 ， 用 碱 裂 解 细菌 ， 菌 落 释 放 的 DNA 就 吸附 在 膜 上 ， 再 用 标记 的 核酸 探 针 进 行
分 子 杂 交 ， 核 酸 探 针 就 结合 在 含有 目的 序列 的 菌落 DNA 上 而 不 被 洗 脱 。 核 酸 控
针 可 以 用 放射 性 元 素 标记 ， 结 合 了 放射 性 核酸 探 针 的 菌落 可 用 放射 性 自 显 影 法 显
示 ， 也 可 以 用 非 放 射 性 物质 标记 ， 通 常 是 颜色 反应 显示 ,这样 就 可 以 将 阳性 重组
子 挑选 出 来 。 本 方法 可 以 进行 大 规模 操作 ， 一 次 可 以 筛选 10" 数量 级 的 菌落 或 噬
菌 班 ， 是 从 基因 文库 中 挑选 阳性 重组 子 的 首选 方法 。

2. Southern 印迹 杂交 法

为 了 进一步 确定 外 源 DNA 片段 插入 的 正确 性 ， 在 使 用 限制 性 内 切 核酸 酶 酶
切 、 凝 胶 电泳 分 离 DNA 片段 以 后 ， 可 以 将 这 些 片 段 转移 到 硝酸 纤维 素 膜 或 尼龙
膜 上 ， 用 相应 的 放射 性 元 素 标 记 或 非 放 射 性 物质 标记 的 DNA 探 针 进行 分 子 杂
交 ， 鉴 定 重 组 子 的 插入 片段 是 否 是 目的 基因 片段 。

核酸 杂交 法 中 还 包括 Northtern 印迹 杂交 、 斑 点 印迹 杂交 、 狭 线 印迹 杂交 等
方法 ， 它 们 的 原理 都 是 利用 核酸 分 子 杂 交 。

”440 ，

五 、 免 疫 学 方法

利用 特定 抗体 与 目的 基因 表达 产物 特异 性 结合 的 相互 作用 进行 筛选 。 此 法 不
是 直接 筛选 目的 基因 ， 而 是 通过 与 基因 表达 产物 的 相互 作用 显示 含有 目的 基因 的
转化 细胞 ， 因 而 要 求实 验 设计 要 使 目的 基因 进入 受 体 细胞 后 能 够 表达 出 其 编码 产
物 。 抗 体 可 以 用 放射 性 元 素 〈 一 般 用 王 I) 标记 ， 也 可 用 特定 的 酶 如 过 氧化 物 酶 、
碱 性 磷酸 酶 等 标记 。 放 射 性 元 素 标 记 抗体 在 免疫 反应 后 用 放射 目 显 影 显 示 ， 酶 标
抗体 则 是 利用 酶 可 催化 特定 底 物 分 解 呈 现 的 颜色 来 显示 。 免 疫 学 方法 专 一 性 强 、
灵敏 度 高 ， 因 为 只 要 有 一 个 拷贝 的 目的 基因 在 克隆 细胞 中 表达 和 蛋白质 ， 就 可 以 被
检测 出 来 ， 免 疫 学 方法 适用 于 从 大 量 转化 细胞 中 筛选 出 极 少 的 含 目的 基因 的 细胞
克隆 。

六 、 核 并 酸 序 列 则 定

所 得 到 的 目的 序列 或 基因 的 克隆 ， 一 般 都 要 用 其 核酸 序列 测定 来 最 后 监 定 。
已 知 序列 的 核酸 克隆 要 经 序列 测定 确证 所 获得 的 克隆 准确 无 误 ; 未 知 序 列 的 核酸
克隆 需要 测定 序列 才能 确 知 其 结构 、 推 测 其 功能 ， 用 于 进一步 的 研究 。 目 前 ， 核
酸 序列 测定 已 是 分 子 克隆 中 一 个 常规 的 鉴定 步 又 。 核 酸 序列 测定 的 原理 和 方法 在
实验 教材 中 有 详细 的 叙述 。

七 、 植 物 转化 细胞 和 哺乳 动物 转化 细胞 的 筛选 鉴定

在 植物 转基因 和 哺乳 动物 转基因 研究 中 ， 常 常 利用 载体 携带 的 报告 基因 来 进
行 筛选 鉴定 。 报 告 基因 是 指 一 些 抗生素 抗 性 基因 和 一 些 功能 研究 得 很 透彻 的 编码
某 些 酶 或 特殊 产物 的 基因 。 在 没有 选择 压力 的 条 件 下 ， 可 利用 报告 基因 在 受 体 细
胞 内 的 表达 ， 从 非 转化 克隆 中 选择 出 转化 细胞 ; 同时 报告 基因 可 以 与 目的 基因 形
成 嵌 合 基因 ， 从 它 的 表达 可 以 了 解 目的 基因 的 表达 情况 以 及 研究 基因 的 表达 调
控 。 在 转基因 植物 研究 中 ， 常 用 的 报告 基因 有 新 霉 素 磷 酸 转移 酶 基因 、 测 霉 素 转
移 酶 基因 、 氢 霉 素 乙酰 转移 酶 基因 以 及 荧光 素 酶 基因 等 ， 在 哺乳 动物 转基因 研究
中 ， 常 用 的 报告 基因 有 新 霉 素 磷酸 转移 酶 基因 、 和 氧 霉 素 乙酰 转移 酶 基因 ， 胸 腺 核
苷 激酶 基因 和 二 氢 叶 酸 还 原 酶 基因 等 。

第 六 节 “克隆 基因 的 表达

克隆 基因 的 表达 对 于 理论 研究 和 实际 应 用 有 着 十 分 重要 的 和 意义。 克隆 的 基因

4

只 有 通过 表达 才能 研究 基因 功能 以 及 表达 调控 的 机 理 ; 一 些 有 特定 生物 活性 的 蛋
日 质 ， 在 医学 、 工 业 和 农业 上 具有 应 用 价值 ， 可 以 克隆 其 基因 ， 并 使 之 在 宿主 细
胞 中 大 量 表达 而 进行 规模 化 生产 。 要 使 克隆 基因 在 宿主 细胞 中 表达 ， 就 要 将 它 放
入 带 有 基因 表达 所 需要 的 各 种 元 件 的 载体 中 ， 即 表达 载体 (expression vector) 之
中 。 克 隆基 因 可 以 放 在 不 同 的 宿主 细胞 中 表达 ， 按 宿主 细胞 可 将 表达 系统 分 为 原
核 生 物 表 达 系 统 和 真 核 生 物 表 达 系 统 ( 表 1$-3)， 对 不 同 的 表达 系统 ， 需 要 构建
不 同 的 表达 载体 。 克 隆基 因 在 不 同系 统 中 的 成 功 表 达 并 没有 绝对 的 把 握 性 ， 这 主
要 取决 于 对 这 些 系统 中 基因 表达 调控 规律 的 认识 程度 。

表 15-3 ”目前 在 基因 工程 中 主要 的 外 源 基 因 表 达 系统

原核 生物 表达 系统 真 核 生物 表达 系统

大 肠 杆菌 表达 系统 酵母 表达 系统

苞 杆菌 表 达 系 统 昆虫 细胞 表达 系统

链 苹 苗 表 达 系 统 哺乳 动物 细胞 表达 系统

上 荣 表达 系统 植物 基因 表达 系统

一 、 目 的 基因 在 原核 生物 表达 系统 中 的 表达
(大 肠 杆菌 表达 系统 )

利用 原核 生物 作为 基因 的 表达 系统 具有 很 多 优点 : @ 四 原核 生 物 多 为 单 细 胞 异
养 ， 生 长 繁殖 快 ， 可 通过 发 酵 快速 获得 大 量 基因 表达 产物 。@ 基 因 组 结构 简单 ，
遗传 背景 研究 清楚 ， 便 于 基因 操作 。@ 基 因 表 达 调 控 机 制 和 代谢 途径 研究 较为 透
彻 。@ 大 多 含有 质粒 和 鸣 菌 体 ， 便 于 构建 表达 载体 。

目前 在 原核 生物 表达 系统 中 表达 的 外 源 蛋 白 绝 大 多 数 是 在 大 肠 杆菌 中 实现
的 ， 因 此 我 们 以 大 肠 杆 菌 表达 系统 为 例 来 介绍 目的 基因 在 原核 生物 表达 系统 中 的
表达 ， 在 其 他 原核 生物 表达 系统 中 ， 表 达 外 源 基因 的 原理 与 大 肠 杆 菌 大 致 相似 ，
只 是 某 些 蛋 白 适 于 在 非 大 肠 杆菌 表达 系统 中 表达 。

大 肠 杆菌 是 目前 应 用 最 广泛 的 蛋白 质 表 达 系 统 ， 也 是 人 们 表达 外 源 蛋白 的 首
选 表 达 系 统 。 人 们 用 大 肠 杆 菌 作为 外 源 基 因 的 表达 工具 已 有 20 多 年 的 经 验 积累 ，
对 其 生物 特性 和 遗传 背景 有 了 充分 了 解 。 大 肠 杆菌 表达 外 源 基因 产物 的 水 平 高 于
其 他 基因 表达 系统 ， 表 达 的 目的 蛋白 量 一 般 可 达 细 菌 总 和 蛋白 量 的 5S% 一 30%， 有
时 甚至 能 高 达 80% 。 重 组 DNA 技术 发 展 之 初 ， 人 们 乐观 地 认为 能 够 按照 设计 在
大 肠 杆菌 中 表达 任何 蛋白 ， 但 是 事实 并 非 如 此 ， 实 际 上 迄今 为 止 只 有 极 少 数 蛋白
质 在 大 肠 杆 菌 中 表达 成 功 且 进行 商品 化 生产 。 其 根本 原因 在 于 人 们 还 未 清楚 地 了
解 大 肠 杆 菌 的 一 些 生理 机 制 ， 特 别 是 蛋 白 质 折 和 登 方 面 的 机 制 。 这 使 得 很 多 时 候 的
外 源 基 因 表 达成 为 一 个 摸索 和 条件， 穿越 “黑箱 ”的 过 程 。 多 年 的 大 量 探索 使 人 们

.442 ，

Wi ee 一 站
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得 到 了 一 些 规律 性 的 认识 。
1. 尽量 多 试验 不 同 的 选择 载体 -宿主 表达 系统

在 大 肠 杆 菌 中 获得 成 功 表达 的 〈 有 活性 ) 多 是 些小 的 分 记 和 曙 白 ， 当 蛋白 长 度
超过 100 个 氨基酸 残 基 时 ， 往 往 表 达 不 稳定 或 是 形成 包含 体 。 现 在 已 经 发 展 出 多
种 系列 的 载体 -宿主 表达 系统 用 于 蛋白 表达 ， 尽 管 和 宿主 系统 的 遗传 背景 已 经 研究
得 比较 清楚 ， 但 是 还 是 不 能 解释 一 些 蛋 白 可 以 在 某 些 菌株 中 高 效 表 达 而 在 其 他 菌
株 却 不 能 。 因 此 ， 实 验 选 择 表 达 外 源 蛋 昌 的 宿主 系统 往往 成 为 重 白 表达 的 唯一 标
准 。

2. 含有 融合 基因 的 载体 的 使 用

这 类 载体 在 外 源 基因 克隆 区 已 经 含有 一 个 或 一 个 以 上 的 已 知 蛋 白 〈 称 运载 蛋
自 ) 的 可 读 框 ， 外 源 基 因 克 隆 后 ， 载 体 表达 的 产物 是 一 个 融合 蛋白 。 运 载 蛋 日 对
于 靶 蛋 白 的 表达 和 纯化 极为 有 利 : 运载 蛋 晶 可 以 保护 半 蛋 昌 免 受 和 宿主 细胞 的 蛋 日
酶 的 降解 ， 可 以 改善 靶 蛋 白 的 溶解 性 ， 防 止 形成 不 溶性 的 包含 体 ， 如 果 运 载 蛋白
是 一 种 信号 肽 ， 还 可 以 将 融合 蛋白 引导 到 特定 的 细胞 区 域 ， 此 外 ， 运 载 蛋 白 可 以
提供 特殊 的 酶 功能 或 是 抗原 组 成 的 结构 域 ， 用 于 靶 蛋 日 的 标记 与 纯化 。 目 前 使 用
的 商品 化 表达 载体 ， 几 乎 都 包含 了 运载 蛋白 ， 如 pPGEX 载体 系列 中 的 谷 胱 甘 肽 -
S- 转 移 酶 (GST)、pET 质粒 系列 中 的 聚 组 氨 酸 标签 (6-His Tag)、pPMAL 质粒 系
列 的 麦芽 糖 结合 蛋白 (MBP) 等 。

3. 密码 子 的 使 用

遗传 密码 与 氨基 酸 不 是 一 对 一 的 关系 ，20 种 氨基 酸 由 61 个 密码 子 编码 ， 除
了 两 种 氨基 酸 由 单一 密码 子 编码 外 ， 其 他 18 种 都 各 有 几 种 密码 子 编码 。 有 时 需
要 表达 的 外 源 基 因 含 有 大 量 的 黎 有 密码 子 〈 相 对 于 细菌 宿主 系统 而 言 )， 会 严重
影响 到 翻译 过 程 ， 这 种 情况 下 需要 通过 突变 或 者 重新 合成 基因 除去 黎 有 密码 子 ，
从 而 提高 表达 水 平 。

4. 培养 条 件 的 优化

即使 是 相同 的 表达 系统 ， 不 同 的 培养 基 可 以 导致 表达 水 平 的 巨大 差异 。 三 般
情况 下 ， 可 以 使 用 LB 培养 基建 立 表达 的 基本 参数 ， 在 对 表达 条 件 进行 优化 时 ，
或 是 在 LB 培养 基 中 表达 水 平 很 低 甚 至 没有 表达 时 ， 就 需要 试用 其 他 培养 基 ， 包
括 基本 盐 培养 基 ， 如 M9; 限定 盐 培 养 基 ， 或 是 丰富 培养 基 ， 如 2YT、NZCYM、
肉 汤 ; 及 一 些 诱 导 培 养 基 。 此 外 ， 一 些 培 养 基 添加 剂 也 能 提高 某 一 种 特定 蛋 自 的
表达 水 平 ， 如 NaCl、 基 糖 、 抗 生 素 、 血 红 素 等 。

培养 过 程 中 的 其 他 条 件 对 于 外 源 基 因 的 表达 影响 也 比较 大 ， 如 培养 温度 、 培

443 、

养 时 的 转速 、 诱 导 时 间 、 培 养 液 的 pH 等 ， 其 根本 原因 在 于 细菌 自身 的 生长 旺盛
时 ， 它 的 表达 /加 工 系统 也 会 过 载 ， 往 往 会 形成 没有 活性 的 包含 体 ， 有 时 甚至 会
阻碍 外 源 蛋 白 的 表达 。 因 此 ， 在 诱导 的 培养 过 程 中 ， 往 往 是 采用 非 最 适合 细菌 生
长 的 条 件 ， 如 降低 培养 温度 、 降 低 转速 、 延 长 诱导 时 间 等 ， 获 得 更 多 有 活性 蛋白
质 的 表达 。

二 、 目 的 基因 在 真 核 生 物 表 达 系 统 中 的 表达

利用 原核 系统 表达 真 核 基因 存在 许多 缺陷 。 人 没有 真 核 转录 后 加 工 的 功能 ，
不 能 进行 mRNA 的 剪接 ， 所 以 只 能 表达 cDNA 而 不 能 表达 真 核 的 基因 组 基因
@ 没 有 真 核 翻 译 后 加 工 的 功能 ， 表 达 产 生 的 蛋白 质 ， 不 能 进行 糖 基 化 、 磷 酸化 等
修饰 ， 难 以 形成 正确 的 二 硫 键 配 对 和 空间 构象 折 琶 ， 因 而 产生 的 量 和 白质 常常 没有
足够 的 生物 学 活性 ; @ 表 达 的 蛋白 质 经 常 不 溶 ， 会 在 细菌 内 聚集 成 包含 体 〈 训 -
clusion body)， 尤 其 当 表 达 目 的 蛋白 量 超过 细菌 体 总 蛋白 量 10% 时 。 无 生物 活性
的 不 溶 蛋白 ， 需 要 经 过 复 性 (renaturation) 处 理 ， 使 其 重新 散 开 、 重 新 折 和 登 成 具
有 天 然 蛋白 构象 和 良好 生物 活性 的 蛋白 质 ， 但 是 多 数 蛋白 质 的 复 性 率 通 常 很 低 。

要 表达 真 核 生物 的 蛋白 质 ， 采 用 真 核 表 达 系 统 比 原 核 系统 优越 ， 用 于 表达 的
真 核 细胞 有 酵母 细胞 、 昆 虫 细 胞 、 以 及 一 些 哺乳 类 动物 细胞 等 。 真 核 表 达 载 体 至
少 要 含 两 类 序列 : @ 原 核 质粒 的 序列 ， 包 括 在 大 肠 杆 菌 中 起 作用 的 复制 起 始 序
列 、 能 用 在 细菌 中 筛选 克隆 的 抗 药性 基因 标志 等 ， 以 便 插 入 真 核 基 因 后 能 先 在 操
作 很 方便 的 大 肠 杆菌 系统 中 筛选 获得 目的 重组 DNA 克隆 ， 并 复制 繁殖 得 到 足够
使 用 的 数量 。@ 在 真 核 宿 主 细胞 中 表达 重组 基因 所 需要 的 元 件 ， 包 括 启动 子 、 增
强 子 、 转 录 终 止 和 加 polyA 信和 号 序列 、mRNA 剪接 信号 序列 、 能 在 宿主 细胞 中 复
制 或 增殖 的 序列 ， 能 用 在 宿主 细胞 中 筛选 的 标志 基因 ， 以 及 供 外 源 基因 揪 入 的 单
一 限制 性 内 切 核酸 酶 识别 位 点 等 。 本 节 只 是 简要 介绍 酵母 表达 系统 、 哺 乳 动 物 细
胞 表达 系统 和 昆虫 细胞 表达 系统 。

1. 酵母 表达 系统

酵母 是 单 细 胞 真 核 生 物 ， 其 生长 代谢 与 原核 生物 如 大 肠 杆菌 等 相似 ， 但 在 基
因 的 表达 调控 方面 类 似 于 高 等 的 真 核 生物 ， 因 此 酵母 表达 系统 不 仅 具 有 与
巨 .coli 表达 系统 相同 的 简便 、 表 达 量 高 、 能 大 规模 发 酵 的 特点 ， 还 兼顾 到 蛋白
质 生物 活性 的 需要 。 目 前 酵母 表达 系统 是 外 源 基因 最 理想 的 真 核 生 物 基因 表达 系
统 。 现 已 构建 了 多 种 酵母 基因 表达 载体 ， 如 自主 型 复制 质粒 〈 穿 梭 质 粒 : 酵母 和
大 肠 杆 菌 )、 整 合 型 质粒 、 着 丝 粒 型 质粒 、 酵 母 人 工 染 色 体 等 。 主 要 的 宿主 菌 有
酿酒 酵母 、 巴 斯 德 毕 赤 酵母 、 乳 酸 克 努 维 酵母 等 。 其 中 巴 斯 德 毕 赤 酵母 表达 系统
是 近年 来 发 展 起 来 的 高 效 表 达 系统 ， 成 功 地 表达 了 多 种 外 源 蛋 白 。

-。 444 ，

， 汪 鸭

2. 哺乳 动物 细胞 表达 系统

哺乳 动物 细胞 也 可 用 于 表达 外 源 基因 ， 目 前 主要 应 用 于 生物 制药 方面 ， 如 生
产 基因 工程 疫苗 和 多 肽 产品 。 来 源 于 哺乳 动物 的 外 源 基 因 在 哺乳 动物 细胞 中 表达
具有 优越 性 : 所 表达 蛋白质 的 免疫 原 性 和 生物 学 活性 往往 高 于 其 他 表达 系统 所 表
达 的 。 哺 乳 动物 表达 系统 的 表达 载体 包括 质粒 载体 和 病毒 载体 ， 质 粒 载体 是 一 类
穿梭 质粒 ， 如 前 所 述 它 包 括 了 使 质粒 能 在 原核 、 真 核 生物 细胞 中 生长 以 及 在 真 核
生物 细胞 中 表达 的 各 种 原核 、 真 核 元 件 ， 至 于 病毒 载体 ， 目 前 已 有 多 种 病毒 如
SV40 病毒 、 癌 病毒 、 腺 病毒 、 疱 疹 病 毒 、 反 转录 病毒 等 用 作 真 核 细 胞 表达 载
体 。 哺 乳 动 物 细胞 表达 系统 的 宿主 细胞 主要 是 一 类 与 正常 细胞 生理 特征 相 接近 的
肿瘤 细胞 ， 如 CHO-K1 细胞 、COS 细胞 、 鼠 骨 亿 瘤 细胞 等 。

3. 昆虫 细胞 表达 系统

昆虫 细胞 表达 系统 是 利用 昆虫 细胞 作为 表达 的 宿主 细胞 。 昆 虫 细 胞 表达 系统
表达 的 真 核 外 源 蛋白 在 抗原 性 和 生物 学 活性 方面 与 天 然 蛋 白 十 分 相似 。 昆 虫 细胞
表达 系统 同样 也 具有 易 操 作 、 安 全 的 优点 。 已 有 十 几 种 外 源 真 核 基因 在 昆虫 细胞
中 表达 成 功 ， 是 一 种 极 具 发 展 前 途 的 真 核 表 达 系统 。 以 往 昆 虫 细 胞 表达 系统 的 载
体 主 要 是 重组 昆虫 杆 状 病毒 ， 如 首 薪 银 纹 夜 蛾 多 角 体 病毒 (AcNPV)， 它 是 利用
外 源 基 因 取 代 病 毒 的 多 角 体 基因 ， 从 而 将 外 源 基 因 置 于 强大 的 病毒 多 角 体 蛋白 基
因 启 动 子 的 下 游 ， 引 发 外 源 基 因 的 表达 。 目 前 ， 已 发 展 出 商品 化 的 穿梭 质粒 作为
昆虫 细胞 的 表达 载体 ， 较 重组 杆 状 病毒 载体 而 言 ， 不 需要 进行 空 斑 纯化 这 个 鉴定
重组 病毒 的 繁琐 过 程 ， 使 昆虫 细胞 表达 系统 更 加 简便 易 行 。 杆 状 病毒 的 基因 组 较
大 (130kb)， 可 以 插入 大 片段 的 外 源 DNA (可 达 100kb)， 并 且 人 允许 克隆 多 拷贝
基因 来 提高 表达 效率 。 此 系统 有 一 个 缺点 ， 就 是 外 源 蛋白 的 表达 发 生 在 重组 杆 状
病毒 原液 对 细胞 的 急性 溶解 感染 期 ， 蛋 白质 的 生产 是 一 短期 行为 ， 且 导致 了 细胞
的 死亡 ， 需 要 不 停 地 制备 病毒 原液 和 用 于 感染 的 新 细胞 。

第 七 节 “重组 DNA 技术 应 用

从 20 世纪 70 年 代 发 展 起 来 的 重组 DNA 技术 现 已 成 为 现代 生物 技术 的 核心
技术 ， 同 时 它 在 生产 实际 应 用 方面 也 取得 了 惊人 的 成 绩 。 它 的 应 用 范围 非常 广
泛 ， 涉 及 工业 、 农 业 、 医 学 、 环 境 、 能 源 等 诸多 领域 ， 可 以 说 重组 DNA 技术 已
进入 到 人 类 生活 的 各 个 领域 。 目 前 ， 从 大 的 领域 分 类 来 谈 重 组 DNA 技术 应 用 显
然 为 时 过 早 ， 因 为 重组 DNA 技术 处 于 一 个 加 速 发 展 的 过 程 之 中 ， 现 在 的 重组
DNA 技术 应 用 仅仅 只 是 一 个 起 步 。 因 此 ， 我 们 仅 就 重组 DNA 技术 应 用 相对 而 言
较为 成 熟 的 医学 、 农 业 、 环 保 等 领域 来 前 述 重组 DNA 技术 的 应 用 。

. 445 ，

一 、 重 组 DNA 技术 在 医学 上 的 应 用
作为 分 子 生物 学 发 展 的 重要 组 成 部 分 ，DNA 重组 及 基因 工程 技术 给 生命 科

学 带 来 了 对 命 性 变化 ， 促 进 痢 生命 科学 各 学 科研 究 和 应 用 的 进步 ， 对 推动 医学 各

领域 的 发 展 同样 起 着 重要 的 作用 。
1. 对 人 类 遗传 信息 的 研究

遗传 信息 决定 生物 的 形态 和 特征 ， 是 生物 生存 之 本 。 估 计 人 类 的 基因 组
DNA 约 有 4X10?bp， 含 有 约 3 万 个 基因 ， 但 至 今 人 类 对 自己 赖 以 生存 繁衍 的 这
个 庞大 的 遗传 信息 库 还 知之 甚 少 ， 目 前 已 经 知道 的 人 基因 只 占 估 计数 的 百 分 之
十 ， 已 搞 清 楚 其 表达 调控 者 更 寥 窒 无几， 对 占 基因 组 80% 一 90% 不 是 蛋白 质 编
码 序列 的 认识 更 少 ， 因 而 实际 上 我 们 现在 对 自己 生存 的 基础 和 实质 只 有 很 表面 的
肤浅 认识 ， 设 想 如 果 人 类 掌握 了 自身 全 部 遗传 信息 的 结构 、 功 能 、 表 达 和 调控 ，
无 疑 将 能 够 深刻 认识 人 的 生长 、 发 育 、 生 存 、 繁 衍 的 整个 生老病死 历程 ， 将 能 对 疾
病 的 诊断 、 治 疗 和 预防 提出 极 有 效 的 措施 ， 将 能 真正 掌握 自己 生存 和 发 展 的 命运 。

DNA 重组 技术 的 出 现 和 发 展 ， 就 使 人 们 有 可 能 去 深入 探索 这 个 重大 的 课题 。
1985 年 提出 的 人 基因 组 研究 计划 (Human Genome Project) 很 快 得 到 世界 科学 界
的 响应 ， 这 个 研究 计划 的 目标 是 要 阐明 人 类 遗传 信息 的 组 成 和 表达 ， 是 迄今 全 球
性 生物 学 、 医 学 领域 最 引 人 注 目的 巨大 研究 工程 。DNA 重组 是 完成 这 个 任务 的
主要 手段 ， 其 中 包括 大 片段 DNA 克隆 、DNA 的 大 尺度 分 析 、 全 自动 DNA 序列
测定 、 基 因 组 信息 数据 库 的 建立 等 新 思维 和 新 技术 的 不 断 出 现 和 发 展 ， 再 加 上 大
规模 引入 其 他 领域 先进 的 科学 技术 ， 原 预定 21 世纪 头 10 年 绘制 出 完整 的 人 类 染
色 体 基因 定位 图 、 测 定 出 人 类 基因 组 全 部 DNA 序列 ， 业 已 提前 完成 。 当 然 在 此
基础 上 要 搞 清 楚 全 部 人 类 基因 的 功能 、 各 基因 间 的 关系 ， 基 因 表 达 调 控 、 人 类 遗
传 信息 的 多 样 性 等 还 要 经 历 更 长 期 和 更 艰苦 的 努力 。 但 DNA 重组 技术 促进 了 分
子 生 物 学 迅速 发 展 ， 给 人 类 探索 自身 生命 的 奥秘 展示 了 光明 的 前 景 。

生命 关键 的 基础 在 于 和 晶 白 质 与 蛋白 质 、 蛋 白质 与 核酸 的 相互 作用 ， 生 物 大 分
子 的 结构 与 功能 的 联系 正 是 生命 的 本 质 所 在 。 凭 借 基 因 工 程 人 们 可 以 克隆 获得 天
然 的 或 任意 设计 的 核酸 序列 ， 可 以 大 量 获 得 过 去 难以 得 到 的 生物 体内 极 微量 的 活
性 蛋 和 白质、 可 以 设计 获得 任意 定点 突变 (site-directed mutagenesis) 的 基因 和 和 蛋
白质 ， 这 就 为 研究 蛋白 质 与 核酸 的 结构 与 功能 、 揭 露 生命 的 本 质 提 供 了 最 基本 的
手段 和

2. 基因 工程 药物 和 疫苗

自从 20 世纪 80 年 代 初 第 一 种 基因 工程 产品 一 一 人 胰岛 素 投放 市 场 以 来 ， 以
基因 工程 药物 为 主导 的 基因 工程 应 用 产业 已 成 为 全 球 发 展 最 快 的 产业 之 一 。 利 用

”446

加 本 Ye

基因 工程 技术 生产 有 应 用 价值 的 药物 是 当今 医药 发 展 的 一 个 重要 方向 ， 利 用 基因
工程 技术 生产 药物 有 两 个 不 同 的 途径 : 一 是 利用 基因 工程 技术 改造 传统 的 制药 工
业 ， 例 如 用 DNA 重组 技术 改造 制药 所 需要 的 菌 种 或 创建 的 菌 种 ， 提 高 抗菌 素 、
维生素 、 氨 基 酸 等 的 产量 ; 二 是 用 克隆 的 基因 表达 生产 有 用 的 肽 类 和 和 蛋 白 质 药 物
或 疫苗 。 目 前 基因 工程 药物 还 只 处 在 发 展 的 早期 ， 真 正 被 正式 批准 投放 市 场 的 基
因 工 程 肽 或 蛋白 类 治疗 药物 现在 还 不 多 ， 不 过 正在 开发 的 基因 工程 治疗 药物 有 几
百 种 ， 并 且 在 迅速 增加 ， 呈 现 出 基因 工程 药物 的 巨大 潜力 。 基 因 工 程 药 物 主要 包
括 激素 、 细 胞 因子 、 疫 苗 、 抗 体 和 宅 核 苷 酸 药 物 等 。

(1) 基因 工程 激素 类 药物

激素 是 一 类 由 生物 体内 分 泌 腺 或 特异 性 细胞 产生 的 微量 有 机 化 合 物 ， 通 过 体
液 或 细胞 外 液 运 送 到 特殊 部 位 ， 能 引起 特殊 的 生理 反应 。 激素 在 天 然 产 生 过 程 中
的 表达 量 是 极 低 的 ， 通 过 传统 的 提取 方法 难以 获得 。 基 因 工 程 则 可 克隆 其 基因 ，
使 之 表达 获得 大 量 产物 。 根 据 激素 的 化 学 性 质 可 将 其 分 为 多 肽 蛋白 类 激素 、 当 醇
类 激素 和 脂肪 酸 类 激素 。 基 因 工 程 激素 类 药物 主要 指 通过 基因 工程 方法 合成 蛋 日
质 多 肽 类 激素 。 目 前 被 批准 上 市 的 有 胰岛 素 (insulin)、 人 生长 激素 (human
growth hormone)、 人 促 卵 泡 激素 (human follical stimulating) 等 。

(2) 基因 工程 细胞 因子 类 药物

细胞 因子 是 由 免疫 细胞 和 其 他 细胞 分 泌 的 调节 生物 体 生 理 功 能 、 参 与 细胞 的
增殖 、 分 化 和 凋 亡 的 小 分 子 多 肽 类 物质 ， 称 为 肽 类 细胞 因子 。 同 激素 一 样 ， 它 们
在 生物 体内 只 是 被 微量 表达 。 表 1$-4 是 一 些 已 上 市 和 正在 研制 的 基因 工程 细胞
因子 类 药物 。

表 15-4 ”基因 工程 细胞 因子 类 药物

名 称 作 | 用

各 种 干扰 素 (interferon，IFN) 抗 病毒 、 抗 肿瘤 、 免 疫 调 节
各 种 细胞 介 素 (interleukin，IL) 免疫 调节 、 促 进 造血
各 种 集落 刺激 因子 (colony stimulating factor，CSF) 刺激 造血
红细胞 生成 素 (erythropopoetin，EPO) 促进 红细胞 生成 ， 治 疗 贫血
肿瘤 坏死 因子 (tumor necrosis factor，TNF) 杀伤 肿瘤 细胞 、 免 疫 调节 、 参 与 炎症 和 全 身 性 反应
表皮 生长 因子 〈epidermal growth factor，EGF) 促进 细胞 分 裂 、 创 伤 愈合 、 骨 肠 道 溃疡 防治
神经 生长 因子 (nerve growth factor ，NGF) 促进 神经 纤维 再 生
骨 形 态 形成 蛋白 (bone morphogenetic protein， 骨 缺 损 修 复 、 促 进 骨 折 愈合

BMP)
组 织 纤 溶 酶 激活 剂 〈tissue-type plasminogen 溶解 血栓 、 治 疗 血 栓 疾 病

activator，t-PA)
血 凝 因子 砷 、 区 治疗 血 友 病
生长 激素 (growth hormnone ，GHI) 治疗 侏儒 证
胰 怠 素 (insulin) 治疗 糖尿 病

超 氧 化 物 歧 化 酶 (superoxide dismutase ，SOD) 清除 自由 基 、 抗 组 织 损伤 、 抗 衰老

. 447 .

(3) 基因 工程 抗体

抗体 作为 疾病 预防 、 诊 断 和 治疗 的 制剂 已 有 上 百年 的 发 展 历史 。 早 期 制备 搞
体 的 方法 是 将 某 种 天 然 抗原 经 各 种 途径 免疫 动物 ， 在 血清 中 获得 抗体 ， 这 种 抗体
是 多 种 单 克隆 抗体 的 混合 物 即 多 克隆 抗体 。 多 克隆 抗体 的 不 均一 性 限制 了 对 抗体
结构 和 功能 的 进一步 研究 和 应 用 。1975 年 Kohler 和 Milstein 首次 用 B 淋 巴 细胞
杂交 瘤 技术 制备 出 均一 性 的 单 克隆 抗体 。 杂 交 瘤 单 克 隆 抗 体 又 称 细胞 工程 抗体 。
利用 这 种 技术 制备 的 单 克隆 抗体 在 疾病 诊断 、 治 疗 和 科学 研究 中 得 到 广泛 的 应
用 。 但 是 ， 这 种 单 克 隆 抗体 多 是 由 鼠 B 细胞 与 鼠 骨 人 散 瘤 细 胞 经 细胞 融合 形成 的
杂交 瘤 细 胞 分 泌 的 ， 具 有 鼠 源 性 ， 进 入 人 体会 引起 机 体 的 排 异 反 应 ; 完整 抗体 分
子 的 分 子 质量 较 大 ， 在 体内 穿 透 血管 的 能 力 较 差 ;生产 成 本 太 高 ， 不 适合 大 规模
工业 化 生产 。 在 20 世纪 80 年 代 初 ， 抗 体 基 因 结 构 和 功能 的 研究 成 果 与 重组
DNA 技术 相 结合 ,产生 了 基因 工程 抗体 技术 。 基 因 工 程 抗 体 即将 抗体 的 基因 按
不 同 需要 进行 加 工 、 改 造 和 重新 装配 ， 然 后 导入 适当 的 受 体 细胞 中 进行 表达 的 抗
体 分 子 。 与 单 克隆 抗体 相 比 ， 基 因 工 程 抗体 具有 如 下 优点 : @ 通 过 基因 工程 技术
的 改造 ， 可 以 降低 甚至 消除 人 体 对 抗体 的 排斥 反应 ;@ 基 因 工 程 抗体 的 分 子 质量
较 小 ， 可 以 部 分 降低 抗体 的 鼠 源 性 ， 更 有 利于 穿 透 血 管 壁 ， 进 入 病灶 的 核心 部
位 ; @ 根 据 治疗 的 需要 ， 制 备 新 型 抗体 ; 轿 可 以 采用 原核 细胞 、 真 核 细胞 和 植物
等 多 种 表达 方式 大 量 表达 抗体 分 子 ， 大 大 降低 生产 成 本 。 自 从 1984 年 第 一 个 基
因 工程 抗体 人 - 鼠 嵌 合 抗体 诞生 以 来 ， 新 型 基因 工程 抗体 不 断 出 现 ， 如 人 源 化 抗
体 、 单 价 小 分 子 抗体 、 多 价 小 分 子 抗体 、 某 些 特 殊 类 型 抗体 〈 双 特异 抗体 、 抗 原
化 抗体 、 细 胞 内 抗体 、 催 化 抗体 、 免 疫 脂 质 体 ) 及 抗体 融合 蛋白 〈 免 疫 毒素 、 免
疫 粘 连 素 ) 等 。 抗 体 分 子 是 生物 学 和 医学 领域 用 途 最 为 广泛 的 蛋白 分 子 。 肿 瘤 特
异性 抗原 或 肿瘤 相关 性 抗原 、 抗 体 独特 型 决定 和 能、 细胞 因子 及 其 受 体 、 激 素 及 一
些 癌 基 因 产 物 等 均 可 以 作为 靶 分 子 ， 目 前 正在 进行 开发 和 已 经 投入 市 场 的 抗体 性
药物 有 着 广泛 的 用 途 ， 如 器 官 移植 排斥 反应 的 逆转 、 肿 瘤 免 疫 诊 断 和 显 像 、 肿 瘤
导向 治疗 以 及 哮喘 、 和 牛皮癣 、 类 风湿 性 关节 炎 、 红 斑 狼 疮 等 多 种 自身 免疫 性 疾病
的 治疗 。

(4) 基因 工程 疫苗

直接 利用 微生物 制备 疫苗 来 预防 和 治疗 疾病 已 有 100 多 年 的 历史 ， 并 且 取 得
了 巨大 的 成 就 。 经 典 疫苗 是 指 灭 活 的 整个 病原 体 或 者 通过 不 断 培养 获得 的 减 毒 活
力 病 原 体 ， 它 们 存在 着 一 些 如 含有 有 害 成 分 、 毒 力道 转 等 有 可 能 给 人 体 带 来 副 作
用 的 问题 。 利 用 重组 DNA 技术 发 展 的 新 型 基因 工程 疫苗 则 可 以 将 这 种 副作用 降
至 最 低 。 通 过 抗原 基因 或 者 含 抗原 表达 片段 的 克隆 、 表 达 和 纯化 ， 人 们 可 以 制备
纯化 组 分 疫苗 和 亚 单位 音 等 新 型 疫苗 ， 这 些 疫苗 去 除了 病原 微生物 的 有 害 成
分 ， 安 全 性 得 到 极 大 的 提高 。 目 前 已 经 使 用 和 正在 研究 的 基因 工程 疫苗 有 多 种 ，
在 细菌 中 包括 痢疾 菌 苗 、 霍 乱 菌 苗 、 结 核 菌 昔 、 产 毒性 大 肠 杆 菌 苗 等 、 在 病毒 中

.448

包括 乙肝 疫苗 、 丙 肝 疫 苗 、 艾 滋 病 疫苗 、 甲 型 肝炎 疫苗 、 巨 细胞 病毒 疫苗 、 流 行
性 出 血 热 疫苗 、 轮 状 病毒 疫 苗 等 。 除 了 上 述 基 于 有 蛋白质 的 基因 工程 疫苗 外 ， 自
20 世纪 90 年 代 发 现 DNA 可 以 直接 引起 机 体 免 疫 应 答 以 来 ， 核 酸 疫苗 成 为 人 们
极为 关注 的 新 型 疫苗 。 核 酸 疫苗 包括 DNA 疫苗 和 RNA 疫苗 ， 与 以 前 的 疫苗 相
比 它 具 有 许多 优点 ， 同 时 在 目前 也 有 很 多 有 待 解决 的 问题 ， 其 中 包括 其 免疫 机 理
和 安全 性 问题 ， 它 的 应 用 还 有 赖 于 进一步 的 深入 研究 。

3. 基因 治

基因 治疗 (gene therapy) 是 指 将 外 源 正 常 基因 导入 靶 细胞 ， 以 纠正 或 补偿
因 基 因 缺 陷 和 蜡 常 引 起 的 疾病 ， 以 达到 治疗 目的 。 也 就 是 将 外 源 基因 通过 重组
DNA 技术 以 及 基因 转移 技术 揪 入 病人 的 适当 的 受 体 细胞 中 ， 使 外 源 基 因 制 造 的
产物 能 治疗 某 种 疾病 。 基 因 治 疗 主要 以 两 种 策略 达到 治疗 目的 。 其 一 是 正常 基因
来 纠正 突变 基因 ， 也 就 是 在 原 位 修复 缺陷 基因 的 直接 疗法 ， 此 乃 理想 的 基因 治疗
策略 ， 由 于 多 种 困难 ， 目 前 尚未 实现 ; 其 二 是 用 正常 基因 替代 致 病 基 因 的 间接 疗
法 ， 此 法 较 前 者 难度 小 ， 也 是 目前 众多 主张 采用 的 策略 之 一 ， 并 已 付 诸 临床 实
践 ， 如 复合 免疫 缺陷 综合 征 的 基因 治疗 、 黑 色素 瘤 的 基因 治疗 等 。 从 广义 说 ， 基
因 治 疗 还 可 包括 从 DNA、RNA 水 平 采取 的 治疗 某 些 疾病 的 措施 和 新 技术 ， 例 如
反 义 技术 (antisense technology) 和 RNA 干扰 (RNAi) 技术 。 预 计 基因 治疗 在
遗传 病 和 肿瘤 治疗 方面 将 有 广阔 的 应 用 前 景 。

二 、 重 组 DNA 技术 在 农业 上 的 应 用

重组 DNA 技术 应 用 于 农业 生产 是 农业 生物 技术 领域 中 研究 和 开发 最 为 活 牙
的 部 分 。 应 用 重组 DNA 技术 将 目的 基因 导入 动 、 植 物体 内 ， 对 家 畜 、 家 禽 和 农
作物 等 进行 品种 改良 已 取得 了 可 喜 的 进展 ， 尤 其 在 农作物 转基因 育种 方面 所 取得
的 成 就 更 为 引 人 注 目 。 自 从 1983 年 首次 获得 转基因 植物 一 一 转基因 烟草 以 来 ，
基因 工程 在 农业 方面 的 研究 与 应 用 进入 了 壕 勃 发 展 阶段 。 目 前 ， 植 物 基 因 工 程 已
经 在 多 方面 有 了 深入 的 发 展 ， 包 括 抗 虫 、 抗 病 、 抗 除草 剂 、 抗 着 、 品 质 改 恨 等 。
此 外 ， 在 植物 发 育 调控 、 成 熟 期 的 调控 方面 也 有 了 长 足 发 展 。 基 因 工 程 在 农业 生
产 上 的 应 用 深刻 影响 到 农业 的 生产 方式 和 效益 ， 在 解决 人 类 所 面临 的 环境 恶化 、
资源 荐 乏 等 问题 方面 初步 显示 出 巨大 的 作用 。 由 于 转基因 农作物 品种 推广 和 应 用
的 时 间 还 不 长 ， 对 其 可 能 带 来 的 负面 作用 特别 是 对 人 体 健 康 和 生态 环境 的 影响 进
行 正 确 评价 还 需要 时 间 。

.449 ，

”ER

1. 在 转基因 植物 中 的 应 用

(1) 利用 基因 工程 培育 抗 除草 剂 作物

化 学 除草 剂 在 现代 农业 中 起 着 十 分 重要 的 作用 。20 世纪 80 年 代 中 期 开始 除
草 剂 抗菌 素 基 因 的 转移 研究 与 抗 性 品种 的 开发 。 目 前 世界 上 采用 的 除草 剂 主要 分
为 两 大 类 ， 一 类 主要 是 通过 破坏 氨基 酸 合成 途径 来 杀 死 杂 草 。 男 一 类 是 通过 破坏
植物 光合 作用 中 电子 传递 链 的 蛋 白 来 杀 死 杂 草 。 现 已 获得 的 抗 除草 剂 转基因 作物
有 有 大豆、 棉花、 玉米、 水稻、 甜菜 等 20 多 种 ， 抗 除草 剂 的 转基因 作物 古 总 的 转
基因 作物 的 70% 以 上 。

(2) 利用 基因 工程 技术 改良 植物 品质

转基因 植物 育种 的 一 个 主要 目标 是 提高 农作物 产量 和 品质 。 如 更 长 久 地 保鲜
水 果 和 蔬 莱 、 培 育 出 富 含 有 益 健 康 的 脂肪 的 油料 作物 、 增 强 营 养 价值 〈 如 维 他
命 、 氢 基 酸 、 核 酸 ) 的 食品 、 生 产 抗 癌 蛋 白质 含量 高 的 大 豆 及 其 他 应 用 。 在 目前
的 转基因 作物 中 ， 涉 及 品质 改良 的 占 转基因 植物 总 数 的 1/5$ 左右 ， 包 括 番 荔 、 大
豆 、 小 麦 、 水 稻 、 玉 米 、 土 豆 等 一 些 主要 的 粮食 和 蔬菜 品种 在 内 ， 有 30 多 种 转
基因 植物 已 经 准许 商业 性 种 植 。

(3) 利用 基因 工程 技术 培育 抗 虫 作物

全 世界 粮食 产量 因 虫 害 所 造成 的 损失 占 14% 左 右 ， 以 往 长 期 使 用 化 学 农药
防止 病虫害 ， 已 经 产生 了 严重 的 环境 污染 、 生 态 破 坏 和 抗 药 性 等 问题 ， 因 而 抗 里
基因 工程 在 国内 外 受到 高 度 重 视 ， 是 植物 基因 工程 研究 和 应 用 的 热点 。 目 前 ， 获
得 了 一 大 批 转基因 抗 虫 作物 品种 或 品系 。 抗 虫 基因 来 源 于 细菌 、 植 物 和 动物 ， 从
细菌 中 分 离 出 来 的 抗 虫 基 因 ， 主 要 是 苏 云 金 杆 菌 〈Bt) 毒 蛋 白 基 因 ; 从 植物 组 织
中 分 离 出 的 抗 虫 基因 ， 主 要 为 蛋白 酶 抑制 剂 基因 、 淀 粉 酶 抑制 剂 基因 、 外 源 凝 集
素 基 因 等 ; 从 动物 体内 分 离 的 主要 是 毒素 基因 ， 如 蝎 毒 素 基 因 、 蜂 蛛 毒素 基因
等 。 目 前 应 用 最 广 的 抗 虫 基因 是 苏 云 金 杆 菌 的 结晶 蛋白 的 基因 (了 Bt 毒 蛋白 基
因 )。 杀 虫 蛋 白 对 许多 重要 的 农作物 害虫 、 包 括 鳞 翅 目 、 精 刀 目 、 膜 翅 目 、 双 却
目 等 都 具有 特异 性 的 毒 杀 作 用 ， 而 对 人 、 畜 、 哺 乳 动物 和 天 敌 无 害 ， 因 而 被 广泛
应 用 于 各 种 作物 的 转基因 育种 。 目 前 ， 抗 虫 槐 已 经 在 国内 外 推广 种 植 ， 但 是 仍然
不 能 排除 8 一 10 年 后 出 现 抗 性 问题 ， 以 及 新 虫害 、 新 病害 的 出 现 。

(4) 利用 基因 工程 技术 培育 抗 病 作 物

对 植物 造成 重要 危害 的 病原 生物 主要 有 真菌 、 细 菌 、 病 毒 和 线虫 等 ， 目 前 对
前 3 种 病原 具有 一 定 抗 性 作用 的 转基因 作物 都 已 培育 出 来 ， 达 十 余 种 。 抗 病 基因
工程 中 ， 目 前 主要 采用 病原 体 的 外 壳 和 蛋白 基 因 导 入 植物 的 方法 ， 使 植物 具有 抗 病
性 。 例 如 ， 将 TMV、CMV、PVY、PVX、SMV 等 多 种 病毒 的 外 壳 蛋 白 基 因 分
别 转 入 烟草 、 番 茄 、 马 铃 昔 、 大 豆 、 首 薪 等 多 种 作物 中 ， 在 不 同 程度 减轻 了 病
症 ， 推 迟 了 发 病 时 间 。

” 450 ，

“uses 认 -

(S) 利用 基因 工程 技术 培育 抗 池 性 强 的 作物

影响 植物 生存 的 主要 逆境 因子 是 干旱 、 高 温 、 低 温 、 盐 胁 等 ， 抗 逆 基 因 工 程
主要 包括 抗旱 、 抗 寒 、 抗 热 和 抗 盐 等 方面 的 研究 。 这 方面 工作 目前 尚 处 于 起 步 阶
段 ， 但 已 取得 了 初步 的 进展 。 在 抗 寒 抗 冻 转基因 方面 主要 采取 冷 诱导 基因 转移 、
抗 冻 蛋 白 基 因 转移 或 是 改善 植物 代谢 途径 中 的 关键 酶 等 方法 ; 在 抗旱 、 抗 盐 碱 转
基因 方面 主要 是 将 甘露 醇 、 果 聚 糖 、 海 藻 糖 等 细胞 渗透 保护 物质 生物 合成 的 关键
酶 基因 导入 作物 中 。

(6) 利用 转基因 植物 生产 各 有 蛋 白 等 产品

植物 生物 反应 器 将 是 未 来 基因 工程 发 展 的 一 个 重要 领域 。 利 用 植物 生产 口服
疫苗 、 工 业 用 酶 、 脂 肪 酸 、 药 物 等 已 逐步 成 为 人 们 关注 的 热点 和 工作 重心 。 此
外 ， 通 过 基因 工程 的 方法 ， 可 以 用 植物 生产 用 来 制造 生物 塑料 的 底 物 多 羟基 丁
酸 ， 从 而 最 终 避 免 目 前 所 谓 的 “白色 污染 ”问题 。 植 物 生物 反应 器 的 研究 发 展 使
农业 这 一 概念 的 外 延 大 大 拓宽 ， 突 破 了 传统 农业 范畴 ， 延 伸 到 工业 和 医药 领域 。

此 外 ， 重 组 DNA 技术 在 转基因 植物 方面 还 包括 : 利用 基因 工程 生产 具有 重
要 经 济 价值 的 植物 次 生 代谢 产物 〈 生 产 药物 、 化 妆 品 、 食 品 添加 剂 等 ); 利用 重
组 的 植物 病毒 (如 MTV) 感染 植物 ， 以 产生 大 量 有 医用 价值 的 蛋白 ; 固氮 基因
工程 ;利用 基因 工程 调控 植物 激素 和 生长 发 育 等 。

2. 重组 DNA 技术 在 转基因 动物 方面 的 应 用

动物 转基因 技术 是 20 世纪 80 年 代 初 发 展 起 来 的 一 项 新 的 生物 技术 。 转 基因
动物 研究 主要 表现 在 利用 基因 工程 改良 动物 、 生 产 药 用 蛋白 质 、 动 物 抗 病 育 种 、
建立 诊断 和 治疗 人 类 疾病 的 动物 模型 、 生 产 用 于 人 体 器 官 移植 的 动物 器 官 等 方
面 ， 并 已 取得 了 初步 的 成 就 。

(1) 提高 动物 产品 的 产量 和 质量

1980 年 Cordon 等 人 用 显 微 注射 法 育成 带 有 人 胸腺 激酶 基因 片段 的 转基因 小
鼠 后 ，1982 年 Pacmiter 等 将 大 鼠 的 生长 激素 基因 导入 小 鼠 受精 卵 雄 性 原核 中 育
成 转基因 “超级 鼠 "， 该 鼠 比 普通 小 鼠 生 长 速度 快 2 一 4 倍 ， 体 型 大 1 倍 ， 这 一 科
研 结 果 大 大 鼓励 了 该 领域 的 科研 人 员 。 记 今 为 止 ， 转 基因 免 、 转 基因 羊 、 转 基因
猪 、 转 基因 牛 、 转 基因 鸡 和 转基因 鱼 等 相继 问世 。 目 前 ， 转 基因 动物 方面 的 研究
主要 集中 在 : 四 利用 外 源 基 因 提 高 动物 生产 性 能 ， 主 要 指 的 是 导入 各 种 生长 激素
基因 以 获得 增 重 的 动物 。@ 抗 冻 蛋 白 基 因 、 抗 病 和 蛋白 基因 的 转移 。@) 通 过 转移 和
表达 适当 的 基因 ， 培 育 出 有 突出 经 济 性 状 的 动物 改良 品种 或 动物 新 品种 。

(2) 动物 反应 器 生产 有 重要 价值 的 有 蛋白质

用 转基因 动物 作为 生物 反应 器 (bioreactor) 开发 生产 新 一 代 生 物 工 程 药物 正
在 成 为 全 球 范围 内 生物 高 技术 产业 的 技术 制高点 。 其 原理 是 将 编码 活性 蛋白 的 基
因 导 入 动物 的 受精 卵 或 早期 豚 胎 内 以 制备 转基因 动物 ， 并 使 外 源 基 因 在 动物 体内

.451 ，

(乳汁 、 血 液 等 ) 高 效 表达 ， 然 后 再 分 离 提 取 目 的 基因 编码 产物 ， 亦 称 为 ”分子

农场 "。 对 于 利用 转基因 动物 (家 畜 ) 生产 转基因 药物 而 言 ， 最 理想 的 表达 场所 、

是 乳腺 。 因 为 乳腺 是 一 个 外 分 泌 器 官 ， 乳 汁 不 进入 体内 循环 ， 不 会 影响 转基因 动
物 本 喘 的 生理 代谢 反应 。 从 转基因 动物 乳汁 中 获取 的 基因 产物 不 但 产量 高 、 易 提
纯 ， 而 且 表达 的 蛋白 经 过 转基因 动物 生物 反应 句 表 达 的 产物 经 过 了 充分 的 修饰 和
加 工 ， 具 有 稳定 的 生物 活性 ， 同 时 具有 成 本 低 、 周 期 短 、 易 规模 化 生产 等 优点 5
至 今 ， 各 国 科 学 家 已 制造 出 乳腺 分 泌 各 种 医用 蛋白 质 的 转基因 牛 、 山 羊 :。 绵羊 %
猪 和 家 兔 ， 乳 腺 分 泌 的 医用 和 蛋白质 达到 可 商业 开发 水 平 的 转基因 动物 已 达 :10 种 ，
如 wm- 抗 胰 蛋 白 酶 、 人 血清 白 和 蛋白、 人族 血 因子 IV、 人 族 血 因子 VIII、 组 织 性 纤
溶 酶 原 激活 剂 〈(tPA) 等 。

(3) 转基因 动物 生产 人 体 器 官 ， 用 于 异种 移植

人 类 同 种 异体 器 官 移植 近 几 十 年 来 已 取得 了 令 人 满意 的 效果 ， 但 其 供 体 来 源
严重 不 足 。 而 且 随 着 人 非 正 常 死亡 的 逐渐 减少 及 人 寿命 的 延长 ， 人 供 体 需 官 将 更
加 贫乏 ， 异 种 器 官 移植 将 是 解决 此 问题 的 主要 途径 。 猪 的 器 官 大 小 ， 解 痢 生 理 特
点 与 人 类 相似 ， 组 织 相 容 性 抗原 SLA 与 人 HLA 具有 较 高 的 同 源 性 ， 研 究 者 普遍
认为 猪 是 人 类 器 官 移植 的 最 理想 的 供 体 。 异 种 移植 最 大 的 障碍 仍然 是 移植 后 发 生
的 免疫 排斥 反应 。 通 过 免疫 排斥 相关 基因 转基因 猪 的 建立 ， 对 猪 的 需 官 进行 遗传
改造 ， 是 降低 其 免疫 排斥 反应 的 重要 途径 。 现 已 培育 出 带 人 体 基 因 的 转基因 猪 ，
其 器 官 移 植 于 人 体能 够 有 效 降 低 动 物 器 官 的 排斥 ， 这 种 转基因 猪 的 成 功 可 望 解决
供 移植 的 人 体 器 官 不 足 的 问题 。

(4) 克隆 技术 培育 动物

动物 克隆 技术 早 在 20 世纪 70 年 代 就 为 科学 家 所 关注 ， 已 有 了 重要 进展 。
1997 年 ， 英 国 克 隆 羊 “多 利 ” 的 产生 ， 引 起 全 球 极 大 关注 。“ 多 利 ” 是 第 一 例 经
体 细 胞 核 移 植 出 生 的 动物 ， 是 人 类 在 这 一 领域 研究 中 的 重大 突破 ， 意 味 着 可 以 快
速 地 生产 出 大 量 的 克隆 动物 。 从 本 质 上 讲 ， 动 物 克 隆 技 术 只 是 亚 细 胞 水 平 的 操
作 ， 属 于 细胞 工程 ， 但 我 们 可 以 预期 在 不 远 的 将 来 重组 DNA 技术 将 会 很 快 应 用
于 动物 克隆 ， 因 为 几乎 不 存在 技术 上 的 障碍 。 从 科学 技术 和 经 济 效益 上 分 析 ， 利
用 克隆 技术 可 以 加 快 优 良家 畜 品 种 的 繁育 ， 同 时 对 于 濒危 动物 和 家 畜 遗 传 多 样 性
的 保存 具有 重大 意义 。

三 、 基 因 工 程 在 环境 保护 中 的 应 用

微生物 对 环境 的 净化 已 被 用 于 污水 处 理 和 环境 净化 。 通 过 DNA 重组 可 以 提
高 某 些微 生物 体内 特异 酶 的 活性 ， 从 而 为 构建 能 降解 水 中 、 土 壤 中 特殊 的 污染 化
合 物 的 微生物 提供 新 的 途径 。 到 目前 为 止 ， 已 经 分 离 到 的 降解 性 质粒 有 25 个 之
多 。 将 这 些 质粒 有 目的 地 转 入 到 以 降解 有 害 有 毒 有 机 污染 物 为 目的 的 微生物

452 ，

中 一 一 即 基因 工程 菌 的 构建 ， 能 大 大 提高 降解 污染 有 机 物 的 效率 ， 还 有 利于 扩大
可 降解 污染 物 的 种 类 ， 有 利于 环保 工业 的 发 展 。 美 国 获得 的 速效 消除 水 面 油污 的
“超级 菌 ” 是 美国 第 一 个 基因 工程 改造 微生物 的 专利 ， 它 是 将 分 别 能 降解 己 烷 、
壮 烷 和 糯 烷 ; 降解 二 甲 茶 和 甲苯; 降解 蔡 和 分 解 樟脑 的 4 种 假 单 钨 菌 的 不 同 质 粒
构建 成 一 个 质粒 转 入 细胞 内 ， 获 得 了 具有 特殊 功能 的 “超级 菌 "， 其 代谢 碳 氢化
合 物 的 活性 极 强 ， 几 小 时 便 可 降解 掉 天 然 菌 种 需 1 年 以 上 才能 降解 的 烃 类 物质 。

， 453 ，

二 站 由
第 十 六 章 ” 现 代 分 子 生 物 学 的 重要 研究 方法 和 技术

自 20 世纪 $0 年 代 初 沃 森 (JJ D. Watson) 和 克 里 克 (下 .Crick) 提出 关于
DNA 双 螺 旋 模 型 学 说 以 及 70 年 代 初 期 DNA 限制 性 内 切 核 酸 酶 的 发 现 和 一 整套
DNA 体外 重组 技术 的 建立 ， 分 子 生 物 学 技术 以 空前 的 速度 鞠 勃 发 展 ， 建 立 起 了
一 套 完整 的 技术 体系 ， 并 在 生命 科学 的 各 个 研究 领域 得 到 了 广 谤 的 应 用 ， 成 为 不
可 取代 的 研究 技术 手段 。 同 时 ， 分 子 生物 学 技术 已 对 农 、 林 、 牧 、 副 、 渔 ， 食
品 ， 制 药 ， 化 工 ， 石 油 工业 以 及 环境 监测 和 保护 等 国民 经 济 诸多 领域 产生 深远 的
影响 ， 为 人 类 社会 带 来 难以 估量 的 社会 效益 和 经 济 效益 。

第 一 节 王 年 - 量 PCR

聚合 酶 链 式 反应 (polymerase chain reaction ，PCR) 自 诞 生 之 日 起 就 决定 了
它 不 仅 是 一 种 高 敏感 、 高 特异 的 检测 核酸 分 子 的 定性 方法 ， 而 且 也 是 一 个 能 对 核
酸 分 子 进行 精确 定量 的 有 利 工 具 。 随 着 分 子 生物 学 技术 研究 的 不 断 进展 ， 定 量
PCR 技术 取得 了 突飞猛进 的 发 展 ， 不 仅 建立 了 一 系列 的 方法 ， 而 且 也 诞生 了 许
多 与 这 些 方法 相 匹配 的 新 型 热 循 环 仪 和 实验 材料 。 实 时 定量 (quantitative real-
time PCR，QRTPCR ) 技术 便 是 一 种 具有 间 命 性 意义 的 定量 PCR 技术 。
QRTPCR 是 199%6 年 由 美国 Applied Biosystems 公司 推出 ， 由 于 该 技术 不 仅 实现 了
PCR 从 定性 到 定量 的 飞跃 ， 而 且 与 常规 PCR 相 比 ， 它 具有 特异 性 更 强 、 有 效 解
决 PCR 污染 问题 、 自 动 化 程度 高 等 特点 ， 目 前 已 得 到 了 广泛 的 应 用 。 所 谓
QRTPCR 技 术 是 指 在 PCR 反应 体系 中 加 入 荧光 基 团 ， 利 用 荧光 信和 号 积累 实时 监
测 整个 PCR 进程 ， 最 后 通过 标准 曲线 对 未 知 模板 进行 定量 分 析 的 方法 ， 同 时 也
可 以 用 于 RT-PCR 测定 mRNA 的 量 来 确定 基因 转录 水 平 的 变化 。

一 、 常 用 的 实时 定量 PCR 方法
1. TaqMan 探 针 技术

定量 PCR 技术 自 产 生 以 来 ， 不 断 发 展 完善 ， 到 目前 为 止 已 经 非常 成 熟 了 。
标记 方法 由 最 初 单一 的 染料 法 ， 发 展 到 了 特异 性 更 高 的 探 针 法 ， 如 TaqMan、
Molecular Beacon、Fret 等 不 同方 法 的 标记 探 针 ， 其 中 由 于 TaqMan 探 针 的 广泛 使
用 ，QRTPCR 的 方法 也 称 为 TaqMan 法 。TaqMan 探 针 法 是 高 度 特异 的 定量 PCR
技术 ， 其 核心 是 利用 Taoa 酶 的 $ 一 3 外 切 核酸 酶 活性 ， 切 断 探 针 ， 产 生效 光 信

.454 ，

|

号 。 由 于 探 针 与 模板 是 特异 性 结合 ， 所 以 荧光 信和 号 的 强 弱 就 代表 了 模板 的 数量 。
在 TaqMan 探 针 法 的 定量 PCR 反应 体系 中 ， 包 括 一 对 PCR 引物 和 一 条 探 针 。 探
针 只 与 模板 特异 性 地 结合 ， 其 结合 位 点 在 两 条 引物 之 间 。 探 针 的 $ 端 标 记 有 报
告 基 团 (reporter，R)， 如 FAM、VIC 等 ，3 ” 端 标 记 有 荧光 深 灭 基 团 〈quencher，
Q@QD 六 如 TAMRA 等 。 当 探 针 完整 的 时 候 ， 报 告 基 团 所 发 射 的 荧光 能 量 被 漆 灭 基
团 吸 收 ， 仪 器 检测 不 到 信号 。 随 着 PCR 的 进行 ，Taq 酶 在 链 延 伸 过 程 中 遇 到 与
模板 结合 的 探 针 ， 其 $ 一 3 外 切 核酸 酶 活性 就 会 将 探 针 切断 ， 报 告 基 团 远 离 六 灭
基 团 ， 其 能 量 不 能 被 吸收 ， 即 产生 荧光 信和 号 (图 16-1)。 所 以 ， 每 经 过 一 个 PCR
循环 ， 荧 光 信 号 也 和 目的 片段 一 样 ， 有 一 个 同步 指数 增长 的 过 程 。 信 和 号 的 强度 就
反映 出 模板 DNA 的 拷贝 数 。

TaqMan@ 探 针

下 游 引物

图 16.1 TaqMan 探 针 技术 原理 示意 图

TaqMan 探 针 根据 其 3 端 标 记 的 荧光 六 灭 基 团 的 不 同 分 为 两 种 : 普通 的 Taq-
Man 探 针 和 TaqMan MGB 探 针 。MGB 探 针 的 淳 灭 基 团 采用 非 荧 光 淳 灭 基 团
(non-fluorescent quencher)， 本 身 不 产生 荧光 ， 可 以 大 大 降低 本 底 信 和 号 的 强度 。
同时 探 针 上 还 连接 有 MGB (minor groove binder) 修饰 基 团 〈 图 16-2)， 可 以 将 探
针 的 Ta 值 提高 107 左右 。 因 此 为 了 获得 同样 的 Tu 值 ，MGB 探 针 可 以 比 普通
TaqMan 探 针 设计 得 更 短 ， 既 降低 了 合成 成 本 ， 也 使 得 探 针 设计 的 成 功率 大 为 提
高 。 因 为 在 模板 的 DNA 碱 基 组 成 不 理想 的 情况 下 ， 短 的 探 针 比 长 的 更 容易 设
计 。 实 验证 明 ，TaqMan MGB 探 针 对 于 富 含 A/T 的 模板 可 以 区 分 得 更 为 理想 。

2. SYBR Green 工 荧 光 染 料 技术

SYBR Green T 是 一 种 只 与 DNA 双 链 结合 的 荧光 染料 (图 16-3)。 当 它 与
DNA 双 链 结合 时 ， 发 出 荧光 ; 从 DNA 双 链 上 释放 出 来 时 ， 菊 光 信 和 号 急剧 减弱 。
因此 ， 在 一 个 体系 内 ， 其 信号 强度 代表 了 双 链 DNA 分 子 的 数量 。SYBR Green 1
荧光 染料 法 定量 PCR 的 基本 过 程 是 : @ 四 开始 反应 ， 当 SYBR Green 工 染 料 与
DNA 双 链 结合 时 发 出 荧光 。C@DNA 变性 时 ，SYBR Green I 染 料 释 放出 来 ， 荧 光

， 455 ，

w 训
非 荧 光 淳 灭 基 团
Minor Groove Blinder

16-2 ”TaqMan MGB 探 针

急剧 减少 。@@ 在 聚合 延伸 过 程 中 ， 引 物 退 火
并 形成 PCR 产物 。 四 聚合 完成 后 ，SYBR
Green 工 染料 与 双 链 产物 结合 ， 定 量 PCR 系
统 检测 到 荧光 的 净 增 量 加 大 。SYBR Green I
是 一 种 DNA 结合 染料 ， 能 非特 异地 挫 入 到
双 链 DNA 中 去 。 在 游离 状态 下 ， 它 不 发 出
荧光 ， 但 一 旦 结合 到 双 链 DNA 中 以 后 ， 便
可 以 发 出 艾 光 。 它 的 最 大 优点 就 是 可 以 与 任
意 引 物 、 模 板 相 配合 ， 用 于 任意 反应 体系
中 ， 从 经 济 角度 考虑 ， 它 也 比 其 他 的 探 针 的
价格 要 便宜 得 多 ， 但 由 于 它 能 与 所 有 的 双 链
DNA 结 合 ， 所 以 一 旦 反应 体系 中 出 现 非特
异 扩 增 ， 那 它 就 会 影响 到 定量 结果 的 可 靠 性
与 重复 性 。

3. 实践 中 的 问题

QRTEPECR 已 被 广泛 运用 于 分 子 生物 学
的 各 个 领域 ， 就 目前 的 应 用 情况 来 看 ， 虽 然
取得 了 很 好 的 效果 ， 但 其 在 方法 学 上 的 选
择 、 敏 感性 问题 、 重 复 性 问题 等 都 一 直 是 争
论 不 休 的 。

图 16-3 SYBR Green 工 荧光 染料 与
DNA 双 链 的 结合

(1) 克 法 的 选择
研究 者 在 实验 中 往往 想 要 得 到 目的 基因 的 绝对 定量 ， 因 为 绝对 定量 对 目的 基

”4956 ，

II 一

因 的 表达 差异 有 直接 的 反映 。 绝 对 定量 最 为 简单 的 方法 就 是 标准 曲线 法 ， 用 一 系
列 已 知 浓度 的 标准 品 制 作 标准 曲线 ， 在 同等 条 件 下 目的 基因 测 得 的 荧光 信和 号 量 同
标准 曲线 进行 比较 ， 从 而 得 到 目的 基因 的 量 。 该 标准 品 可 以 是 纯化 的 质粒
dsDNA， 体 外 转录 的 RNA， 或 者 是 体外 合成 的 sDNA。 目 的 基因 与 标准 品 在 不
同 的 反应 管内 同时 进行 扩 增 ， 使 用 的 荧光 材料 可 以 是 杂交 探 针 、 水 解 探 针 或 是
SYBR Green I。 有 研究 表明 ， 这 一 方法 的 动力 学 范围 可 以 达到 9 个 数量 级 ， 远 比
终点 法 的 要 高 。 这 一 方法 虽然 简便 ， 但 是 为 了 得 到 可 靠 的 实验 结果 ， 有 两 个 先决
条 件 必 须 得 到 满足 ， 一 是 所 选用 的 标准 品 必须 与 目的 基因 的 扩 增 效率 一 致 ， 要 达
到 这 个 要 求 ， 需 要 标准 品 同 目的 基因 的 同 源 性 尽 可 能 的 高 ， 不 仅 长 度 相 似 ， 而 且
其 碱 基 组 成 也 尽量 相同 ; 二 是 要 尽 可 能 地 优化 实验 条 件 和 模板 的 准备 过 程 。 就 标
准 品 而 言 ， 实 践 中 有 外 参照 和 内 参照 之 分 ， 作 为 外 参照 的 标准 品 与 目的 基因 不 在
同一 反应 体系 中 进行 扩 增 ， 所 以 它 无 法 检测 也 不 可 能 补偿 可 能 出 现在 目的 基因 反
应 体系 中 的 影响 因素 ， 如 PCR 抑制 因素 。 事 实 上 ， 在 绝 大 多 数 的 实验 中 ， 要 想
使 标准 品 和 目的 基因 的 扩 增 效率 绝对 完全 一 致 是 不 可 能 的 。 为 了 弥补 单独 使 用 一
个 标准 品 作为 外 参照 的 不 足 ， 研 究 者 便 引 入 一 个 内 参照 同 目的 基因 在 同一 反应 体
系 中 同时 进行 扩 增 ， 以 反映 体系 中 可 能 出 现 的 PCR 影响 因素 ， 此 即 所 谓 的 竞争
性 PCR。 竞 争 性 PCR 所 使 用 的 内 参照 具有 与 目的 基因 序列 相同 的 引物 结合 位 点 ，
但 不 具有 相同 的 探 针 结合 位 点 。

(2) 重复 性 问题

重复 性 是 判断 实验 结果 优 劣 的 重要 指标 ， 其 主要 判断 指标 为 标准 差 〈(SD)
和 变异 系数 (CV)。 对 于 特定 的 分 析 系 统 ， 重 复 性 的 高 低 决定 了 PCR 反应 能 检
测 出 样本 中 目的 基因 的 初始 浓度 变化 的 最 小 值 。 由 于 PCR 反应 本 身 具 有 不 精确
扩 增 的 特性 ， 它 所 造成 的 结果 精确 性 要 远 小 于 经 典 的 临床 化 学 检验 和 免疫 分 析 。
对 于 绝 大 多 数 实验 ， 一 般 都 可 以 计算 出 所 设计 体系 能 检测 出 样本 初始 浓度 的 最 小
值 ， 根 据 多 次 实验 可 以 求 得 该 最 小 值 的 变异 情况 和 它 的 可 信 区 间 范 围 ， 变 异 越 小
或 是 可 信 区 间 范 围 越 小 ， 说 明 这 一 反应 体系 的 精确 度 越 高 。 在 QRTPCR 过 程 中 ，
从 样本 的 准备 到 扩 增 ， 再 到 定量 的 进行 ， 实 验 中 的 每 个 方面 都 与 实验 的 重复 性 息
息 相 关 ， 除 了 加 样 的 准确 性 和 实验 所 选用 的 仪器 固定 参数 的 限制 之 外 ， 影 响 结果
重复 性 较为 关键 的 因素 还 包括 : DPCR 反应 扩 增 的 效率 ， 如 果 在 反应 体系 中 扩
增 效 率 不 一 致 ， 就 会 使 目的 基因 在 单位 时 间 内 的 产量 发 生 差 异 ， 从 而 影响 到 结果
的 稳定 ， 要 解决 这 个 问题 ， 必 须 尽 量 优化 实验 条 件 ， 使 反应 体系 达到 最 佳 扩 增 效
率 ; @ 目 的 基因 的 初始 浓度 ， 初 始 拷贝 数 越 低 ， 结 果 的 重复 性 越 差 ， 为 了 保证 获
得 精确 的 结果 ， 应 使 用 初始 浓度 具有 较 高 数量 级 的 样本 ， 如 果 待 测 样本 中 目的 基
因 的 量 处 于 反应 体系 的 检 出 限 附近 ， 那 么 最 好 是 使 用 多 管 重复 以 保证 结果 的 可 靠
性 ; 图 标准 曲线 的 影响 ， 对 于 必须 进行 绝对 定量 的 研究 ， 标 准 曲 线 是 必 不 可 人 少
的 ， 虽 然 标 准 品 和 样本 之 间 的 差异 始终 存在 ， 但 是 制作 一 个 好 的 标准 曲线 对 定量

. 457 .

结果 至 关 重 要 ， 在 制作 标准 曲线 时 ， 应 至 少 选择 5 个 稀释 度 的 标准 品 ， 涵 盖 待 测
样本 中 目 er pe 理想 的 标准 品 应 与 样本 具有 高 同 源
性 ， 最 好 是 选择 纯化 的 质粒 DNA 或 是 体外 合成 、 转 录 的 RNA (用 于 RT-PCRJ)
在 制备 过 程 中 ， 应 使 用 规范 的 步骤 或 是 根据 所 购买 的 试剂 盒 提供 的 标准 操作 手册
进行 。

(3) 灵敏 度 问 题

QRTPCR 由 于 使 用 了 荧光 物质 作为 定量 的 工具 ， 使 得 其 灵敏 性 又 大 大 地 提
高 了 ， 有 人 报道 QRTPCR 的 灵敏 性 要 高 出 传统 的 终点 定量 PCR 大 约 250 倍 。 在
理论 上 ， 只 要 设计 的 引物 对 目的 基因 有 足够 的 特异 性 ，PCR 应 可 检测 出 只 含 一
个 拷贝 目 的 基因 的 样 末 ， 也 的 确 有 人 报道 在 特定 的 反应 条 件 下 ，QRTPCR 可 以
检测 出 单 细 胞 水 平 的 基因 组 DNA， 但 是 在 大 多 数 情况 下 ， 对 基因 组 DNA 而 言 ，
它 的 最 低 检 出 限 一 般 在 pg 到 低级 ， 对 于 病毒 、 质 粒 而 言 ， 其 检 出 限 一 般 在 10
拷贝 数 以 上 。 影 响 QRTPCR 灵敏 性 的 因素 众多 ， 除 了 对 一 般 PCR 反应 均 存 在 的
影响 因素 如 反应 体系 、Tad 酶 的 活性 之 外 ，QRTPCR 还 有 其 特殊 的 影响 因素 。

4. 影响 QRTPCR 的 因素

(1) 反应 体系 中 形成 的 引物 二 聚 体 的 影响

引物 二 聚 体 是 非特 异性 退火 和 延伸 的 产物 ， 它 的 形成 不 保全 第 则 条 全 的 和
率 ， 而 且 由 于 SYBR Green 工 可 以 与 所 有 的 双 链 DNA 结合 ， 所 以 会 在 反应 体系 中
出 现 特异 性 产物 与 引物 二 聚 体 竞争 SYBR Green I 的 现象 ， 从 而 降低 了 实时 PCR
的 敏感 性 。

(2) 循环 数

一 般 的 QRTPCR 反应 只 须 25 一 30 个 循环 便 可 获得 满意 的 结果 ， 但 是 对 于 那
些 极 微量 的 待 测 样本 而 言 ， 适 当 增 加 循环 数 可 以 提高 反应 的 检 出 限 ， 有 文献 报道
当 循环 数 从 25 增加 到 34 个 循环 时 ，QRTPCR 的 最 低 检 出 限 可 提高 到 102 个 模板
分 子 。 但 是 并 非 循 环 数 增加 得 越 多 ， 其 敏感 性 就 会 越 高 。

(3) Mg 的 浓度

Mg 的 浓度 将 影响 到 QRTPCR 的 敏感 性 ， 推 荐 使 用 的 浓度 为 3mmolI
Mg 浓度 对 敏感 性 的 影响 主要 存在 于 两 方面 ， 首 先 ，Mg 是 影响 Taq 酶 活性 的
关键 因素 ， 如 果 M 娩 ”的 浓度 无 法 达到 使 Taq 酶 发 挥 最 佳 活性 ， 无 疑 将 会 影响 到
实时 定量 的 敏感 性 ; 其 次 ，Mg 的 浓度 过 高 ， 会 增加 引物 二 聚 体 的 形成 ， 从 而
导致 敏感 性 降低 。 所 以 在 反应 中 选择 合适 的 Mg 流 度 条 件 ， 是 相当 重要 的 。

5$. Ct 值 的 含义

在 QRTPCR 技术 中 ， 有 一 个 很 重要 的 概念 一 一 C, 值 。C 代表 cycle， tt 代表
threshold，C; 值 的 含义 是 : 每 个 反应 管内 的 荧光 信号 达到 设 定 的 域 值 时 所 经 历
。4538 。

2 一

Wece9en AGECAOOAO2 一

的 循环 数 。 菊 光 域 值 (threshold) 的 设 定 可 以 通过 PCR 反应 前 15 个 循环 的 欧 光
信和 号 作为 荧光 本 底 信号 ， 菊 光 域 值 的 缺 省 设置 是 3 一 15 个 循环 的 获 光 信和 号 的 标准
偏差 的 10 倍 。

研究 表明 ， 每 个 模板 的 C, 值 与 该 模板 的 起 始 拷贝 数 的 对 数 存在 线性 关系 ，
起 始 拷贝 数 越 多 ，C， 值 越 小 。 利 用 已 知 的 起 始 拷贝 数 的 标准 品 可 做 出 标准 曲线 ，
因此 ， 只 要 获得 未 知 样品 的 C, 值 ， 就 可 以 通过 标准 曲线 计算 出 该 样品 的 起 始 拷
贝 数 。

6. 怎样 确定 Ct 值 ?

实验 操作 中 ，Ct 值 定义 为 在 基线 上 方 产生 可 检测 到 的 统计 学 上 显著 的 荧光
发 射 时 所 对 应 的 PCR 循环 次 数 (图 16-4)。“ 基 线 上 方 ” 也 就 是 国 值 高 度 的 量化
定义 ， 是 基线 范围 内 荧光 信和 号 强度 标准 偏差 的 10 倍 。 浆 值 所 在 的 横 线 与 PCR 扩
增 曲 线 的 交点 所 指 的 PCR 循环 次 数 就 是 Ct 值 。 基 线 范 围 的 定义 是 从 第 3 个 循环
起 到 C, 值 前 3 个 循环 止 ， 其 终点 要 根据 每 次 实验 的 具体 数据 调整 ， 一 般 取 第 3
到 第 15 个 循环 之 间 。 早 于 3 个 循环 时 ， 交 光 信 号 很 弱 ， 扣 除 背 景 后 的 校正 信和 号
往往 波动 比较 大 ， 不 是 真正 的 基线 高 度 ; 而 在 C, 值 前 3 个 循环 之 内 ， 大 多 数 情
况 王 荧光 信号 已 经 开始 增强 ， 超 过 了 基线 高 度 ， 都 不 宜 当 做 基线 来 处 理 。

荧光 强度
2 000 000

图 16-4 _C, 值 和 畏 值

7. 为 什么 终点 定量 不 准确 ?
我 们 都 知道 理论 上 PCR 是 一 个 指数 增长 的 过 程 ， 但 是 实际 的 PCR 扩 增 曲线

459 ，

并 不 是 标准 的 指数 曲线 ， 而 是 S 形 曲 线 。 这 是 因为 随 着 PCR 循环 的 增多 ， 扩 增
规模 迅速 增 大 ，Tac 酶 、dNTP、 引 物 ， 甚 至 DNA 模板 等 各 种 PCR 要 素 逐 渐 不
敷 需求 ，PCR 的 效率 越 来 越 低 ， 产 物 增 长 的 速度 就 逐渐 减缓 。 当 所 有 的 Ted 酶
都 被 饱和 以 后 ，PCR 就 进入 了 平台 期 。 由 于 各 种 环境 因素 的 复杂 相互 作用 ， 不
同 的 PCR 反应 体系 进入 平台 期 的 时 机 和 平台 期 的 高 低 都 有 很 大 变化 ， 难 以 精确
控制 。 所 以 ， 即 使 是 重复 实验 ， 各 种 条 件 基 本 一 致 ， 最 后 得 到 的 DNA 拷贝 数 也
是 完全 不 一 样 的 ， 波 动 很 大 。

8. 标准 曲线 、 重 复 实验 和 阴性 、 阳 性 对 照

定量 实验 ， 误 差 是 不 可 避免 的 。 设 立 重复 实验 ， 对 数据 进行 统计 处 理 ， 可 以
将 误差 降低 到 最 小 。 所 以 定量 实验 的 每 个 样本 至 少 要 重复 3 次 以 上 ， 严 格 的 定量
更 应 当 重 复 6 一 8 次 ， 以 满足 小 样本 统计 的 要 求 。

如 果 做 绝对 定量 ， 则 标准 曲线 需要 在 $ 个 点 以 上 。 标 准 曲 线 使 用 的 标准 品 是
流 度 已 知 的 DNA 样本 ， 可 以 自己 制备 ， 也 可 以 购买 商品 化 的 试剂 盒 。 其 PCR 反
应 条 件 应 当 与 未 知 样本 的 一 致 ， 以 便 在 同一 反应 板 上 同时 定量 。

阴性 对 照 中 不 加 模板 DNA， 而 以 水 或 缓冲 液 代 奉 ， 用 于 检验 是 否 存在 PCR
污染 。 阳 性 对 照 则 用 于 检验 PCR 试剂 和 实验 操作 上 可 能 出 现 的 问题 。 如 果实 验
中 设立 了 阳性 内 对 照 (internal positive control，IPC) IPC， 则 IPC 既 可 以 用 来 校
正 数据 ， 也 可 以 起 到 阳性 对 照 的 作用 。

二 和 :核酸 分 子 的 供 殉

核酸 分 子 杂 交 (moleucular hybridization) 技术 是 分 子 生 物 学 领域 中 最 常用 的
基本 技术 方法 之 一 。 其 基本 原理 是 把 具有 一 定 同 源 性 的 两 条 核酸 单 链 在 一 定 的 条
件 下 〈 适 宣 的 温度 及 离子 强度 等 ) 可 按 碱 基 互补 原则 退火 形成 双 链 。 此 杂交 过 程
是 高 度 特异 性 的 。

杂交 的 双方 是 待 测 的 核酸 序列 及 探 针 。 待 测 核酸 序列 可 以 是 克隆 的 基因 和 片
段 ， 也 可 以 是 未 克隆 化 的 基因 组 DNA 和 细胞 总 DNA。 将 核酸 从 细胞 中 分 离 纯化
后 可 以 在 体外 与 探 针 直接 杂交 ( 膜 上 印迹 杂交 )， 也 可 以 在 细胞 内 进行 〈 细 胞 原
位 杂交 )。

用 于 检测 的 已 知 的 核酸 片段 称 为 探 针 〈probe)。 为 了 便于 检测 ， 探 针 必 须 用
一 定 的 手段 加 以 标记 ， 以 利于 随后 的 检测 。 负 用 的 标记 物 是 放射 性 同位 素 。 近 年
来 发 展 了 一 些 非 放射 性 标记 物 ， 如 生物 素 、 荧 光 素 、 地 高 辛 等 ， 检 测 这 些 标 记 物
的 方法 是 极其 灵敏 的

， 460 .

一 、 核 酸 分子 杂 交 的 原理

DNA 分 子 杂 交 实 质 上 是 双 链 DNA 的 变性 和 具有 同 源 性 序列 的 两 条 单 链 的 复
性 过 程 。

全 人寿 生 人 交 得

加 热 、 有 机 溶剂 及 低 盐 浓度 等 因素 都 可 以 导致 DNA 二 级 结构 破坏 ， 双 螺旋
解 旋 、 两 条 链 完全 解 离 ， 但 是 未 破坏 其 一 级 结构 ， 此 过 程 称 为 DNA 的 变性 。
DNA 的 变性 伴随 着 DNA 一 系列 理化 性 质 的 变化 ， 如 黏度 降低 、 旋 光 性 的 改变 及
260nm 紫外 吸收 值 增加 等 。

(二 ) 复 “性

变性 的 两 条 互补 单 链 ， 在 适当 的 条 件 下 重新 缔 合 形成 双 链 的 过 程 称 为 复 性
(renaturation) 或 退火 (annealing)。 热 变性 的 DNA 深 液 在 低 于 T, 值 2SY 的 温
度 下 维持 相当 长 的 一 段 时 间 ， 则 可 使 之 恢复 到 天 然 的 双 链 结构 状态 。 复 性 的 速度
受到 诸多 因素 的 影响 。@D DNA 浓度 : DNA 浓度 直接 影响 到 DNA 单 链 间 碰 撞 的
几率 ，DNA 浓度 越 大 ， 复 性 速度 越 快 。@O DNA 的 分 子 质 量 : 大 分 子 质 量 的
DNA 扩散 速度 较 慢 ， 也 难于 形成 正确 配对 ， 因 此 复 性 速度 较 慢 。G@ 温度 : 温度
过 高 ， 有 利于 DNA 变性 而 不 利于 复 性 ; 而 温度 过 低 ， 则 少数 碱 基 配对 形成 的 局
部 双 链 不 易 解 离 ， 难 以 继续 寻找 正确 的 配对 ， 适 宜 的 复 性 温度 是 较 Tu 值 低
2SYC 。 田 离子 强度 : 离子 强度 过 低 不 利于 复 性 ， 和 采用 0.15 一 1.0moVL 盐 溶液
进行 复 性 研究 。@ DNA 分 子 的 复杂 性 : DNA 总 量 一 定时 ， 基 因 组 越 复杂 ， 其
中 特定 序列 的 拷贝 数 就 越 少 ， 互 补 序列 的 浓度 就 越 低 ， 因 而 复 性 反应 速度 越 慢 。

二 、 固 相 支 持 物 的 选择

固 相 支 持 物 的 种 类 很 多 。 一 种 良好 的 固 相 支持 物 应 具备 以 下 几 个 特性 : 四 具
有 较 强 的 结合 核酸 分 子 的 能 力 ， 一 般 要求 每 平方 厘米 结合 核酸 分 子 的 量 不 低 于
10wg， 最 好 能 达到 数 十 微克 ; @ 与 核酸 分 子 结合 后 ， 应 不 影响 其 与 探 针 分 子 的 杂
交 反 应 ; @ 与 核酸 分 子 的 结合 稳定 牢固 ， 能 经 受 杂 交 、 洗 膜 等 操作 过 程 而 不 至 于
脱落 或 脱落 很 少 ;， 田 非特 异性 吸附 少 ， 在 洗 膜 条 件 下 能 将 非特 异性 吸附 在 其 表面
的 探 针 分 子 洗 脱 反 ;@ 具 有 良好 的 机 械 性 能 ， 如 有 柔软 性 好 、 超 性 强 等 ， 以 便于 操
作 。

”40 直 ，

(一 ) 硝酸 纤维 素 滤 膜

硝酸 纤维 素 滤 膜 〈nitrocellulose filter membrane) 具有 较 强 的 吸附 单 链 DNA
和 RNA 的 能 力 ， 特 别 是 在 高 盐 浓 度 下 ， 其 结合 能 力 可 达 80 一 100wg/cm2z。 吸 附
的 单 链 DNA 或 RNA 经 真空 烘 烤 后 ， 依 靠 疏 水 性 相互 作用 而 结合 在 硝酸 纤维 素
膜 上 。 另 外 ， 硝 酸 纤维 素 膜 还 具有 杂交 信和 号 本 底 较 低 的 优点 。 虽 然 硝酸 纤维 素 膜
是 应 用 的 最 为 广泛 的 一 种 固 相 支持 物 ， 但 它 存在 一 些 难以 克服 的 缺点 。 首 先 由 于
硝酸 纤维 素 膜 是 依靠 疏水 作用 结合 DNA， 这 种 结合 并 不 十 分 牢固 ， 随 着 杂交 及
洗 膜 的 进行 。DNA 会 慢 慢 脱 离 硝酸 纤维 素 膜 ， 特 别 是 在 高 温情 况 下 ， 从 而 使 杂
交 效 率 下 降 。 另 外 ， 硝 酸 纤维 素 膜 质 地 较 脆 ， 操 作 不 方便 ， 须 十 分 小 心 * 所 以 现
在 更 多 的 人 倾向 于 使 用 尼龙 膜 。

Go 帮 电 龙 一 师

尼龙 膜 (nylon membrane) 是 目前 较 理想 的 一 种 核酸 固 相 支持 物 。 尼龙 膜 结
合 单 链 及 双 链 DNA 或 RNA 的 能 力 较 硝酸 纤维 素 膜 更 强 ， 可 达 350 一 500ug/cm。
而 且 经 烘 烤 或 紫外 线 照 射 后 ， 核 酸 分 子 可 以 牢固 地 结合 在 尼龙 膜 上 ， 特 别 是 经 得“ 上
波 紫 外 线 照 射 后， 结合 更 加 牢固 。 另 外 ， 由 于 韧性 较 强 ， 操 作 起 来 很 方便 ; 对 于 “和
小 分 子 的 核酸 片段 亦 有 较 强 的 结合 能 力 ， 甚 至 短 至 10bp 的 核酸 片段 它 也 能 结合 ，
同时 尼龙 膜 还 可 以 重复 使 用 。 其 缺点 就 是 杂交 信号 本 底 较 高 ， 但 是 可 以 通过 加 大
预 杂 交 液 中 的 特异 性 封闭 试剂 的 方法 加 以 克服 。

三 、 印 迹 技 术

印迹 技术 是 指 将 待 测 核酸 分 子 结合 到 一 定 的 固 相 支持 物 上 的 方法 ， 这 些 结合
在 固 相 支 持 物 上 的 核酸 分 子 即 可 与 存在 于 液 相 中 的 探 针 分 子 进 行 杂 交 。 选 择 良好
的 固 相 支持 物 与 有 效 的 转移 方法 是 此 项 技术 成 功 与 否 的 两 个 关键 因素 。

印迹 的 方法 很 多 ， 根 据 核 酸 种 类 的 不 同 ， 可 以 分 为 Southern 印迹 法 和
Northern 印迹 法 。

(一 ) Southern 印迹

Southern 印迹 是 指 将 电泳 分 离 的 DNA 片段 转移 到 一 定 的 固 相 支持 物 上 的 过

程 。DNA 分 子 被 限制 酶 酶 切 ， 经 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 将 所 得 DNA 片段 按 分 子 质 量 大

小 分 离 ， 然 后 将 含 DNA 片段 的 琼脂 糖 凝 胶 变 性 ， 并 将 其 中 的 单 链 DNA 片段 转

移 到 硝酸 纤维 素 膜 或 其 他 的 固 相 支持 物 上 ， 而 各 DNA 片段 的 相对 位 置 保持 不
， 462 ，

变 。 这 种 滤 膜 可 用 于 下 一 步 的 杂交 反应 。 利 用 Southern 印迹 可 进行 克隆 基因 的
酶 切 图 谱 分 析 、 基 因 组 中 某 一 基因 的 定性 及 定量 分 析 、 基 因 突 变 分 析 及 限制 性 片
段 长 度 多 态 性 分 析 等 。

(二 ) Northern 印迹

Northern 印迹 是 指 将 RNA 变性 及 电泳 分 离 后 ， 将 其 转移 到 固 相 支持 物 上 的
过 程 ， 从 而 用 于 杂交 反应 以 鉴定 其 中 特定 mRNA 分 子 的 大 小 与 含量 。Northern
印迹 的 基本 原理 与 Southern 印迹 相同 ， 但 RNA 变性 方法 与 DNA 不 同 ， 不 能 用
碱 变性 ， 因 为 碱 会 导致 RNA 的 水 解 ， 需 用 甲醛 变性 。 与 DNA 相 比 ，RNA 操作
具有 更 高 的 难度 。 这 主要 是 因为 Rnase 极其 活跃 ， 而 且 十 分 稳定 ， 在 100YT 煮沸
10min 活力 没有 明显 丧失 ， 因 此 必须 严格 注意 到 RNase 对 RNA 的 降解 作用 。

(三 ) 斑点 及 狭 颖 印迹

将 RNA 或 DNA 变性 后 直接 点 样 于 固 相 支持 物 上 ， 用 于 基因 组 中 特定 基因
及 其 表达 的 定性 及 定量 分 析 研 究 ， 称 为 斑点 或 狭 颖 印迹 (dot and slot blot)， 也
是 实验 室 常用 的 技术 之 一 。 与 Southern 和 Northern 印迹 法 相 比 ， 其 优点 是 简单 、
迅速 ; 可 在 同一 张 膜 上 同时 进行 多 个 样品 检测 ; 对 于 核酸 粗 提 样 品 的 检测 效果 也
较 好 。 其 缺点 是 不 能 鉴定 所 测 基因 的 分 子 质量 ， 而 且 特 异性 不 高 ， 有 一 定 比 例 的
假 阳 性 。

三 节 “” 基 因 沉 默 与 基因 吻 除

研究 基因 沉默 可 帮助 人 们 进一步 揭示 生物 体 基 因 遗 传 表达 调控 的 本 质 ， 在 基
因 工程 中 克服 基因 沉默 现象 ， 从 而 使 外 源 基 因 能 更 好 的 按照 人 们 的 需要 进行 有 效
表达 ; 利用 基因 沉默 在 基因 治疗 中 有 效 抑制 有 害 基因 的 表达 ， 达 到 治疗 疾病 的 目
的 ， 所 以 研究 基因 沉默 具有 极其 重要 的 理论 和 实践 意义 。

基因 沉默 (gene silencing) 是 指 生 物体 中 特定 基因 由 于 种 种 原因 不 能 表达 ，

是 研究 基因 功能 的 重要 手段 。 基 因 沉 默 现 象 是 导致 基因 不 能 正常 表达 的 重要 因素

之 一 ， 其 作用 机 制 主 要 有 三 种 : 位 置 效 应 (position effect)、 转录 水 平 的 基因 沉

默 (transcriptional gene silencing，TGS) 和 转录 后 水 平 的 基因 沉默 (post-tran-

scriptional gene silencing，PTGS)。 根 据 目前 的 知识 ， 重 复 序列 是 基因 沉默 的 普遍
“的 交

诱因 ， 甲 基 化 是 基因 沉默 的 直接 原因 。

位 置 效 应 是 指 基因 在 基因 组 中 的 位 置 对 其 表达 的 影响 。 外 源 基因 进入 细胞 核
后 首先 整合 到 染色 质 上 ， 其 整合 位 点 与 表达 有 密切 的 关系 。 如 果 整 合 到 甲 基 化 程
度 低 、 转 录 活 性 高 的 并 染 色 质 上 其 表达 受 两 侧 DNA 序列 的 影响 。 植 物 基 因 组 常
是 由 具有 相似 GC 含量 的 DNA 片段 相互 嵌 合 在 一 起 的 ， 外 源 基 因 的 插入 打 乱 了
它们 的 正常 的 组 合 。 生 物体 可 以 通过 外 源 基 因 与 其 两 侧 序 列 GC 含量 的 差别 来 识
别 外 源 基 因 ， 然 后 激活 甲 基 化 酶 ， 使 外 源 序列 甲 基 化 而 降低 其 转录 活性 。

转录 水 平 上 的 基因 沉默 是 DNA 水 平 上 调控 转录 的 结果 ， 主 要 是 由 启动 子 甲
基 化 或 导入 基因 异 染 色 质 化 所 造成 的 。 二 者 都 和 转基因 重复 序列 有 密切 关系 。 自
身 甲 基 化 外 源 基因 如 果 以 多 拷贝 的 形式 整合 到 同一 位 点 上 ， 形 成 首尾 相连 的 正 向
重复 或 头 对 头 、 尾 对 尾 的 反 向 重复 ， 则 不 能 表达 。 而 且 拷 贝 数 越 多 ， 基 因 沉 默 现
象 越 严 重 。

转录 后 基因 沉默 是 RNA 水 平 基 因 调 控 的 结果 ， 比 转录 水 平 的 基因 沉默 更 普
遍 。PTGS 表现 为 一 种 序列 特异 性 的 RNA 降解 过 程 ， 主 要 作用 于 同 源 性 较 高 的
转录 产物 ， 包 括 具 有 同 源 性 的 内 源 基 因 的 转录 产物 。 它 广泛 存在 于 各 种 生物 中 ，
直到 最 近 人 们 才 发 现在 植物 中 被 称 为 共 抑 制 (cosuppression) 、 真 菌 中 被 称 为 抑制
(quelling)、 动 物 中 称 为 RNA 干扰 (RNA interference，RNAi) 的 现象 可 能 具有
很 大 的 相似 性 ， 都 与 PTGS 现象 有 关 。 现 在 普遍 认为 PTGS 并 非 一 种 偶然 现象 ，
而 是 生物 在 长 期 进化 过 程 中 所 形成 的 对 病毒 、 转 座 因 子 和 其 他 可 转移 核酸 的 防御
系统 ， 因 为 这 些 外 源 核酸 的 引入 很 可 能 使 宿主 细胞 内 的 平衡 机 制 遭 到 致命 破坏 ，
而 转基因 沉默 ， 无 非 是 和 宿主 将 外 源 基 因 视 为 对 自己 有 害 的 序列 而 将 其 抑制 。 细 胞
对 外 源 核酸 的 这 种 抑制 作用 具有 序列 特异 性 的 特点 ， 所 以 一 旦 细胞 内 转录 后 沉默
机 制 被 启动 ， 细 胞 对 转 入 核酸 的 同 源 序列 就 具有 了 “免疫 ”能 力 。 目 前 对 PTGS
机 制 的 了 解 仍 不 是 十 分 清楚 。 这 是 因为 生物 在 长 期 的 进化 过 程 中 防御 外 来 基因 侵
入 的 机 制 本 身 具 有 多 样 性 ， 所 以 很 难 用 一 种 理论 或 学 说 来 解释 基因 沉默 现象 (图
ES 站

RNAi 现象 是 广泛 存在 于 生物 中 的 一 种 普遍 现象 。 研 究 显 示 ， 生 物体 内 有 一
套 RNA 监视 系 统 ， 可 以 由 多 种 异常 RNA 来 激发 。 如 果 外 来 核酸 是 DNA (包括
转基因 、 重 组 基因 、DNA 病毒 、 扩 增 子 等 )， 靶 标 RNA 需要 在 细胞 核 中 完成 转
录 后 运转 到 细胞 质 中 ， 而 侵入 细胞 质 的 病毒 RNA 可 以 直接 提供 靶 标 RNA。 各 种
不 同 的 靶 标 RNA (包括 与 外 源 基因 同 源 的 内 源 基因 和 外 来 DNA 产生 的 RNA 以
及 病毒 的 RNA) 由 寄主 的 RdRP (依赖 于 RNA 的 RNA 育 合 酶 ) 或 病毒 自身 的
RdRP 通过 多 种 不 同 的 途径 把 靶 标 RNA 转变 成 双 链 RNA， 从 而 通过 RNAi 引发
的 PTGS。PTGS 被 引发 后 就 不 再 需要 RdRP。 关 于 双 链 RNA 介 导 的 RNAi 特异
性 靶 标 RNA 的 降解 ， 有 研究 认为 生物 体内 存在 着 一 种 复合 酶 : RNAi 核酸 酶 ，
该 酶 具有 双 链 RNA 结合、RNase 和 RNA 解 旋 酶 三 个 活性 区 。 首 先 双 链 RNA 结

， 464 ，

HA 的 VAN E

Cnucleus) 一 一 一 一 | 人 一 一 一 一 一
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本
Dicer
(CAF) 一 - ie
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Systemic signal

Homologous
mRNA 计 宙 人 作

en An ~wvvvvvv
desgradation vv “aberrant”RNA

图 16-5 ”基因 沉默 原理 示意 图
Dicer: 一 种 能 促进 RNA 成 熟 和 降解 的 酶 。
siRNA: short interfering RNA， 小 干扰 RNA。
stRNA: small temporal RNA， 小 瞬时 RNA。
Genome: 基因 组 。
Ago: 一 种 蛋白 质 的 名 称 。
RISC: RNA-induced silencing complex，RNA 沉默 诱导 复合 体 。
RdRP: RNA-dependent RNA polymerase， 依 赖 RNA 的 RNA 聚 合 酶 。
adapter: 接头 分 子 。
dsRNA: 双 链 RNA。
inverted repeat transcripts;， 反 转 序列 转录 。
non-coding RNA genes: 非 编码 RNA 基因。
transgene arrays: 转基因 阵列 。
transposon: 转 座 子 。
translational arrest， 翻 译 停滞 。
degrade: 降解 。
genomic modification， 基因 组 修饰 ，
Transgene: 转基因

。 465 。

合 到 该 酶 的 双 链 RNA 结合 区 并 引导 该 酶 识别 靶 标 RNA， 接 着 该 酶 的 解 旋 酶 区 完
成 ATP 依赖 性 的 靶 标 RNA 与 该 酶 结合 的 双 链 RNA 的 正义 链 的 换 位 ，RNase 在
靶 标 RNA 结合 位 点 附近 完成 切割 ， 从 而 使 园 标 RNA 能 被 进一步 降解 ， 产 生 大
量 的 小 片段 RNA， 包 括 序列 特异 性 的 约 2SntRNA。 载 有 序列 特异 性 的 双 链 RNA
的 游离 复合 酶 再 去 识别 并 降解 其 他 的 靶 标 RNA， 产 生 更 多 的 约 2SntRNA， 从 而
使 PTGS 具有 持久 性 和 系统 性 。

转录 水 平 上 的 基因 沉默 、 转 录 后 基因 沉默 以 及 RNAi 引起 的 基因 沉默 都 与 基
因 的 同 源 性 有 关 ， 称 为 同 源 依 赖 性 的 基因 沉默 (homology-dependent gene silenc-
ing，HDGS)。TGS 是 发 生 在 核 内 的 事件 ， 而 PTGS 发 生 在 细胞 质 中 。 两 者 都 与
超 甲 基 化 〈hypermethylated) 或 形成 的 RNA 双 链 有 关 ，TGS 现象 中 甲 基 化 主要
发 生 在 启动 子 区域 ， 基 因 的 转录 受到 抑制 ; 而 PTGS 中 ， 甲 基 化 主要 发 生 在 基因
的 编码 区 ， 基 因 能 够 转录 ， 产 生 mRNA， 但 mRNA 在 细胞 质 中 被 特异 地 降解 。
二 者 在 时 间 上 并 非 简单 的 前 后 关系 ， 在 空间 上 也 不 因为 核 膜 的 存在 而 相互 隔离 。
研究 发 现 ，PTGS 可 能 以 RNA 的 方式 影响 TGS， 而 且 越 来 越 多 的 研究 表明 TGS
可 能 与 PTGS 有 着 相似 的 机 制 。

基因 沉默 现象 具有 重要 的 理论 和 实践 意义 。 首 先 ， 在 理论 上 如 果 能 阑 明基 因
沉默 的 机 理 对 于 提高 转化 效率 和 外 源 基 因 的 表达 活性 具有 指导 意义 ; 在 实践 上 ，
由 于 植物 基因 工程 的 兴起 ， 使 人 们 的 许多 愿望 有 可 能 成 为 现实 ， 但 是 由 于 转基因
的 转化 效率 较 低 ， 稳 定性 不 高 、 表 达 水 平 难以 预料 这 些 缺 点 限制 了 植物 基因 工程
的 发 展 ， 转 基因 沉默 的 研究 的 实践 意义 首先 在 于 提高 表达 活性 ， 减 少 基因 沉默 。
另外 基因 沉默 还 可 以 用 于 研究 基因 功能 、 基 因 的 表达 调控 。

克服 基因 沉默 已 经 成 为 基因 工程 的 一 个 重要 课题 ， 目 前 针对 上 述 基因 沉默 的
机 制 ， 初 步 提出 了 以 下 一 些 对 策 : @ 由 于 重复 或 同 源 序列 是 基因 沉默 的 普遍 诱
因 ， 所 以 在 构建 表达 载体 时 ， 应 尽量 使 得 所 设计 的 序列 与 内 源 序 列 的 同 源 性 较
低 ， 以 减少 或 避免 配对 。 另 外 ， 选 用 外 源 基 因 插 入 基因 组 中 拷贝 数 低 的 ， 最 好 是
单 拷贝 的 转基因 植株 ， 亦 可 减少 重复 序列 的 存在 。@@ 甲 基 化 是 基因 沉默 的 直接 原
因 ， 转 基因 甲 基 化 的 程度 与 基因 沉默 的 程度 成 正 相 关 ， 人 们 正在 试图 在 载体 上 加
上 有 去 甲 基 化 功能 的 序列 以 防止 甲 基 化 。 图 实验 表明 转基因 的 侧 愤 核 基质 结合 序
列 (matrix attachment region，MAR) 会 在 一 定 程度 上 避免 位 置 效 应 ， 提 高 基因
的 表达 。MAR 具有 限定 DNA 环 的 大 小 ， 使 之 成 为 相对 独立 的 结构 功能 单位 的
作用 > 本

二 、 基 因 有 别 除
基因 吻 除 技术 是 在 基因 定位 整合 技术 以 及 小 鼠 胚 胎 干 细胞 体外 培养 的 基础 上
建立 的 一 种 新 兴 的 生物 技术 。 该 技术 使 转基因 技术 更 前 进 了 -一步 ， 为 人 们 在 动物

.466

把

体内 分 析 某 一 特定 的 基因 提供 了 有 力 的 手段 ， 这 一 最 新 技术 最 先 用 于 动物 模型 的
复制 上 。1988 年 人 类 培育 了 第 1 例 基 因 吻 除 动 物 模型 ， 揭 开 了 基因 吻 除 动物 模
型 建立 的 序幕 。 进 入 20 世纪 90 年 代 ， 在 生命 科学 研究 的 各 个 领域 如 免疫 学 、 人
类 疾病 模型 复制 和 基因 功能 鉴定 等 方面 都 有 着 广泛 的 应 用 。

”基因 剔除 (gene knock-out) 就 是 用 基因 转移 方法 将 一 段 DNA 转移 至 受 体 细
胞 肉 ， 转 移 基 因 可 以 取代 受 体 细 胞 染色 体 基 因 组 上 一 段 长 度 相 同 的 DNA 片段 ，
取代 方式 有 随机 组 合 和 同 源 重 组 两 种 ， 同 源 重 组 即 用 转移 的 一 段 DNA 序列 取代
基因 组 上 相应 的 一 段 序列 。 基 因 吻 除 可 以 用 突变 的 基因 剔除 相应 的 正常 基因 ， 也
可 以 用 正常 基因 剔除 相应 的 突变 基因 。 目 前 主要 采用 突变 基因 (mutated gene)
殴 除 正常 基因 以 产生 定位 突变 (target mutation)。 首 先 选 定 需要 突变 的 基因 的 全
部 或 部 分 DNA 序列 ， 通 过 插入 、 人 修饰、 删除 或 置换 等 手段 使 其 突变 ， 克 隆 到 载
体 中 建成 靶 载 体 ， 将 靶 载 体 导 入 小 鼠 ES 细胞 〈 胚 胎 干 细胞 ) 中 ， 使 之 与 细胞 染
色 体 内 同 源 的 靶 序 列 进行 重组 ， 达 到 定位 突变 细胞 内 该 基因 的 目的 。 然 后 在 细胞
水 平和 分 子 水 平 筛选 富 集 发 生 突变 的 细胞 ， 并 注射 到 小 鼠 吉 豚 腔 内 ， 将 这 些 宫 胚
导入 假 孕 母 鼠 子宫 中 。 所 产生 的 子 代 雄 性 府 合 鼠 与 正常 肉 鼠 交配 可 获得 携带 该 突变
基因 的 纯 合 鼠 。 最 后 对 纯 合 鼠 的 表 型 、 基 因 型 及 基因 表达 产物 进行 分 析 。

采用 同 源 重组 定位 突变 的 基因 剔除 系统 为 探讨 基因 的 生理 功能 和 表达 调控 机
制 提供 了 有 效 的 方法 。 这 种 方法 的 最 大 优点 是 它 能 对 所 有 已 经 克隆 的 基因 进行 突
变 ， 且 能 对 同一 基因 进行 多 种 形式 的 突变 。 目 前 采用 的 基因 吻 除 是 使 该 基因 功能
全 部 丧失 。 今 后 的 研究 可 使 这 一 作用 进一步 扩大 与 完善 : @@ 可 散 除 基因 的 一 小 段
序列 观察 其 功能 细节 ， 也 可 以 缺失 大 片段 研究 成 复 基 因 的 功能 与 调控 机 制 ; @ 从
多 基因 调控 机 制 入 手 ， 使 得 突变 体 额 外 获得 某 一 基因 的 功能 ， 部 分 或 完全 丧失 某
一 基因 功能 ; @@ 除 突变 结构 基因 外 ， 也 可 敲 除 调控 元 件 以 及 编码 反 式 调节 因子 的
基因 。 深 入 研究 上 述 不 同类 型 的 突变 体 ， 将 逐步 揭示 多 种 基因 的 功能 与 表达 调控
机 制 。

在 分 析 基 因 吻 除 实 验 结果 时 ， 需 注意 一 个 普遍 存在 的 现象 。 当 某 一 基因 被 敲
除 后 ， 该 基因 在 正常 状态 下 特异 表达 的 组 织 中 并 非 都 出 现 纯 合 突变 鼠 的 表 型 。 这
一 现象 的 可 能 原因 是 : @ 常 规 形 态 检查 法 难以 测 出 组 织 细胞 的 微细 变化 ; @ 该 基
因 产 物 对 其 所 表达 的 组 织 并 非 绝对 必要 ; 图 可 能 存在 其 他 的 基因 的 功能 补偿 了 突
变 基因 的 缺陷 。 另 外 ， 对 分 化 与 发 育 起 重要 作用 的 同 源 异形 基因 ， 成 复 排 列 且 在
进化 上 高 度 保守 ， 成 复 特 点 在 基因 表达 调控 中 显然 有 重要 的 意义 。 但 其 中 单个 基
因 的 表达 系统 似乎 也 有 相应 的 功能 ， 与 上 述 推断 相 矛 盾 。 其 可 能 的 原因 是 : @ 由
于 进化 上 高 度 保 守 ， 转 基因 动物 中 已 有 相应 的 遗传 背景 ; 回 同 源 异型 基因 的 典型
瞬间 表达 不 易 在 基因 剔除 系统 中 反映 出 来 。 因 此 不 管 是 实验 设计 还 是 结果 分 析 ，
均 应 考虑 系统 的 整体 性 与 系统 诸 要 素 之 间 的 相关 性 。 对 于 一 个 小 系统 的 反常 现
象 ， 不 可 以 简单 地 看 做 新 发 现 的 证 据 。

. 467 .

第 四 节 ”基因 表达 差异 分 析

生物 的 表 型 主要 是 由 其 内 在 的 基因 表达 所 决定 的 。 高 等 生物 以 前 估计 一 般 具
有 1x10- 个 基因 ， 不 同 细胞 间 基 因 表达 的 差异 决定 了 生命 活动 的 多 样 性 ， 如 发
育 与 分 化 、 内 环境 稳定 、 细 胞 周期 调节 等 。 正 常 代 谢 或 各 种 病理 改变 ， 不 管 是 单
基因 突变 或 是 受 多 基因 体系 调控 ， 本 质 上 都 是 基因 表达 的 改变 所 致 。 因 此 ， 分 析
正常 细胞 与 突变 细胞 之 间 基 因 表 达 的 差异 ， 可 以 为 生物 生命 的 活动 过 程 提供 重要
的 信息 。 传 统 上 研究 基因 表达 的 方法 如 Northern 印迹 或 斑点 杂交 ， 既 费时 又 费
力 。 随 着 分 子 生 物 学 及 其 技术 的 飞速 发 展 ， 出 现 了 大 量 的 新 方法 、 新 技术 研究 基
因 表 达 的 差异 。 按 其 技术 特点 可 分 为 三 类 : 四 以 杂交 为 基础 的 技术 ， 包括
Northern 印迹 、DNA 微 阵列 〈 基 因 芯 片 ); @ 以 PCR 为 基础 的 技术 ， 如 差异 显
示 、 代 表 性 差异 分 析 ; 图 以 测序 为 基础 的 技术 ， 如 表达 序列 标签 (EST)、 基 因
表达 系列 分 析 〈SAGE) 等 。 下 面 对 其 中 有 代表 性 的 技术 作 “ 介 绍 。

、 传 统 研究 基因 表达 差异 的 方法

Northern blot 即 用 同位 素 或 其 他 非 放射 性 的 物质 标记 的 DNA 或 RNA 探 针 与
吸 印 在 滤 膜 上 的 被 分 析 样 品 总 RNA 杂交 ， 根 据 杂 交 信 和 号 判定 已 知 基 因 在 被 分 析
样品 中 表达 与 否 或 表达 量 的 技术 。 近 30 年 过 去 了 ， 该 技术 在 分 子 生物 学 领域 仍
有 极为 广泛 的 应 用 ， 任 何 基因 的 表达 都 要 用 它 来 证 实 。 另 外 一 项 比较 基因 表达 差
异 的 技术 是 核酸 酶 保护 分 析 (RNase-protection assay)。 用 标记 好 的 被 检测 基因 与
样品 总 RNA 杂交 ， 由 于 单 链 特异 的 核酸 酶 不 能 降解 mRNAVDNA 杂交 双 链 ， 用
核酸 酶 降解 后 电泳 ， 就 能 检测 到 被 保护 的 也 是 被 检测 基因 对 应 的 mRNA 的 存在 。
这 些 技术 的 一 个 共同 点 就 是 只 能 对 已 知 的 基因 进行 鉴别 分 析 。

削减 cDNA 文库 构建 技术 (subtractive cDNA library) 使 基因 表达 差异 分 析
的 比较 有 了 质 的 飞跃 。 用 过 量 参 比 材料 cDNA 与 被 分 析 材 料 总 mRNA 杂交 ， 分
离 不 能 形成 杂交 双 链 的 mRNA 并 用 于 构建 cDNA 文库 ， 就 能 分 析出 那些 在 被 分
析 材 料 中 特异 表达 的 全 部 基因 。 该 技术 最 重要 的 改进 是 差异 表达 基因 的 选择 扩
增 。 把 被 分 析 材 料 (tester) 的 双 链 cDNA 用 限制 性 内 切 核酸 酶 消化 ， 连 上 有 生
物 素 未 端 标 记 的 接头 序列 ， 用 过 量 的 参 比 样品 (drive 或 control) cDNA 与 之 杂
交 ， 用 单 链 DNA 酶 降解 不 能 复 性 的 接头 序列 ， 在 生物 素 帮 助 下 分 离 被 分 析 样 品
特异 cDNA 片段 的 允 再 经 PCR 扩 增 ， 就 能 获得 大 量 的 被 分 析 材 料 中 特
异 表达 基因 的 片段 。 这 是 因为 只 有 被 分 析 样 品 特异 表达 的 基因 才能 形成 两 端 都 有
接头 序列 的 双 链 DNA 而 使 接头 不 被 降解 从 而 能 被 接头 序列 引物 有 效 扩 增 。

08

庙

二 :差异 展示

差异 展示 (differential display) 是 一 种 方便 、 快 捷 、 能 一 次 比较 多 个 样品 基
因 表达 差异 的 技术 。 由 于 灵敏 度 极 高 ， 发 育 时 期 的 微小 不 同步 、 微 量 组 织 细胞 不
一 致 等 都 能 造成 大 量 的 带 纹 差异 ， 从 而 使 真正 的 差异 表达 基因 的 鉴别 非常 困难 。
同时 ， 污 染 的 基因 组 DNA 也 能 因 随 机 引物 的 使 用 在 PCR 扩 增 过 程 中 产生 带 纹 ，
造成 严重 的 干扰 ， 因 此 样品 必须 用 DNA 酶 处 理 ， 以 获得 高 纯度 的 RNA。

该 技术 的 基本 流程 是 : 在 反 转 录 酶 作用 下 ， 用 三 条 与 mRNA 3 端 配对 的 锚
定 引物 合成 EDNA， 然 后 用 锚 定 引 物 和 随机 引物 的 组 合 进行 PCR 扩 增 ， 在 序列
分 析 胶 上 带 纹 的 有 无 和 强 弱 就 是 不 同 材 料 中 基因 表达 差异 的 体现 。 把 有 差异 的
cDNA 带 洗 脱 、 再 扩 增 、 克 隆 和 测序 ， 就 能 分 离 出 大 量 差异 表达 基因 的 不 完整 序
列 并 可 以 作为 进一步 分 离 基因 的 探 针 。 在 鉴别 和 分 离 发 育 生化 相关 基因 和 疾病 形
成 相关 基因 等 方面 ， 差 异 展 示 获 得 了 极 成 功 的 应 用 。 该 技术 具有 能 同时 对 多 个 样
品 进行 相互 比较 且 需 要 的 RNA 起 始 量 非 常 微小 等 优点 。 其 缺点 就 是 假 阳 性 较
多 ， 但 是 ， 尽 管 如 此 ， 差 异 展示 技术 仍然 是 比较 基因 表达 差异 的 最 有 效 方法 。

三 、 代 表 差 异 分 析

(representational difference analysis，RDA)

RDA 最 初 是 为 分 离 基因 组 特有 的 DNA 序列 而 设计 的 ， 后 来 被 用 于 基因 表达
差异 分 析 。 它 结合 了 PCR 技术 和 削减 杂交 技术 的 优点 ， 能 极 有 效 地 分 离 在 一 个
cDNA 群体 中 存在 而 在 另 一 个 群体 中 不 存在 的 基因 序列 ， 但 对 那些 在 表达 量 上 有
差异 的 基因 的 鉴别 和 分 离 却 较 困 难 。 一 般 期 望 被 分 析 样 品 含 有 特异 表达 的 基因 ，
但 经 常 做 交互 分 析 ， 即 先 确 定 一 个 样品 为 被 分 析 样 品 ， 然 后 交换 ， 把 参 比 样品 作
为 被 分 析 样 品 再 做 一 次 分 析 ， 把 分 析 样 品 和 参 比 样品 的 mRNA 群体 反 转 录 成
cDNA， 再 用 限制 性 内 切 核酸 酶 消化 ， 并 在 cDNA 限制 性 内 切 核酸 酶 消化 片段 两
端 连 上 接头 序列 ， 经 PCR 扩 增 ， 就 能 获得 足够 量 cDNA 群体 的 限制 性 片段 ， 把
接头 序列 从 cDNA 片段 的 两 端 用 酶 切 掉 ， 再 给 被 分 析 样 品 加 上 新 接头 序列 ， 对 照
的 切割 接头 后 则 不 加 新 接头 ， 这 样 就 只 有 被 分 析 样 品 的 EDNA 片段 两 端 有 外 加 的
接头 序列 。 用 1:100 比例 混合 的 被 分 析 样 品 和 参 比 样品 cDNA 片段 作 模板 进行
PCR 扩 增 ， 来 源 于 对 照 的 DNA 片段 由 于 没有 新 接头 ， 不 能 和 引物 退火 因而 不 能
被 扩 增 ， 而 测试 的 和 对 照 都 有 片段 ， 过 量 的 参 比 样品 cDNA 片段 在 复 性 时 很 快 与
被 分 析 样 品 的 相同 序列 杂交 而 阻碍 扩 增 ， 只 有 被 分 析 样 品 中 特有 片段 获得 了 有 效
地 扩 增 。RDA 的 最 大 优点 是 能 富 集 被 分 析 样 品 特异 表达 的 cDNA 片段 。 为 了 达
到 更 好 的 富 集 效 果 ， 通 常 要 进行 第 二 轮 甚至 第 三 轮 的 杂交 PCR 操作 ， 这 样 大 大

。 4609 。

降低 了 电泳 分 析 的 假 阳性 条 带 。
四 、 基 因 表达 系列 分 析

(serial analysis of gene expression，SAGE )

SAGE 是 通过 比较 序列 信息 来 比较 基因 表达 差异 的 技术 。 它 能 用 少数 几 个 测
序 反 应 获得 不 同 的 组 织 或 细胞 基因 表达 差异 的 全 部 信息 。SAGE 包括 每 个 表达 基
因 独 有 的 10 到 14 个 碱 基 标 签 序列 的 获得 ， 能 用 于 克隆 和 测序 的 基因 标签 序列 的
组 装 和 标签 种 类 以 及 频率 的 统计 三 个 基本 步 又。 根据 标签 的 种 类 和 频率 就 能 推论
各 标签 对 应 基因 的 表达 情况 。

基因 表达 系列 分 析 是 一 个 以 测序 为 基础 的 基因 组 工具 ， 具 有 发 现 新 基因 以 及
定量 基因 表达 分 析 的 功能 。SAGE 技术 ， 是 1995 年 由 约翰 ' 霍 普 金 斯 大 学 的 Vel-
culeseu 等 提出 的 ， 此 方法 用 来 鉴定 哪些 基因 被 表达 以 及 量化 表达 水 平 。SAGE 方
法 的 两 个 基本 原理 是 : @ 需 要 一 个 短 的 守 核 苷 酸 标 记 物 (SAGE 标记 物 ，10bp)，
它 必须 包含 充分 的 信息 能 特异 性 地 代表 一 个 转录 本 ; @ 以 一 个 串联 体 的 形式 将
SAGE 标记 物 随 机 地 串联 起 来 ， 使 得 测序 经 济 高 效 。 具 体 解 释 如 下 :

最 初 估 计 人 类 基因 组 中 大 约 有 100 000 个 不 同 的 基因 ， 一 个 10bp 大 小 的 宴
核 苷 酸 序列 有 1 000 000 多 种 不 同 的 组 合 方式 。 如 果 在 每 个 转录 本 中 特定 的 区 域
能 获得 一 个 10bp 的 标记 物 ， 那 么 此 标记 物 足 以 特异 性 的 代表 这 一 转录 本 。 第 二
条 原则 是 对 短 的 核 苷 酸 序列 标签 随机 线形 串联 组 成 的 模板 (concatemer， 串 联 体 )
进行 测序 ， 这 些 短 核酸 标记 物 来 源 于 不 同 的 转录 本 。 这 个 串联 体 的 测序 结果 将 提
供 多 种 基因 的 信息 。

SAGE 作为 一 种 强 有 力 的 全 新 的 方法 ， 能 够 对 基因 表达 的 整体 模式 做 出 综合
而 又 全 面 的 评价 。 其 操作 过 程 简 要 介绍 如 下 : 首先 ， 用 多 聚 工 柱子 分 离
poly (A)* RNA， 用 生物 素 标记 的 引物 T18， 以 多 聚 (A)* RNA 为 模板 合成 被 生
物 素 标记 的 cDNA， 再 被 一 种 “ 锚 定 酶 ”切割 ， 被 生物 素 标记 的 cDNA 片段 与 包
被 有 链 亲 和 素 的 珠 状 物 结合 。 含 有 标记 酶 识别 位 点 的 两 种 衫 核 苷 酸 (linker) 分
别 连接 到 这 种 结合 性 cDNA 片段 的 3 终端， 这 样 形成 一 个 守 核 苷 酸 + 3"cDNA 标
记 物 复合 体 。 标 记 酶 使 寡 核 苷 酸 + 3'cDNA 标记 物 复 合体 从 珠 状 物 上 消化 下 来 ，
形成 寡 核 苷 酸 + 标记 物 复合 体 ， 复 合体 的 3 末端 被 纯化 。 带 有 两 种 不 同 朝 核 苷
酸 (linker) 的 短 标记 物 可 互相 连接 形成 102bp 大 小 的 双 标 记 物 。 将 包含 有 两 个
标记 物 (SAGE 双 标 记 物 ) 和 两 个 linker 结合 的 双 标 记 物 进行 PCR 扩 增 。Linker
结合 的 SAGE 双 标 记 物 被 标记 酶 〈II 型 限制 性 内 切 核酸 酶 ) 从 识别 下 游 约 20bp
处 切 开 产生 大 约 26 一 28 个 碱 基 对 的 宴 核 苷 酸 聚 合 物 (SAGE 双 标 签 )， 经 纯化 、
连接 形成 串联 体 ， 克 隆 到 M13 载体 中 ， 扩 增 DNA 并 测序 。 利 用 SAGE 软件 对 测
序 结 果 进 行 分 析 能 够 将 标记 物 分 类 和 量化 ， 这 些 标 记 物 反应 了 一 个 已 知 细胞 系 或

.470 ，

站

组 织 中 转录 本 的 特性 和 数量 。
五 、 生 物 忆 及 技术

生物 芯片 〈biochip) 技术 是 近年 来 发 展 起 来 的 新 型 实用 技术 ， 已 成 为 高 效 、
大 规模 获取 相关 生物 信息 的 重要 手段 。 所 谓 生物 芯片 就 是 缩小 了 的 生物 化 学 分 析
器 ， 通 过 芯片 上 微 加 工 获 得 的 微米 结构 与 生物 化 学 处 理 结合 ， 将 成 千 上 万 个 与 生
命 相 关 的 信息 集成 在 一 块 厘米 见方 的 氧化 硅 玻 璃 或 塑料 等 材质 制 成 的 必 片 上 ， 实
现 对 化 合 物 、 蛋 白质 、 核 酸 、 细 胞 或 其 他 生物 组 分 准确 、 快 速 、 大 信息 量 的 筛选
或 检测 。 基 因 忌 片 ， 又 称 DNA 微 阵 列 (DNA microarray)， 是 一 种 最 重要 的 生物
芯片 ， 广 泛 用 于 基因 表达 差异 分 析 、 新 基因 发 现 、 基 因 突 变 及 多 态 性 分 析 、 基 因
组 文库 作 图 、 疾 病 诊断 、 药 物 蹄 选 、 基 因 测 序 等 。

基因 芯片 是 利用 原 位 合成 法 或 将 已 经 合成 好 了 的 一 系列 寡 核 背 酸 以 预先 设 定
的 排列 方式 固定 在 固 相 支持 介质 表面 ( 硅 片 、 玻 片 、 尼 龙 膜 等 )， 形 成 高 密度 的
守 核 苷 酸 的 阵列 ， 以 用 于 杂交 分 析 。 其 中 ， 窦 核 苷 酸 的 长 度 与 链 内 互补 序列 及
Tu 值 等 因素 的 限制 ， 一 般 在 2Sbp 以 内 ， 针 对 不 同 的 用 途 ， 长 度 不 一 。 目 前 有
关 基 因 心 片 的 来 源 和 介绍 都 很 多 ， 但 大 多 数 为 公司 化 的 产品 ， 尚 无 明确 统一 的 标
准 来 限定 基因 芯片 的 质量 。

基因 芯片 技术 的 突出 特点 在 于 高 度 并 行 性 、 多 样 性 、 微 型 化 和 自动 化 。 高 度
并 行 性 不 仅 可 大 大 提高 实验 的 进程 ， 并 且 有 利于 基因 芯片 技术 所 展示 图 谱 的 快速
对 照 和 阅读 。 多 样 性 是 指 在 单个 芯片 中 可 以 进行 样品 的 多 方面 分 析 ， 从 而 大 大 提
高 了 分 析 的 精确 性 ， 避 免 了 因 不 同 实验 条 件 产生 的 误差 。 微 型 化 是 当前 芯片 制造
中 普遍 的 趋势 ， 其 好 处 是 可 以 减少 试剂 用 量 和 减少 反应 液体 积 ， 从 而 提高 样品 浓
度 和 反应 速度 。 高 度 自动 化 则 可 以 降低 制备 芯片 的 成 本 和 保证 芯片 的 制造 质量 不
易 波动 。

所 有 的 基因 心 片 技术 都 包含 五 个 基本 要 点 : 生物 学 问题 的 提出 和 DNA 方 阵
的 构建 、 样 品 的 制备 、 杂 交 反 应 、 杂 交 图 谱 的 检测 、 数 据 的 处 理 及 建 模 。

基因 心 片 的 制备 方法 大 致 可 以 分 为 点 样 法 和 在 片 合成 法 。 在 基因 芯片 的 使 用
过 程 中 常常 需要 同时 对 大 量 不 同 的 基因 片段 进行 扩 增 和 标记 。 因 此 ， 要 求 对
PCR 引物 的 选择 、 扩 增 条 件 以 及 PCR 产物 的 标记 进行 摸索 。 基 因 芯 片 杂 交 结 果
的 检测 有 多 种 方法 ， 目 前 主要 为 荧光 标记 方法 。 根 据 获得 的 荧光 图 谱 ， 进 行 数据
的 分 析 ， 建 立 相 应 的 数据 库 。

将 基因 心 片 技 术 应 用 于 基因 表达 差异 的 研究 的 做 法 是 : 把 不 同 条 件 下 某 生物
体内 转录 出 来 的 所 有 mRNA 经 标记 成 为 探 针 后 ， 再 与 代表 它 所 有 基因 而 制 成 的
宅 核 苷 酸 方 阵 杂 交 ， 通 过 分 析 杂 交 位 点 及 其 信号 强 弱 就 可 得 出 不 同情 况 下 每 个 基
因 是 否 表 达 及 表达 多 少 。

5 人/

蛋白 质心 片 又 称 蛋 白质 微 阵列 (protein microarray)， 其 制作 原理 类 似 于 基因
心 片 。 不 同 的 是 ， 蛋 白质 必 片 所 用 的 样品 是 提纯 了 的 蛋白 质 、 多 肽 或 从 cDNA 表
达 文 库 中 提取 的 蛋 日 产物 。 它 是 继 基因 芯片 之 后 ， 作 为 基因 芯片 功能 的 补充 发 展
起 来 的 。 与 基因 芯片 的 概念 类 似 ， 它 是 在 一 个 基因 芯片 大 小 的 载体 上 ， 点 布 高 密
度 的 不 同 种 类 的 蛋白 质 ， 然 后 再 用 标记 了 荧光 染料 或 其 他 的 标记 物 标 记 的 已 知 抗
体 或 配 体 一 起 同心 片 上 和 蛋 昌 质 竞争 结合 ， 在 扫描 仪 上 读 出 荧光 强 弱 ， 计 算 机 分 析
计算 出 待 测 样品 结果 。 在 此 基础 上 可 发 展 到 对 各 种 蛋白 质 、 抗 体 以 及 配 体 的 检
测 ， 弥 补 了 基因 必 片 检测 的 不 足 。

第 五 节 DNA 启动 子 的 活性 研究

在 DNA 分 子 上 ， 调 控 蛋 白 结合 以 及 转录 起 始 复合 物 装 配 地 方 的 一 段 DNA，
一 般 位 于 转录 起 始点 上 游 ， 称 为 启动 子 。 要 分 析 启 动 子 的 活性 ， 就 必须 将 假定 的
启动 子 序 列 插入 到 报告 基因 的 上 游 ， 为 了 选择 要 插入 报告 载体 的 合适 DNA 片
段 ， 必 须 首 先 确 定 翻译 起 始 密码 子 和 转录 起 始 位 点 的 位 置 。 哺 乳 动物 基因 的 转录
起 始 位 点 通常 位 于 翻译 起 始 密码 子 上 游 50 一 200bp 处 。 但 是 ， 通 过 序列 同 源 性 鉴
定 到 了 可 能 的 TATA 框 和 其 他 可 能 的 调控 元 件 ， 就 简单 地 推断 启动 子 在 ATG 密
码 子 的 上 游 是 不 正确 的 。 可 以 在 目的 基因 旁 侧 序列 存在 的 条 件 下 检测 报道 活性 。
但 是 在 未 得 到 转录 起 始 位 点 图 谱 的 情况 下 ， 仅 利用 灵敏 的 报道 分 析 检 验 时 ， 就 难
以 区 分 检测 到 的 活性 是 由 真正 的 启动 子 驱 动 ， 还 是 由 能 驱动 低 水 平 转录 并 存在 于
整个 基因 组 中 的 隐蔽 调控 元 件 驱动 产生 。 因 为 启动 子 区 总 是 位 于 转录 起 始 位 点 周
围 ， 如 果 转 录 起 始 位 点 已 经 明确 ， 结 果 的 可 靠 性 就 会 大 大 增加 。

目前 ， 研 究 启动 子 活 性 的 方法 比较 多 ， 下 面 主要 介绍 采用 毛 霉 素 乙 酰基 转移
酶 试验 (CAT 实验 )。

一 、CAT 实验 原理

自从 Gorman 等 1982 年 首次 介绍 以 毛 霉 素 乙 酰基 转移 酶 (chloramphenicol
acetyltransferase，CAT) 作为 报告 分 子 以 来 ，CAT 基因 就 被 广泛 用 作 许 多 哺乳 动
物 细胞 标准 培养 系 的 报告 基因 。CAT 满足 报告 分 子 所 需 的 许多 标准 。

CAT 由 原核 基因 编码 ， 可 以 产生 对 抗生素 氛 坦 系 的 抗 性 。CAT 可 以 把 酰基
基 团 从 酰基 辅酶 A (acetyL-CoA) 加 到 和 毛 霉 素 上 ， 从 而 使 抗生素 结合 原核 核糖 体
并 抑制 其 功能 的 活性 老 失 。 因 为 哺乳 动物 细胞 中 没有 CAT 基因 ， 而 且 CAT 酶
活性 分 析 具 有 高 灵敏 度 和 可 重复 性 ， 所 以 原核 CAT 基因 成 为 广泛 应 用 于 真 核 启
动 子 分 析 的 报告 基因 。 实 验 中 通常 把 一 段 真 核 DNA 放 在 CAT 基因 编码 区 的 7/
上 游 ， 得 到 的 质粒 再 去 转 染 哺 乳 动 物 细胞 。 转 染 的 基因 表达 一 段 时 间 后 再 检测

”72

CAT 活性 。 如 果实 验 设置 正确 ，CAT 活性 值 与 转 染 质粒 的 转录 水 平 之 间 会 有 线
形 关系 。 对 假定 的 启动 子 DNA 片段 作 突变 ， 转 染 后 测定 突变 体 合成 CAT 的 活
性 ， 有 可 能 以 此 来 确定 DNA 中 的 调控 元 件 。 尽 管 CAT 实验 分 析 具 有 可 定量 的
特性 ， 但 要 记 住 本 方法 并 不 直接 测量 转录 情况 ， 某 些 参数 如 CAT 蛋白 在 转 染 细
胞 中 的 半衰期 会 影响 结果 。 还 有 一 个 潜在 的 问题 ，CAT 活性 可 能 由 起 始 于 质粒
中 异常 位 置 的 转录 物产 生 ， 这 种 异常 转录 可 能 使 对 所 测试 启动 子 活性 的 佑 计 有 很
大 程度 的 压 大 。 有 些 情况 下 ， 可 以 将 转录 终止 信号 放 在 感 兴趣 的 启动 子 的 上 游 ，
可 以 消除 假 转录 造成 的 背景 。 如 果 用 虫 荧光 素 酶 作 报告 基因 ， 检 测 比 CAT 方 便 ，
但 稳定 性 和 重复 性 不 如 CAT。

二 、CAT 实验 方法

1. 转 染 细胞 沉淀 的 制备

1) 将 经 过 转 染 并 在 组 织 培养 下 中 生长 的 单 层 细胞 轻 轻 地 吸 掉 培养 液 。 单 层
细胞 用 不 含 钙 盐 和 镁 盐 的 PBS 洗 3 次 ;

2) 把 培养 下 以 一 定 角度 放置 2 一 3min， 使 最 后 残留 的 PBS 流 到 一 侧 。 吸 掉
PBS 残 液 。 每 个 培养 四 加 lml PBS， 用 橡胶 棒 把 细胞 刮 倒 离 心 管 中 。 冰 浴 ， 直 到
所 有 的 培养 四 处 理 完毕 ;

3) 室温 下 以 最 大 速度 离心 10s 收集 细胞 。 用 lml 冰冷 的 PBS 轻 轻 地 重 悬 细
胞 沉淀 ， 然 后 再 次 离心 收集 细胞 。 去 掉 细 胞 沉 洽 与 管 壁 中 的 PBS 残 液 。 细 胞 沉
淀 可 以 储存 在 - 20 以 便 将 来 分 析 用 。

2. 制备 细胞 抽 提 物

裂解 细胞 是 用 反复 冻 融 法 或 用 含有 去 污 剂 的 缓冲 液 处 理 细 胞 。 后 一 种 方法 快
速 简 便 ， 而 且 适 用 于 在 % 孔 板 上 测量 CAT。

3. 用 薄 层 层 析 法 测定 CAT 活性

1) 取 S0ml 细胞 抽 提 物 在 6SC 旷 育 10min 使 内 源 性 的 去 乙酰 基 酶 失 活 。 如 果
这 时 抽 提 物 混浊 不 透明 ， 在 4C 以 最 大 速度 离心 2min 以 去 除 微 粒 ;

2) 每 个 待 测 样品 用 80wl CAT 反应 混合 液 混合 ，37 及 育 。 孵 育 时 间 的 长 短
与 细胞 抽 提 物 中 CAT 的 浓度 有 关 ， 而 CAT 的 流 度 又 与 所 研究 的 启动 子 强度 和 细
胞 类 型 有 关 。 在 大 多 数 情况 下 ， 孵 育 30min 到 2h 就 足够 了 ;

3) 每 个 样品 加 lml 乙 基 乙 酸 ， 振 功 3 次 ， 每 次 10s， 彻 底 使 溶液 混 匀 。 混 合
物 在 室温 下 以 最 大 速度 离心 Smin;

4) 用 移 液 管 把 900Al 有 机 相 转 移 到 新 管 中 ， 操 作 时 应 小 心 ， 避 兔 水 相 和 中

9

间 相 混入 。 把 含有 下 层 相 的 管子 作为 放射 性 废物 丢弃 ;

5) 把 管子 放 入 旋转 营 发 器 ， 真 空 下 使 乙 基 乙酸 挥发 约 1h;

6) 把 10 一 15 风 已 溶解 的 反应 产物 加 到 硅胶 薄 层 层 析 板 的 起 始 处 。 板 上 的 起
点 用 软 石 墨 铅笔 标记 。 每 次 加 样 中， 用 吹风 机 把 样品 吹 干 ;

7) 准备 盛 有 200ml 薄 层 层 析 溶剂 的 薄 层 层 析 槛 。 把 薄 层 层 析 板 放 入 槽 中 ，
关上 容器 ， 然 后 使 溶剂 前 沿 移动 到 板 上 端 大 约 75% 的 地 方 ;

8) 把 薄 层 层 析 板 从 槽 中 取出 来 ， 在 室温 下 干燥 。 用 放射 性 墨水 在 薄 层 层 析
板 上 做 点 标记 以 便于 对 齐 板 与 胶片 的 位 置 ， 然 后 用 板 对 X 射线 胶片 曝光 ， 或 者
把 板 放 在 磷 屏 分 析 的 盒子 内 ， 盒 子 在 室温 下 放置 适当 的 时 间 ;

9) 冲洗 X 射 线 胶 片 并 与 薄 层 层 析 板 校对 位 置 。 此 外 ， 还 可 以 用 层 析 图 对 磷
屏 分 析 设 备 的 图 像 板 曝光 或 把 薄 层 层 析 板 拿 去 扫描 ;

10) 为 了 对 CAT 活性 定量 ， 需 要 从 薄 层 层 析 板 中 把 放射 性 斑点 切割 下 来 ，
然后 用 液 闪 计数 器 测定 放射 性 量 。 取 另 一 份 细胞 抽 提 物 (来 自 于 步骤 中 的 @)，
用 Bradford 分 析 法 等 快速 比 色 法 确定 抽 提 物 中 的 蛋白 浓度 。 测 定 蛋白 浓度 前 ， 把
Triton X-100 的 浓度 稀释 为 逐 0.1%， 以 免 发 生 交 叉 反应 。CAT 活性 表示 为 每 单
位 时 间 每 毫克 细胞 抽 提 物 蛋白 中 产生 乙酰 基 化 产物 的 摩尔 数 。

第 六 节 “DNA 与 蛋白 质 相 互 作用 研究 方法
一 、 凝 胶 阻 背 分 析 一 一 Gel-shift 实验

1. Gel-shift 实验 原理

当 DNA 片段 与 蛋白 质 结合 在 一 起 形成 DNA -蛋白 质 复 合 物 后 ，DNA 片段 的
分 子 质量 及 所 带 的 电荷 发 生 改 变 ， 因 而 在 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶体 系 中 的 电泳 迁移 率 也
发 生变 化 ， 由 此 得 名 为 电泳 迁移 率 改变 分 析 法 ， 由 于 在 一 般 情 况 下 DNA -和 蛋 白
质 复 合 物 的 迁移 率 会 变 慢 ， 所 以 一 般 称 之 为 凝 胶 阻 沾 分 析 法 〈gel retardation as-
say)， 或 称 为 Gel-shift 实验 。 此 方法 具有 高 度 灵 敏 性 ， 可 以 检测 出 10 5mol 的
DNA 结 合 蛋白 。 采 用 该 方法 可 以 鉴定 目的 基因 的 调控 序列 中 是 否 存在 特定 的
DNA 结合 蛋白 的 结合 位 点 ， 也 可 以 用 来 检测 特定 的 细胞 核 蛋 白 是 否 存在 某 种 基
因 的 DNA 结合 蛋白 ， 因 此 常用 于 基因 转录 调控 因子 的 初步 筛选 ， 是 研究 序列 特
异性 DNA 结合 蛋白 的 和 用 方法 。
2. 操作 步骤
1) 阔 胶 制备 :
40% 丙 炳 酰胺 溶液 Sml
10% 过 硫酸 铵 0.Sml
474 ，

10XTAE Sml

混 匀 后 ， 加 入 TEMED10wl， 混 匀 ， 灌 入 电泳 板 中 。

2) 预 电泳 : 将 凝 胶 在 1xTAE 中 于 4C 条 件 下 预 电 泳 30 一 60min， 电 泳 条 件
为 11 V/cm， 在 电泳 过 程 中 ， 用 蠕动 泵 循环 上 、 下 模 的 缓冲 液 。

3) 结合 反应 : 取 细 胞 核 提 取 液 1 一 4 岂 加 入 到 eppendorf 管 中 ; 加 结合 缓冲 液
至 总 体积 为 12 由 ，10mmoyL MgCb 和 125mmoyL 亚 精 胺 各 2moVL; 加 入 多 聚
(dI.dC) 3uwl， 混 匀 ， 室 温 放 置 2 一 3min; 加 入 用 [2P] 末端 标记 的 DNA 片段
(lng) lpl。

4) 307C 保温 30min 后 ， 点 样 于 预 电 泳 后 的 凝 胶 中 ， 用 30mA 恒定 电流 进行
电泳 。

5) 游离 DNA 片段 至 凝 胶 下 端 时 ， 停 止 电泳 。

6) 电泳 完毕 ， 将 凝 胶 转 移 到 滤纸 上 ， 用 凝 胶 干 燥 器 真空 加 热 干燥 后 ， 进 行
放射 自 显影 。

3. 注意 事项

1) DNA 片段 的 长 度 在 200bp 左右 为 宜 ，DNA 片段 太 长 ， 在 聚 丙烯 酰胺 凝 胶
电泳 中 不 易 分 离 ， 电 泳 迁 移 率 的 轻微 改变 难以 被 检 出 。

2) 为 检查 DNA 与 核 蛋白 结合 的 特异 性 ， 需 要 进行 竞争 性 抑制 试验 ， 其 方法
是 向 反应 体系 中 加 入 过 量 的 非 标记 的 特异 性 DNA 片段 。 如 果 结 合 是 序列 特异 性
的 ， 则 这 些 非 标记 的 DNA 片段 可 与 标记 的 DNA 片段 竞争 性 地 与 核 蛋 白 结 合 ，
其 结果 是 造成 放射 自 显影 X 底 片上 的 滞后 带 消失 。 用 这 种 方法 ， 将 多 种 人 工 合
成 的 双 股 寡 核 苷 酸 或 较 短 的 DNA 限制 酶 切片 段 分 别 加 入 反应 体系 中 进行 竞争 抑
制 试验 ， 可 将 核 蛋白 在 DNA 分 子 上 的 结合 位 点 进行 初步 定位 ， 因 为 只 有 相当 于
结合 位 点 DNA 序列 的 寡 核 苷 酸 片 段 才能 抑制 它们 的 结合 。

3) 反应 体系 中 加 入 多 聚 (dI'dC) 的 目的 是 抑制 核 蛋白 与 DNA 片段 的 非特
异性 结合 ， 起 封闭 作用 。 在 核 蛋 白 提 取 液 纯度 较 低 的 情况 下 ， 多 聚 (dI'dC) 的
用 量 要 进行 摸索 ， 也 可 以 用 链 精 DNA 或 小 牛 胸腺 DNA 代替 多 聚 (dI'dC)。

4) 核 蛋 白 的 用 量 对 实验 结果 具有 明显 影响 ， 蛋 白 量 过 高 则 非特 异性 结合
加 ， 过 低 则 有 可 能 出 现 假 阴 性 结果 。 核 蛋白 的 用 量 与 其 对 DNA 的 亲 和 性 、 核 蛋
白 提取 液 中 特定 DNA 结合 蛋白 的 丰 度 以 及 反应 条 件 等 多 种 因素 有 关 。 因 此 ， 在
正式 试验 前 ， 应 对 核 蛋 白 量 进行 摸索 ， 以 能 形成 清晰 的 滞后 带 ， 又 有 适量 的 游离
DNA 带 残 存 为 宜 。

5) 亚 精 腕 和 MgClh 的 浓度 也 显著 影响 核 蛋白 与 DNA 的 结合 ， 其 用 量 也 需要
经 过 预 试验 摸索 。

6) DNA 片段 的 用 量 一 般 为 1.0ng， 但 可 视 情 况 适 当 增 减 ， 以 能 形成 清晰 的
滞后 带 而 游离 DNA 带 又 不 过 浓 为 宜 。

51

7) 为 保持 DNA -条 白 质 复合 物 在 凝 胶 中 的 稳定 性 ， 电 泳 缓冲 液 一 般 采 用 低
离子 强度 的 0.25xTBE 或 1xTAE。 但 是 ， 低 离子 强度 的 缓冲 液 缓冲 能 力 不 强 ，
长 时 间 的 电泳 会 导致 正 负极 缓 冲 液 的 pH 发 生变 化 ， 因 此 ， 宣 将 正 负极 的 缓冲 液
进行 不 间断 的 循环 。

8) 为 除去 凝 胶 中 的 不 纯 物质 ， 在 标本 进行 电泳 分 离 之 前 应 在 稳定 电流 情况
下 进行 预 电 泳 至 电压 不 再 上 升 为 止 。 电 泳 一 般 在 4C 条 件 下 进行 为 宜 。

二 、DNase 工 足迹 法

DNase I 足 迹 法 (foot printing) 是 在 体外 鉴定 DNA 结合 蛋白 在 DNA 分 子 上
的 结合 位 点 的 实验 方法 。 这 种 方法 的 基本 原理 是 DNA 分 子 上 的 特定 序列 与 DNA
结合 蛋白 结合 后 ，DNA 结合 蛋白 可 保护 该 部 位 的 DNA 序列 不 受 DNase 工 的 攻
击 ， 也 即将 待 测 双 链 DNA 片段 中 的 一 条 单 链 的 一 端 用 ”2P 标记 后 与 核 蛋 白 进 行
结合 ， 之 后 加 入 适当 浓度 的 DNase I 进 行 部 分 消化 (平均 一 个 DNA 分 子 上 产生
一 个 切口 )， 经 变性 后 用 测序 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 电泳 分 离 ， 放 射 自 显影 ， 即 可 出 现
以 相差 一 个 核 苷 酸 为 阶梯 的 DNA 条 带 。 因 为 结合 有 蛋白 质 的 序列 不 能 被 DNase
I 所 切断 ， 所 以 不 能 检 出 DNA 条 带 。 因 此 ， 将 与 核 蛋 白 结 合 和 未 与 核 蛋 白 结 合
的 DNA 片段 分 别 用 DNase 工 消 化 ， 以 Maxam 和 Gilbert 化 学 测序 法 处 理 的 DNA
片段 作为 Marker 同时 进行 电泳 ， 经 比较 两 者 的 DNA 条 带 ， 即 可 确定 DNA 分 子
上 的 蛋白 质 结合 位 点 。

在 放射 自 显影 图 谱 上 ，DNA 梯度 条 带 在 相应 于 DNA 结合 蛋白 的 结合 部 位 中
断 形 成 一 个 空白 区 域 ， 好 像 蛋 白 在 DNA 上 留 下 的 足迹 ， 因 而 被 形象 地 称 为 足迹
法 。 实 际 上 ， 足 迹 是 一 个 统计 学 的 结果 ， 因 为 DNase 工 切断 所 形成 的 每 一 个
DNA 片段 本 身 并 不 能 反映 DNA 结合 蛋白 的 结合 部 位 ， 而 是 反映 此 部 位 不 是 结合
位 点 ， 只 有 将 所 有 DNA 片段 综合 在 一 起 后 才能 反映 出 精细 的 结合 位 点 。

三 、 甲 基 化 干扰 足迹 法

甲 基 化 干扰 足迹 法 是 利用 硫酸 二 甲 酯 (DMS) 使 DNA 分 子 中 的 G7 及 As 位
发 生 甲 基 化 ， 当 蛋白 结合 位 点 上 的 G 和 人 A 被 甲 基 化 后 ， 便 会 干扰 DNA 结合 蛋白
与 结合 位 点 的 结合 反应 从 而 形成 足迹 。 与 DNase I 足 迹 法 相 比 ， 甲 基 化 干扰 足迹
法 的 优点 是 : @ODNase I 足 迹 法 需要 较 高 的 蛋白 浓度 以 使 所 有 的 结合 位 点 被 饱
和 ， 而 本 方法 不 受 非 完全 结合 的 影响 ， 因 为 DNA 与 蛋白 质 结 合 后 需 经 凝 胶 电 泳
迁移 率 改 变 分 析 ， 将 与 蛋白 结合 的 DNA 探 针 与 游离 探 针 分 离 ;，@ 蛋 白质 与 DNA
的 结合 是 动态 反应 ， 在 蛋白 从 DNA 上 的 结合 位 点 解 离 时 ，DNase I 工 可 导致 结合
位 点 的 消化 ， 而 本 方法 则 不 会 ， 因 为 凡 能 结合 蛋白 质 的 DNA 在 结合 位 点 上 均 不

.476 ，

”会 有 甲 基 化 修饰 @ 本 方法 的 分 辩 率 较 DNase I 足 迹 法 高 。 本 方法 的 缺点 是

DMS 的 甲 基 化 修饰 作用 具有 碱 基 特异 性 ， 主 要 修饰 G 位 和 A: 位 ， 不 修饰 工 和
_C， 因 此 ， 当 结合 位 点 的 一 条 单 链 上 不 存在 G 和 A 时 ， 则 需要 测定 另 一 条 互补 单
链 ， 综 合 两 条 链 的 结果 才能 得 出 精确 的 结合 位 点 。

第 七 节 ”和 蛋 日 质 与 恒 日 质 的 相互 作用

蛋白 质 间 的 相互 作用 存在 于 机 体 细胞 的 生命 活动 过 程 中 ， 生 物 学 的 许多 现象
如 复制 、 转 录 、 翻 译 、 剪 切 、 分 沁 、 细 胞 周期 调控 、 信 和 号 转 导 和 中 间 代 谢 等 均 受
到 蛋白 质 之 间 相 互 作用 的 调控 。 有 些 蛋 白质 由 多 个 亚 基 组 成 ， 他 们 之 间 的 相互 作
用 就 显得 更 为 普遍 ， 有 些 蛋 白质 结合 紧密 ， 而 有 些 蛋 白质 只 有 短暂 的 相互 作用 ，
然而 不 论 哪 种 情况 ， 它 们 均 控制 着 大 量 的 细胞 活动 事件 ， 如 细胞 的 增殖 、 分 化 和
死亡 。 通 过 蛋白 质 之 间 的 相互 作用 ， 可 改变 细胞 内 蛋白 质 的 动力 学 特征 ; 也 可 以
产生 新 的 结合 位 点 ， 改 变 蛋 白质 对 底 物 的 特异 收 ; 还 可 以 失 活 其 他 的 蛋白 质 ， 调
控 其 他 基因 表达 。 因 此 ， 研 究 蛋 白质 与 蛋白 质 之 间 的 相互 作用 的 意义 重大 ， 其 检
测 方法 的 也 备 受 重视 。 目 前 研究 蛋白 质 与 重 白 质 相 互 作用 的 方法 有 生化 方法 〈 如
蛋白 质 亲 和 层 析 、 亲 和 印迹 、 免 疫 沉 淀 及 交 联 ) 以 及 发 展 到 现在 的 分 子 生 物 学 方
法 〈 如 以 基因 文库 为 基础 的 蛋白 质 探测 、 鸣 菌 体 展 示 技 术 以 及 双 杂 交 系 统 )。 通
过 这 些 方法 的 联合 使 用 ， 由 实验 得 出 的 蛋白 质 间 相 互 作 用 的 结论 更 为 可 靠 。 分 子
生物 学 方法 尤其 是 双 杂 交 系 统 的 建立 ， 使 研究 蛋白 质 间 的 相互 作用 变 得 更 为 简
捷 。

入 双 杂 交 了 系 引 L

双 杂 交 系 统 (two-hybrid system) 又 称 相互 作用 陷阱 〈interaction trap) 是 近

几 年 来 建立 的 研究 蛋白 质 相 互 作 用 的 新 方法 。 其 基本 原理 是 : 构建 二 个 基因 重组
杂交 有 蛋 日 ， 一 个 杂交 蛋白 为 DNA 结构 域 (A) 与 感 兴趣 的 蛋白 质 (X) 融合 而
成 ， 表 示 为 A+X， 另 一 个 杂交 蛋白 为 DNA 转录 激活 结构 域 (B) 与 待 第 选 的 蛋
日 〈Y) 融合 而 成 ， 表 示 为 B+ YY， 在 酵母 细胞 中 含有 两 个 报告 基因 ， 通 稼 为
Lex 和 ,ac2 基因 ， 这 两 个 基因 受 一 段 DNA 序列 调控 ， 通 常 为 DNA 上 游 激 活 序
列 〈(upstream activating sequence，UAS) 或 LezA 操纵 基因 ， 它 们 可 被 DNA 结合
结构 域 结合 。 报 告 基因 的 检测 灵敏 度 为 Lex 大 于 LacZ。 将 两 个 杂交 蛋白 重组 体
转化 到 酵母 细胞 中 后 ， 若 X 与 Y 可 相互 作用 ， 则 转录 激活 结构 域 通过 DNA 结合
结构 域 与 UAS 或 LerA 的 结合 激活 报告 基因 的 转录 ， 结 果 酵 母 菌 能 在 缺乏 Leu
的 培养 基 上 生长 同时 在 含有 X-gal 的 培养 基 上 呈 蓝 色 。 反 之 则 和 否 。 挑 取 阳 性 酵
母 菌 ， 分 离 含 有 编码 B+Y 的 质粒 ， 进 行 序列 分 析 ， 其 中 Y 基因 编码 的 Y 蛋白

. 477 ，

即 为 新 发 现 的 与 又 相互 作用 的 蛋白 质 。

二 、 哗 菌 体 撒 示 技术

1. 鸣 菌 体 展示 技术 的 基本 原理

鸣 菌 体 展 示 技 术 (phage display) 的 基本 原理 是 将 外 源 基因 揪 入 鸣 菌 体 信 和 号
肽 序列 与 主要 衣 壳 蛋白 基因 出 或 基因 亚 之 间 ， 构 建成 融和 蛋白 噬菌体 库 ， 表 达 的
融和 和 蛋白 可 以 呈现 在 唉 菌 体 表面 ， 而 不 影响 叹 菌 体 的 完整 性 。 利 用 呈现 的 多 肽 与
感 兴 趣 的 蛋白 亲 和 结 合 的 性 质 可 以 高 效率 的 筛选 所 需 的 基因 ， 即 先 将 感 兴趣 的 蛋
白 固 相 化 ， 如 结合 在 塑料 板 上 ， 加 上 文库 鸣 菌 体 并 与 感 兴趣 的 蛋白 反应 。 经 过 洗
活 ， 无 结合 力 的 鸣 菌 体 被 洗 掉 ， 有 亲和力 的 叹 菌 体 即 被 俘获 ， 洗 脱 的 噬菌体 可 以
再 感染 大 肠 杆菌 而 繁殖 ， 这 样 “吸附 一 洗涤 一 洗 脱 一 繁殖 ”的 富 集 过 程 称 为 淘 租 一
(panning)。 一 轮 淘 筛 可 使 噬菌体 富 集 103 倍 ， 经 过 几 轮 淘 得 就 能 从 10? 一 101 的
鸣 菌 体 文库 中 筛选 得 到 与 感 兴趣 蛋白 相互 作用 的 蛋白 。

2. 用 于 噬菌体 展示 的 载体

在 叹 菌 体 展 示 系 统 中 ， 外 源 DNA 片段 插入 到 基因 III 或 基因 VIII 中 位 于 切
割 部 位 下 游 的 几 个 核 音 酸 处 。 用 重组 病毒 DNA 转 染 的 下 .coli 合成 并 分 泌 单一
成 分 的 感染 性 “融合 噬菌体 ”颗粒 ， 其 表面 展示 有 外 源 DNA 编码 的 氨基 酸 。 因
| 为 在 转 染 的 细菌 噬菌体 颗粒 表面 的 每 一 份 pIII 或 pVIII 拷贝 均 载 有 外 源 DNA 纺
让 码 的 序列 ， 因 此 它们 是 以 紧密 装配 的 多 价 方式 来 展示 。
针对 特定 的 目的 ， 已 经 建立 了 特殊 的 叹 菌 体 展 示 载 体 。 其 中 最 著名 的 是 含有
一 个 琥珀 (UAG) 链 终止 突变 的 鸣 菌 体 载 体 ， 这 一 突变 位 于 外 源 性 DNA 插入 片
段 的 下 游 ，pIII 或 pVIII 结构 的 上 游 。 当 重组 噬 菌 粒 用 来 转化 下 .coii 的 非 抑 制
性 菌株 时 ， 由 外 源 DNA 编码 的 蛋白 质 在 琥珀 密码 子 位 置 终 止 ， 并 分 泌 进 入 培养
基 中 。 当 采用 载 有 免疫 球 蛋白 基因 片段 的 喉 菌 粒 时 ， 从 各 个 抑制 基因 阴性 的 转化
子 的 上 清 液 中 ， 可 以 筛选 到 能 够 与 抗原 结合 的 可 溶性 抗体 片段 。 然 而 ， 当 鸣 菌 粒
用 来 转化 表达 琥珀 抑制 子 的 细胞 时 ， 可 以 合成 整个 融和 蛋白， 抗体 片段 按 正 常 方
式 展示 在 所 分 泌 的 吹 菌 体 颗粒 的 表面 。

3. 肽 的 噬菌体 展示

将 序列 不 同 而 长 度 相 同 的 合成 寡 核 苷 酸 插 入 基因 III 或 基因 VIII 中 ， 就 可 以
生成 巨大 的 、 可 以 展示 数 千 万 个 肽 的 重组 喉 菌 体 文库 。 因 为 编码 了 目标 的 基因 是
细菌 噬菌体 基因 组 的 一 部 分 ， 那 么 通过 其 蛋白 质 产物 的 亲 和 选 择 ， 细 菌 鸣 菌 体 展
示 就 可 以 用 来 分 离 特 定 的 DNA 序列 。 获 益 于 鸣 菌 体 肽 展示 的 广 谤 的 生物 系统 ，

.478 ，

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包括 抗原 表面 定位 、 蛋 白质 -蛋白 质 相 互 作 用 分 析 以 及 抑制 剂 、 激 动 剂 和 持 抗 剂
的 分 离 。

4. 肽 展示 文库 的 构建

建立 肽 展示 文库 的 步骤 原理 很 简单 : 合成 正确 长 度 的 随机 守 核 苷 酸 ， 采 用
PCR 转换 成 双 链 分 子 ， 用 限制 酶 消化 ， 连 接 到 已 经 在 细菌 喉 菌 体 基因 III 或 VIII
中 的 适当 位 置 构建 好 的 相应 的 限制 位 点 上 。 连 接 产物 转 染 到 正 . coa， 并 收集 经
培养 产生 的 叹 菌 体 。 许 多 只 菌 体 展 示 载 体 ， 比 如 像 TUSE 系列 的 载体 都 载 有 四 环
素 抗 性 基因 ， 这 可 以 在 含有 抗生素 的 培养 基 上 对 转 染 细胞 作为 克隆 选择 和 维持 。
然后 ， 鸣 菌 体 基 因 组 就 可 像 质粒 一 样 繁殖 。 这 种 选择 减少 了 多 轮 感染 期 间 对 pIII
功能 的 要 求 。 细 胞 在 液体 培养 基 中 生长 几 个 小 时 后 ， 可 以 随时 收集 喉 菌 体 。

三 、 免 疫 共 沉 演技 术

当 细 胞 在 非 变性 条 件 下 被 裂解 时 ， 完 整 细胞 内 存在 的 许多 和 蛋白质- 蛋白质 结
合 保持 下 来 。 这 一 事实 可 被 用 于 检测 和 确定 生理 条 件 下 相关 的 蛋白 质 -蛋白 质 间
相互 作用 。 如 果 蛋 白质 X 的 抗体 免疫 沉 省 X， 那 么 与 X 在 体内 结合 的 蛋白 质 Y
可 能 也 沉淀 下 来 。 基 于 与 蛋白 质 X 的 生理 性 相互 作用 ， 蛋 白质 Y 的 免疫 沉淀 被
归 关 为 免疫 共 沉 演 。 这 种 方法 最 常用 于 测定 两 种 目标 蛋白质 是 否 在 体内 结合 ， 但
也 用 于 确定 一 种 特定 蛋白 质 的 新 的 作用 搭档 。

两 种 旦 白质 间 生 理性 相互 作用 的 最 严格 证 实 ， 也 许 是 它们 从 细胞 提取 液 中 的
免疫 共 沉淀 。 假 定 的 相互 作用 可 能 首先 用 有 效 的 高 通 量 方法 确定 ， 如 酵母 双 杂 交
筛选 ， 然 后 用 免疫 共 沉 淀 证 实 两 种 蛋白 质 是 真正 的 生理 性 相互 作用 。 通 过 用 编码
相关 香 白 质 的 质粒 瞬间 转 染 细胞 ， 然 后 表达 和 蛋白质， 常 可 加 快 以 此 方法 对 蛋白 质
- 蛋 特 质 相 互 作 用 的 检测 。 然 而 ， 从 质粒 的 过 表达 生成 的 蛋白 质 可 能 驱动 那些 非
生理 性 的 两 种 蛋白 质 间 的 相互 作用 。 因 此 ， 证 实 两 种 蛋白 质 在 它们 的 自然 的 非 转
染 细 胞 内 的 相互 作用 常 是 更 好 的 选择 。

用 免疫 共 沉 演 探 询 与 已 知 蛋白 质 相 互 作 用 的 新 蛋白 质 ， 是 确定 完整 细胞 内 生
理性 相互 作用 的 有 效 方法 。 此 方法 的 主要 缺点 是 费时 费力 ， 并 且 需 要 大 量 培养 细
胞 ， 以 及 可 能 检测 不 到 低 亲 和 力 的 瞬间 的 蛋白 质 - 蛋 白质 相互 作用 。 另 外 ， 免 疫
共 沉 深 仅 对 从 细胞 溶出 的 、 并 存留 在 生理 复合 物 中 的 蛋白 质 有 效 。 因 此 ， 免 疫 共
沉淀 可 能 不 适合 于 检测 构成 巨大 的 、 不 溶性 的 大 分 子 结构 的 蛋 自 质 - 蛋 白质 相互
作用 。

.479 .

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